DE1643496C3 - Verfahren zur Herstellung von menschlichem Corticotropin bzw. analoger Verbindungen - Google Patents

Description

H —Ser —Tyr —Ser —Met —Glu— (I)

— His — Phe²— Arg — Try — Gly⁵—

6 7 8 9 10

— Lys — Pro — VaI — Gly — Lys — Lys —

11 12 13 14 15 16

— Arg — Arg — Pro — VaI — Lys —

17 18 19 20 21

— VaI — Tyr— Pro —

22 23 24

— Asp —Ala —Gly — G!u—Asp— (A)

— GIn — Ser—AIa — Glu —

— Asp —Gly—Ala —Glu—Asp— (B)

— GIn — Leu — AIa — Glu —

— Asp —Gly —Glu—Ala —Glu— (C)

— Asp — Ser — AIa — GIn —

—Ala —Gly —Glu —Asp —Asp— (D)

25 26 27 28 29

— Glu — AIa — Ser — GIn — AIa —

30 31 32 33 34

— Phe — Pro

35 36

- Leu — GIu -

37 38

Phe —OH

39 Es wurde nun gefunden, daß das Molekül des menschlichen Corticotropins, dessen Struktur durch die nachstehende Formel Il dargestellt werden kann

H — Ser — Tyr — Ser — Met — GIu

1 2 3 4 S

— His — Phe — Arg — Try — Gly —

6 7 8 9 10

— Lys — Pro — VaI — Gly — Lys —

11 12 13 1+ 15

— Lys — Arg — Arg — Pro — VaI —

16 17 18 19 20

— Lys — VaI — Tyr — Pro — Asp —

21 22 23 24 25

—Ala —Gly —Glu —Asp —Gin —

26 27 28 29 30

— Ser — AIa — Glu — AIa — Phe —

31 32 33 34 35

— Pro — Leu — Glu — Phe — OH

36 37 38 39

durch die Anwendung von an sich bekannten peptidchemischen Methoden unter Vermeidung des den synthetischen Aufbau von solchen langen Peptid-

ketten erschwerenden Auftretens von Razemisation einzelner Aminosäuren aufgebaut werden kann, wenn man das aus den Aminosäuren 1 bis 14 der Sequenz des menschlichen Corticotropins bestehende und in an sich bekannter Weise geschützte Tetradekapeptid

der Formel III

OY

X —Ser —Tyr —Ser —Met —Glu— (III) X'

— His — Phe — Arg — Try — Gly — X

40 — Lys — Pro — VaI — Gly — R

worin (A) die Teilsequenz 25 bis 33 des menschlichen Corticotropins, (B), (C) und (D) die entsprechenden Teilsequenzen des Schweine-, Schaf- bzw. Rindercorticotropinsdarstellen.

Die aus den tierischen Hypophysen isolierbaren Corticotropine werden in breitem Umfang in der Therapie von verschiedenen asthmatischen, rheumatischen Erkrankungen und von Entzündungszuständen sowie zur Behandlung von bei schweren Brandwunden, Verletzungen, Operationen und akuten Infektionskrankheiten auftretenden Schockzuständen angewendet, obwohl solche Präparate bei einem Teil der Patienten allergische Symptome verursachen. Das menschliche Corticotropin konnte bisher in der Therapie nicht angewendet werden, da die synthetische Herstellung dieses Hormons bisher nicht bekannt war und zu seiner Gewinnung die menschliche Hypophyse als einzige Quelle diente.

unte^r Anwendung von in der Peptidchemie an sich bekannten Kupplungsmethoden mit dem aus den Aminosäuren 15 bis 39 der Sequenz des menschlichen Corticotropins bestehenden und ebenfalls entsprechend geschützten Pentakozapeptid der Formel IV

X XXX'

H — Lys — Lys — Arg — Arg Pro — (IV)

X Y

— Vai — Lys — VaI — Tyr — Pro — OY OY OY

— Asp — AIa — Gly ·

-GIu — Asp — OY

— GIn — Ser — AIa — GIu — AIa —

OY

— Phe — Pro — Leu — GIu — Phe — OY verknüpft, wobei in diesen Formeln X und Y für auf

H — Q' — T

(V)

IO

gleiche Weise entfernbare Schutzgruppen, wie tert.-Butyloxycarbonyl- oder tert.Butylgruppen, R für eine Hydroxylgruppe oder einen sonstigen, die Carboxylgruppe aktivierenden, in der Peptidchemie für solche Zwecke gebräuchlichen Substituenten, wie für eine Azid-, Nitrophenoxy- oder Chlorphenoxygruppe, und X' für einen zum Schutz der Guanidinogruppe geeigneten Substituenten, z. B. eine Nitrog.uppe, oder für ein die Guanidinogruppe schützendes Proton stehen.

Der Ausgangsstoff dieser Synthese, das geschützte Tetradekapeptid der Formel III, ist eine neue, in der Literatur bisher nicht beschriebene Verbindung. Sie ist eine leicht herstellbare, weitgehend unlösliche und daher sehr gut in reiner Form isolierbare Verbindung, welche vom Gesichtspunkt dieser Synthese noch den besonderen Vorteil zeigt, daß sie den der Gefahr einer Razemisierung bei der Kupplun^sreaktion nicht ausgesetzten Glycinrest als C-terminale Aminosäure enthält. Deshalb kann das geschützte Tetradekapeptid der Formel III im Sinne der vorliegenden Erfindung nicht nur für die Herstellung des menschlichen Corticotropins der obigen Formel II, sondern auch zur Herstellung von analogen, aus kürzeren Teilsequenzen der natürlichen Corticotropine bestehenden, biologisch ebenfalls aktiven Polypeptiden äußerst vorteilhaft als Ausgangsstoff verwendet werden. Bekannterweise zeigen auch solche, die Teilsequenz 1 bis 13 der natürlichen Corticotropine in gleicher Form enthaltende, aber nur aus einem Teil der vollständigen Aminosänrekette der natürlichen Corticotropine bestehende Polypeptide, besonders aber die aus den ersten 24 oder 28 Aminosäuren der natürlichen Corticotropine bestehenden Tetrakoza- bzw. Oktakozapeptide therapeutisch sehr wertvolle, denjenigen der natürlichen Corticotropine ziemlich nahekommende Hormonwirkungen. Diese kürzeren, aber die ersten 1 bis 13 Aminosäuren der natürlichen Corticotropine enthaltenden Fragmente haben auch andere therapeutisch ebenfalls wertvolle Eigenschaften, so z. B. lipoidmobilisierende Wirkungen, welche auch schon bei kürzerkettigen, adrenocorticotrope Wirkung noch gar nicht oder nur kaum aufweisenden Fragmenten auftreten.

Diese ebenfalls wertvollen Corticotropin-Fragmente können im Sinne der vorliegenden Erfindung ebenfalls sehr vorteilhaft, mit guten Ausbeuten und ohne das Auftreten von Razemisation hergestellt werden, wenn man das in entsprechender Form geschützte Tetradekapeptid der obigen Formel III nach an sich bekannten peptidchemischen Methoden mit den den restlichen Teil des als Endprodukt gewünschten PoIypeptids enthaltenden und entsprechend geschützten Peptiden der allgemeinen Formel V lichem Corticotropin der Formel HA

55 H — Ser — Tyr — Ser — Met

t 2 3 4

— His — Phe — Arg — Try -

8 9

— GIu — (ΠΑ)

-Gly —

10

— Lys — Pro — VaI —

11 12 13

— Lys — Arg — Arg —

16 17 18

— Lys — VaI — Tyr —

21 22 23

— AIa — GIy — GIu

26 27 28

GIy —

14

Pro -

19

Pro -

Asp -

29

Ly* -

15

-VaI-

20

Asp —

25

-Gin —

30

worin T' für eine Aminogruppe oder eine Alkoxy- oder Aryloxy gruppe und Q' für die an den reaktiven Seitengruppen entsprechend geschützte Aminosäurerest-Kette des die Aminosäuresequenz des Tetradekapeptids der Formel III zum gewünschten natürlichen menschlichen oder tierischen Corticotropin oder Corticotropin-Fragment ergänzenden Peptidfragment steht, verknüpft und die Schutzgruppen sodann abspaltet.

Der Gegenstand der Erfindung ist also ein Verfahren zur synthetischen Herstellung von mensch-

— Ser — AIa — GIu — AIa — Phe —

31 32 33 34 35

— Pro — Leu — GIu — Phe — OH

36 37 38 39

bzw. der analogen, aber im Nonapeptid-Fragment (25 bis 33) die Aminosäuresequenz IIB, IIC bzw. IID

— Asp — Gly — Ala — GIu — Asp— (HB)

2S 26 27 28 29

— Gin — Leu — Ala — GIu —

30 31 32 33

— Asp —Gly —Glu —Ala —GIu- (HC)

25 26 27 28 29

— Asp — Ser — Ala — Gin —

30 31 32 33

— Ala —Gly —Glu —Asp —Asp— (HD)

25 26 27 28 29

— GIu — Ala — Ser — Gin —

30 31 32 33

aufweisenden Schweine-, Rinder- bzw. Schaf-Corticoiropine sowie deren mindestens die ersten 15 Aminosäuren der obigen Sequenzen 1IA bis IID enthaltende Fragmente der allgemeinen Formel VI

H—Ser —Tyr —Ser —Met —Glu— (VI)

— His — Phe — Arg — Try — Gly —

— Lys —Pro —Val —Gly —Q-T

worin T für eine Hydroxyl- oder Aminogruppe steht und Q eine der Aminosäuresequenzen (15 bis 39) der Nonatriakontapeptide der Formel IIA bis HD oder ein beliebiges, mit der obigen Anfangsgruppe "Lys beginnendes und aus 1 bis 24 Aminosäureresten bestehendes Teilstück der obigen Sequenzen (15 bis 39] bedeutet, das dadurch gekennzeichnet ist, daß mar mit dem aus den Aminosäuren (1 bis 14) der Sequenz der natürlichen Corticotropine bestehenden und ir an sich bekannter Weise geschützten Tetradekapeptid· Derivat der allgemeinen Formel HI

X—Ser—Tyr—Ser—Met—GIu(OY)- (III)

—His—Phe—Arg(X')—Try—

—Gly—Lyspi)—Pro—Val—Gly—R

worin X und Y für entfernbare Schutzgruppen, X für einen zum Schutz der Guanidinogruppe geeignetei Substituenten und R für eine Hydroxylgruppe ode einen die Carboxylgruppe aktivierenden Substituente steht, das aus den weiteren Aminosäuren des g« wünschten Corticotropins oder Corticotropin-Frag ments bestehende geschützte Peptid der allgemeine

Formel V

Η — Q' — T'

worin T' für eine Amino-, Alkoxy- oder Aryloxygruppe, Q' für eine geschützte Corticotropin-Aminosäuresequenz (15 bis 39) der allgemeinen Formel IVA, IVB₅IVC bzw. IVD

— Lys(X) — Lys(X)— Arg(X')— (IVA)

— Arg(X') — Pro — VaI — Lys(X) —

— VaI — Tyr(Y) — Pro — Asp(OY) —

— Ala — GIy-GIu(OY)- Asp( OY) —

— Gin —Ser—Ala —GIu(OY)-Ala —

— Phe — Pro — Leu — GIu(OY) — Phe —

-Ly₅(X)-LyS(X)-Ar₈(X')- (IVB)

— Arg(X') — Pro — VaI — Lys(X) —

— VaI — Tyr(V) — Pro — Asp(OY) —

— GIy — AIa — GIu(OY) — Asp(OY) —

— GIn — Leu—AIa — GIu(OY) — AIa —

— Phe — Pro — Leu — GIu(OY) — Phe —

— Lys(X)— Lys(X) — Arg(X') — (IVC)

— Arg(X') — Pro — Va! — Lys(X) —

— VaI — Tyr(Y) — Pro — Asp(OY) —
-GIy-GIu(OY)-AIa-GIu(OY)-

— Asp(OY) — Ser — AIa — GIn — AIa —

— Phe — Pro — Leu — GIu(OY) — Phe —

— Lys(X) — Lys(X) — ArgiX')— (IVD)

— Arg(X') — Pro — VaI — Lys(X) —

— VaI — Tyr(Y) — Pro — AIa — GIy —

— GIu(OY) — Asp(OY) — Asp(OY) —

— GIu(OY) — AIa — Ser — GIn — AIa —

— Phe — Pro — Leu — GIu(OY) — Phe —

oder für ein beliebiges, mit der geschützten Aminosäuregruppe ^l5Lys(X) beginnendes Teilstück dieser Sequenzen (15 bis 39) steht, wobei in diesen Formeln X. X' und Y die obige Bedeutung haben, acyliert und die Schutzgruppen des erhaltenen Peptids in an sich bekannter Weise abspaltet.

Das Verfahren wird im Sinn der Erfindung derart ausgeführt, daß man ein entsprechend geschütztes Tetradekapeptid der Formel 111 nach irgendeiner der bekannten peptidchemischen Kupplungsmethoden (z. B. nach der Azid-Methode oder unter Bildung eines gemischten Anhydrids oder eines aktiven Esters oder mit Hilfe von einem Carbodiimid) mit der anderen Peptidkomponente der allgemeinen Formel V kondensiert. Obwohl diese Verknüpfungsreaktion prinzipiell nach sämtlichen bekannten Kupplungsmethoden durchgeführt werden kann, haben wir doch gefunden, daß besonders hohe Ausbeuten erzielt und wesentlich reinere und leichter isolierbare Produkte erhalten werden können, wenn man diese Kondensation mit einem Carbodiimid, vorteilhaft mit Di-(V) cyclohexyl-carbodiimid, in Anwesenheit von einer

Hydroxylverbindung, vorteilhaft von Pentachlorphenol, durchführt. Die gewünschten Reaktionsprodukte werden mit etwa 60% erreichenden Ausbeuten erhalten, es bleiben im Reaktionsgemisch bei Anwendung von äquimolaren Mengen der Reaktionskomponenten praktisch keine unreagierten Ausgangsprodukte zurück, und so können die in reinerer Form erhaltenen Reaktionsprodukte wesentlich einfacher isoliert werden.

Die durch Kondensation des geschützten Tetradekapeptids der Formel 111 mit der Verbindung der Formel V erhaltenen geschützten Peptide können durch in an sich bekannter Weise erfolgende Abspaltung der Schutzgruppen in die entsprechenden, an den funktioneilen Gruppen freien Peptide übergeführt werden, diese können dann nach entsprechender Reinigung in freier Form, in der Form von Salzen oder gewünschtenfalls in der Form von mit Metallsalzen gebildeten Komplexen, von mit Gelatine oder mit humanem Serumprotein gebildeten Addukten oder von mit reduzierenden Zuckern hergestellten Kondensaten therapeutisch angewendet werden.

Die als Ausgangsstoffe des erfindungsgemäßen Verfahrens dienenden Peptidkomponenten, d. h. das geschützte Tetradekapeptid der Formel III und die geschützten Peptid-Fragmente der Formel V, können nach an sich bekannten peptidchemischen Methoden unter Anwendung von an sich ebenfalls bekannten Schutzgruppen - Kombinationen hergestellt werden. Entsprechend den allgemeinen Prinzipien der Peptidsynthese ist es zweckmäßig, solche Schutzgruppen anzuwenden, die am Ende der Synthese durch milde saure Hydrolyse entfernt werden können (z. B. tert.-Butyloxycarbonylgruppen zum Schutz der Amino-¹ gruppen und tert.Butylester- oder tert.Butyläthergruppen zum Schutz der Carboxyl- bzw. Hydroxylgruppen); bei der Herstellung der Zwischenprodukte

können aber auch Carbobenzoxy- bzw. p-Chlorcarbobenzoxygruppen und zum Schutz der Guanidinogruppe des Arginins Nitrogruppen vorteilhaft angewendet werden. Die Synthese kann aber auch mil keine besonderen Schutzgruppen tragendem, nui protonierte Guanidinogruppe enthaltendem Arginin durchgeführt werden.

In Fällen, wo die zu aktivierende Komponente eint Acylaminosäure oder ein als C-terminale Aminosäure Prolin oder Glycin enthaltendes Acylpeptid ist, kön nen zur Ausbildung der Peptidbindungen die Metho den der gemischten Anhydride, der aktiven Este oder die Carbodiimid-Methode angewendet werden In allen anderen Fällen, wenn also mit der Racemi sierung der aktivierten Aminosäure gerechnet werdei muß, ist es vorteilhaft, die Azid-Methode, mit iso liertem oder unisoliertem Azid, in wäßrigem Mediun oder in organischen Lösungsmitteln anzuwenden.

Bei der Herstellung des geschützten Tetradekapep tids (1 bis 14) der allgemeinen Formel III wird zweck mäßig derart vorgegangen, daß man das aus de Literatur bekannte Tetrapeptidester Z—Lys(BOQ-

— Pro—VaI—GIy—OC₂H₅ zuerst in den geschütz ten Hexapeptidester Z — Try — GIy — Lys(BOC)-

— Pro — VaI — GIy — OC₂H₅, dann den letztere durch Kupplung mit geschütztem Arginin und En fernen der C- bzw. N-terminalen Schutzgruppen i das Heptapeptid H— Arg—Try—Gly—Lys(BOQ-

— Pro — VaI — GIy — OH überführt. Dieses wii

309 681-2

10

dann zuerst mit dem geschützten Tripeptidazid erforderlichen Amino-Komponenten sind schon be-

Z—GIu(OBu¹)—His- -Phe—N₃, dann das erhaltene kannte Verbindungen. Die bei der Herstellung der

Dekapeptid nach Entfernen der N-terminalen Schutz- Heptadeka- bzw. Oktadekapeptide (1 bis 17 und 1 bis

gruppe mit dem geschützten Tetrapeptidazid 18) verwendeten Amino-Komponenten (15 bis 17 bzw.

BOC — Ser — Tyr — Ser — Met — N₃ acyliert. In 5 15 bis 18) können durch die Kondensation von

dieser Weise wird das an der N-terminalen Gruppe Z—Lys(BOC)—Lys(BOC)—N₃ mit H—Arg(NO₂)—

und an den Seitenketten geschützte Tetradekapeptid — NH₂ bzw. H — Arg(NO₂) — Arg(NO₂) — NH₂

(1 bis 14) der Formel erhalten werden. Bei der Herstellung der zur Synthese

der Nonadeka- bis Oktakozapeptide (1 bis 19 bis

BOC — Ser — Tyr — Ser — Met — io 1 bis 28) verwendeten Amino-Komponenten kann als

/~i ,ad t\ ti- r.u α τ gemeinsamer Ausgangsstoff der geschützte aktive

- GIu(OBu') - His - Phe - Arg - Try - Pentapeptidester Z - Lys(BOC) - Ly₈(BOC) -

— GIy — Lys(BOC) — Pro — Val — GIy — OH — Arg(NO₂) — Arg(NO₂) — Pro — OR' (worin R'

einen zur Bildung eines aktiven Esters geeigneten

erhalten. 15 Rest, z. B. den p-Nitrophenyl- oder Pentachlorphenyl-

Das Pentakozapeptid (15 bis 39) kann in vorteil- rest vertritt) verwendet werden. Diese Verbindung

hafter Weise derart hergestellt werden, daß man die wird bei der Synthese des Nonadekapeptids (1 bis 19)

bekannten Peptide H — GIu(OBu¹) — AIa — Phe — mit Ammoniak, in allen anderen Fällen mit dem ent-

— Pro — OH und Z — Ser—AIa — N₃ miteinander sprechenden, in geeigneter Weise geschützten Aminokondensiert und dann durch Hydrolyse des erhaltenen 20 säure- bzw. Peptidderivat in Reaktion gebracht. Die Produkts das neue Hexapeptid H — Ser — AIa — zur Herstellung der Oktakozapeptide (1 bis 28) ver-

— GIu(OBu') — AIa — Phe — Pro — OH herstellt, wendeten Amino-Komponenten konnten demgemäß welches dann in das ebenfalls neue Heptapeptid aus dem obenerwähnten geschützten aktiven Penta-Z — GIn — Ser — AIa — GIu(OBu¹) — AIa — Phe— peptidester derart hergestellt werden, daß man die

— Pro—OH übergeführt wird. Durch Verknüpfung 25 Nonapeptidderivate H —Val — Lys(BOC) — Val — dieses geschützten Heptapeptids mit dem bekannten — Tyr(OBu·) — Pro — ASp(OBu¹) — GIy — AIa — Tripeptidester H — Leu — GIu(OBu') — Phe — OBu¹ — Glu( OBu¹) — OBu¹ bzw. H — Val — Lys(BOC)— wird das neue Dekapeptid Z —Gin —Ser—Ala— —Val—Tyr(OBu·)—Pro—AsplOBu¹)—Ala—Gly— —GIu(OBu¹)-Ala—Phe—Pro—Leu—GIu(OBu¹)- -GIu(OBu¹I-OBu¹ mit dem geschützten aktiven

— Phe — OBu¹ hergestellt. Dieses wird zuerst mit 30 Pentapeptidester acyliert. Diese Nonapeptidderivate entsprechend geschützter Asparaginsäure, dann mit konnten durch die Kondensation von Z — Val — geschützter Glutaminsäure acyliert, wodurch die ent- -LyS(BOC)-VaI-Ty^OBu¹)-Pro—OR' (worin sprechenden neuen Undeka- bzw. Dodekapeptide R'für einen zur Bildungeines aktiven Esters geeigneten erhalten werden. Letzteres wird dann mit dem neuen Rest, z. B. für den Rest des N-Hydroxysuccinimids Tripeptid Z — Asp(OBu^l) — AIa — GIy — OH ver-35 steht) mit H—ASp(OBu¹J-GIy-AIa-GIu(OBu¹)-knüpft, wodurch ein neues Pentadekapeptid entsteht, — OBu¹ bzw H — ASp(OBu¹) — AIa — GIy — welches dann mit dem durch die Kondensation —GIu(OBu¹I-OBu¹ hergestellt werden. Der zur der Pentapeptide Z — Lys(BOC) — Lys(BOC) — Herstellung des Dotriakontapeptids (1 bis 32) ver-—Arg(NO₂)—Arg(NO₂)—Pro—OR (worin R einen wendete C-terminale Teil kann auch aus diesem p-Nitrophenyl-oder einen Pentachlorphenylrest ver- 40 geschützten Pentapeptidaktivester derart hergestellt tritt) und H — Val — Lys(BOC) — Val — Tyr(Bu') — werden, daß man das Tridekapeptidderivat (20 bis 32)

— Pro—OH erhältlichen neuen geschützten Deka- mit dem obenerwähnten Pentapeptidderivat acyliert. peptid acyliert wird. Durch Hydrogenolyse des auf Das Tridekapeptidderivat (20 bis 23) wurde aus dem diese Weise erhaltenen geschützten Pentakozapeptids geschützten Oktapeptidaktivester (20 bis 27) und aus wird dann das bisher unbekannte Pentakozapeptid- 45 dem Pentapeptidderivat (28 bis 32) hergestellt,
derivat der Formel IV, worin X = BOC, Y = Bu¹ Zur Reinigung der größermolekularen, nicht kri- und X' = H, erhalten. stallisierbaren Polypeptide werden in der Literatur

Man kann aber auch derart vorgehen, daß man das meistens äußerst komplizierte, mit Ionenaustauscherobenerwähnte Dodekapeptid mit dem durch die Chromatographie, Elektrophorese oder Gegenstrom-Reaktion des Pentapeptids Z — Val — Lys(BOC)— 50 Verteilung arbeitende Methoden anempfohlen. Bei —Val—Tyr(Bu')—Pro—OR' (worin R' für eine akti- der erfindungsgemäßen neuen Synthese wurde durcli vierende Gruppe, z. B. für einen Succinimidrest —Su die geeignete Wahl der Zwischenprodukte die Aussteht) mit dem neuen Tripeptid H — ASp(OBu¹) — schaltung dieser komplizierten Reinigungstnethoder

— AIa — GIy — OH erhaltenen neuen Oktapeptid ermöglicht; es können bei diesem Verfahren die ver verknüpft und so das neue Ikozapeptid Z — Val— 55 schiedensten Zwischenprodukte und sogar auch di< —Lys(BOC)—Val—Tyr(Bu')—Pro—Asp(OBu·)— geschützten Endprodukte durch eine einzige, generei —AIa—GIy—GIu(OBu¹)—ASp(OBu¹)—GIn—Ser— anwendbare Reinigungsoperation, durch eine einfache

— AIa — GIu(OBu¹) — AIa — Phe — Pro — Leu — an einer Silicagel-Säule ausgeführte chromatogra

— GIu(OBu') — Phe — OBu¹ erhält. Dieses wird phische Trennung in reinem Zustand isoliert werdet durch Entfernen der N-terminalen Schutzgruppe und 60 Der Maßstab dieser chromatographischen Operatioi durch Verknüpfen mit dem schon erwähnten Penta- kann nach Belieben vergrößert werden, somit kam peptid in das obenerwähnte geschützte Pentakoza- man diese Methode auch bei der Herstellung vo: peptid übergerührt, aus welchem dann in der oben größeren Mengen der Polypeptide mit gutem Erfol beschriebenen Weise durch Hydrogenolyse die ge- anwenden. Die an Silicagel durchgeführte chromate wünschte Komponente (15 bis 39) der Formel IV 65 graphische Trennung der geschützten Polypeptid (X = BOC, Y = Bu¹, X' = H⁺) erhalten wird. liefert Produkte von genügender Reinheit, wobi

Die zur Synthese der Tetradeka-, Pentadeka- und dann die durch Entfernen der Schutzgruppen erha Hexadekapeptide (1 bis 14, 1 bis 15 und 1 bis 16) tenen freien Peptide ohne jede weitere Reinigung i

chromatographisch reiner Form erhalten werden können.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die nachstehenden Beispiele näher veranschaulicht. Die einzelnen Zwischen- und Endprodukte sind in diesen Beispielen ebenfalls unter Anwendung der in der Peptidchemie üblichen abkürzenden Schreibweise angegeben. Außer den oben schon erwähnten üblichen Abkürzungen für die einzelnen Aminosäurereste werden auch die Schutzgruppen mit einer entsprechend abgekürzten Schreibweise angeführt:

BOC
Bu¹
NB
NP

Carbobenzyloxy- (C₆H₅CH₂OCO-)

tert.Butyloxycarbonyl-/(CH₃)₃COCO-/

tert.Butyl-/C(CH₃)₃/

p-Nitrobenzyl-

p-Nitrophenyl-

Pentachlorphenyl

Bei den in den Beispielen angegebenen Identifizierungsdaten sind die chromatographischen Rf-Werte auf verschiedene Lösungsmittelsysteme bezogen angegeben; die neben dem Symbol »Rf« stehenden Zahlen beziehen sich auf die folgenden Lösungsmittelsysteme :

1: Essigsäureäthylester— 60:20:6:11

Pyridin—Essigsäure—Wasser
2: Essigsäureäthylester— 60: 10:3: 5,5

Pyridin—Essigsäure—Wasser
3: Chloroform—Methanol— 60: 38 :10

Wasser

4: Chloroform—Methanol 90:10

5: Essigsäureäthylester— 40:20:6: 5.5

Pyridin—Ameisensäure—

Wasser
6: Butanol—Pyridin— 30:20:6:24

Essigsäure—Wasser
7: Essigsäureäthylester— 60:20:6:5,5

Pyridin—Ameisensäure—

Wasser
8: Chloroform—Methanol— 40:10:1

Wasser
9: Chloroform—Methanol— 60:26:5

Wasser

10: Chloroform—Methanol 80:15

11: Chloroform—Methanol 80:20

12: Essitfsäureäthylester— 240:20:6 :11

Pyridin—Essigsäure—Wasser

Als stationäre Phase wurde bei den chromatographischen Untersuchungen Kieselgel G nach Stahl/Merck verwandt.

Beispiel 1

Synthese des menschlichen Corticotropins
Schritt 1

Z—Ser—Ala—GIu(OBu¹)-Ala—Phe—Pro
(31 bis 36)

3,6 g (11,ImMoI) des geschützten Dipeptid-hydrazids Z—Ser—Ala—N₂H₃ (vgl J. S. H a r r i s. J. S. Bruton: .1. Biol. Chem.191, 143/1951) werden in 36 ml Dimethylformamid suspendiert, die Sus- 6s pension bei —30"C mit 5.55 ml 6N-Salzsäure versetzt, dann wird die Temperatur langsam erhöht. Der suspendierte Stoff löst sich etwa bei —20" C. Dann wird die Lösung unter —30° C abgekühlt und tropfenweise mit 2,2 ml 5molarer Natriumnitritlösung versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 15 Minuten bei — 20 bis —30°C gerührt, dann wird die wäßrige Lösung der Amino-Komponente zugesetzt; diese Lösung wird durch Auflösen von 4,92 g des freien Tetrapeptids GIu(OBu¹)-Ala—Phe—Pro in 20 ml Wasser, welches auch 1,33 ml (9,5 mMol)Triäthylamin enthält, hergestellt (vgl. S. Bajusz, T. Läzär: Acta Chim. Hung. 48, 111 [1966]). Nach Vermischen der beiden Lösungen läßt man die Temperatur langsam bis O⁰C steigen und läßt das Gemisch über Nacht stehen. Dann wird die Lösung mit Zitronensäure auf etwa pH = 3 angesäuert, worauf das entstandene Hexapeptid ausscheidet; es werden 5,65 g (73,5% der Theorie) Hexapeptid erhalten; F. 172 bis 173°C. Rf² 0,23 bis 0.33, Rf¹ 0,65 bis 0,75.
C₄₀H₅₄O₁₂N₆ (810,88).

Schritt 2

Ser—Ala—GIu(OBu¹)-Ala—Phe—Pro (31 bis 36)

5,8 g (7,15 mMol) des im Schritt 1 hergestellten geschützten Hexapeptids werden in 100 ml 80%iger Essigsäure gelöst und in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle hydriert. Das Foi tschreiten der Reaktion wird durch Chromatographie verfolgt. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, die Lösung verdampft, der Rückstand mit Methanol versetzt und wieder verdampft. Aus der methanolischen Lösung des Rückstandes scheidet sich das Produkt in kristalliner Form ab. Die erhaltene dicke Kristallsuspension wird mit Äther verdünnt, die Kristalle werden abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet. 4,3 g (89% der Theorie) des freien Hexapeptids werden erhalten; F. 200 bis 202°C. Rf¹O₁IS bis 0,20.

Schritt 3

-Gin—Ser—Ala—GIu(OBu¹)-Ala—Phe—Pro (30 bis 36)

4,3 g (6,35 mMol) des im Schritt 2 erhaltenen freien

Hexapeptids, 0,45 ml (6,35 mMol) Triäthylamin und 2,81g (7.OmMoI) Carbobenzoxy - glutamin -p-nilrophenylester werden in 13,0 ml Pyridin bei 50⁰C gelöst.

Das Reaktionsgemisch wird einen Tag stehengelassen.

dann wird das erhaltene gelartige Reaktionsprodukt

mit Äther, dann mit Zitronensäure verrieben und aus Methanol kristallisiert. Es werden 4,65 g (78% der Theorie) des geschützten Heptapeptids erhalten

F. 188 bis 190⁰C. Rf¹ 0,45 bis 0,52.
C₄₅H₆₂O₁₄N₈ (939,01).

Schritt 4

Z—Gin—Ser—Ala—GIu(OBu¹J-AIa-Phe—
— Pro—Leu—GIu(OBu¹)-Phe—OBu' (30 bis 39)

3,95 g {6,06 mMol) des geschützten Tripeptidesten Z—Leu—GIu(OBu¹)-Phe—OBu' (vgl. S. Bajusz T. L ä ζ ä r: Acta Chim. Hung. 48. 111 1966) werden in 50 ml Methanol gelöst und in Anwesenheit vor Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung dei Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und da; Filtrat verdampft. Das als Rückstand erhaltene Ό wird in 4 ml Dimethylformamid gelöst und die l.ösunt der in der nachstehenden Weise hergestellten Lösum der Anhydridkomponente zugesetzt.

4,55 g (4.84 mMol) des im Schritt 3 hergestellten geschützten Heptapeptids werden in 25 ml Dimethylformamid gelöst, mit 0,675 ml (4,82 mMol) Triäthylamin versetzt und auf -30⁰C abgekühlt. Der abgekühlten Lösung werden 0,49 ml (etwa 4,9 mMol) Chlorkohlensäureäthylester tropfenweise zugesetzt, das Gsmisch wird bei —20⁰C 10 Minuten gerührt und dann mit der in obiger Weise erhaltenen Lösung der Aminokomponente versetzt. Das Gemisch wird über Nacht stehengelassen, dann mit 0,5 ml Triäthylamin versetzt, mit etwa 100 ml Wasser verdünnt, der abgeschiedene Niederschlag wird abfiltrierl, mit Wasser neutral gewaschen, getrocknet, dann mit Äther gewaschen, zuletzt im Gemisch von 100 ml Methanol und 70 ml Wasser heiß gelöst und zum Kristallisieren stehengelassen. Das erhaltene Produkt wird abfiltriert, mit 60%igem wäßrigem Methanol gewaschen und getrocknet. Es werden 5,9 g (84% der Theorie) des geschützten Dekapeptids erhalten; F. 213 bis 214°C. Rf⁴ 0,23 bis 0.30. Rl¹² 0.28 bis 0,35.

C₇₃H₁₀₅O₁₉N₁₁ (1440,66).

Schritt 5
Z —Asp(OBu') —Gin —Ser —Ala— _2J

— GIu(OBu¹)-Ala—Phe—Pro —Leu —

— GIu(OBu¹)-'Phe — OBu¹ (29 bis 39)

6,48 g (4,5 mMol) des im Schritt 4 erhaltenen geschützten Dekapeptids werden in 200 ml Dimethylformamid gelöst, mit 4,5 ml N-Salzsäure versetzt und in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, die Lösung verdampft, mit einem Gemisch von Äther und Petroläther verrieben, mit demselben Gemisch und dann mit Äther gewaschen und getrocknet. Es werden 5.62 g (87% der Theorie) des freien Dekapeptid-hydrochlorids erhalten; ΚΓ 0.K! h,.s 0.23.

Das in obiger Weise erhaltene freie Dckapepudhydrochlorid (4,03 mMol) wird in 12.5 ml Dimethylformamid gelöst, mit 0.565 ml (4.03 mMol) Triäthylamin, dann mit 2,7 g (6.05 mMol) u-Carbobenzoxy- ß - tert.butyl - asparaginsäure - ρ - nitrophenylesier versetzt und 40 Stunden bei 50 C stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wird mit Äther verrieben, filtriert. das als Niederschlag erhaltene rohe Produkt mit Äther gewaschen, in 130 ml Äthanol gelöst, die Lösung mit Aktivkohle behandelt, die Aktivkohle wird abfiltriert, mit 26 ml heißem Methanol nachgewaschen und das vereinigte methanolische Filtrai mit 105 ml heißem Wasser verdünnt. Das ausgeschiedene Produkt wird nach Abfiltrieren und Waschen aus 130 ml Methanol und 100 ml Wasser noch einmal umgefüllt. Es werden 4,9 g (75,5% der Theorie) geschütztes Undekapeptid erhalten; F. 211 bis 213¹X. Rf¹² 0,4 bis 0,45, Rf* 0,27 bis 0,33.

C₈₁H₁₁₈O₂₂N₁₂ (1611.85).

60

Schritt 6

Z — GIu(OBu¹) — Asp(OBu') — GIn — Ser —

— AIa — GIu(OBu¹) — AIa — Phe — Pro —

— Leu — GIu(OBu¹) — Phe — OBu¹ (28 bis 39)

4,6 g (2,85 mMol) des im Schritt 5 erhaltenen gc- schützten Undekapeptids werden in 250 ml 80%iger Essigsäure in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, die Lösung verdampft, der Rückstand mit Äther verrieben, filtriert und getrocknet. Es werden 4,25 g (97% der Theorie) am N-Terminale freies Undekapeptid erhallen. Dieses Produkt wird in 10 ml Dimethylformamid mit 2,1 g (4,5 mMol) α - Carbobenzoxy - ■/ - terl.butyl - glutaminsäurep-nitrophenylester 20 Stunden bei 50^c C umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird mit Äther verrieben, filtriert, der Niederschlag mit Äther gewaschen und getrocknet. Das in dieser Weise erhaltene rohe Produkt wird in 20 ml eines Gemisches von Essigester. Pyridin, Essigsäure und Wasser (60: 10:3 : 5) ausgekocht, dann in Eiswasser gekühlt, das ausgeschiedene gelartige Produkt wird abfiltriert, zweimal mit je 2 ml des obigen Lösungsmittelgemisches, dann mit Äther gewaschen und getrocknet. Es werden 3,48 g (70% der Theorie) geschütztes Dodekapeptid erhalten: F. 201 bis 203"CRf¹² 0.46 bis 0.53. Rf⁴ 0.47 bis 0.52. C₉₀H₁₃₃O₂₅N₁₃ (1797,07).

Schritt 7

GIu(OBu¹) — Asp(OBu') — GIr. — Ser — AIa — — GIu(OBu¹) — AIa — Phe — Pro — Leu — -GIu(OBu¹)- Phe— OBu'.HCl (28 bis 39)

2,34 g (1,3 mMol) des im Schritt 6 erhaltenen geschützten Dodekapeptids werden in 20 ml Dimethylformamid, welchem auch 1,3 ml Nl Salzsäure zugesetzt wurde, in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator durch Filtrieren entfernt, die Lösung verdampft, der Rückstand mit etwa 10 ml 15%iger wäßriger Kochsalzlösung verrieben, filtriert, mit wenig kaltem Wasser gewaschen und getrocknet. Es werden 2,11 g (95.5% der Theorie) freies Dodekapeptidhydrochloriu erhalten: Rf¹⁰ 0.48 bis 0,53. Rf 0.06 bis Ö. 15.

C^H₁₂₈O₂₃N₁₃U 11699,40)

Schritt 8

Z — AIa — GIy — ONB (26 bis 27) (NB = p-Nitrobenzyl)

2,80 g (9,65 mMol) H — GIy — ONB- HBr (vgl. H.Schwarz. K.Arakawa: J. Am. Chem. Soc. 81, 5691 1959) werden in einem Gemisch von 5 ml Wasser und 15 ml Essigester suspendiert und bei 0° C mit 15 ml kalt gesättigter Kaliumcarbonatlösung zusammengeschüttelt. Nach Trennen der Phasen wird die wäßrige Schicht noch zweimal mit Essigester ausgeschüttelt, die Essigester-Lösungen werden vereinigt, getrocknet und bei Zimmertemperatur im Vakuum verdampft, es werden 2,0 g (100% der Theorie) kristalliner freier Glycin-p-nitrobenzylester erhalten, welcher ohne Umkristallisieren zur weiteren Synthese verwendet werden kann.

2.0 g (9,5 mMol) Glycin - ρ - nitrobenzylester und 2,13 g (9,5 mMol) Carbobenzoxy - alzanin werden in 20 ml Methylenchlorid gelöst. Die Lösung wird auf 0⁰C abgekühlt und mit einer Losung von 1,96 g (9,5 mMol) Dicyclohexyl-carbodiimid in 4 ml Methylenchlorid versetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde bei 0⁰C und eine weitere Stunde bei Zimmertemperatur gerührt, dann über Nacht stehengelassen. Das entstandene Dicyclohexylharnstoff (2,0 g, 93% der Theo rie) wird durch Filtrieren entfernt, das Filtrat mit ver-

dünnter Salzsäure, mit Wasser, daon mit 5%iger Natriumbicarbonatlösung und zuletzt wieder mit Wasser gewaschen, getrocknet und verdampft. Der Rückstand wird aus dem Gemisch von 20 ml Essigester und 20 ml Petroläther kristallisiert. Der erhaltene geschützte Dipeptidester (3,50 g) wird aus einem Gemisch von Methanol und Wasser noch einmal umkristallisiert; es werden 2,0 g (76% der Theorie) geschützter Dipeptidester erhalten; F. 104 bis 106⁰C Rf⁷ 0,5 bis 0,6.

Analyse: C₂₀H₂₁O₇N₃ (415,396)

Berechnet ... C 57,80, H 5,10, N 10,10%;
gefunden .... C 57,9, H 5,4, N 10,1%.'

Schritt 9
AJa — GIy — ONB · HBr (26 und 27)

4,0 g (9,6 mMol) des im Schritt 8 erhaltenen geschützten Dipeptidesters werden in 5 ml Eisessig gelöst und mit 15 ml etwa 4 N Bromwasserstoffsäure in Eisessig versetzt. Das Gemisch wird bei Zimmertemperatur bis zum Aufhören des Brausens (etwa 1 Stunde) stehengelassen. Das Produkt wird durch Zugabe von abs. Äther gefällt, verrieben, filtriert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Das erhaltene 3,30 g rohe Produkt wird aus 20ml Äthanol umkristallisiert; es werden 3,0 g (86% der Theorie) freier Dipeptidesler erhalten. Rf¹ 0,6 bis 0,7.

C₁₂H₁₅O₅N₃ HBr (363,188).

Analyse:

Berechnet... C 39,80, H 4,45, N 11,61, Br 22.05%; gefunden ... C40,1, H4,8, N 11,6, Br22,25%.

Schritt 10
Z — ASp(OBu¹) — AIa — GIy — ONB (25 bis 27)

2,40 g (7,5 mMol) Carbobenzoxy - />' - tert.butylasparaginsäure und 2,70 g (7,5 mMol) im Schritt 9 erhaltenes Dipeptidesterhydrobromid werden in 8 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung auf 0^r C abgekühlt, mit 1,54 g (7,5 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid und nach dessen Auflösung mit 1,04 ml (7,5 mMol) Triäthylamin versetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde bei 0⁰C und eine weitere Stunde bei Zimmertemperatur gerührt. Am nächsten Tag wird das Reaktionsgemisch verdampft, der Rückstand in Essigester gelöst, die Lösung mit N Zitronensäurelösung, dann mit Wasser mit 0,2 N Kaliumbicarbonatlösung und zuletzt wieder mit Wasser ausgeschüttelt. Die organische Lösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und verdampft. Der Rückstand wird aus einem Gemisch von Essigester und Petroläther umkristallisiert. Es werden 2,8 g (64% der Theorie) geschützter Dipeptide$ter erhalten; F. 122 bis 124°C. Rf⁷ 0,2 bis 0,3.

C₂₈H₃₄O₁₀N₄ (586,588)

Schritt 11
Asp(OBu') —Ala —GIy (25 bis 27)

!,Og (1,7 mMol) des im Schritt 10 erhaltenen geschützten Dipeptidesters wird in 15 ml Methanol, in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle hydriert. Bis zur Beendigung der Reaktion scheidet sich das freie Tripeptid aus; dieses Produkt wird durch Zugabe von Wasser wieder in Lösung gebracht, dann wird der Katalysator durch Filtrieren entfernt, nachgewaschen und das Filtrat verdampft. Der kristalline Rückstand wird aus einem Gemisch von Wasser und Aceton umkristailisiert. Es werden 0,40 g (74% der Theorie) freies Tripeptid erhalten ;Zers. 194⁰CRi¹O₅IO bis 0.15.

Ana' se: C₁₃H₂₃O₆N₃ (317,38)

Be.echnet ... C49,20, H 7,30, N 13,24%;
ίο gefunden... C 49,4, H 7,5, N 13,3%.

Schritt 12
Z—Asp(OBu') —Ala —GIy (25 bis 27)

0,9 g (2,85 mMol) des im Schritt 11 erhaltenen freien Tripeptids werden in 25 ml 5%iger Natriumbicarbonaiiösung bei O⁰C gelöst und in kaltem Zustand unter Rühren tropfenweise mit 0,64 ml (3 mMol) etwa 80%igem Carbobenzoxychlorid versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur so lange gerührt, bis chromatographisch kein freies Tripeptid mehr nachgewiesen werden kann (etwa 48 Stunden). Die Lösung wird dann mit Äther ausgeschüttelt und mit Zitronensäure auf pH = 3 angesäuert. Das ausgeschiedene öl wird mit Essigester extrahiert, der vereinigte Essigesterextrakt mit Wasser gewaschen, getrocknet und verdampft. Der Rückstand wird mit Petroläther verrieben; es werden 1,15g (90% der Theorie) amorphes geschütztes Tripeptid erhalten.

Rf 0,7 bis 0,8.

C₂₁H₂₉O₈N₃ (451,46)

Schritt 13

Z- ASp(OBu¹) — AIa — GIy — GIu —

— (OBu¹)-AsD(OBu¹) — Gin — Ser — Ala —

— GIu(OBu¹) — Ala — Phe — Pro — Leu —

— GIu(OBu') — Phe — OBu¹ (25 bis 39)

342 mg (0,76 mMol) des im Schritt 12 erhaltenen geschützten Tripeptids werden in 5 ml Dimethylformamid gelöst und zuerst mit 0,106 ml (0,76 mMol) Triäthylamin, dann bei —10° C mit 0,76 ml (etwa 0,76 mMol) Chlorkohlensäureäthylester versetzt. Das Gemisch wird 15 Minuten gerührt, dann mit einer Lösung von 937 mg (0,75 mMol) des im Schritt 7 erhaltenen Dodekapeptid-hydrochlorids und 0,077 ml (0,55 mMol) Triäthylamin in 2,8 ml Dimethylformamid tropfenweise versetzt. Das Gemisch wird über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen, dann mit Wasser verdünnt, der ausgeschiedene Niederschlag wird abgetrennt, mit Wasser gewaschen, getrocknet und dann auch mit Äther gewaschen. D?s erhaltene rohe Produkt wird aus dem Gemisch von 45 ml Methanol und 10 ml Wasser umgefällt, filtriert und getrocknet. Es werden 805 mg (70% der Theorie) geschütztes Pentadekapeptid erhalten; Ri⁴O₅Ie bis 0,23; Rf⁵O₁OS bis 0,70.
C₁₀₃H₁₅₄O₃₀N₁₆ (2096,39)

Schritt 14

H— Arg(NO₂) — Arg(NO₂)—Pro— OH · HBr (17 bis 19)

6,5 g geschütztes Tripeptid Z — Arg(NO₂) — — Arg(NO₂) — Prc — OH (vg. K. Slu'rni, R.Geiger, W. Si ed el, Ber. 96, 609 l_l%3])

werden in 25 ml Eisessig gelöst, mit 25 ml 4 N-Brom-(vasserstoffsäurelösung in Eisessig versetzt und stehengelassen. Nach Aufhören des Brausens wird durch Zugabe von 200 ml Äther das Tripeptid-hydrobromid gefällt, der Äther dekantiert, der Niederschlag auf diese Weise mit Äther, dann mit Isopropanol gewaschen, abfiltriert, am Filter mit Isopropanol noch einmal gewaschen und getrocknet. Es werden 5,4 g (90% der Theorie) Tripeptidhydrobromid erhalten; Rf* 0,0; Rf H₂O 0,5 bis 0,6.

Schritt 15
Z — Lys(BOC) — Lys(BOC) — N₂H₃ (15 bis 16)

8,6 g des Dipeptidesters Z — Lys(BOC) — — Lys(BOC) — OMe (vgl. R. Schwyzer und W. R i 11 e 1: HeIv. Chim. Acta 44, 159 1961) werden in 15 ml heißem Methanol gelöst, mit 6 ml 73%igem Hydrazinhydrat versetzt und 4 Stunden unter Rückfluß gekocht. Nach Beendigung der Reaktion wird die Lösung eingeengt, der kristalline Rückstand mit Wasser verrieben und getrocknet. Es werden 7.8 g (90% der Theorie) kristallines geschütztes Dipeptidhydrazid erhalten; F. 126 bis 128°C. Rf 0,50 bis 0,60 (beim Ester 1,0).

Analyse: C₃₀H₅₀O₈N₆ (622,75)

Berechnet ... N 13,5%;
gefunden N 13,5%.

Schritt 16

Z— Lys(BOC)— Lys(BOC) — Arg(NO₂) —
— Arg(NO₂) — Pro — OH (15 bis 19)

7,8 g des im Schritt 15 erhaltenen Dipeptidhydrazids Z—Lys(BOC) — LyS(BOC)-N₂H₃ werden in 125 ml Dimethylformamid gelöst und bei etwa — 10°C mit 50 ml 0,5 N-Salzsäurelösung, dann mit 12,5 ml 1 M-Natriumnitritlösung versetzt. Das Gemisch wird 15 Minuten bei etwa — 10^cC gerührt, dann mit 1,0 ml Triäthylamin neutralisiert und mit 250 ml gekühltem Chloroform und 250 ml Wasser verdünnt. Nach Abtrennen der Chloroformphase wird die wäßrige Schicht in Chloroform noch einmal gewaschen, die vereinigten Chloroform-Lösungen werden mit kaltem Wasser gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Diese Azidlösung in Chloroform wird dann der durch Auflösen von 7,5 g des im Schritt 14 erhaltenen Tripeptidhydrobromids in 17 ml Dimethylformamid und Zugabe von 4,62 ml Triälhylamin erhaltenen Lösung zugesetzt. Das Chloroform wird aus dem Gemisch im Vakuum abdestiilieri, und das zurückgebliebene Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur 2 Tage stehengelassen. Dann wird auch das Dimethylformamid abdestilliert und der Rückstand an einer Säule von 250 g Silicagel mit einem Gemisch von Essigester, Pyridin. Essigsäure und Wasser (60:10:3:5,5) Chromatographien. Die das reine geschützte Pentapeptid enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, verdampft und bei 0 C mit N-Salzsäurc und mit Wasser verrieben. Die Waschflüssigkeiten werden durch Dekantieren entfernt. Das als Rückstand erhaltene dicke öl wird in Chloroform gelöst, die Lösung über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und verdampft. Nach Veneibcn des Verdampfungsrückstandes mit Äther werden 5.1 g (42% der Theorie) geschütztes Pentapeptid erhalten. Rf¹ 0.45 bis 0,55; L«]i = -¹^ (c = 1. in Methanol).

Analyse: C₄₇H₇₇O₁₆N₁₅ (1108,21)

Berechnet ... C 51,6, H 6,95, N 18,9%;
gefunden ...: C 51,5, H 7,0, N 19,0%.

Schritt 17

a) Z — Lys(BOC) — Lys(BOC) — Arg(NO₂) —
— Arg(NO₂) — Pro — ONP (35 bis 19)
(NP = p-Nitrophenyl)

0,65 g des im Schritt 16 erhaltenen geschützten Pentapeptids werden in 3,OmI Dimethylformamid gelöst und die Lösung zuerst mit 0,082 ml Triäthylamin, dann bei -10¹¹C mit 0,059 ml Chlorkohlensäureäthylester versetzt. Das Gemisch wird unter Kühlen 10 Minuten stehengelassen, dann mit 0,24 g p-Nitrophenol versetzt und über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen. Das Dimethylformamid wird dann abdestilliert und der Rückstand an einer Säule von 14 g Silicagel mit einem Gemisch von Chloroform und Methanol (9:1) Chromatographien. Die das Hauptprodukt enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, verdampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Es werden 0,47 g (65% der Theorie) geschützter Pentapeptid-p-nitrophenylester erhalten. Rf⁴ 0,3 bis 0,4; [_«]' = -20° (c = 1, in Methanol)

Analyse: C₅₃H₈₀O₁₈N₁₆ (1229,30)

Berechnet
gefunden .

N 18,2%;
N 18,1%.

b) Z—Lys(BOC)—Lys(BOC) —Arg(NO₂) —
— Arg(NO₂) —Pro — OPCP (15 bis 19)
(PCP = Pentachlorphenyl)

1,62 g des im Schritt 16 erhaltenen geschützten

Pentapeptids, 0,45 g Pentachlorphenol und 0,4 g Dicyclohexyl-carbodiimid werden in 4,0 ml Dimethylformamid gelöst. Das Gemisch wird über Nacht stehengelassen, dann wird der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff durch Filtrieren entfernt, aus dem

Filtrat das Dimethylformamid verdampft, der Rückstand mit Äther verrieben und in 1 ml eines Gemisches von Chloroform, Aceton und Wasser (40:40:1) gelöst, dann auf einer Säule von 50 g Silicagel mit einem Gemisch von Chloroform, Aceton und Wasser Chromatographien. Die den aktiven Ester in reinem Zustand enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, verdampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Es werden 1,4 g (70% der Theorie) geschützter Pentapeptidester erhalten. Rf* 0,55 bis 0,65. Rf im System Chloroform — Aceton — Wasser (40:40:10) 0,45 bis 0,55.

Analyse: C₅₃H₇₆O₁₆N₁₅Cl₅ (1356,54)

Berechnet ... N 15,4, Cl 13,05%;
gefunden .... N 15,35, Cl 13,1%.

Schritt 18

Z — Tyr(Bu')— OSu (23)

175 g des feingepulverten Dicyc! ..hexylammoniumsalzes von Z—Tyr(Bu')—OH werden in 1 1 Äther suspendiert undnachZugabeeinerLösungvon 17.5mlconc.

Schwefelsäure in 1250 ml Wasser bis zur vollständigen Auflösung geschüttelt. Die ätherische Lösung wird dann getrocknet und verdampft, das als Rückstand erhaltene öl in 625 ml wasserfreiem Dioxan gelöst und die Lösung unter Eiswasserkühlung mit 33,25 g N-Hydroxysuccinimid und 65,7 g Dicyclohexyl-carbodiimid versetzt Das Gemisch wird über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen. Der abgeschiedene Dicyclohexylharnstoff wird durch Filtrieren entfernt, das Dioxan im Vakuum abdestiiliert und das als Rückstand erhaltene öl mit Petro'äther verrieben. Nach Umkristallisieren des erhaltenen rohen Produkts aus 180 ml Methanol werden 80 g (54% der Theorie) des aktiven Esters erhalten; F. 118 bis 120°C.

Schritt 19
H — Ty₁-(Bu¹) — Pro — OH (23 und 24)

160 g des im Schritt 18 erhaltenen aktiven Esters Z — Tyr(Bu') — OSu werden in 2 1 wasserfreiem Dioxan gelöst, diese Lösung mit einer Lösung von 50,3 g Prolin und 36,7 g Natriumbicarbonat in 1,51 Wasser vermischt und 2 Stunden bei Zimmertemperatür gerührt. Dann wird das Gemisch in Vakuum auf etwa 11 eingeengt, der Rückstand mit 600 ml Wasser verdünnt und mit 11 Essigester ausgeschüttelt. Die abgetrennte Essigesterlösung wird zuerst mit 8%iger Natriumbicarbonatlösung, dann mit Wasser gewaschen. Die vereinigten wäßrigen Lösungen werden mit Zitronensäure auf pH = 3 angesäuert, das ausgeschiedene ö! ixiii Essigester extrahiert, die Essigester lösung getrocknet und im Vakuum verdampft. Das als Rückstand erhaltene rohe Carbobenzyloxy-dipeptid wird in 2,51 Äthanol gelöst und in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle einer Hydrogenolyse unterworfen. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird die Lösung im Vakuum verdampft. Es werden 90 bis 95 g (79,83% der Theorie) amorphes Dipeptid als Rückstand erhalten, welches dann aus Wasser kristallisiert wird.

Schritt 20
H — VaI — Tyr(Bu') — Pro — OH (22 bis 24)

21,5 des im Schritt 19 erhaltenen Dipeptids H—Tyr(Bu')—Pro—OH und 9,05 ml Triäthylamin werden in 250 ml wasserfreiem Dioxan gelöst, und dann werden 17,9 g aktiver Valinester Z—VaI— OSu der Lösung zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bis zum nächsten Tag bei Zimmertemperatur stehengelassen, dann im Vakuum verdampft und der Rückstand im Gemisch von 300 ml 8%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und 150 ml Äther gelöst. Die wäßrige Phase wird abgetrennt, mit Zitronensäure auf pH = 3 angesäuert und das ausgeschiedene öl wird mit Chloroform extrahiert. Der Chloroformextrakt wird getrocknet und verdampft. Das als Rückstand erhaltene rohe Carbobenzyloxy-tripeptid wird in 250 ml 80%iger Essigsäure gelöst und in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle einer Hydrogenolyse unterworfen. Nach Abfiltrieren des Katalysators und Abdestillieren des Lösungsmittels wird das als Rückstand erhaltene rohe Tripeptid aus 1.1 1 wasserfreiem Methanol umkristallisiert. Hs werden insgesamt 13.7 g (62% der Theorie) freies Tripeptid erhalten: F. I34~bis 136-C.

Schritt 21
Ζ —Lys(BOC) — OSu (21)

67,3 g Z—Lys(BOC)—OH werden in 300 ml was-

serfreiem Dioxan gelöst, und die mit Eiswasser

gekühlte Lösung wird mit 20,4 g N-Hydroxysuccin-

imid und 37,0 g Dicyclohexyl-carbodümid versetzt.

Das Gemisch wird 1 Stunde unter Kühlung, dann 3 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen, dann

wird der ausgeschiedene Dicycjohexylharnstoff durch

Filtrieren entfernt und das Filtrat verdampft. Das als Rückstand erhaltene rohe Produkt wird aus dem Gemisch von 350 ml wasserfreiem Benzol und 250 ml Petroläther umkristallisiert Es werden 59 g (70%

!5 der Theorie) aktiver Ester erhalten; F. 93 bis 96⁰C.

Schritt 22

H — Lys(BOC) — VaJ — Tyr(Bu') — Pro — OH (21 bis 24)

53,6 g des im Schritt 20 erhaltenen Tripeptids Val—Tyr(Bu')—Pro—OH und 17,2 g Triäthylamin werden in 600 ml Dioxan gelöst und die Lösung mit 59,1 g aktiver Lysinester Z—Lys(ßOC)—OSu versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen, dann im Vakuum verdampft, der Rückstand in 800 ml Essigester gelöst, die Lösung mit Wasser, dann mit 10%iger Zitronensäurelösung und zuletzt wieder mit V/asser ausgeschüttelt. Die Essigesterlösung wird nach Trocknen im Vakuum verdampft, der Rückstand in 1 1 80%iger Essigsäure gelöst und in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle einer Hydrogenolyse unterworfen. -Das nach Abfi¹.-trieren des Katalysators und Verdampfen des Lösungsmittels erhaltene rohe Produkt wird aus 4,21 wasserfreiem Methanol umkristallisiert; es werden insgesamt 59,5 g (73% der Theorie) Tetrapeptid erhalten; F. 192 bis 193° C.

Schritt 23

Z — VaI — Lys(BOC) — VaI — Tyr(Bu') —

— Pro — OH (20 bis 24)

In 410 ml wasserfreiem Dimethylformamid werden unter Schütteln 41,0 g des im Schritt 22 erhaltenen Tetrapeptids H — Lys(BOC) — VaI — Tyr(Bu^l) — — Pro — OH und 8,6 ml Triäthylamin gelöst, und dann werden 21,5 g aktiver Valinester Z—VaI—OSu zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bis zum nächsten Tag bei Zimmertemperatur stehengelassen, dann im Vakuum verdampft, der Rückstand in 800 ml Chloroform gelöst, dann wird die Lösung mit 10%iger Zitronensäurelösung und dann mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und das Chloroform abdestiiliert Nach Verreiben des Rückstandes mit Petroläther werden 51,0 g (93% der Theorie) geschütztes Pentapeptid erhalten: F. 123 bis 126' C.

Schritt 24

H — VaI — Lys(BOC) — VaI — Tyr(Bu') —

— Pro — OH (20 bis 24)

1.4 g (1.565 mMol) des im Schritt 23 erhaltenei geschützten PenU'.peptids werden in 30 ml 80%ige Salzsäure «elöst und in Anwesenheit von Palladium

Lktivkohle einer Hydrogenolyse unterworfen. Nach leendigung der Reaktion wird der Katalysator durch nitrieren entfernt und das Filtrat verdampft. Der 'erdampfungsrückstand wird mit 10 ml Methanol ersetzt and zur Kristallisierung stehengelassen. Die rhaltenen Kristalle werden abfiltriert und mit kaltem Methanol gewaschen. Es werden -0,785 g (66% der Theorie) freies Pentapeptid erhalten; F. .102 bis 205⁰C. C₃₉H₆₄O₉N₆ (760,95)

IO

Schritt 25

Z —Lys(BOC) —Lys(BOC) —Arg(NO₂) —
—Arg(NO₂)—Val—Lys(BOC)—Val—
-TyT(Eu¹)-Pro (15 bis 24) '⁵

481mg (0,63 mMol) des im Schritt 24 erhaltenen Pentapeptids, 841 mg (0,62 mMol) ds im Schritt Π erhaltenen geschützten aktiven Pentapeptidesters Z—Lys(BOC)—Lys(BOC)—Arg(NO₂)—Am(NO₁)- ao —Pro— ONP und 0,088 ml (0,63 mMol) Triäthylamin werden in 3 ml Dimethylformamid bei 50 C gelöst. Das Reaktionsgemisch wird 8 Stunden stehengelassen, dann wird das Produkt mit Äther gefällt, mit Zitronensäurelösung verrieben und getrocknet. Das rohe Produkt wird im Gemisch Essigester—Pyridin—Essigsäure—Wasser 60: IG: 3 : 5,5 an einer Silicagel-Säule chromatographiert. Es werden 848 mg (74% der Theorie) geschütztes Dekapeptid erhalten; Γ. 167 bis 170⁰C. Rf² 0,30 bis 0.36; Rf¹⁰ 0.10 bis 0,18.

C₈₈H₁₃₉O₂₄N₂₁ (1851,14)

Schritt 26

Z — Lys(BOC) - Lys(BOC) — Arg(NO₂) —

— Arg\NO₂) — Pro — VaI — Lys(BOC) —

— Val —Tyr(Bu')—Pro—OPCP (15 bis 24)

841 mg (0.453 mMol) des im Schritt 25 erhaiieiien geschützten Dekapeptids und 145 mg (0,545 mMol) Pentachlorphenol werden in 2.0 ml Dimethylformamid gelöst, und der mit Eiswasscr gekühlten Lösung werden 144 mg (0.695 mMol) Dicyclohexyl-carbodiimid zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 2 Tage stehengelassen, dann wird der ausgeschiedene Harnstoff abfillriert, mit Dimethylformamid nachgewaschen, die vereinigte Dimethylfonnamidlösung verdampft, und dann wird die konzentrierte acetonische Lösung des Rückstandes auf eine Silicagel-Säulc aufgetragen. Die Säule wird mit Aceton tluiert, wobei die nicht reagierte Säure an der Säule gebunden bleibt. Die erhaltene acetonische Lösung des Esters wird verdampft, der Rückstand mit Äther verrieben, gewaschen und getrocknet. Es werden 704 mg (74% der Theorie) geschützter aktiver Dodekapeptidester erhalten. Rf² 0.80 bis 0,87; Rf¹- 0,24 bis 0,33; Rf⁰ 0,79 bis 0,86.

C₉₂H₁₃₈O₂₄N₂₁Cl₅ (2099.48)

Schritt 27
Lys(BOC) —Lys(BOC) —Arg —Arg—Pro —

— VaI — Lys(BOC) — VaI — TyrtBu¹) — Pro —

— Asp(OBu') — AIa — GIy — GIu(OBu¹) —

— Asp(OBu') — GIn — Ser — AIa —

— GIu(OBu¹)-Ala — Phe — Pro — Leu —

— GIu(OBu¹) — Phe — OBu¹ (15 bis 39)

35 600 mg (0,286 mMol) des im Schritt 13 erhaltenen geschützen Pentadekapeptids werden in 20 ml Essigsäure in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Kata lysator abfiltriert, das Fihrat verdampft, der Rückstand mit Äther verrieben, filtriert und getrocknet. Es werden 490 mg (85% der Theorie) Pentadekapeptid mit freiem N-Terminale erhalten. Rf¹ 0,50 bis 0,55; Ri¹⁰ 0,25 bis 0,30.

Das in obiger Weise erhaltene Produkt (0,242 mMol) wird zusammen mit 515 mg (0,242 mMol) des im Schritt 26 erhaltenen geschützten aktiven Dekapeptidesters in 3_;0 ml Dimethylformamid gelöst und 48 Stunden bei 50^cC reagieren gelassen. Das Reaktionsgemisch wird in Äther verrieben, dann wird das rohe Produkt aus 70%igem wäßrigem Methanol dreimal umgefälh und zuletzt mit Aceton verrieben. Es werden 460 mg (50¹: ο der Theorie) geschütztes Pentakozapeptid erhalten. Rf² 0.42 bis 0.47; Rf¹⁰O₅SS bis 0,60.

3,66 me (0,00965 mMol) dieses geschützten Pentakozapepüds werden in 100 ml 80%iger Essigsäure in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion (was daraus erkennbar ist, daß am Chromaiogramm nur der Fleck Rf¹ 0,23 bis 0.27 sichtbar ist) wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat verdampft. Der Verdampfungsrückstand wird in Eiswasser gekühlt, dann mit 10 ml 0,1 N-SaIzsäure verrieben, mit 10 ml 15%iger Kochsalzlösung versetzt, filtriert, mit kaltem Wasser gewascher, und getrocknet. Es werden 225 mg (63% der Theorie) Pentakozapeptid-trihydrochlorid erhalten. Rf 0,23 bis 0.27; Rf 0,34 bis 0.40.

Q₇₃H₂₈₄O₄₅N₃₅Cl₃ (3679,65)

Schritt 28

Z - Try - GIy — Lys(BOC) — Pro — VaI —
GIy — OEt (9 bis 14)

4,95 g Tetrapeptidester Z — Lys(BOC) — Pro — — VaI — GIy — OEt (R. Schwyzer und W. R i 11 e 1: HeIv. Chim. Acta 44, 159 1961) werden in Äthanol gelöst und in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle zum Abspalten 4er Carbobenzoxy-Schutzgruppe hydrogenolysiert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat verdampft. Als Rückstand wird der am N-Terminale freie Tetrapeptidester (Ri¹ 0,40 bis 0,50) erhalten, dieses wird dann in 7,5 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösunt dem in der nachstehenden Weise hergestellten gemischten Anhydrid zugesetzt.

2,95 g Dipeptid Z—Try—Gly—OH (K.Hofmann, M. E. Woolner, G. Spühler und E. T. S c h w a r ι ζ: J. Am. Chem. Soc. 80, 1486/1958) werden in 7,5 ml Dimethylformamid gelöst, der Lösung werden 1.05 ml Triäthylamin und nach Abkühlen auf -10'C 0,99 ml Chlorkohlensäureisobutylester zugesetzt. Nach 15 Minuten Rühren wird dann dem in dieser Weise erhaltenen gemischten Anhydrid die

obige Tetrapeptidesterlösung zugesetzt. Die vereinigten Lösungen werden über Nacht stehengelassen, dann verdampft und der Rückstand in Essigester gelöst. Die Essigeslerlösung wird bei 0^cC mit verdünnter Salzsäure, dann mit Wasser, mit 10%iger

f>5 Natriumcarbonatlösung und zuletzt wieder mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und verdampft. Der Rückstand wird mit Äther verrieben, filtriert und getrocknet. Der rohe

geschützte Hexapeptidester wird in wasserfreiem Essigsäureäthylester unter Kochen gelöst, dann wird nach dem Abkühlen der Lösung das abgeschiedene Produkt filtriert, mit kaltem wasserfreiem Essigsäureäthylester gewaschen und getrocknet. [«];·■ = —50" (c=l, in Äthanol). Rf" 0,13 bis 0,22, Rf⁴ 0.48 bis 0,59. Nach Solvolyse mit Trifluoressigsäurc: Rf¹ 0,44 bis 0,50.

Analyse: C₄₆H₆₄O_nN₈ (905,04)

Berechnet ... C 61,05, H 7,13, N 12,4%;
gefunden .... C 61,05, H 7,35, N 12.4%.

Schritt 29

Z — Arg — Try — GIy — Lys(BOC) — Pro —
— VaI — GIy — OEt · HCl (8 bis 14)

3,5 g des im Schritt 28 erhaltenen geschützten Hexapeptidesters werden zum Abspalten der Carbobenzoxy-Schutzgruppe in äthanolischer Lösung in Anwesenheitvon Palladium-Aktivkohlehydrogenolysiert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat verdampft. Das als Rückstand erhaltene öl (Rf¹ 0,54 bis 0,64) wird zusammen mit 1,33 g Carbobenzoxy-L-arginin-hydrochlorid im Gemisch von 3,9 ml Pyridin und 3,9 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung mit 1,2 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen. Nach Beendigung der Reaktion wird der Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, das FiI-traf verdampft, der Rückstand in Chloroform gelöst, die Lösung bei 0⁰C mit verdünnter Salzsäure, dann mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und verdampft. Der Verdampfungsrückstand wird wieder in Chloroform gelöst und durch Zugabe von Äther gefällt. Der Niederschlag wird filtriert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Es werden 3,6 g (84,5% der Theorie) geschütztes Heptapeptidestcr-hydrochlorid erhalten. Rf¹ 0,43 bis O,53;Rf°O,l bis0,25.0]? = -41°(c = 1,inÄthanol)

Analyse: C₅₂H₇₇O₁₂N₁₂Cl (1097,69)

Berechnet ... C 56,9, H 7,1, N 15,3, Cl 3,25%;
gefunden .... C 56,55, H 7,1, N 15,3, Cl 2,9%.

hydrochlorid erhalten. Rf¹ 0,14 bis 0,20. O]* = -29° (c = 1 in Äthanol).

Analyse: C₅₀H₇₃O₁₂N₁₂Cl (1069.64)

Berechnet ... C 56,14, H 6,88, N 15,72%;
gefunden .... C 56,2, H 7,0, N 15,7%.

Schritt 31

ίο H— Arg— Try — GIy — Lys(BOC) — Pro —

— VaI — GIy — OH · HCl (8 bis 14)

6.0 g des im Schritt 30 erhaltenen geschützten Hexapeptid-hydrochlorids werden in Äthanol gelöst und in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, die Lösung verdampft und der Verdampfungsrückstand mit Äther verrieben. Es werden 4,25 g (81.5% der Theorie) Heptapeptid-hydro-

chlorid erhalten. Rf¹ 0,04 bis 0,014; Rf 0,50 bis 0.58. Nach Solvolyse mit Trifluoressigsäure: Rf¹ 0,0;Rf 0,33 bis 0,41. O]v" = -30° (c = 1 in Äthanol)

Analyse: C₄₂H₆₇O₁₀N₁₂Cl (935,51)
Berechnet ... N 17,97, Cl 3,8%;

Schritt 30

Z — Arg — Try — GIy — LyS(BOC) — VaI — GIy — OH · HCl (8 bis 14)

Pro

9,9 g des im Schritt 29 erhaltenen geschützten Heptapeptidester-hydrochlorids werden in Methanol gelöst, mit 18 mi N-Natriumhydroxidlösung versetzt. 1 Stunde stehengelassen und dann mit 1,08 ml Eisessig neutralisiert. Die Lösung wird verdampft und der Rückstand an einer 200 g Silicagel enthaltenden Säule (3 χ 70 cm) Chromatographien mit einem Gemisch von Essigsäureäthylester, Pyridin, Essigsäure und Wasser (60:20:6:11). Die das reine Hauptprodukt enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, verdampft, der Rückstand in einem Gemisch von Chloroform und Butanol (1:1) gelöst und bei O⁰C zuerst mit 0,5 N-Salzsäure, dann mit Wasser gewaschen und getrocknet. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand mit Äther verrieben. Es werden 6,15 g (64% der Theorie) geschütztes Heptapeptid-

gefunden

N 18,0. Cl 3,7%.
Schritt 32

Z — Glu(OBu') — His — Phe — OMe (5 bis 7)

11.8 g geschütztes Dipeptid Z---His—Phe—OMe (St. G u 11 m a η η und R. A. B ο i s s ο η η a s : HeI. Chirr». Acta 41. 1852 1958) werden in einer methanolischen Lösung von 1.04 g Salzsäure gelöst und in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle zur Abspaltung der Carbobenzoxy-Schutzgruppe hydrogenolysiert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, die Lösung verdampft und der kristalline Rückstand aus einem Gemisch Methanol und Äther umkristallisiert. Es werden 6,4 g (70% der Theorie) Dipeptidester-hydrochlorid erhalten.

Das erhaltene Produkt wird mit 6,87 g Carbobenzoxy - glutaminsäure - y - tert.butyl - u - (p - nitrophenolester in 90 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung mit 2,6 ml Triäthylamin versetzt und 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wird dann verdampft, der Rückstand in einem Gemisch von Essigsäureäthylester und Wasser gelöst, die wäßrige Phase abgetrennt und die orga-

so nische Lösung mit 5%iger wäßriger Triäthylaminlösung, dann mit Wasser gewaschen, getrocknet und verdampft. Der Verdampfungsrückstand wird au; einem Gemisch von Methanol und Wasser kristallisiert. Es werden 7,5 g (78% der Theorie) geschütztei Tripeptidester erhalten; F. 180 bis 182^CC.

Schritt 33
Z — GIu(OBu¹) — His — Phe — N₂H₃ (5 bis 7)

12.7 g des im Schritt 32 erhaltenen geschütztei Tripeptidester werden in Methanol gelöst, die Lösunj bei Zimmertemperatur mit 3.2 ml einer 94%igei Hydrazinhydratlösung versetzt, 3 Tage bei Zimmer temperatur stehengelassen, dann wird das Lösungs

mittel verdampft und der Rückstand über koni Schwefelsäure im Vakuum getrocknet. Das erhalten schaumartige Produkt wird aus einem 1 : 1-Gemisd von Äthanol und Wasser kristallisiert. Es werde

Hf

11,Og (86,4% der Theorie) geschütztes Tripeptidhydrazid erhalten; F. 2C9 bis 210°C.

Schritt 34

Z — GIu(OBu¹) — His — Phe — Arg — Try —

— GIy — Lys(BOC) — Pro — VaI — GIy — OH (5 bis 14)

3,2 g des im Schritt 33 erhaltenen geschützten Tripeptidhydrazids werden in 9,0 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung bei -30⁰C zuerst mit einer Lösung von 720 mg Chlorwasserstoff in 10 ml Tetrahydrofuran, dann mit 0,84 ml lsoamylnitrit und nach 5 Minuten Rühren mit 4,0 ml Triäthylamin versetzt, dann wird eine Lösung von 5.4 g des im Schritt 31 erhaltenen Heptapeptids in 12,0 ml Dimethylformamid der in obiger Weise erhaltenen Azidlösung zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 1 Stunde bei einer Temperatur zwischen -10 und -20⁰C gerührt, dann über Nacht bei 0°C stehengelassen. Nach Verdampfen des Reaktionsgemisches wird der Rückstand mit Wasser verrieben, getrocknet und das trockene rohe Produkt wird an einer Kolonne von 140 g Silikagel mit einem Gemisch von Essigsäureäthylester, Pyridin, Essigsäure und Wasser (60:20:6:11) chromatographiert. Die das Hauptprodukt in reinem Zustand enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, verdampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Es werden 4,0 g geschütztes Dekapeptid erhalten. Rf 0,15 bis 0.20.

Schrill 35

H — GIu(OBu') — His — Phe — Arg — Try —

— Giy — Lys(BOC) — Pro — VaI — GIy —

— OH -HCl (5 bis 14)

3,5 g des im Schritt 34 erhaltenen geschützten Dekapeptids werden im Gemisch von 80 ml Methanol, 10 ml Wasser und 1 ml Eisessig in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator amfiltriert. das Filtrat verdampft und der Rückstand nach Auflösen in 10 ml Methanol durch Zugabe von 100 ml Äther gefällt. Der Niederschlag wird filtriert und getrocknet. Es werden 3,0 g (100% der Theorie) freies Dekapeptid erhalten. Rf 0,05 bis 0,10.

Schritt 36

BOC- Ser — Tyr — Ser — Met —

— GIu(OBu¹) — His — Phe — Arg — Try —

— GIy — Lys(BOC) — Pro — VaI — GIy —

-OH-HCl(I bis 14)

3,1 gTetrapeptidhydrazidBOC—Ser—Tyr—Ser— — Met — H₂H₃ (B. 1 s e 1 i η und R. Schwyzer: HeI. Chim. Acta 44, 169 [1961]) werden in 15 ml Dimethylformamid gelöst, und der auf — 30" C abgekühlten Lösung werden 2.35 ml 6 N-Salzsüure und dann eine konzentrierte wäßrige Lösung von 410 mg Natriumnitrit zugesetzt. Die auf diese Weise erhaltene Azidlösung wird sofort einer auf — 20^cC abgekühlten Lösung von 3,5 g des im Schritt 35 erhaltenen Dekapeptids und 2,1 ml Triethylamin in 15 ml Dimethylformamid zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 1 Stunde zwischen -10 und -20⁰C gerührt, dann über Nacht bei 0⁰C stehengelassen. Nach Verdampfen des Reaktionsgemisches wird der Rückstand mit Wasser zum Pulver verrieben und an einer Säule von 150 g Silikagel in einem Gemisch von Essigsäureäthylester, Pyridin, Essigsäure und Wasser (60: 20:6 :11) chromatographiert. Die das Hauptprodukt in reinem Zustand enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und verdampft. Der Verdampfungsrückstand wird unter Zugabe von 1 bis 2 g Pyridinhydrochlorid in 20 bis 30 ml Methanol gelöst, die Lösung eingeengt, das Produkt durch Zugabe von Wasser gefällt, zum Pulver verrieben, filtriert, mit . Wasser gewaschen und getrocknet. Es werden 2,3 g geschütztes Tetradekapeptidhydrochlorid erhalten. Rf 0,10 bis 0,15.

C₉₁H₁₃₄O₂₃N₂₂SCl (1971,68)

Aminosäure-Analyse (in Klammern die theoretischen Werte:

Ser 1,95(2), Tyr 0,95(1), Met 1,0(1), GIu 1,0(1). His 1,05(1)1, Phe 1,0(1), Arg 0,95(1), GIy 2.0 (2), Lys 1,05 (1)1, Pro 0,95 (1), VaI 1,05(1).

Schritt 37

BOC — Ser — Tyr — Ser — Met — -GIu(OBu¹)-His—Phe —Arg —Try -

— GIy — Lys(BOC) — Pro — VaI — GIy -

— Lys(BOC)— Lys(BOC) — Arg — Arg-

— Pro — VaI — Lys(BOC) — VaI —

— Tyr(Bu') — Pro — ASp(OBu¹) — AIa — GIy — GIu(OBu') — Asp(OBu') — GIn -

— Ser — AIa — GIu(OBu') — AIa — Phe -

— Pro — Leu — GIu(OBu') — Phe —

— OBu¹ · 3 HCOOH (1 bis 39)

202 mg (0,055 mMol) des im Schritt 23 erhaltenen Pentakozapeptid - trihydrochlorids, 118 mg

(0,060 mMol) des im Schritt 36 erhaltenen geschützten Tetradekapeptids, 38 mg (0,144 mMol) Pentachlorphenol und 30 mg (0,145 mMol) Dicyclohexyl-carbodiimid werden in 0,6 ml Dimethylformamid, welches auch O,O77ml (0,055 mMol) Triethylamin enthält, gelöst. Das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur 4 Tage stehengelassen, dann mit peroxydfreiem Äther verdünnt, der erhaltene Niederschlag abfiitriert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Das auf dieser Weise erhaltene rohe Produkt wird an einer Silikagel-Säuie mit einem Gemisch von Essigsäureäthylester, Pyridin, Ameisensäure und Wasser chromatographiert. Die das Hauptprodukt in reinem Zustand enthaltenden Fraktionen werden gesammelt verdampft, und der Rückstand wird mit peroxyd freiem Äther verrieben. Die das Hauptprodukt ir Begleitung von anderen Stoffen enthaltenden Frak tionen werden ebenfalls gesammelt, und aus dieser kann durch Chromatographie eine weitere Mengi des gewünschten Produkts erhalten werden. Insge samt werden auf diese Weise 136 mg (44% der Theo ri^) geschütztes Nonatriakontapeptid erhalten. Rf 0.3 bis 0,37.
C₂₆₇H₄₁₁₁O₇₃N₅₇S (5622,54)

Schritt 38

Ser — Tyr — Ser — Met — GIu — His —

— Phe — Arg — Try — GIy — Lys — Pro —

— Val — GIy — Lys — Lys — Arg — Arg —

— Pro — Val — Lys — Val — Tyr — Pro —

— Asp — Ala — GIy — GIu — Asp — Gin —

— Ser —Ala —Glu —Ala —Phe—Pro —

— Leu — GIu — Phe (a_h — ACTB)

100 mg des im Schritt 37 erhaltenen geschützten Nonatriakontapeptids werden in 2 ml Trifiuorcssigsäure gelöst, die Lösung 15 Minuten stehengelassen und dann im Vakuum verdampft. Der Rückstand in 2 ml Wasser gelöst und wieder verdampft. Das Auflösen im Wasser und Verdampfen wird noch einmal wiederholt, und dann wird der Rückstand in 5 ml Wasser gelöst, die.Lösung durch eine mit lonenaustauscherharz im Acetat-Cyclus gefüllte Säule passiert, und die Säule wird mit 20 ml Wasser nachgewaschen. Die vereinigte wäßrige Lösung wird dann lyophilisiert. Es werden als Lyophilisat 80 mg (etwa 80% der Theorie) des mit den menschlichen Corticotropin identischen freien Nonatriakontapeptids erhalten. Ri⁶ 0,23 bis 0,30.

Aminosäure-Analyse:

Asp 1,8 (2), Ser 2,7 (3), GIu 4,5 (5), Pro 3,8 (4),
GIy 2,9 (3), AIa 3,0 (3), Leu 1,0 (1), Val 2,9 (3),
Met 0,95 (I), Tyr 1,9 (2), Phe 3,0 (3), His 0(1),
Lys 3,8 (4), Arg 2,8 (3), Tyr: Try 2.2 (2).

Beispiel 2

Abänderung der Synthese des menschlichen
Corticotropins

Schritt 1

Z — Val — Lys(BOC) — Val — Tyr(Bu') —

— Pro—OSu (20 bis 24)

51,5 g des nach Beispiel 1, Schritt 23. erhaltenen PentapeptidsZ—Val—Lys(BOC)—Val—Tyr(Bu·)— Pro— OH und 13,2 g N-Hydroxysuccinimid werden in 400 ml wasserfreiem Dioxan gelöst, dann wird die mit Eiswasser gekühlte Lösung mit 12,1 g Dicyclohexyl - carbodiimid versetzt. Das Gemisch wird ¹Z₂ Stunde unter Kühlung, dann bis zum nächsten Tag bei Zimmertemperatur stehengelassen. Nach Verdampfen des Reaktionsgemisches im Vakuum wird der Rückstand in 1 1 Essigsäureäthylester gelöst und die Lösung dreimal mit je 300 ml 2%iger Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Nach Trocknen der organischen Phase wird der Essigsäureäthylester im Vakuum abdestilliert, der Rückstand mit wasserfreiem Äther verrieben, filtriert und im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet. Es werden 49.0 g (86% der Theorie) aktiver Pentapeptidester erhalten: F. 171 bis 173" C.

Schritt 2

Z — Val — Lys(BOC) — Val — Tyr(Bu') —

— AIa — GIy — OH (20 bis 27)

130 mg des nach Beispiel 1. Schritt 11. erhaltenen und feingepulverten Tripcptids H — Asp(OBu') — —AIa—GIy—OH werden in 3,6 ml wasserfreiem Dimethylformamid, welches'auch 36 mg Triäthylamin enthält, suspendiert. Der Suspension werden unter Rühren 365 mg des nach Beispiel 2, Schritt 1, erhaltenen aktiven Pentapeptidesters Z — Val — — Lys(BOC) — Val — Tyr(Bu·) — Pro — OSu zugesetzt, und das Gemisch wird bei Zimmertemperatur noch 12 Stunden gerührt, wobei das Tripeptid langsam aufgelöst wird. Das Gemisch wird dann 36 Stunden stehengelassen, dann im Vakuum zur Trockne verdampft. Der Rückstand wird in 3 ml des Gemisches EssigsäureLthylester — Pyridin — Eisessig — Wasser 120:20:6:11 gelöst, an einer mit Silikagel gefüllten 20 χ 250-mm-Säule chromatographiert und mit demselben Lösungsmittelgemisch eluiert. Die das reine Produkt enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, im Vakuum verdampft und der Rückstand mit Wasser zum Pulver verrieben. Nach Trocknen im Exsiccator über Phosphorpentoxyd werden 304 mg (70% der Theorie) geschütztes Oktapeptid erhalten. Rf²O₁SO bis 0,55; Rf¹¹ 0,55 bis 0,60.
C₆₀H₉₁O₁₆H₉ (1194,45)

Schritt 3

Z — Val — Lys(BOC) — Tyr(Bu') — Pro —

— ASp(OBu¹) — AIa — GIy — GIu(OBu¹) —

— Asp(OBu') — GIn — Ser — Ala —

— GIu(OBu¹) — Ala — Phe — Pro — Leu —
— GIu(OBu¹) — Phe — OBu¹ (20 bis 39)

120 mg (0,1 mMol) des nach Beispiel 2, Schritt 2, erhaltenen geschützten Oktapeptids werden in 2 ml wasserfreiem Dioxan gelöst, mit 23 mg (0,2 mMol) N - Hydroxysuccinimid und dann mit 25 mg (0,12 mMol) Dicyclohexyl-carbodiimid versetzt. Das Gemisch wird 24 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen, dann wird der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat zur Trockne verdampft. Das Produkt zeigt bei dünnschichtchromatographischen Untersuchungnicht mehr als 5% Gehalt an unreagiertem Oktapeptid-Ausgangsstoff; Rf⁶ des erhaltenen aktiven Oktapeptidesters: 0,85 bis 0,95.

Der in obiger Weise erhaltene aktive Oktapeptidester wird ohne weitere Reinigung in 1 ml Dimethylformamid gelöst, dann werden in dieser Lösung 170 mg (0,1 mMol) des nach Beispiel 1, Schritt f, erhaltenen Dodekapeptid-hydrochlorids gelöst und eir.e Lösung von 30 mg (0.3 mMol) Triäthylamin in 0,5 ml Dimethylformamid zugesetzt. Das Gemisch wird 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen, dann wird das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert, der Rückstand mit Wasser verrieben, filtriert und im Exsiccator getrocknet. Es werden 222 mg des weitgehend unlöslichen Ikozapeptids erhalten. Der als Ausgangsstoff verwendete aktive Ester oder die entsprechende freie Säure sowie auf Ninhydrin positive Verunreinigungen können in diesem Produkt nicht nachgewiesen werden. Bei Dünnschichtchromatographic in 90%iger Essigsäure- Rf0.75 bii 0.85.

C,«H₂₁₍,Oj_SN₂₂ (2839.03).

Schritt 4

H — VaI — Lys(BOC) — VaI — Tyr(Bu') —

— Pro — Asp(OBu') — AIa — GIu(OBu¹) —

— Asp(OBu') —Gin —Ser —Ala—

— GIu(OBu') — Ala — Phe — Pro — Leu —

— GIu(OBu¹)- Phe— OBu¹ (20 bis 39)

100 mg des im Schritt 3 erhaltenen geschützten Ikozapeptids werden in 10 ml 80%iger Essigsäure gelöst und in Anwesenheit von 70 mg 10%iger Palladium-Aktivkohle 3 Stunden hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat im Vakuum verdampft und der Rückstand im Exsiccator über Natriumhydroxid getrocknet. Es werden 90 mg des freien Ikozapeptidesters in der Form glasartiger amorpher Schuppen erhalten. Das Produkt ist chromatographisch einheitlich, zeigt eine schwach positive Nynhydrin-Reaktion; es enthält kein geschütztes lkozapeptid. Rf 0,76 bis 0,84; Rf¹¹ 0,47 bis 0,53.

C₁₃₄H₂₁₀O₃₆N₂₂ (2704,90)

Schritt 5

Z—Lys(BOC)—-LyS(BOC)-Arg(N O₂)-

— Arg(N O₂) — Pro — VaI — Lys(BOC) —

— VaI — Tyr(Bu') — Pro — ASp(OBu¹) — AIa —

— GIy — GIu(OBu¹) — Asp(OBu') — GIu —

— Ser — AIa — GIu(OBu¹) — AIa — Phe —

— Pro — Leu — GIu(OBu¹) — Phe — OBu'
(15 bis 39)

90 mg des im Schritt 4 erhaltenen Ikozapeptids werden in 1,0 ml Dimethylformamid, welches auch 6 mg Triäthylamin enthält, gelöst. Die Lösung wird mit 45 mg des nach Beispiel 1, Schritt 17/b, erhaltenen geschützten Pentapeptid-pentachlorphenylesters versetzt und 3 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen. Das Lösungsmittel wird dann im Vakuum abdestilliert und das als Rückstand erhaltene Produkt vom unreagierten lkozapeptid und von einer kleinen anwesenden Menge des aktiven Pentapeptidesters durch Säulenchromatographie an Silikagel (Lösungsmittelgemisch : Essigsäureäthylester — Pyridin — Eisessig — Wasser 120: 20:6:11 oder Chloroform — Methanol 80: 20) befreit.

Es werden 54 mg (40% der Theorie) des geschützten Pentakozapeptidesters erhalten. Rf² 0,42 bis 0,47; Rf¹⁰ 0,55 bis 0,60. Dieses Produkt kann in der im Beispiel 1, Schritt 27, beschriebenen Weise von der Schutzgruppe befreit und nach Beispiel 1, Schritt 37 zur Kupplungsreaktion mit dem geschützten Tetradekapcptid (1 bis 14) verwendet werden.

Beispiel 3
Synthese des Corticotropin-Fragments (1 bis 14)

H — Ser ■— Tyr — Ser — Met — GIu — His —

— Phe — Arg — Try — GIy — Lys — Pro —

— VaI — GIy — OH

200 mg des nach Beispiel 1, Schritt 36, erhaltenen geschützten Tetradekapeptids werden in 5,0 ml Trifluoressigsäure, welche auch 0,02% Mercaptoäthanol enthält, gelöst. Nach 20 Minuten wird die Lösung im Vakuum verdampft, der Rückstand in 5 ml Wasser gelöst und an eine Säule von 5 ml lonenaustauschcrharz (im Aceton-Zyklus) aufgetragen und mit 5 χ 3ml Wasser eluiert. Die vereinigten wäßrigen Lösungen werden lyophilisiert. Es werden 180 mg freies Tetradekapeptid erhalten. Rf⁵ 0.45 bis 0,50.

Aminosäure-Analyse:

Ser 1,95(2), Tyr 0,95(1). Met 1.0(1), GIu 1,0(1), His 1,05(1), Phe 1.0(1). Arg 0.95(1), GIy 2.0 (2). Lys 1,05 (1), Pro 0.95 (1), VaI 1.05 (1).

Beispiel 4

Synthese des Corticotropin-Fragmenu

(1-14-Amid) 15

Schritt 1

BOC- Ser — Tyr — Ser — Met —

— GIu(OBu¹) — His — Phe — Arg — Try — — Gly —Lys(BOC)—Pro-—Val —Gly — -NH₂ HCl

197 mg des nach Beispiel 1, Schritt 36, erhaltenen geschützten Tetradekapeptid-hydrochlorids werden in 0,5 ml Dimethylformamid, welches auch 5 mg Ammoniak enthält, gelöst, dann mit 60 mg Dicyclohexyl-carbodiimid versetzt und über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen. Die Zugabe von Ammoniak wird in derselben Weise am nächsten Tag wiederholt, und das Reaktionsgemisch wird mit weiteren 60 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach 2 Tagen wird die Lösung mit peroxydfreiem Äther verdünnt, das ausgeschiedene Produkt filtriert und an einer Säule von Silikagel im Lösungsmittelsystem

Essigsäureäthylester— Pyridin—Essigsäure—Wasser 60; 20:6:11 Chromatographien. Es werden 150 mg (75^Civ. der Theorie) geschütztes Telradekapeptidamid erhalten. Rl¹ 0.2t) bis 0.25.

Schritt 2

H — Ser — Tyr — Ser — Met — GIu —

— His — Phe — Arg — Try — GIy — Lys —

— Pro — Val — Gly — NH₂(1 bis 14)

Von 100 mg des im Schritt 1 erhaltenen Tetradeka· pepiidamids werden die Schutzgruppen in der im Beispiel 3 angegebenen Weise entfernt. Es werder 60 mg (70% der Theorie) freies Tetradekapeptidamic erhalten. Rf⁶ 0,55 bis 0,60.

Beispiel 5

Synthese des Corticotropin-Fragments (1 bis 15-Amid)

Schritt 1
Z — Lys(BOC) — NH₂

2,5 g aktiver geschützter Lysinester Z—Lys(BOC)-— ONP werden in 25 ml Methanol gelöst und naci Zugabe von 1,5 ml cone. Ammoniumhydroxidlösun über Nacht stehengelassen, dann wird die Lösung vei dampft, die erhaltenen Kristalle mit verdünnter Arr moniaklösung gewaschen und aus dem Gemisch vo 20 ml Äthanol und 30 ml Wasser umkristallisier Es werden 1,35 g (71% der Theorie) geschützt Lysinamid erhalten; F. 140 bis 141¹C. Rf*0,6.

Schritt 2
H — Lys(BOC)—NH₂

800 mg des im Schritt ϊ erhaltenen geschützten Lysinamids werden in 40 ml Methanol in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle hydriert, dann wird nach Abfiltrieren des Katalysators die Lösung verdampft und der Rückstand kristallisiert. Es werden 440 mg (86% der Theorie) freies Lysinamid H — Lys(BOC) — NH₂ erhalten. Rf¹ 0,34.

Analyse: C₁₁H₂₃N₃O₃ (245,33)

Berechnet ... Amid-N5.7%;
gefunden .... Amid-N 5,5%.

Schritt 3

BOC- Ser — Tyr — Ser — Met —
-GIu(OBu¹)-His —Phe—Arg —Tyr—

— GIy — Lys(BOC) — Pro — VaI — GIy —

— Lys(BOC) — NH₂ (1 bis 15)

40 mg des im Schritt 2 erhaltenen Lysinamids und 197 mg des nach Beispiel 1, Schritt 36, erhaltenen geschützten Tetradekapeptid-hydrochlorids werden in 0,5 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird mit 53 mg Pentachlorphenol und 45 mg Dicyclohexyl-carbodiimid versetzt und 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wird dann mit wasserfreiem Äther verdünnt, der erhaltene Niederschlag filtriert, mit Äther gewaschen und an einer Silikagel-Säule Chromatographien. Die das reine Hauptprodukt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, verdampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Es werden 120 mg (60% der Theorie) geschütztes Pentadekapeptidamid erhalten. Rf 0,2 bis 0,25.

Schritt 4

H —Ser —Tyr —Ser—Met —Glu —His—

— Phe—Arg—Try — GIy — Lys — Pro—

— VaI — GIy — Lys — NH₂

100 mg-des im Schritt 3" erhaltenen geschützten Pentadekapeptidamids werden in der im Beispiel 3 beschriebenen Weise von den Srhutzgruppen befreit. Das freie Pentadekapeptidamid wird mit nahezu quantitativer Ausbeute erhalten. Rf⁶ 0,45 bis 0,55.

Beispiel 6

Synthese des Corticotropin-Fragments
(1 bis 16-Amid)

Schritt 1
Z —Lys(BOC) — LyS(BOC)-NH₂ (15 und 16)

2,0 g geschützter Dipeptidester Z—Lys(BOC)— — Lys(BOC) — OMe (vg. R. S c h w y ζ e r und W. R i 11 e 1: HeIv. Chim. Acta 44, 159/1961) werden in 50 ml Methanol gelöst, und die Lösung wird dann mit Ammoniakgas gesättigt. Das Gemisch wird 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen, dann verdampft. Der kristalline Rückstand wird aus wenig Methanol umkristallisiert. Es werden 1,6 g (83% der Theorie) geschütztes Dipeptidamid erhalten; F. 160 bis 162⁰C. RfO₅O (Chloroform-Methanol 98:2, wo der Ester mit dem Rf-Wert 0,20 bis 0,25 migriert).

Schritt 2

H —Lys(BQC) — Lys(BOC) —NH₂ (15 und 16)

1,0 g des im Schritt 1 erhaltenen geschützten Dipeptidamids werden in metbanolischer Lösung in Anwesenheit von Palladium - Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und die Lösung verdampft. Als kristalliner Rv ;kstand werden 0,75 g (etwa 100% der Theorie) ίο frc es Dipeptidamid erhalten. Rf 0,7 (beim geschützten Dipeptidamid 1,0); Rf⁷ 0,7.

Schritt 3

BOC-Ser —Tyr —Ser—Met —

— GIu(OBu¹) — His — Phe —Arg — Try —

— GIy — Lys(BOC) — Pro — VaI — GIy —

— Lys(BOC) — Lys(BOC) — NH₂ (1 bis 16)

197 mg des nach Beispiel 1, Schritt 36, erhaltenen geschützten Tetradekapeptid-hydrochlorids, 60 mg des im obigen Schritt 2 erhaltenen freien Dipeptidamids, 50 mg Pentachlorphenol und 45 mg Dicyclohexylcarbodiimid werden in 0,5 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen, dann mit peroxydfreiem Äther verdünnt. Das abgeschiedene Produkt wird abfiltriert und an einer Si'likagel-Säule im Lösungsmittelsystem Essigsäureäthylester—Pyridin—Essigsäure—Wasser 60:20:6: 11 Chromatographien. Es werden 125 g (50% der Theorie) geschütztes Hexadekapeptidamid erhalten. Rf 0,20 bis 0,25.

Schritt 4

H —Ser —Tyr —Ser- Met —Glu —His —

— Phe — Arg — Try — GIy — Lys — Pro —

— VaI — GIy — Lys — Lys — NH₂ (1 bis 16)

100 mg des im Schritt 3 erhaltenen geschützten Hexadekapeptidamids werden in der im Beispiel 3 beschriebenen Weise von den Schutzgruppen befreit. Es werden 70 mg (etwa 80% der Theorie) freies Hexadekapeptidamid erhalten. Rf⁶ 0,35 bis 0,40.

Beispiel 7

Synthese des Corticotropin-Fragments
(1 bis 17-Amid)

Schritt 1

Z — Lys(BOC — Lys — BOC)—Arg(N O₂) —
-NH₂ (15 bis 17)

a) Herstellung des Azids: 3,12 g des nach Beispiel 1, Schritt 15, erhaltenen geschützten Dipeptidhydrazids Z—Lys(BOC)—Lys(BOC)—N₂H₃ werden in 50 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung bei etwa -1O⁰C mit 20 ml 0,5 N-Salzsäure, dann mit 5,0 ml M/l Natriumnitritlösung versetzt. Das Gemisch wird bei etwa - 10⁰C 15 Minuten gerührt, dann mit 1,0 ml Triäthylamin neutralisiert, mit 50 ml gekühltem Chloroform und mit 50 ml Wasser verdünnt. Nach Abtrennen der Chloroform-Phase wird die wäßrige Schicht mit Chloroform noch einmal gewaschen, die Chloroformlösungen werden vereinigt, mit kaltem Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und in der nachstehenden Weise mit dem Amino-Komponenten in Reaktion gebracht.

b) Kupplung: 1,5 g ω-Nitro-arginiamid-hydrobronid (H. Otsuka, K. Inouye, M. Kanayama md F. S h i η ο ζ a k i: Bull. Chem. Soc. Japan 38, 1563 [1965]) werden in 10 ml Dimethylformamid geöst und mit 0,77 ml Triäthylamin versetzt, dann wird zu diesem Gemisch die in obiger Weise herge- >tellte Azidlösung zufiltriert. Das Chloroform wird ius dem Gemisch abdestilliert, und das als Rückstand erhaltene Reaktionsgemisch wird über Nacht sei Zimmertemperatur stehengelassen. Dann wird auch das Dimethylformamid im Vakuum abdestilliert, der Rückstand in 200 ml Essigsäureäthylester gelöst, die Lösung bei 0⁰C mit N/l Salzsäurelösung, dann mit Wasser gewaschen, getrocknet und verdampft. Das geschützte Tripeptidamid bleibt in kristalliner Form zurück; es wird in Essigsäureäthylester aufgeschlämmt, filtriert und getrocknet. Es werden 3,1 g (77% der Theorie) geschütztes Tripeptidamid erhalten; F. 92 bis 94°C. Rf² 0,80 bis 0,88.

20 Schritt 2

H —Lys(BOC) —Lys(BOC)—Arg —
-NH₂-2HCl (15 bis 17)

1,5 g des im Schritt 1 erhaltenen geschützten Tripeptidamids werden in ⁷5 m! Essigsäure in Anwesenheit von Palladium - Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und die Lösung verdampft. Der Verdampfungsrückstand wird in Chloroform gelöst, mit 1,0 g Pyridinhydrochlorid versetzt, das Produkt wird durch Zugabe von Äther gefällt, mit Äther verrieben, dann in 1 ml des Gemisches Chloroform — Methanol 60:38 wieder gelöst und auf eine Silikagel - Säule aufgetragen. Das Produkt wird mit dem Gemisch Chloroform — Methanol — Wasser 60:38 :10 chromatographiert. Die das Hauptprodukt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, verdampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Es wird 1,0 g (77% der Theorie) Tripeptidamiddihydrochlorid erhalten. Rf³ 0,70 bis 0,80. (Das bei der Hydrogenolyse ent-, stehende Ammoniumacetat wurde in Ammoniumchlorid übergeführt, welches mit einem kleineren Rf-Wert migriert und beim Chromatographieren zurückbleibt.)

Schritt 3

BOC-Ser —Tyr —Ser—Met— _$0

— GIu(OBu') — His — Phe — Arg — Try —

— GIy — Lys(BOC) — Pro — VaI — GIy —

— Lys(BOC) — Lys(BOC) — Arg — NH₂
(1 bis 17)

197 mg des nach Beispiel 1, Schritt 36, hergestellten geschützten Tetradekapeptid-hydrochlorids, 100 mg des im obigen Schritt 2 erhaltenen Tripeptidamiddihydrochlorids, 53 mg Pentachlorphenol und 46 mg Dicyclohexylcarbodiimid werden in 0,5 ml Dimethylformamid, welches auch 14 mg Triäthylamin enthält, gelöst. Das Reaktionsgemisch wird 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen, dann mit Äther verdünnt und das abgeschiedene rohe Reaktionsprodukt wird an einer Silikagel-Säule mit dem Lösungsmittelgemisch Essigsä.ureäthylester — Pyridin — Ameisensäure -Wasser 40:20:6: 5,5 Chromatographien. Die das Hauptprodukt enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, verdampft und der Rückstand mit Essigsäureäthylester verrieben. Es werden 149 mg (58% der Theorie) geschütztes Heptadekapcptidamid erhalten. Rf⁵ 0,38 bis 0,43; Rf 0,08 bis 0,13.

Schritt 4

H — Ser — Tyr — Ser—Met—Glu — His —

— Phe—Arg—Try — GIy — Lys — Pro—

— VaI — GIy — Lys — Lys—Arg — NH₂ (1 bis 17)

100 mg des im Schritt 3 erhaltenen geschützten Heptadekapeptidamids werden in der im Beispiel 3 beschriebenen Weise von den Schutzgruppen befreit. Es werden 70 mg (etwa 75% der Theorie) freies Heptadekapeptidamid erhalten. Rl⁶ 0,30 bis 0,35.

Beispiel 8

Synthese des Corticotropin-Fragments (1 bis 18-Amid)

Schritt 1

Z - Lys(B OC) — Lys(BOC) — Arg(N O₂) —

— Arg(NO₂) —NH₂ (15 bis 18)

Aus 1,85 g geschütztem Dipeptidhydrazid Z —

— Lys(BOC) — LyS(BOC)-N₂H₃ wird in der im Beispiel7, Schritt l/a, beschriebenen Weise eine Azidlösung in Chloroform hergestellt und diese dann der in der nachstehenden Weise hergestellten Lösung zugesetzt:

1,8 g des Dipeptidderivats H — Arg(NO₂) —

— Arg(NO₂) — NH₂ · HBr (vgl H O < ? u k a, K.Inouye, M.Kanayama und E.Shinozaki: Bull. Chem. Soc. Japan 38, 1563 [1965]) und 0,6 ml Triäthylamin werden in 8,0 ml Dimethylformamid gelöst, dann wird die obige Azidlösung zugesetzt und das Reaktionsgemisch 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand auf eine Silikagel-Säule aufgetragen und mit dem Gemisch Essigsäureäthylester — Pyridin — Essigsäure — Wasser 60:10: 3 : 5,5 Chromatographien. Die das Hauptprodukt in reinem Zustand enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und verdampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Es werden 2,05 g (68% der Theorie) geschütztes Tetrapeptidamid erhalten. Rf² 0,38 bis 0,48.

55 Schritt 2

H — Lys(B OC) — Lys(BOC) — Arg -NH₂ -3 HCl (15 bis 18)

-Arg —

0,4 g des im Schritt 1 hergestellten Tetrapeptidamids werden in 10,0 ml Essigsäure in Anwesenheii von Palladium-Aktivkohle einer Hydrogenolyse unterworfen. Nach Beendigung der Reaktion wird dei Katalysator abfiltriert und die Lösung verdampft Der Verdampfungsrückstand wird in Chloroforn gelöst, mit 0,3 g Pyridin-hydrochlorid versetzt, dam wird das Produkt durch Zugabe von Äther gefällt Der Niederschlag wird in 0,5 ml eines Chloroform Methanol — Gemisches 60:38 gelöst und auf ein Silikagel-Säule aufgetragen, dann mit dem Gemise Chloroform — Methanol — Wasser 60: 38 : 10 ehre matographiert. Die das Hauptprodukt in reinem Zv stand enthaltenden Fraktionen werden gesammel

IO

verdampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Es werden 0,3 g (86% der Theorie) Tetrapeptidamidtrihydrochlorid erhalten. Rf⁹ 0,55 bis 0,65.

Schritt 3

BOC- Ser — Tyr — Ser — Met —

— GIu(OBu¹) — His — Phe — Arg — Try —

— GIy — Lys(B OC) — Pro — VaI — GIy —

— Lys(BOC) — Lys(BOC)—Arg —Arg—
-NH₂ (Ibis 18)

103,5 mg des nach Beispiel 1, Schritt 36, erhaltenen geschützten Tetradekapeptid - hydrochloride, 65 mg des im obigen Schritt 3 erhaltenen freien Tetrapeptidamid-trihydrochlorids, 26 mg Pentachlorphenol und 21 mg Dicyclohexyl-carbodiimid werden in 0,3 ml Dimethylformamid, welches auch 7,6 mg Triäthylamin enthält, gelöst. Das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur 2 Tage stehengelassen, dann mit peroxydfreiem Äther verdünnt, das abgeschiedene rohe Reaktionsprodukt auf eine Silikagel-Säule aufgetragen und mit dem Gemisch Essigsäureäthylester — Pyridin — Ameisensäure — Wasser 40 : 20 : 6 : 5,5 chromatographiert. Die das Hauptprpdukt in reinem Zustand enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, verdampft und der Rückstand mit Essigsäureäthylester verrieben. Es werden 73 mg (51% der Theorie) geschütztes Oktadekapeptidamid erhalten. Rf⁵ 0,17 bis 0,23.

Schritt 4

35

Η —Ser —Tyr —Ser—Met —Glu —His —

— Phe — Arg — Try — Giy — Lys — Pro -

— VaI — GIy — Lys — Lys — Arg —

— Arg —NH₂(lbis 18)

50 mg des im Schritt 3 erhaltenen geschützten Oktadekapeptidamids werden in der im Beispiel 3 beschriebenen Weise von den Schutzgruppen befreit. Das freie Oktadekapeptidamid wird mit nahezu quantitativer Ausbeute erhalten.

B e i s ρ i e 1 9

Synthese des Corticotropin-Fragments
(1 bis 19-Amid)

Schritt 1
Z — Lys(B OC) — Lys(B OC) — Arg(N O₂) —

— Arg(NO₂)— Pro — NH₂ (15 bis 19)

a) 1,0 g des nach Beispiel 1, Schritt 17/a, erhaltenen geschützten Pentapeptid - ρ - nitrophenylesters wird in 10 ml Methanol gelöst, die Lösung mit 3 ml cone. Ammoniaklösung versetzt und über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wird dann verdampft, der Rückstand in einem Gemisch von Chloroform und Wasser gelöst, die Chloroform-Phase abgetrennt, mit Wasser gewaschen, getrocknet und verdampft. Der Verdampfungsrückstand wird an einer Silikagel-Säule mit dem Gemisch Chloroform — Methanol — Wasser 40:10:1 chromatographiert. Die das Hauptprodukt enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, verdampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Es werden 0,8 g (89% der Theorie) geschütztes Pentapeptidamid erhalten. Rf" 0.25 bis 0,35; Rf⁸ 0,30 bis 0.40.

b) 0,41 g des nach Beispiel 1, Schritt 17/b, erhaltenen geschützten Pentapeptid-pentachlorphenylesters werden in 4,1 ml Methanol gelöst und durch Zugabe von 1,2 ml cone. Ammoniaklösung amidiert. Das Reakt'onsgemisch wird auf die unter a) beschriebene Weise aufgearbeitet; es werden 0,24 g (74% der Theorie) geschütztes Pentapeptidamid erhalten. Dieses Produkt ist mit dem unter a) erhaltenen Produkt identisch.

Schritt 2

H — Lys(B OC) — Lys(B OC) — Arg — Arg —

— Pro — NH₂ · 3 HCl (15 bis 19)

0,5 g des im Schritt 1 erhaltenen geschützten Pentapeptidamids werden in 45 ml Eisessig in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle hydrogenolysiert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und die Lösung verdampft. Der Verdampfungsrückstand wird mit Chloroform gelöst, mit 0,3 g Pyridin-hydrochlorid versetzt, dann wird das Produkt durch Zugabe von Äther gefällt. Der Niederschlag wird in 0,5 ml eines Gemisches von Chloroform und Methanol (60: 38) gelöst und an einer Si!ikage!-Säu!e mit dem Gemisch Chloroform — Methanol — Wasser öO: 38:10 chromatographiert. Die das Hauptprodukt enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, verdampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Es werden 0,4 g (89% der Theorie) Pentapeptid-trihydrochlorid erhalten. Rf³ 0,5 bis 0,6.

Schritt 3

BOC — Ser — Tyr — Ser — Met —

— GIu(OBu") — His — Phe — Arg — Try —

— GIy — Lys(BOC) — Pro — VaI — GIy —

— Lys(BOC) — Lys(B OC) — Arg — Arg —

— Pro—NH₂(I bis 19)

197 mg des nach Beispiel 1, Schritt 36, hergestellten geschützten Tetradekapeptid - hydrochlorids, 149 mg des im Schritt 2 erhaltenen Pentapeptid-trihydrochlorids, 56 mg Pentachlorphenol und 45 mg Dicyclohexyl-carbodiimid werden in 0,5 ml Dimethylformamid, welches auch 15 mg Triäthylamin enthält, gelöst. Das Reaktionsgemisch wird 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen, dann mit peroxydfreiem Äther verdünnt, der erhaltene Niederschlag auf eine Silikagel-Säule aufgetragen und mit dem Gemisch Essigsäureäthylester — Pyridin — Ameisensäure — Wasser 40 : 20: 6: 5,5 chromatographiert. Nach der üblichen Reinigung werden 144 mg (50% der Theorie) geschütztes Nonadekapeptidamid erhalten. Rf⁵ 0.20 bis 0,26.

Schritt 4

H — Ser — Tyr — Ser — Met — GIu — His —

— Phe — Arg — Try — GIy — Lys — Pro —
■ - VaI — GIy — Lys — Lys — Arg — Arg —
-Pro — NH, (1 bis 19)

Von 100 mg des im Schritt 3 erhaltenen geschützten Nonadekapeptidamids werden die Schutzgruppen in der im Beispiel 3 beschriebenen Weise entfernt. Es werden 60 mg (etwa 70% der Theorie) freies Nonadekapepiidamid erhalten. Rf¹ 0.30 bis 0,40.

37
Beispiel 10

Synthese des Corticotropin-Fragments
(1 bis 20-Amid)

Schritt 1

Z — Lys(BOC) — Lys(B OC)—Arg(N O₂) — Arg(NO,)—Pro —VaI-NH₂ (15 bis 20)

584,8 mg des nach Beispiel 1, Schritt 17/b, hergestellten geschützten Pentapeptid - pentachlorphenylesters und 0,15 g Valinamid werden in 1,0 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung bei Zimmertemperatur 2 Tage stehengelassen. Nach Verdampfen des Reakiionsgemisches wird der ölige Rückstand durch Chromatographieren an einer Silikagel-Säule mit dem Gemisch Essigsäureäthylester — Pyridin — Essigsäure—Wasser 60:10:3: 5,5 gereinigt. Es werden 320 mg reines geschütztes Hexapeptidamid erhalten. Rf² 0,4 bis 0,5.

In ähnlicher Weise kann dieses geschützte Hexapeptidamid auch durch Umsetzen von 500 mg des nach Beispiel 1, Schritt 17/a, hergestellten geschützten Pentapeptid-p-nitrophenylesters mit 80 mg Valinamidhydrochlorid und 50 mg Triäthylamin hergestellt werden. Nach dem üblichen Chromatographieren werden 430 mg (88% der Theorie) geschütztes Hexapeptidamid erhalten. Rf² 0,4 bis 0,5.

Schritt 2

H — Lys(B OC) — Lys(B OC) — Arg — Arg —

— Pro — VaI — NH₂ · 3 HCl (15 bis 20)

0,2 g des im Schritt 1 erhaltenen Hexapeptidamids werden in 10 ml Eisessig in Anwesenheit Palladium-Aktivkohle hydrogenolysiert; nach Beendigung der Reaktion wird der* Katalysator abfiltriert uiid die Eisessiglösung verdampft. Der Rückstand wird in Chloroform gelöst, mit 0,12 g Pyridinhydrochlorid versetzt und das Produkt durch Zugabe von Äther gefällt. Der Niederschlag wird in 0,1 ml des Gemisches Chloroform—Methanol 60:38 gelöst und an einer Silikagel-Säule mit dem Gemisch Chloroform—Methanol — Wasser 60: 38 :10 chromatographiert. Es werden 0,17 g Hexapeptid - trihydrochlorid (100% der Theorie erhalten. RP 0,42 bis 0,50.

Schritt 3

50 BOC- Ser — Tyr — Ser — Met —

— GIu(OBu') — His — Phe — Arg — Try —

— GIy — Lys(BOC) — Pro — VaI — GIy —

— Lys(BOC) —Lys(BOC) —Arg —Arg—

— Pro —VaI-NH₂ (1 bis 20)

197 mg des nach Beispiel 1, Schritt 36, hergestellten geschützten Tetradekapeptid-hydrochlorids, 128 mg des im obigen Schritt 2 erhaltenen Hexapeptid-trihydrochlorids, 56 mg Pentachlorphenol und 45 r.ig Dicyclohexyl - carbodiimid werden in 0,5 ml Dimethylformamid, welches auch 11,7 mg Triäthylamin enthält, gelöst. Das Reaktionsgemisch wird 2 Tage stehengelassen, dann mit peroxydfreiem Äther verdünnt und der erhaltene Niederschlag an einer Silikagel-Säule mit dem Gemisch Essigsäureäthylester — Pyridin — Ameisensäure — Wasser 40: 20 : 6 : 5.5 chromatographiert. Die das Hauptprodukt in reinem Zustand enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, verdampft und der Rückstand mit Essigsäureäthylester verrieben. Es werden 185 mg (61% der Theorie) geschütztes Ikozapeptidamid erhalten. Rf⁵ 0,27 bis 0,34.

Schritt 4

H — Ser — Tyr — Ser — Met — GIu — His —

— Phe — Arg — Try — GIy — Lys — Pro —

— VaI — GIy — Lys — Lys —Arg — Arg —

— Pro — Val — NH₂(1 bis 20)

Die Schutzgruppen von 100 mg geschütztem Ikozapeptidamid werden in der im Beispiel 3 beschriebenen Weise entfernt. Es werden 75 mg (87% der Theori«) freies Ikozapeptidamid erhalten. Rf" 0,22 bis 0,25.

B e i sp i e J 11

Synthese des Corticotropin-Fragments
(1 bis 21-Amid)

Schritt 1
Z — Lys(BOC) — Lys(BOC) — Arg(NO,) —

— Arg(NO₂) — Pro — VaI — Lys(BOC) —
-NH₂ (15 bis 21)

a) 0,5 g des nach Beispiel 1, Schritt 17/a, hergestellten geschützten Pentapeptid - ρ - nitrophenylesters Z — Lys(BOC) — Lys(BOC) — Arg(NO₂) —

— Arg(NO₂)—Pro—ONP werden in 1,0ml Dimethylformamid mit 0,17 g Dipeptidamid H —VaI —

— Lys(BOC) — NH₂(vgl. K.Sturm, R.Geiger und W. Siedel: Ber. 97, 1197/1964) umgesetzt. Nach 2 Tagen wird das Reaktionsgemisch mit Äther verdünnt. Der Niederschlag wird an einer Silikagel-Säule mit dem Gemisch Essigsäureäthylester—Pyridin—Essigsäure—Wasser 60: 10:3: 5,5 chromatographiert. Es werden 0,52 g (89% der Theorie) geschütztes Heptapeptidamid erhalten.

b) 877 mg des nach Beispiel 1, Schritt 17/b, hergestellten geschützten Pentapeptid - pentachlorphenylesters werden in 1,5 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung mit 478 mg Dipeptidamid H—VaI— —Lys(BOC)—NH₂ versetzt und das Reaktionsgemisch 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen. Das Reaktionsprodukt wird mit Äther gefällt und an Silikagel gereinigt. Es werden 713 mg (77% der Theorie) geschütztes Heptapeptidamid erhalten. Rf²O^l bis 0,72; Rf¹ 0,35 bis 0,40.

Schritt 2

H —Lys(B OC)—Lys(BOC) —Arg —Arg —

— Pro — VaI — Lys/ BOC) — NH₂ · 3 HCl
(15 bis 21)

0,4 g des im Schritt 1 erhaltenen geschützten Heptapeptidamids werden in 25 ml Eisessig in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle hydrogenolysiert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, die Lösung verdampft und der Rückstand in Chloroform gelöst. Die Chloroformlösung wird mit 0,3 g Pyridin-hydrochlorid versetzt, das Produkt mit Äther gefällt, in 0.5 ml des Gemisches Chloroform — Methanol 60:26 gelöst und an einer Silikagel-Säule mit dem Gemisch Chloroform — Methanol — Wasser

60: 26: 5 chromatographiert. Die das Hauplprodükl in reinem Zustand enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, verdampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Es werden 0,35 g (89% der Theorie) Heptapeptid-trihydrochlorid erhalten. Rf 0,07 bis 0,10; Rf 0,45 bis 0,50 im System Chloroform —Methanol — Wasser 60 : 26 : 5.

Schritt 3

BOC — Ser — Tyr — Ser — Met —

— GIu(OBu¹) — His — Phe — Arg — Try —

— GIy — Lys(BOC) — Pro - VaI — GIy —

— Lys(BOC) — Lys(BOC) — Arg — Arg —

— Pro — VaI — Lys(BOC) — NH₂ (1 bis 21)

197 mg des nach Beispiel 1, Schritt 36, hergestellten geschützten Tetradekapeptid - hydrochloride, 152 mg des im obigen Schritt 2 erhaltenen Heptapeplidamidtrihydrochlorids, 52 mg Pentachlorphenol und 44 mg Dicyclohexyl-carbodiimid werden in 0,5 ml Dimethylformamid, welches auch 11 mg Triäthylamin enthält, gelöst und 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wird dann mit peroxydfreiem Äther verdünnt und der Niederschlag an einer Säule von 10 g Silikagel mit dem Lösungsmittelsystem Essigsäureäthylester ■— Pyridin — Ameisensäure — Wasser 40: 20:6: 5,5 chromatographiert. Nach der üblichen Aufbereitung werden 200 mg (61 % der Theorie) geschütztes Heneikozapeptidamid erhalten. RfO.35 bis 0,40.

Schritt 4

H — Ser — Tyr — Ser — Met — GIu — His —

— Phe — Arg — Try — GIy — Lys — Pro —

— VaI — GIy — Lys — Lys — Arg — Arg —

— Pro —Val — Lys — NH₂(1 bis 21)

Die Schutzgruppen von 100 mg geschütztem Heneikozapeptidamid werden in der im Beispiel 3 beschriebenen Weise entfernt; es werden 75 mg (80% der Theorie) freies Heneikozapeptidamid erhalten. Rf¹0,20 bis 0,25.

Beispiel 12

Synthese des Fragments (1 bis 28) vom
Schweine-Corticotropin

Schritt 1

Z — GIy — AIa — GIu(OBu¹) — OBu¹
(26 bis 28 B)

58,1 g geschlitzter aktiver Alaninester Z—AIa — — ONSu (worin NSu den Rest des Succinimids vertritt) werden in 150 ml wasserfreiem Dioxan gelöst und einer Lösung von 54,4 g Glutaminsäureester GIu(OBu¹)-OBu¹ in 200 ml wasserfreiem Dioxan zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehengelassen, dann mit 1 1 Essigsäureäthylester versetzt und mit Wasser, dann mit N/l Salzsäure, mit 8%iger Natriumbicarbonatlösung und zuletzt wieder mit Wasser ausgeschüttelt. Die organische Phase wird getrocknet und in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle hydrogenolysiert, dann wird der erhaltene freie Dipeptidester in eine 10%ige Zitronensäurelösung extrahiert. Die wäßrige Lösung wird mit Natriumcarbonat bis pH = 9 alkalisch gemacht und der in öliger Form ausgeschiedene Dipeptidester mit Äther extrahiert. Nach Abdestillieren des Äthers wird der als Rückstand erhaltene Dipeptidester AIa — GIu(OBu¹) — OBu¹ in 1 1 Essigsäureäthylester gelöst und mit 45,8 g aktiver Glycinester Z—GIy—ONSu versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bis zum nächsten Tag bei Zimmertemperatur stehengelassen, dann mit N/l Salzsäure, mit 8%iger Natriumbicarbonatlösung lind zuletzt mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und dann wird der Essigsäureäthylester abdestilliert. Der ölige Rückstand erstarrt beim Stehen unter Petroläther. Das Produkt wird aus 250 ml Diisopropyläther umkristallisiert. Es werden 65 bis 66,5 g (83 bis 85% der Theorie) geschützter Tripeptidester erhalten; F. 105 bis 107⁰C. («) = -32,5 bis -35,7° (c = 1, in Äthanol).

Schritt 2
Z — Asp(OBu') — ONSu (25B)

58,6 g feingepulvertes Z — ASp(OBu¹) — OH — Dicyclohexylaminsalz werden in einem Schütteltrichter in 250 ml Äther suspendiert, mit einem Gemisch von 3,3 ml cone. Schwefelsäure und 200 ml Wasser versetzt und bis zur Lösung des Salzes geschüttelt. Die wäßrige Phase wird mit Äther ausgeschüttelt, die vereinigten ätherischen Phasen mit Wasser gewaschen, getrocknet und dann wird der Äther abdestilliert. Das als Rückstand erhaltene öl wird in 250 ml wasserfreiem Dioxan gelöst und unter Eiswasser-Kühlung mit 13,4 g N-Hydroxysuccinimid und 22,4 g Dicyclohexyl-carbodiimid versetzt. Das Gemisch wird bis zum anderen Tag stehengelassen, dann wird nach Abfiltrieren des Dicyclohexylhamstoffes die Dioxanlösung im Vakuum verdampft und das als Rückstand erhaltene öl unter Petroläther zum Erstarren gebracht. Nach Umkristallisieren aus 100 ml lsopropanol werden 35 bis 40 g (72 bis 83% der Theoric) geschützter aktiver Asparaginsäureester erhalten; F. 148 bis 150⁰C.

Schritt 3

Z — Asp(OBu') — GIy — AIa — GIu(OBu¹) — -OBu'(25 bis 28B)

46 g des im Schritt 1 erhaltenen geschützten Tripeptids Z-GIy-AIa-GIu(OBu¹)-OBu¹ werden in 550 ml 80%iger Essigsäure gelöst und in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle hydrogenolysiert. Nach Abnitrieren des Katalysators wird die Lösung im Vakuum verdampft, das als Rückstand erhaltene öl in 500 ml Wasser gelöst, mit 120 g Natriumchlorid versetzt und mit Natriumcarbonat bis pH = 9 alkalisch gemacht. Das ausgeschiedene öl wird mil Essigsäureäthylester extrahiert, die Essigesterlösunf getrocknet und verdampft. Der Rückstand wird in Gemisch von 200 ml wasserfreiem Essigester unc 100 ml wasserfreiem Dioxan gelöst, mit 30,6 g dei aktiven Esters Z—ASp(OBu¹)—ONSu versetzt, dam wird das Reaktionsgemisch nach 3stündigem Stehei mit 200 ml Essigsäureäthylester verdünnt, mit Was ser, dann mit N/l Salzsäure, mit 8%iger Natrium bicarbonatlösung und zuletzt wieder mit Wasse gewaschen, getrocknet und im Vakuum verdampf Das als Rückstand erhaltene öl kristallisiert unte Petroläther; es werden 38 bis 40 g (75 bis 79% de

309 681 nc

Theorie) des geschützten Tetrapeptidesters erhalten; F. 80 bis 83° C.

Schritt 4

H — VaI — Lys(BOC) — VaI — Tyr(Bu') —

— Pro — Asp(OBu^l) — GIy — AIa —

— GIu(OBu¹) — OBu' (20 bis 28)

37,2 g des im obigen Schritt 3 erhaltenen geschützten Tetiapeptidesters Z—Asp(OBu·)—Gly—Ala—

— GIu(OBu¹) — OBu¹ werden in 400 ml 80%iger Essigsäuire gelöst und in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle einer Hydrogenolyse unterworfen. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert, das ais Rückstand erhaltene öl in 330 ml Wasser gelöst und die Lösung mit Natriumcarbonat bis pH = 9 alkalisch gemacht. Das ausgeschiedene öl wird mit Essigsäureäthylester extrahiert, die Lösung getrocknet und das Lösungsmiltel im Vakuum abdestilliert Der in dieser Weise erhaltene Tetrapeptidester wird in 350 ml wasserfreiem Dioxan gelöst und mit 48,9 g des nach Beispiel 2, Schritt 1, erhaltenen geschützten aktiven Pentapeptidester Z — VaI — Lys(BOC) — VaI — Tyr(Bu') —

— Pro - ONSu versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 20 Stunden bei Zimmeitemperatur stehengelassen, dann im Vakuum verdampft, der Rückstand in 700 ml Essigsäureäthylester gelöst, die Lösung mit Wasser, dann mit 10%iger Zitronensäure, mit 8%iger Natriumbkarbonatlösung und zuletzt wieder mit Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum verdampft. Der erhaltene rohe Carbobenzyloxy-nonapeptidester wird in 1 1 80%iger Essigsäure gelöst und in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle hydrogenolyüiert. Nach Abfiltrieren des Katalysators wild das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert, der Rückstand in 1 1 Essigsäureäthylester gelöst, die. Lösung zweimal mit je 150 ml 10%iger Zitronensäurelösung, dann mit 5%iger Natriumcarbonatlösung gewaschen, getrocknet und der Essigsäureäthylester abdestilliert. Das als Rückstand zurückbleibende, nach Lösungsmittel riechende Harz wird mit Petroläther verrieben, abfiltriert und über Phosphorpentoxyd im Vakuum getrocknet. Es werden 49,5 g (77% der Theorie) Nonapeptidester erhalten; F. 135 bis 140°C. A= 268 ιημ, log f = 2,71 (in Äthanol).

Analyse: C₆₅H₁₀₈N₁₀O₁₇ (1301,60)

Berechnet ... C 59,98, H 8,36, N 10,76%; so

gefunden .... C 59,25, H 8,70, N 10,66%.

ander umgefällt. Es werden 735 mg(88,5% der Theorie) geschützter Tetradekapeptidester erhalten. Rf² 0,75 bis 0,85; Rf⁴ 0,26 bis 0,36.
[«]? = -65,7° (c = 1, in Methanol).

Analyse: C₁₁₂H₁₈₃O₃₂N₂₅ (2391,78)

Berechnet ... C 56,2, H 7,7, N 14,6%; gefunden .... C 56,05, H 7,8, N 14,5%.

Schritt 6

H — Lys(BOC) — Lys(BOC) — Arg — Arg —

— Pro — VaI — Lys(BOC) — VaI —

— Tyr(Bu')—Pro —Asp(OBu') —GIy -

Schritt 5

Z — Lys(BOC) — LyS(BOC) — Arg(NO₂) —

— Arg(N0₂) — Pro — VaI — Lys(BOC) —

— VaI — Tyr(Bu') — Pro — ASp(OBu¹) —

— GIy — AIa — GIu(OBu¹) — OBu¹
(15 bis 28)

451mg des im Schritt 4 erhaltenen Nonapeptids und 426 mg des nach Beispiel 1, Schritt 17/a, hergestellten geschützten Pentapcptid - ρ - nitrophenyl- esters werden in 0,7 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen. Dann wird das Reaktionsgemisch mit Äther verriebenunddaserbaltene Produkt auseinem Gemisch von ilssigsäureäthylester und Äther viermal nachein-— AIa — GIu(OBu¹) — OBu¹ (15 bis 28)

5 HCl

55

60 6,1 g des im Schritt 5 erhaltenen geschützten Tetradekapeptidesters werden in 300 ml Eisessig in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, die Lösung verdampft, der Rückstand in 50 ml Wasser gelöst und die mit Eiswasser gekühlte Lösung wird mit 20 ml 0,5 N-Salzsäure versetzt. Das Peptid wird durch Zugabe von 10 ml gesättigter Kochsalzlösung aus der wäßrigen Lösung gefallt. Das Produkt wird filtriert und getrocknet. Das trokkene Produkt wird mit dem Gemisch von 80 ml Chloroform und 80 ml Äthanol verrieben: die unlöslichen anorganischen Salze werden durch Filtrieren entfernt, die Lösung wird verdampft und der Rückstand an einer Silikagel-Säule mit dem Gemisch Chloroform — Methanol — Wasser 60:26: 5 chromatographiert. Die das Hauptprodukl enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, verdampft und mil Äther verrieben. Es werden 4,35 g (76% der Theorie Tetradekapeptid - trihydrochlorid erhalten. Rf 0.3" bis 0,47; Rf⁹ 0,55 bis 0,60.

Analyse: C₁₀₄H₁₈₂O₂₆N₂₃Cl., (2277,05)

Berechnet ... N 14,2, Cl 4,65%; gefunden .... N 14,15, Cl 4,65%.

Aminosäure-Analyse:

AIa 0,95(1), Arg 2,05 (2), Asp 1,0(1), GIu 1.05(1 GIy 1,0(1), Lys2,85(3), Pro 2,05 (2), Tyr 1.0(1), VaI 2,05 (2).

Schritt 7

BOC — Ser — Tyr — Ser — Met —

— GIu(OBu¹) — His — Phe — Arg — Try —

— GIy — Lys(BOC) — Pro — VaI — GIy —

— Lys(BOC) — Lys(BOC) — Arg — Arg —

— Pro — VaI — Lys(BOC) — VaI —

— Tyr(Bu·) — Pro — AspfOBu¹) — GIy — -AIa-GIu(OBu¹)- OBu¹ (1 bis 28)

0,986 g des nach Beispiel 1. Schritt 36, hergestellt! Tetradekapeptid - hydrochlorids, 1,138 g des i obigen Schritt 6 erhaltenen Tetradekapeptid-trihydr Chlorids, 0,266 g Pentachlorphenol und 0,206 g E cyclohexyl - carbodiimid werden in 3,0 ml Dimeth; formamid, welches auch 50 mg Triäthylamin enthä gelöst. Das Reaktionsgemisch wird 2 Tage bei Zimrn« temperatur stehengelassen, dann mit peroxydfreic Äther verdünnt, und der erhaltene Niederschlag wi

an einer Silikagcl-Säule mit dem Gemisch Essigsäureäthylesler--Pyridin —Ameisensäure Wasser 60: 20:6: 5,5 chromatographiert. Die das Hauptprodukt in reinem Zustand enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und verdampft. Die weiteren Hauptprodukt ebenfalls enthaltenden Fraktionen werden separat ebenfalls gesammelt, verdampft und noch einmal chromatographiert; auf diese Weise wird eine weitere Menge des reinen geschützten Oktakozapeptids erhalten. Insgesamt werden 0,85 g (etwa 40% der Theorie) des geschützten Oktakozapcptids erhalten. Rf⁷ 0,17 bis 0,25.

Schritt 8

H — Ser — Tyr — Ser — Met — GIu — His-

— Phe — Arg — Try — GIy — Lys — Pro —

— VaI — GIy — Lys — Lys — Arg — Arg —

— Pro — VaI — Lys — VaI — Tyr — Pro —
-Asp— GIy — Ala — GIu — OH (1 bis 28)

760 mg des im Schritt 7 erhaltenen geschützten Oktakozapeptids werden in 20 ml 90%iger Trifluoressigsäure, welches auch 0,02% Mercaptoäthanol enthält, geiöst. Die Lösung wi^rd 15 Minuten stehengelassen, dann verdampft, der Rückstand in 3 ml Wasser gelöst und wieder verdampft. Das Lösen in Wasser und das Verdampfen werden noch einmal wiederholt. Zuletzt wird das Produkt in 5 ml Wasser gelöst und auf eine Säule von 20 ml Ionenaustauscherharz (im Acetat-Zyklus) aufgetragen. Die Säule wird sechsmal mit je 5 ml Wasser gewaschen und die erhaltenen wäßrigen Lösungen durch Lyophilisieren getrocknet. Es werden 580 mg (etwa 90% der Theorie) freies Oktakozapeptid erhalten. Rl* 0,30 bis 0,35.

Aminosäure-Analyse:

Asp 1.0 (1), Ser 2,0 (?.), GIu 2.03 (2). Pro 3.04 (3).
GIy 3,1 (3), AIa 1.05 (1). VaI 3.09(3).
Met 0,97 (1), Tyr 2,12 (2), Phe 1,0 (1),
His 1,2 (1), Lys 3,9 (4), Arg 2,91 (3).

Beispiel 13

Synthese vom Fragment (1 bis 28) des menschlichen Corticotropins

Schritt 1
Z — AIa — GIy — Glu(0Bu')₂

11,9 g Z—GIy—OSu werden in 170 ml Essigester gelöst, die Lösung auf 0⁰C abgekühlt und einer ebenfalls gekühlten Lösung von 12,2 gH—Glu(OBu')₂ in 60 ml Essigester zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht stehengelassen, dann mit Nl Salzsäure, mit 5%iger Natriumbicarbonatlösung und zuletzt mit Wasser ausgeschüttelt. Die Essigesterlösung wird dann getrocknet und das Lösungsmittel verdampft. Als ölartiger Rückstand wird Z—Gly— —GIu(OBu¹J₂ erhalten (Analyse: berechnet C 61.4. H 7,6, O24,9%; gefunden C 60,8, H 7.6. O 24,5%). welches dann ohne weitere Reinigung in 200 ml Essigester wieder gelöst und in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle bis zum Aufhören der CO₂-Emwicklung hydriert wird. Der erhaltene chromatographisch (Rf 0,7 Ninhydrin) einheitliche Dipeptidester H — GIy — Glu(OBu')₂ wird mit 10%iger Zitronensäurelösung extrahiert, und die wäßrige Lösung wird bis pH = 9 alkalisch gemacht. Das ausgeschiedene öl wird in Essigester extrahiert, die Essigeslerlösung getrocknet und bei 0°C mit einer Lösung von 11,1g Z — AIa — OSu in 150 ml Essigester versetzt. Das Gemisch wird bei Zimmertemperatur 24 Stunden stehengelassen, dann mit N/l Salzsäure, mit 5%iger Natriumbicarbonatlösung und zuletzt mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und bei vermindertem Druck verdampft. Der als Rückstand erhaltene feste Schaum wird mit einem Gemisch von Äther und Petroläther verrieben und filtriert.. Es werden 13,2 g (53,7% der Theorie) roher geschützter Tripeptidester erhalten. Nach Umkristallisieren aus einem Ge misch von Essigester und Petroläther werden 11,8g des gereinigten Produkts als nadeiförmige Kristalle erhalten; F. 63 bis 66⁰C.

Analyse: C₂₆H₃₉O₈N₃ (521,59)

Berechnet ... C 59,9, H 7,5, N 8,0%;
gefunden .... C 59,6, H 7,7, N 7,8%.

40

45

55 Z —Asp(OBu')-(25 bis 28)

Schritt 2
-Ala — Gly — GIu(OBu¹);,

4,8 g des im Schritt 1 erhaltenen geschützten Tripeptidesters Z — AIa — GIy — GIu(OBu¹J₂ werden in 60 ml 80%iger Essigsäure gelöst und in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle in üblicher Weise hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators und Verdampfen des Lösungsmittels wird das als Rückstand erhaltene ölartige. chromatographisch (Rf¹ 0,5) einheitliche Produkt in kochsalzhaltigem Wasser gelöst, die Lösung auf pH = 8 gestellt und das ausgeschiedene öl mit Essigester extrahiert. Die Essigesterlösung wird getrocknet und bei 0° C mit 3,2 g Z—Asp(OBu")— — OSu versetzt. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht stehengelassen, dann in der üblichen Weise gewaschen, getrocknet, das Lösungsmittel abdestilliert und der Rückstand unter Petroläther zum Erstarren gebracht. Es werden 4,75 g roher geschützter Tetrapeptidester (74.6% der Theorie) erhalten. Das Produkt kann aus einem Gemisch von Essigester und Petroläther umkristallisiert werden: F. 88 bis 90⁰C.

Analyse: C₃₄H₅₂O_nN₄ (692.78)

Berechnet ... C 58.9. H 7.5, N 8.1. O 25.4%;
gefunden .... C 58.2. H 7.2, N 8,2, O 25.6%.

Schritt 3

Z — VaI — Lys(B OC) — VaI — TyrfBu") —

— Pro — Asp(OBu') — AIa — GIy — Glu(OBu')_; (20 bis 28)

2,5 g (3.6 mMol) des im Schritt 2 erhaltenen ge schützten Tetrapeptidester werden in 28 ml 80%igei Essigsäure gelöst und in Anwesenheit von Palladium Aktivkohle bis zur Beendigung der Kohlendioxyd

6c entwicklung hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert das Filtrat unter vermindertem Druck verdampf und der Rückstand in 20 ml Wasser gelöst. Du wäßrige Lösung wird mit Natriumcarbonat auf pH = < alkalisch gemacht und der ausgeschiedene Tetrapep tidester dreimal mit je 20 ml Äther ausgeschüttelt Die vereinigten Ätherlösungen werden getrockne und verdampft. Es werden 1,8 g ölartiges rohes Pro dukt (90% der Theorie) erhalten.

Dieses Produkt wird mit 2,2 g (2.2 mMol) des nach Beispiel 2, Schritt 1, hergestellten geschützten Pentapeptid-N-hydroxysuccinimidesters in 25 ml wasserfreiem Dioxan gelöst, die Lösung 2 Tage stehengelassen, dann im Vakuum verdampft und der Rückstand in 50 ml Essigester gelöst. Die Lösung wird zweimal mit je 10 ml 10%iger Zitronensäurelösung, dann zweimal mit je 10 ml 8%iger Natriumbicarbonatlösung ausgeschüttelt, und der bei diesem Ausschütteln gebildete Niederschlag wird durch Filtrieren entfernt. Die Lösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, der Essigester abdestilliert und der Rückstand mit Petroläther auf einen Filter getragen. Es werden 3,15 g (100% der Theorie) roher geschützter Nonapeptidester erhalten; F. 140°C (Erweichung bei 115°C). Nach Umfallen aus dem Gemisch von Essigester und Petroläther schmilzt das Produkt bei 132 bis 146^oC.Rf³0,72.

Analyse: C₇₃H₁₁₄N₁₀O₁₉ (1435,73)

Berechnet ... C 60,0, H 8,0, N 9.8%;
gefunden .... C 60,45, H 8.24. N 10,25%.

Schritt 6

Schritt 4
H — VaI — Lys(BOC) — VaI — Tyr(Bu') —

— Pro — AsrXOBu¹) — AIa — GIy —

— Glu(OBu')₂ (20 bis 28)

3,1 g (2,35 mMol) des im Schritt 3 erhaltenen geschützten Nonapeptidesters.werden in 60 ml 80%iger Essigsäure gelöst und in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Aufhören der CO₂-Emwicklung wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat im Vakuum verdampft. Der Rückstand wird in 50 ml Essigester gelöst, viermal mit je 10 ml 8%igcr Natriumbicarbonatlösung, dann mit 10 ml 10%iger Natriumcarbonatlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und verdampft. Der Rückstand erstarrt beim Stehen unter Petroläther. Nach Filtrieren und Trocknen werden 17g (61% der Theorie) freier Nonapeptidester erhalten; F. 101 bis 112°C (Erweichung bei 93°C). Rf³ 0,15.

Schritt 5

Z —Lys(BOC)—Lys(BOC) — Ar₈(NO₂) —

— Arg(NO₂)— Pro — VaI — Lys(BOC) —

55

— VaI — Tyr(Bu') — Pro — Asp(OBu') —

— AIa — GIy — Glu(OBu')₂ (15 bis 28)

1,6 g (1,23 mMol) des im Schritt 4 erhaltenen freien Nonapeptidesters und 1,66 g (1,23 mMol) des nach Beispiel 1, Schritt 17/b, hergestellten geschützten Pcntapcptid-pentachlorphenylesters werden in 2 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wirdl Tag stehengelassen, dann mit wasserfreiem Äther verdünnt. der Niederschlag nitriert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Es werden 2,65 g (90% der Theorie) geschützter Tetradckapcptidester erhalten. RPO.55. H — Lys(BOC) — Lys(BOC) —Arg —Arg —

— Pro — VaI — Lys(BOC) — VaI — Tyr(Bu') —

— Pro — Asp(OBu^l) — AIa — GIy —

— GiuiOBu¹^ · 3HCl (15 bis 28)

2,65 g (1,21 mMol) des im Schritt 5 erhaltenen geschützten Tetradekapeptidesters werden in 150 ml Essigsäure gelöst und in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle hydriert. Das Fortschreiten der Reaktion wird durch Dünnschichtchromatographie verfolgt. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, das Filtrat verdampft, der Rückstand mit Äther verrieben, filtriert und getrocknet. Das erhaltene rohe Produkt (2,35 g) wird in 60 ml Wasser gelöst, die Lösung mit Eis gekühlt und durch Zugabe von 7,8 ml 0,5 N-Salzsäure bis pH = 4 angesäuert. Nach Zugabe von 10 ml gesättigter Kochsalzlösung scheidet das Tetrapeptidester-trihydrochlorid aus, es wird filtriert, mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet. Das kochsalzhaltige Produkt (1,45 g) wird in 20 ml Äthanol gelöst, mit 20 ml Chloroform versetzt und das gefällte Kochsalz wird abfiltriert. Nach Verdampfen der Lösung werden 1,35 g (53% der Theorie) freier Tetradekapeptidester erhalten. Rf¹ 0.35.

Schritt 7

BOC — Ser — Tyr — Ser — Met —
-GIu(OBu¹)-His—Phe —Arg —Try —

— GIy — Lys(BOC) — Pro — VaI — GIy
-LyS(BOC)-LyS(BOC)-Arg —Arg —

— Pro — VaI — Lys(BOC) — VaI —

— Tyr(Bu') — Pro — AsD(OBu¹) — AIa —

— GIy — Glu(OBu')₂ · 3 HCOOH (1 bis 28)

0,60 g (0.305 mMol) des nach Beispiel 1, Schritt 36, hergestellten geschützten Tetradekapeptids, 0,69 g (0,305 mMol) des im obigen Schritt 6 erhaltenen Tetradekapeptidester - trihydrochlorids und 0,48 g (1,SmMoI) Pentachlorphenol werden in 2,0 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung mit 0,124 g (0,6 mMol) Dicyclohexyl-carbodnmid versetzt und über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen. Dann wird das Reaktionsgemisch mit einer Lösung von 0,3 ml (0,215 mMol) Triethylamin in 1,5 ml Dimethylformamid neutralisiert, einen weiteren Tag stehengelassen und dann mit peroxydfreiem Äthei verdünnt. Das gefällte Produkt wird filtriert, mii Äther gewaschen und getrocknet. Das erhaltene 1,45 g rohe Produkt wird an einer 50 g Silikage enthaltenden Säule von 2 cm Durchmesser mit den Gemisch Essigester—Pyridin —Ameisensäure —- Was ser 60:20: 6: 5,5 Chromatographien. In jeden 20 Mi nuten werden Fraktionen von 3 ml gesammelt. Da reine geschützte Oktakozapeptid wird aus den Frak tionen 79 bis 110 durch Verdampfen gewonnen. E werden 0,171g (13% der Theorie) reines Produl erhalten. Rf⁷ 0.30.

	1 643 496	48
47		Schritt 2
Schritt 8

Η — Ser — Tyr — Ser — Met — GIu —

— His — Phe — Arg — Try — GIy —

— Lys — Pro — VaI — GIy — Lys — Lys —

— Arg —Arg—Pro —Val—Lys —

— VaI — Tyr — Pro—Asp — Ala —

— GIy — GIu — OH (1 bis 28)

171mg des im Schritt 7 erhaltenen geschützten Oktakozapeptids werden in 5 ml 90%iger Trifluoressigsäure gelöst; die Lösung wird 15 Minuten stehengelassen und dann verdampft. Der Rückstand wird in 2 ml Wasser gelöst und wieder verdampft; diese Operation wird noch einmal wiederholt, dann wird der Rückstand in 2 ml Wasser gelöst und durch eine 5 ml Ionenaustauscherharz im Acetat-Zyklus enthaltende Säule geführt. Die Säule wird mit 120 ml Wasser nachgewaschen, und die vereinigten Flüssigkeiten werden lyophilisiert. Es werden 127,5 mg (96% der Theorie) freies Oktakozapeptid erhalten.

Aminosäure-Analyse:

Lys 3,86 (4), Arg 2,95 (3), His 1,2 (1), Asp 1.01 (1). Ser 2,05 (2), GIu 2,05 (2), Pro 2,9 (3).
GIy 3,0 (3). AIa 0,97 (1), VaI 2,85 (3),
Met 0,96 (1). Tyr 1,77 (2), Phe 1,04 (1).

Beispiel 14

Synthese vom Fragment (1 bis 32) des menschlichen Corticotropins

Schritt 1

Z —Ser —Ala—OBu¹ (31 und 32)

7,5 g (29,5 mMol) Z—Ser—N₂H₃ werden in 80 ml Dimethylformamid suspendiert, die Suspension auf -10⁰C abgekühlt und zuerst mit 7,3 ml konz. Salzsäure, dann mit einer konzentrierten wäßrigen Lösung von 2,04 g Natriumnitrit tropfenweise versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 5 Minuten gerührt, dann mit 12,4 ml Triäthylamin vorsichtig alkalisch gemacht und dann wird die erhaltene Azidlösung mit eii.er Lösung von 4,5 g (3ImMoI) Ala —OBu' in 16 ml Dimethylformamid versetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde bei — 1O⁰C gerührt, dann bis zum nächsten Tag bei Zimmertemperatur stehengelassen. Die Lösung wird dann bei vermindertem Druck verdampft und der ölartige Rückstand im Gemisch von 150 ml Äthylacetat und 30 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird dreimal mit je 30 ml 10%iger Zitronensäurelösung, dreimal mit je 30 ml 8%iger Natriumbicarbonatlösung und zuletzt mit 30 ml Wasser ausgeschüttelt, dann wird die organische Phase über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und verdampft. Der ölartige Dipeptidester wird unter Petroläther zum Erstarren gebracht und filtriert. Es werden 8,4 g (76% der Theorie) geschützter Dipeptidester erhalten; nach Umkristallisieren aus 10%igem Äthanol F. 63 bis 65° C.

H — Ser—Ala — OBu¹ H 0OC — CH₃

(31 bis 32)

10,0 g (27,4 mMol) Z—Ser—Ala—OBu' werden in 100 ml 80%iger Essigsäure gelöst und in Anwes iheit von Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Aui. ören der C O₂-Emwicklung wird der Katalysator abfiltriert und die Lösung bei vermindertem Druck verdampft. Der ölige Rückstand wird unter Äther zum Erstarren gebracht und filtriert. Es werden 6,9 g (S7% der Theorie) freies Dipeptidesteracetat erhalten, F. 76 bis 78°C. Rf¹ 0,55.

Schritt 3

Z — GIu(NH₂) — OPCP (30)

14,0g (5OmMoI) Z-GIu(NH₂), 13,3 g (5OmMoI) Pentachlorphenol und 10,5 g (50 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid werden in 15Om! Dimethylformamid bei O⁰C gelöst. Das Reaktionsgemisch wird 1 Stunde bei 0⁰C gehalten, dann auf Zimmertemperatur erwärmen gelassen. Am nächsten Tag wird der Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und die Lösung im Vakuum verdampft. Der erhaltene kristalline Rückstand wird mit Äther auf einen Filter gebracht. Es werden 17,25 g (65% der Theorie) aktiver Ester erhallen, F. 179 bis 181⁰C.

Schritt 4
Z — GIu(NH₂) — Ser — AIa — OBu¹ (30 bis 32)

4,2 g (14,4 mMol) Dipeptidestersalz Ser—AIa— OBu¹-Acetat und 7,6 g(14,4 mMol) Z-GIu(NH₂)-— OPCP werden im Gemisch von 5 ml wasserfreiem Pyridin und 30 ml Dimethylformamid gelöst. Das Reaktionsgemisch wird 20 Stunden stehengelassen, dann unter vermindertem Druck verdampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird in Äther aufgenommen, mit 8%iger Natriumbicarbonatlösung und mit Wasser gewaschen und dann getrocknet. Es werden 4,8 g (67,5% dei Theorie) geschützter Tripeptidester erhalten, F. 183 bis 185° C. Nach Umkristallisieren aus Wasser schmilzt der reine Ester bei 196 bis 197° C; Erweichung bei 193°C.

Analyse: C₁₈H₂₆N₂O₆ + 1/3 H₂O (372,42)

Berechnet ... C 58,10, H 7,25, N 7,53%;
gefunden .... C 58,18, H 7,26, N 7,80%.

Analyse: C₂₃H₃₄N₄O₈ (494,63)
Berechnet ... N 11,35%;
gefunden .... N 11,33%.

Schritt 5

Z — Asp( OBu¹) — GIu(N H₂) — Ser —
— Ala —OBu'(29 bis 32)

4,1 g (8,3 mMol) geschützter Tripeptidester Z—GIu(NH₁)-Ser—Ala—OBu¹ werden in 400 ml Methanol unter Erwärmung gelöst, dann wird die auf Zimmertemperatur abgekühlte Lösung mit einer methanolischen Lösung von 300 mg (8,3 mMol) Chlorwasserstoff versetzt und in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle bis zum Aufhören der CO₇-EnI-wicklung hydriert. Der Katalysator wird dann abfiltriert und die Lösung unter vermindertem Druck verdampft. Der als Rückstand erhaltene feste Schaum wird in 32 ml Dimethylformamid gelöst, mit 3,45 g (8,2 mMol) aktivem Ester Z—Asp(OBu')—ONSu

und mit 1,16 ml (8,3 mMol) Triäthylamin versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 2 Tage stehengelassen, dann verdampft und der ölige Rückstand mit Äther zum Erstarren gebracht. Das abfiltrierte Produkt wird mit Äther, mit 8%iger Natriumbicarbonatlösung und zuletzt mit Wasser gewaschen und getrocknet. Es werden 4,8 g (87,5% der Theorie) geschützter Tetrapeptidester erhalten, F. 181 bis 183⁰C.

Analyse: C₃₁H₄₇N₅O₄ (665,75)

Berechnet .. C 55,9, H 7,10, N 10,60%;
gefunden ... C 55,9, H 7,20, N 10,60%.

Schritt 6

Z — GIu(OBu¹)—Asp(OBu') — GIu(N H₂) —

— Ser—Ala— OBu¹ (28 bis 32)

6,0 g (9,0 mMol) des im Schritt 5 erhaltenen geschützten Tetrapeptidesters werden in 100 ml 80%iger Essigsäure gelöst und in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle bis zum Aufhören der CO₂-Entwicklung hydriert. Der Katalysator wird dann abfiltriert, das Lösungsmittel verdampft, der als Rückstand erhaltene ölartige Tetrapeptidestsr mit 20 m! Äthanol versetzt, der Alkohol abdestilliert; diese Operation wird noch einmal wiederholt, dann wird der Rückstand in 20 ml Dimethylformamid gelöst und mit 5,3 g (9,0 mMol) des geschützten aktiven Esters Z—GIu(OBu¹)-OPCP versetzt. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen, dann bei vermindertem Druck verdampft, der Rückstand mit Äther verrieben, filtriert und am Filter mit Äther, mit 8%iger Natriumbicarbonatlösung, zuletzt mit Wasser gewaschen und getrocknet. Es werden 6,6 g (86% der Theorie) geschützter Pentapeptidester erhalten, F. 170 bis 173° C. Rf³ 0,65.

Analyse: C₄₀H₆₂N₆O₁₄ (850,97)

Berechnet ... C 56,4, H 7,35, N 9,90%;
gefunden ... C 55,8, H 7,45, N 9,75%.

Schritt 7

Z — VaI — Lys(BOC) — VaI — TyrfBu¹) —

— Pro — AspiOBu¹) — AIa — GIy—

— GIu(OBu¹J-AsP(OBu¹) — GIu(NH₂) —

— Ser—Ala — OBu¹ (20 bis 32)

1,2 g (1,4 mMol) des im Schritt 6 erhaltenen geschützten Pentapeptidesters werden in 50 ml Äthanol gelöst und in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle in der üblichen Weise hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators und Verdampfen der Lösung wird der Rückstand mit 1,68 g (1,4 mMol) des aus dem nach Beispiel 2, Schritt 2, erhaltenen geschützten Oktapeptid hergestellten N-Hydroxysuccinimidesters in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht stehengelassen, dann verdampft, der Rückstand mit Wasser verrieben, filtriert und am Filter mit 8%iger Natriumhydrocarbonatlösung und dann mit Wasser gewaschen. Es werden 2,25 g (85% der Theorie) roher geschützter Tridekapeptidester erhalten. Rf³ 0,55; das Produkt zeigt bei der Chromatographie eine gereinigte Verunreinigung von geschütztem Oktapeptid (Rf³ 0,15).

Schritt 8

Z — Lys(BOC) — Lys(BOC)—Arg(NO₂) —
Z — Lys(BOC — Lys(BOC)—Arg(NO₂) —
—Arg(NO₂)—Pro —Val —Lys(BOC) —
— VaI — Tyr(Bu^l) — Pro—Asp(OBu') —
—AIa — GIy — GIu(OBu¹)—Asp(OBu') —
-GIu(NH₂)-Ser —Ala—OBu¹ (15 bis 32)

ίο 2,25 g (1,19 mMol) des im Schritt 7 erhaltenen geschützten Tridekapeptidesters werden in 50 ml Äthanol gelöst und in Anwesenheit von Palladium-\ktivkohle hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und die Lösung verdampft. Der als Rückstand erhaltene freie Tridekapeptidester wird mit 1,44 g (1,06 mMol) des nach Beispiel 1, Schritt 17/b, hergestellten geschützten Pentapeptid-pentachlorphenylesters in 5 ml Dimethylformamid gelöst. Das Gemisch wird 1 Tag stehengelassen, dann bei vermindertem Druck eingeengt und der Rückstand unter wasserfreiem Äther zum Erstarren gebracht. Das Produkt wird filtriert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Es werden 2,75 g (91% der Theorie) rohes Produkt erhalten, dieses wird in 10 ml Essigester gelöst, auf eine 60 g Silikagel enthaltende Säule von 2 cm Durchmesser aufgetragen und mit dcni Gemisch Essigcstcr—Pyndin — Essigsäure — Wasser 120:10:3 :5,5 eluiert. In jeden 20 Minuten werden Fraktionen von 3 ml aufgefangen; durch Verdampfen der vereinigten Fraktionen 129 bis 141 werden 0,3 g geschütztes Oktadekapeptid erhalten. Rf² 0,35.

35

Schritt 9

H — Lys(B OC) — Lys(BOC)—Arg—Arg —

— Pro — VaI — Lys(BOC) — VaI —

— Tyr(Bu') — Pro—Asp(OBu')—AIa —

— GIy — GIu(OBu¹) — GIu(NH₂) — Ser —

— AIa — OBu¹ · 3 HCl (15 bis 32)

300mg des im Schritte erhaltenen geschützten Oktadekapeptidesters werden in 20 ml 80%iger Essigsäure gelöst und in Anwesenheit von Palladium-Aktivkohle hydriert. Das Fortschreiten der Reaktion wird durch Dünnschichtchromatographie kontrolliert. Nach Beendigung der Reaktion wird die Lösung abfiltriert, im Vakuum verdampft, der Rückstand mit wasserfreiem Äther verrieben, filtriert und getrocknet. Das erhaltene Oktapeptidacetat wird in 7 ml 0,2 N-Salzsäure bei O⁰C gelöst und das Produkt durch Zugabe von 7 ml gesättigter Kochsalzlösung gefällt. Nach Filtrieren und Waschen mit gesättigter Kochsalzlösung wird das Produkt getrocknet; es werden 144 mg (50% der Theorie) Oktadekapeptid-

trihydrochlorid erhalten. Rf¹ 0,40.

Schritt 10

BOC- Ser — Tyr — Ser — Met —
-GIu(OBu¹)-His —Phe—Arg —Try —

— GIy — Lys(BOC) — Pro — VaI — GIy —

— Lys(B OC) —Lys(BOC) — Arg — Arg —

— Pro — VaI — Lys(BOC) — VaI — Tyr(Bu') -

— Pro — Asp(OBu') — AIa — GIy —

— GIu(OBu¹)-Asp(OBu')—GIu(NH₂)-

— Ser —Ala —OBu¹^HCOOH(I bis 32)

120 mg (0,060 mMol) des nach Beispiel 1, Schritt 36, hergestellten geschützten Tetradekapeptids, 144 mg (0,053 mMol) des im obigen Schritt 9 erhaltenen Oktadekapeptidester - trihydrochlorids, 97 mg (0,36 mMol) Pentachlorphenol und 25 mg (0,12 mMol) Dicyclohexyl - carbodiimid werden in 0,4 ml Dimethylformamid gelöst. Das Gemisch wird 1 Tag stehengelassen, dann mit einer Lösung von 0,06 ml (0,43 mMol) Triäthylamin in 0,4 ml Dimethylformamid versetzt und einen weiteren Tag stehengelassen. Dann wird das Reaktionsgemisch durch Zugabe von peroxydfreiem Äther gefällt, filtriert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Das erhaltene rohe Produkt (270 mg) wird an einer Säule von 8 g Silikagel mit dem Gemisch Essigester—Pyridin—Ameisensäure— Wasser 60:20:6:5,5 Chromatographien. Es werden in jedan 20 Minuten Fraktionen von 0,5 ml gesammelt. Das Hauptprodukt wird durch Verdampfen der Fraktionen 109 bis 135 gewonnen. Es werden auf diese Weise 24 mg (10% der Theorie) geschütztes Dctriakontapeptid erhalten. Rf⁷ 0,2.

Schritt 11

H —Ser —Tyr —Ser —Met —Glu —His —
— Phe — Arg — Try — GIy — Lys — Pro —

— VaI — GIy — Lys — Lys—Arg—Arg —

— Pro — VaI — Lys — VaI—Tyr — Pro —
—Asp—Ala — GIy — GIu—Asp —

— GIu(NH₂) — Ser—Ala — OH (1 bis 32)

17 mg des im Schritt 10 erhaltenen geschützten Dotriakontapeptids werden in 0,5 ml 90%iger Trifluoressigsäure gelöst, und nach 15 Minuten Stehen

ίο wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wird in 0,5 ml Wasser gelöst, verdampft und diese Operation noch einmal wiederholt. Zuletzt wird der Rückstand in 0,5 ml Wasser gelöst und durch eine 8 ml Ionenaustauscher-

harz im Acetat-Zyklus enthaltende Säule geführt. Die Säule wird mit 10 ml Wasser nachgewaschen, und die vereinigten wäßrigen Lösungen werden lyophilisiert. Es werden 11 mg (80% der Theorie) freies Dotriakontapeptid erhalten. Ff⁸ 0,45.

Amino-Analyse:

Lys 4,16 (4), Arg 2,98 (3), His 1,5 (1), Asp 2,0 (2),
Ser 3,4 (3), GIu 3,5 (3), Pro 3,2 (3),
GIv 3,5 (3), AIa 1,6 (2), VaI 3,2 (3),
Met 1,1 (1), Tyr 2,1 (2). Phe 1.3 (1).

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von menschlichem Corticotropin der Formel IIA

H — Ser — Tyr — Ser — Met — Glu —

1 2 3 4 5

— His — Phe — Arg — Try — Gly—

6 7 8 9 10

— Lys — Pro — Val — Gly — Lys —

U 12 13 14 IS

— Lys — Arg — Arg — Pro — Val —

16 17 18 19 20

— Lys — Val — Tyr — Pro — Asp —

21 ■ 22 23 24 25

— AIa — Gly — Glu — Asp — GIn —

26 27 28 29 30

— Ser—AIa — Glu — AIa — Phe —

31 Ί"! 33 34 35

— Pro — Leu — Glu — Phe — OH (II A)

36 37 38 39

bzw. der analogen, aber im Nonapeptid-Fragment (25 bis 33) die Aminosäuresequenz IIB, 1IC bzw. HD

IO

15

—Asp—GIy—Ala—GIu—Asp-

25 26 27 28 29

—Gin—Leu—Ala—Glu—

30 31 32 33

(Π B)

-Asp—Gly—Glu—Ala—Glu— (HC) ,.

25 26 27 28 29

-Asp—Ser—Ala—Gin—

30 31 32 33

-Ala—Gly—Glu—Asp—Asp— (HD)

25 26 27 28 23

Glu—Ala—Ser—GIn-

30 31 32 33

35

aufweisenden Schweine-, Rinder- bzw. Schaf-Corticotropine sowie deren mindestens die ersten 15 Aminosäuren der obigen Sequenzen IIA bis IID enthaltende Fragmente der allgemeinen Formel VI

H—Ser—Tyr—Ser—Met—Glu— (VI) —His—Phe—Arg—Try—Gly—

—Lys—Pro—Val—Gly—Q-T

worin T für eine Hydroxyl- oder Aminogruppe steht und Q eine der Aminosäuresequenzen (15 bis 39) der Nonatriakontapeptide der Formel IIA bis HD oder ein beliebiges, mit der obigen Anfangsgruppe ^!5Lys beginnendes und aus 1 bis 24 Aminosäureresten bestehendes Teilstück der obigen Sequenzen(15bis 39)bedeutet, dadurch ss gekennzeichnet, daß man mit dem aus den Aminosäuren (1 bis 14) der Sequenz der natürlichen Corticotropine bestehenden und in an sich bekannter Weise geschützten Tetradekapeptid-Derivat der allgemeinen Formel III

X —Ser —Tyr —Ser —Met— (111)

— GIu(OY) — His — Phe —

— Arg(X') — Try — Gly — Lys(X)—

— Pro —Val —Gly —R

worin X und Y Tür entfernbare Schutzgruppen, X' für einen zum Schutz der Guanidinogruppe geeigneten Substituenten und R für eine Hydroxylgruppe oder einen die Carboxylgruppe aktivierenden Substituenten stehen, das aus den weiteren Aminosäuren des gewünschten Corticotropins oder Corticotropin-Fragments bestehende geschützte Peptid der allgemeinen Formel V

H —Q'—T' (V)

worinT' für eine Amino-, Alkoxy- oder Aryloxygruppe, Q' für eine geschützte Corticotropin-Aminosäuresequenz (15 bis 39) der allgemeinen Formel IVA, IVB, IVC bzw. IVD

— Lys(X) — Lys(X)—Arg(X')— (IVA) —Arg(X') — Pro — Val — Lys(X)—

— Val — TyrOn — Pro — Asp(OY) — —AIa — GIy — GIu(OY) — —Asp(OY)—Gin—Ser—Ala— —GIu(OY)-Ala—Phe—Pro—

— Leu — GIu(OY) — Phe —

— Lys(X) — Lys(X)—Arg(X') —

— Arg(X') — Pro — Val — Lys(X)—

— Val — TyrfY) — Pro—Asp(OY) —

— Gly — AIa — GIu(OY)—

— Asp(OY) — GIn — Leu—AIa —

— GIu(OY) — AIa — Phe — Pro—

— Leu — GIu(OY) — Phe —

-LyS(X)-LyS(X)-ATgPC)- (WC) —Arg(X') — Pro—Val — Lys(X) —

— Val — Tyr(Y) — Pro—Asp(0Y) —

— Gly — GIu(OY)-AIa —

— GIu(OY) — Asp(OY) — Ser—

— AIa — GIn — AIa — Phe — Pro—

— Leu — GIu(OY) — Phe —

— Lys(X) —LysfX)—ArgfX') — (IVD)

— Arg(X') — Pro — Val — Lys(X)—

— Val — TyrfY) — Pro—AIa—

— Gly — GIu(OY)—Asp(OY) —

— Asp(OY) — GIu(OY)—AIa —

— Ser — GIn—AIa — Phe — Pro—

— Leu — GIu(OY)- Phe —

oder für ein beliebiges, mit der geschützten Aminosäuregruppe¹⁵ LysfX) beginnendes Teilstück dieser Sequenzen (15 bis 39) steht, wobei in diesen Formeln X, X' und Y die obige Bedeutung haben, acyliert und die Schutzgruppen des erhaltener Peptids in an sich bekannter Weise abspaltet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß man, die Acylierung in An Wesenheit eines Carbodiimids und einer Hydroxyl verbindung durchrührt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Acylierung mit Dicyclohexylcarbodiimid als Carbodiimid und Pentachlorphenol als Hydroxylverbindung durchführt.

Die Erfindung betrifft die Herstellung von menschlichem Corticotropin und von analogen, eine derjenigen der natürlichen Corticotropine entsprechende Aminosäure-Sequenz aufweisenden und biologisch ebenfalls aktiven Polypeptiden.

In der Reihe der aus der Hypophyse verschiedener Tierarten isolierbaren, als adrenocorticotropes Hormon (ACTH) wirksamen Polypeptide, der sogenannten Corticotropine, wurde nach der in reiner Form erfolgten Isolierung und Strukturaufklärung des Schweine-, Schaf- und Rindercorticotropins bekannterweise auch die Isolierung und Strukturbestimmung des menschlichen Hypophysehormons mit Erfolg durchgeführt. Es hat sich dabei herausgestellt, daß sämtliche bisher bekannte Corticotropine aus Peptidketten von 39 Aminosäuren bestehen, welche sich voneinander — bei sonst gleichem Aufbau — nur in der Sequenz eines (aus den Aminosäuren 25 bis 33 bestehenden) Ncnapeptid-Teiles unterscheiden: