Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptidderivates
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptids der Formel
EMI1.1
<tb> <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb> H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser
11 12 13 14 13 16 17 18 19 20 21 Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg
22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Phe-Ser-Gly- Nle -Gly-Phe-Gly- Pro-Glu-Thr-Pro- NR2, seiner therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe.
Das bisher unbekannte Polypeptid kann nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden, wobei die Aminosäuren in der in der obigen Formel festgelegten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden und bei einer geeigneten Stufe der Synthese die Disulfidbrücke gebildet wird.
Beim A bau des neuen Polypeptids haben sich für die Blockier-:'ne der -Carboxylgruppe, beispielsweise in der nachstenc:nu beschriebenen Teilsequenz A, die tert. Butyloxy-Gruppe bewährt, doch können auch andere Schutzgruppen, wie die Methoxy-, die Athoxy-, die tert. Amyloxy-. die Amid- oder die Benzyloxygruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der lmidazolgruppe des Histidinrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C hat sich die Triphenylmethylgruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbo-tert.-butoxy-. die Carbo-tert.-amyloxy-, die Carbobenzoxy- oder die Benzylgruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der Guanidogruppe des Argininrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz E wurde die Nitrogruppe verwendet, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Tosylgruppe, die p-Nitrocarbobenzoxygruppe oder die 2-(lsopropyloxycarbonyl)-3,4,5,6-tetrachlorbenzoylgruppe $verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt der Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.
Das neue Polypeptid lässt sich auch in Form seiner Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen Säuren. wie Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxy- oder 2-Acetoxybenzoesäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzol- oder Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure. Sulfanilsäure sowie polymere Säuren wie Gerbsäure. Alginsäure, Polygalacturonsäure, Polyphloretinphosphat oder Carboxymethylcellulose und Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäure, z. B. Salzsäure oder Bromwasserstoft- säure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure in Frage.
Als Schwermetallkomplex kommt z. B. derjenige von Zink## in Frage.
Die Ausgangsprodukte zur Herstellung des neuen Polypeptids können, sofern sie bisher nicht bekannt waren. nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.
Die neue Verbindung stellt ein wichtiges therapeutisches Prinzip dar. das den Calciumpiasmaspiegel. insbesondere den erhöhten Calciurnplasmaspiegel senkt und als Antagonist des Parathormons eine positive Calciumbilanz im Knochen bewirkt. Es ist somit indiziert bei allen Zuständen, bei welchen eine Senkung des Plasma calciumspiegcls erwünscht ist. z.
B. Flypercalcämien verschiedener Genese. Alanael des endogenen Thyreocalcitonins infolge Ausfalls von Schilddrüsengewebe, Hyperfunktion der Nebenschilddräsen. Die neue Verbindung ist indiziert bei allen Knochenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine vermehrte Calciumfixation im Knochen erwünscht ist, z. B. Osteoporose verschiedener Genese (z. B. postklimakterisch, posttraumatisch. bedingt durch Corticosteroidtherapie oder Inaktivität usw.), Frakturen, Osteomalacie, Rachitis sowie insbesondere zur Kombinationstherapie mit Calcium bzw. Phosphat.
Die biologische Prüfung der neuen Verbindung ergab eine Wirksamkeit von etwa 100 bis 450 MRC-Einheiten/mg Peptid. Die erforderliche Tages dosis (i. m. verabreicht) in MRC-Einheiten beträgt 20 mE bis 10 E, vorzugsweise 100 mEíkg Tiergewicht. Beim Menschen beträgt die tägliche Dosis (i. m. verabreicht) in MRC Einheiten 1 bis 500 E. Vorzugsweise wird eine tägliche Dosis von 5 E i. m. verabreicht.
Die neue Verbindung kann als Heilmittel, z.B. in Form pharmazeutischer Präparate. Verwendung finden.
Diese enthalten die genannte Verbindung in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit der neuen Verbindung nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat. Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi arabicum, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z.B. in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzmittel oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere, therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. Die neue Verbindung kann auch in Form eines Depotpräparates verabreicht werden.
Die neue Verbindung und ihre Salze können auch als Zwischenprodukt zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.
Es werden folgende Abkürzungen verwendet:
Z = Carbobenzoxy
Bzl = Benzyl
BOC = tert.-Butyloxycarbonyl
Trit = Trityl-Triphenylmethyl
OTB = tert.-Butyloxy
ONP = p-Nitrophenylester
OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxv
OMe = Methoxy
OEt = Äthoxy NO2 = Nitro Ser = L-Seryl
Asn = L-Asparaginyl
Leu = L-Leucyl
Thr = L-Threonyl
Val = L-Valyl
Ala = L-Alanyl
Tyr = L-Tyrosyl
Trp = L-Tryptophanyl
Arg = L-Arginyl
Phe = L-Phenylalanyl
Glu = L-Glutamyl
His = L-Histidyl
Pro = L-Prolyl
Gly = Glycyl
Nle = L-Norleucyl
Cys = L-Cysteinyl
In den folgenden Beispielen, die die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Teilsequenz A: L-Phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-y-tert.-butyloxy-
L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid (H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2)
Man löst bei -5 134 g Z-Thr-NH-NH2 in 2 Liter in Salzsäure und versetzt mit 0,55 Liter in Natriumnitrit. Nach 5 Minuten wird Kaliumcarbonat bis pH 9 zugegeben, das entstandene Azid mit Äthylacetat extrahiert und eine Lösung von 80 g H-Pro-NH2 hydro- chlorid in 100 ml Wasser, 500 ml Dimethylformamid und 77 ml Triäthylamin hinzugefügt. Man verdampft das Äthylacetat bei 200 im Vakuum und lässt über Nacht bei 250 stehen. Die restliche Lösung wird im Vakuum verdampft, der Rückstand in Äthylacetat gelöst, mit Wasser, verdünnter Salzsäure und einer wässrigen Kaliumcarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet.
Man verdampft im Vakuum, löst in warmem Äthylacetat und kühlt ab. Man erhält Z-Thr-Pro-NH2; Smp. 1480, [e] 2D = -720 in 95 % Essigsäure. Man löst hierauf 90 g Z-Thr-Pro-NH2 in 2 Liter Dioxan und 260 ml in Salzsäure und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Man filtriert, verdampft die Lösung im Vakuum, wäscht den Rückstand mit Äthylacetat und erhält
H-Thr-Pro-NH2.HCl; Smp. 2160, [a]2D0 - -64 in 95% Essigsäure. Dieses wird in 500 ml Dimethylformamid, 50 ml Wasser und 32 ml Triäthylamin gelöst und 118 g Z-Glu(OTB)-OCP und 800 ml Tetrahydrofuran zugegeben. Man lässt über Nacht bei 200 stehen, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand mit Äthyläther.
Man erhält Z-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2, Smp. 650 (Zers.); [a] # = -180 in Dimethylformamid.
Man löst 80 g ZGlu(OTB)-Thr-Pro-NH2 in 1,5 Liter Dioxan und 200 ml Wasser und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators.
Die Lösung wird filtriert und im Vakuum verdampft und der Rückstand mit Diäthyläther versetzt, wobei H-Glu (OTB)-Thr-Pro-NH2 erhalten wird; Smp. 650 (Zers.), [a] # = - 280 in Dimethylformamid. Dieses wird in 700 ml Dimethylformamid bei 0 gelöst, 200 ml Acetonitril, 68 g Z-Phe-Gly-Pro-OH, 18 g N-Hydroxysuccinimid und 32 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzugefügt, über Nacht bei 200 stehengelassen, filtriert, im Vakuum eingedampft und mit Athylacetat versetzt. Danach wäscht man die Lösung mit Wasser, verdünnter Salzsäure und wässriger Kaliumcarbonatlösung, trocknet über Natriumsulfat, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand aus ÄthylacetatlÄthyläther. Man erhält .
Z-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB) -Thr-Pro-NH2 Smp. 1200 (Zers.). {a] 2E)0 = - 66 in Dimethylformamid, das man in 1500 ml Dioxan und 300 ml Wasser löst.
Man gibt 30 g Palladiumkohle )10 %) zu und hydriert bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert, dampft das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand aus Dioxan. Man erhält das H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB) Thr-Pro-NH2; Smp. 1530 [e] 20 = - 790 in Dimethylformamid.
Teilsequenz B: Benzyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycin (Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH) a) Benzyloxycarbonyl-L-norleucyl-glycin (ZNle-Gly-OH)
Man löst 31,6 g H-Gly-OH in 420 ml ln NaOH, gibt 840 ml Tetrahydrofuran zu, versetzt anschliessend mit 130 g Z-Nle-ONP, schüttelt, bis die Lösung klar wird, lässt eine Nacht bei 250 stehen. Dann wird im Vakuum auf 500 ml konzentriert und die erhaltene wässige Lösung mit in NaOH auf pH 9 gestellt, zweimal mit Äther extrahiert, dann mit 4n Salzsäure angesäuert, mit Essigester extrahiert. Die Essigesterlösung wäscht man mit Wasser und 30%iger Kochsalzlösung, trocknet über Natriumsulfat, dampft im Vakuum ein. Den Rückstand verreibt man mit Äther, lässt 2 Stunden bei -200 kristallisieren.
Man erhält Z-Nle-Gly-OH, Smp. 1380, [α]# = -4 in Dimethylformamid.
b) Benzyloxycarbonyl-glycyl-L-norleucyl-glycin (Z-Gly-Nle-Gly-OH)
Man löst 100 g Z-Nle-Gly-OH in 1000 ml 4n HBr/ Eisessig, lässt 50 Minuten bei 250, verreibt mit Äther, filtriert Kristalle ab und wäscht gut mit Äther. Man erhält HBr H-Nle-Gly-OH, [a] 1D0 = +24,70 in Essigsäure (95 %).
Man löst 84 g HBr H-Nle-Gly-OH in 240 ml Wasser, versetzt mit 152 ml 4n NaOH, 800 ml Tetrahydrofuran und 91 g Z-Gly-ONP. Man schüttelt 1 Stunde bei 250 und lässt dann 2 Tage bei 250 stehen. Man konzentriert im Vakuum auf 500 ml, stellt mit in NaOH auf pH 9 und extrahiert mit Äther. Die wässrige Phase wird mit in Salzsäure angesäuert, dann zweimal mit Essigester extrahiert. Man wäscht mit Wasser, 30 %iger Kochsalzlösung, trocknet über Natriumsulfat, dampft im Vakuum ein und verreibt den Rückstand mit Äther.
Man erhält Z-Gly-Nle-Gly-OH, Smp. 1550, [α]# = -5,6 in Dimethylformamid.
c) Benzyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl glycin (Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH)
Man löst 89,5 g Z-Gly-Nle-Gly-OH in 900 ml 4n HBr/Eisessig, lässt 50 Minuten bei 250 stehen, dampft am Vakuum ein, verreibt mit Äther, abfiltriert, wäscht gut mit Äther, trocknet im Vakuum, löst in 280 ml Wasser, etwa 650 ml Dimethylformamid, gibt 66,5 ml Triäthylamin zu und versetzt mit dem Azid, das wie folgt erhalten wird:
:
Man kühlt 940 ml in Salzsäure auf -5 , gibt 96 g Z-Ser-NH-NH2 zu und tropft dann bei -50 360 ml in Natriumnitrit ein, rührt noch 6 Minuten bei überschichtet mit etwa 600 ml Essigester von 00, stellt unter Zugabe von festem Natriumcarbonat auf pH 8,5, trennt die Essigesterphase ab, extrahiert nochmals, trocknet die Lösung über Natriumsulfat und filtriert. Die Reaktionslösung dampft man im Vakuum ein, versetzt den Rückstand mit 600 ml Wasser, säuert an, extrahiert mit Äthylacetat, wäscht mit Wasser und 30%iger Kochsalzlösung, kühlt auf 00, filtriert Kristalle ab. Man erhält Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH, Smp. 2100 (mit Zers.), [α]# = -8 in Dimethylformamid.
Teilsequenz C: N#Nimid. Ditrityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenyl alaninhydrazid HCl) [(Trt)-His(Trt)-Arg-Phe
NH-NH2 HCl a) Z-Arg(NO2)-Phe-OMe
51,8 g H-Phe-OMe HCl werden in 1 Liter Ather und etwa 50 ml Eiswasser gelöst und unter Rühren und Kühlen genügend Natriumcarbonat zugegeben, bis alles Wasser abgebunden ist. Man filtriert und dampft das Filtrat bis zur Gewichtskonstanz ein, wobei ein farbloses Öl erhalten wird.
67,6 g Z-Arg(NOa)-OH werden in 300 ml Acetonitril und 150 ml Dimethylformamid gelöst und mit 41,2 g H-Phe-OMe versetzt. Danach wird auf - 200 abgekühlt und eine Lösung von 43,4 g Dicyclohexylcarbodiimid in 100 ml Acetonitril zugegeben. Das Ganze lässt man unter zeitweiligem Umschütteln während 4 Stunden im Eiskasten stehen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Eindampfrückstand wird in 1 Liter Essigester gelöst und hierauf in der Kälte mit 1n Natronlauge, Wasser, 1n Schwefelsäure, Wasser und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester-Phase wird vollständig eingedampft.
Nach Umkristallisieren aus Essigester/Petroläther erhält man ZArg(NO2)-Phe-OMe; Smp. 131 bis 1330, [a] 2D8 = - -7 in Methanol, -40 in Dimethylformamid.
b) H-Arg(NO2)-Phe-OMe 0,5 HeO- 1,2 HBr
20 g Z-Arg(NO2)-Phe-OMe werden in 50 ml Eisessig gelöst und unter leichtem Kühlen 50 ml 40%ige Bromwasserstoffsäure in Eisessig zugesetzt. Danach lässt man das Ganze unter zeitweiligem Umschütteln während 1 Stunde bei 200 stehen. Nach vollständigem Eindampfen wird der Rückstand in 200 ml Wasser gelöst und zweimal mit Äther gewaschen. Die wässrige Phase wird vollständig eingedampft und der Rückstand aus Methanol/Äther umkristallisiert. Smp. 165-167 mit Zers., [α# = +18 in Methanol, + 14 in Dimethylformamid.
c) Z-His(Z)-Arg(NOs)-Phe-OMe
46,1 g H-Arg(NOo)-Phe-OMe 0,5 H.O 1,2 HBr werden in 100 ml Wasser gelöst, hierauf erwärmt und anschliessend abgekühlt. NachZugabe von Chloroform und Eis wird mit Ammoniak auf pH 9 gestellt. Die Chloroformphase wird noch einmal mit Wasser gewaschen, anschliessend über Natriumcarbonat getrocknet und filtriert.
Dem Filtrat wird eine Lösung von 44,5 g Z-His(Z)-OH, 12,1 g Hydroxysuccinimid in 200 ml Acetonitril und 100 ml Pyridin zugesetzt, danach das Ganze auf - -20 abgekühlt und mit einer Lösung von 21,1 g Dicyclohexylcarbodiimid in 70 ml Acetonitril versetzt. Anschliessend wird unter zeitweiligem Rühren 4 Stunden im Eiskasten stehengelassen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wird in Essigsäureäthylester aufgenommen und anschliessend folgendermassen gewaschen: 1OXige Kaliumcarbonatlösung (pH zur 10), Wasser, gesättigte Kochsalzlösung, Wasser, gesättigte Kochsalzlösung, Schwefelsäure (pH 3), Wasser, Kochsalzlösung. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester Phase wird vollständig eingedampft, wobei ein hellbeiger Schaum erhalten wird.
Dieser Schaum wird je zweimal in wenig Methanol gelöst und mit Äther gefällt. Die Ätherphasen werden abdekantiert und der Niederschlag getrocknet; man erhält Z-His(Z)-Arg(NO9)-Phe-OMe (amorpher Schaum) [ri] # = - 80 in Methanol, - 80 in Dimethylformamid.
d) H-His-Arg-Phe-Ome. 4HCl
25 g Z-His(Z)-Arg(NOa)-Phe-OMe werden in 800 ml Eisessig gelöst. Danach werden 10 g 10 % Palladium auf Aktivkohle in 200 ml ln Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer 2stündigen Hydrierung unterworfen und anschliessend der Katalysator abfiltriert. Das Filtrat wird erneut mit 5 g lOaó Palladium auf Aktivkohle in Wasser versetzt und der Hydrierung unterworfen, die nach 51,' Stunden beendet ist.
Hierbei werden etwa 80 % der theoretischen Menge Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft, wobei H-His Arg-Phe-OMe .4 4HC1 in Form eines amorphen Schaumes erhalten wird.
e) Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe. HCl
21,5 g H-His-Arg-Phe-OMe. 4HCL werden in 100 ml Pyridin und etwa 100 ml Dimethylformamid gelöst. Bei etwa +50 wird bis pH 9 Triäthylamin zugegeben und anschliessend eine Lösung von 29 g Tritylchlorid in 300 ml Pyridin während 5 Minuten zugetropft. Nach Beendigung der Zugabe wird von Zeit zu Zeit das pH geprüft und nötigenfalls wieder mit Triäthylamin auf etwa pH 9 gestellt. Das Ganze wird nach ungefähr 4 Stunden eingedampft, der Rückstand in Chloroform und Wasser aufgenommen und unter Zugabe von wenig ln Salzsäure auf pH 4 gestellt. Man trennt die Chloroformphase ab, wäscht sie zweimal mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft vollständig ein. Der Rückstand wird mit Äther versetzt und vom Äther anschliessend abfiltriert, wobei Trt-His(Trt)-Arg-Phe OMe HC1 erhalten wird.
f) Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NH-NHo HC1
17 g Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe HCl werden in 200 ml Methanol gelöst und mit 40 ml Hydrazinhydrat versetzt. Danach wird 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen. Man dampft ein, löst den Rückstand in Chloroform und wäscht zweimal mit Wasser. Die Chloroform-Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Hierauf wird der Rückstand mit Äther gewaschen und abfiltriert; er besteht aus Trt-His(Trt) Arg-Phe-NH-NH.2 HCl; Smp 1580, [a] D18 = - 90 in Dimethylformamid.
Teilsequenz D:
1-(L-Asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl hydrazid Trifluoracetat (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z CFSCOOH) a) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin)
2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 72 g BOC-Phe-OH und 28 g N-Methylmorpholin in 500 ml Methylenchlorid auf und tropft bei -5 26 ml Chlorameisensäuremethylester zu. Nach 10 Minuten gibt man noch 44 g Z-NHNH3 in 100 ml Methylenchlorid zu und rührt 4 Stunden bei Zimmertemperatur weiter. Nach Auswaschen mit verdünnter Phosphorigersäure wird getrocknet und eingedampft.
Nach Kristallisieren aus Petroläther erhält man BOC-Phe-NH NH-Z vom Smp. 1170, [a] "DO = -5 in Dimethylformamid.
b) 1 (N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L- phenylalanin) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 41 g BOC-Phe-NHNH-Z in 400 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen.
Beim Verdampfen der Trifluoressigsäure erhält man das H-Phe-NHNH-Z als kristallines Trifluoracetat vom Smp. 1910, [ce] # = + 26,4 in Dimethylformamid.
Diese Substanz wimzusammen mit 35 g BOC-Asn-ONP und 30 g N-Methylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 210 , [a]2D = - 180 in Dimethylformamid.
c) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxyvarbonyl - hydrazid (BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 26 g BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure auf und lässt 1 Stunde bei 200 stehen.
Nach Verdampfen des Lösungsmittels versetzt man in 100 ml Dimethylformamid mit 17 g BOC-Asn-ONP und
15 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Asn-Phe NH-NH-Z; Smp. 2400, [o] D = - 280 in Dimethylformamid.
d) l-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-asparaginyl- L-asparato,inyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxyvarbonyl hydrazid (BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 22 g BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in
150 ml Trifluoressigsäure und lässt 1 Stunde bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand mit 12 g BOC-Leu-ONP und 10 g N-Methylmorpholin in 100 ml Dimethylformamid versetzt. Nach
16 Stunden Stehenlassen bei 200 wird das Dimethylformamid verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BO C-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 2100, [a] 2D = - 340 in Dimethylformamid.
e) l-(N-tert. -Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-
L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl alanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 57 g BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 300 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Äther kristallisiert. Man löst das Tetrapeptid-trifluoracetat in 400 ml Dimethylformamid und versetzt die Lösung mit 27 g BOC-Asn-ONP und
25 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 2500 (Zers.), [a] 2D0 = - 340 in Dimethylformamid.
f) 1-(L-Asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl hydrazid trifluoracetat (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-z.Trifluor acetat)
Man löst-43,5 .g BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH- NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 20 stehen. Nach Eindampfen wird der Rückstand mit Hilfe von Äther kristallisiert. Man erhält H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z. Trifluoracetat;
Smp. 242 , [α# = -22 in Dimethylformamid.
Teilsequenz E: tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-L-arginyl-hydrazid. acetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2. CH2COOH) a) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl (guanido)N-nitro-L-argininmethylester (BOC-Trp-Arg(NO)-OMe)
Man löst 35 g H-Arg'NOo)-OMe HC1, 63 g BOC Trp-OCP und 14 g N-Methylmorpholin in 300 ml Dimethylformamid auf und lässt 16 Stunden bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Essigester aufgenommen und mit verdünnter Schwefelsäure gewaschen. Man engt etwas ein und fällt mit Äther aus. Dabei kristallisiert BOC-Trp Arg(NO2)-OMe vom Smp. 1300, kil # = -220 in Dimethylformamid.
b) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl (guanido)N-nitro-argininmethylester (BOC-Tyr-Trp-Arg(NO2) -OMe)
Man löst 15 g BOC-Trp-Arg(NO2)-OMe in 80 ml 5n methanolischer Salzsäurelösung auf und lässt 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels und Behandeln mit Äther verbleiben 13 g H-Trp-Arg(NO2)-OMe als Hydrochlorid zurück; Smp. 1200, [a]D = -90 in Dimethylformamid. Dieses Dipeptid wird zusammen mit 14 g BOC-Tyr-OCP und 8 g N-Methylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand in Essigester aufgenommen.
Nach Waschen mit verdünnter Phosphorigersäure und Einengen des Lösungsmittels kann man mit Hilfe von Äther BOC-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe isolieren; Smp. 1300, [o] #= - 110 in Dimethylformamid.
c) tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-trypto phanyl-(guanido)N-nitro-L-argininmethylester (BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO-)-OMe)
Man löst 13,5 g BOC-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe in 130 ml 5n methanolischer Salzsäurelösung auf, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, filtriert ab, löst in 100 ml Dimethylformamid auf und versetzt mit 8,0 g BOC-Ala-OCP und 3,0 ml Triäthylamin. Nach 16 Stunden bei 250 gibt man 500 ml Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Schwefelsäure und Kaliumbicarbonatlösung und dampft zur Trockne ein. Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform erhält man BOC-Ala-Tyr Trp-Arg(NO2.)-OMe; Smp. 1200 (Zers.), [a]D = 120 in Dimethylformamid.
d) tert.-Butyloxycarbonyl-L-s eryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-(guanido)N-nitro-L-arginin methylester (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe)
Man löst 12,3 g BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NOO)-OMe in 100 ml 5n methanolischer Salzsäure, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockene ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, löst ihn in 100 ml Dimethylformamid, versetzt mit 14 ml Triäthylamin und 8,5 g BOC-Ser-N?;, lässt 16 Stunden bei 0 stehen, gibt 500 ml Essigester zu, wäscht nacheinander mit verdünnter Schwefelsäure und Ammoniumhydroxid, trocknet über Natriumsulfat und dampft das Lösungsmittel ab. Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform löst man ihn in Essigester und fällt durch Zugabe von Diäthyläther.
Man erhält 13,5 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)- OMe; Smp. 135e (Zers.), [Ex] oD = - 150 in Dimethylformamid.
e) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl L-tryptophanyl-L-arginin hydrazid hydrazidacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH- OH)
Man löst 13,2 g von dem oben erhaltenen Pentapeptidester in 300 ml Essigsäure. gibt 60 ml Wasser und 13,2 g Palladium-Kohle (10%ig) zu und hydriert bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert.
dampft ab, löst den Rückstand in Dimethylformamid auf, dampft wiederum ab, um die Spuren von Essigsäure zu beseitigen. Anschliessend löst man den Rückstand in 260 ml Methanol, versetzt mit 26 ml Hydrazin hydrat und lässt 16 Stunden bei 400 stehen. Nach Zugabe von 260 ml Diäthyläther filtriert man die ausgeschiedene kristalline Masse ab, wäscht mit Diäthyläther und trocknet im Hochvakuum über Schwefelsäure. Man erbält BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2.CH3COOH; Smp. 1820, [α# # = - 80 im Dimethylformamid.
Teilsequenz Fl
L-Threonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-valyl-L-leucin methylester hydrobromid (H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr) a) H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr
Man löst 21,0 g Z-Cys(Bzl)-OCP und 12,3 g H-Val Leu-OMe-HCl in 120 ml Dimethylformamid. Danach gibt man 5,9 ml Triäthylamin hinzu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, fügt Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat, dampft zur Trockne ab und kristallisiert den Rückstand aus Essigsäureäthylester/Diäthyläther. Man erhält Z-Cys (Bzl)-Val-Leu-OMe, Smp. 1600, [u]D = = 280 in Dimethylformamid, das man in 210 ml einer 40%igen Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig löst.
Man lässt 1 Std. bei 250 stehen. dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Diäthyläther um. Man erhält H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr,
Smp. 1680, [a] D0 = + 140 in Dimethylformamid.
b) H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr
Man löst 20 g ZThr-NHNH in 350 ml Dimethylformamid, kühlt auf -200, gibt 100 ml einer Lösung von 2n Salzsäure in Dioxan und anschliessend noch
10 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei - 200 werden 45 ml Triäthylamin und 25,5 g H-Cys(Bzl)-Val Leu-OMe HBr hinzugefügt und das erhaltene Gemisch während 16 Stunden bei 0 geschüttelt. Man dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigsäureäthylester/Wasser, wäscht die organische Phase mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat, dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Essigester um.
Man erhält Z-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu OMe; Smp. 2080, [a] # = - 270 in Dimethylformamid.
Man löst 20 g von dem oben erhaltenen Tetrapeptid in 200 ml eines Gemisches von Trifluoressigsäure-Essigester (1:1) auf, leitet während 1 Stunde bei 0 einen Strom gasförmigen Bromwasserstoffs ein, dampft anschliessend ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol/Diäthyläther um. Man erhält H-Thr-Cys(Bzl) Val-Leu-OMe .1,3 HBr; Smp. 2020, [α]# = - 10 in Dimethp@formamid.
Teilseq@@nz F2 : tert.-Butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-seryl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-serin-hydrazid (BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NH-NH2) a) H-Asn-Leu-Ser-OMe. HCl
Man löst 43 g H-Leu-Ser-OMe HCl und 53 g BOC-Asn-ONP in 400 ml Dimethylformamid auf, gibt 22 ml Triäthylamin zu. Iässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol um. Man erhält 51.6 g BOC-Asn-Leu Ser-OMe, Smp. 190 , [α]# = -24 in Dimethylformamid, das man in 500 ml einer 4n Lösung von Salzsäure in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in Methanol und fällt mit Diäthyläther. Man erhält H-Asn-Leu Ser-OMe. HCl; Smp. 180 , [α]# = -23 in Dimethylformamid.
b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HC1
Man löst 39,5 g BOC-Ser-NHNH in 500 ml Dimethylformamid, kühlt auf - 200, gibt 200 ml einer 2n Lösung von Salzsäure in Dioxan und anschliessend 20 ml tert. Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei - 200 werden 40 ml Triäthylamin und 38,0 g H-Asn-Leu-Ser-OMe. HCl hinzugefügt, danach 16 Stunden bei 0 gerührt, zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Chloroform/Diäthyläther umkristallisiert. Man erhält BOC-Ser Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. 1350, [a] 20 - 220 in Dimethylformamid, das man in 420 ml einer 4n Salzsäurelösung in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol/Essigsäureäthylester um.
Man erhält H-Ser Asn-Leu-Ser-OMe HC1, Smp. 1550 (Zers.), [u] rz - - 150 in Dimethylformamid.
c) BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2
Man löst 18,5 g H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCl und 18,0 g BOC-Cys(Bzl)-ONP in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 10 ml Wasser, 3,5 ml Essigsäure und 5,6 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol um. Man erhält 25,1 g BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser OMe, Smp. 1820, [o] 2r) = - 170 in Dimethylformamid, das man unter leichtem Erwärmen in 200 ml Dimethylformamid löst.
Man gibt 200 ml Methanol und 20 ml Hydrazinhydrat zu, lässt 16 Stunden bei 300 stehen, fällt mit Diäthyläther, wäscht den Niederschlag mit Di äthyläther/Methanol (1:1) und trocknet das so erhaltene BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2,
Smp. 2240 [ri] # = - 130 in Dimethylformamid.
Teilsequenz F: tert.-Butyloxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemi cystinyl-L-valyl-L-leucin-hydrazid
EMI6.1
<tb> (BOC-Cys=Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu
<tb> NHNH2)
<tb>
Man löst 18,4 g BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser NHNH2 (Teilsequenz F2) in 150 ml Dimethylformamid, kühlt auf - 200, gibt 40 ml einer 2n Lösung von Salzsäure in Dioxan und 15 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach
10 Minuten bei -200 gibt man noch 28 ml Triäthylamin und 24,8 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe 1,3 HBr (Teilsequenz F1) zu und rührt 16 Stunden bei 25 . Danach wird filtriert, die Lösung eingedampft und der Rückstand mit heissem Methanol durchgewaschen.
Man erhält BOC-Cys(Bzl0-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl)-Val Leu-OMe, Smp. 242-244 , [α]# = -25 in Dimethylformamid, das man bei 60C in 100 ml Dimethylformamid löst. Man gibt 10 ml Hydrazinhydrat zu und lässt 2 Stunden bei 600 stehen; das entstandene Nonapeptidhydrazid kristallisiert aus. Man wäscht mit Diäthyläther, Wasser und Methanol und trocknet im Hochvakuum über Phosphorpentoxid. Man erhält Nonapeptidhydrazid vom Smp. 260 (Zers.), [α]# = - 330 in DimethylformamidlWasser (3 : 1). Man löst das erhaltene Produkt in 5000 ml getrocknetem Ammoniak, gibt unter Rühren und Sieden des Ammoniaks Natriummetall bis zur tiefblauen Färbung zu.
Zwecks Entfärbung wird Ammoniumchlorid hinzugefügt und danach ein Luftstrom bis zur negativen Nitroprussiatreaktion durch die Lösung geleitet. Man dampft zur Trockne ein und wäscht den Rückstand mit Wasser und Aceton durch. Nach Trocknen erhält man
EMI7.1
<tb> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu
<tb> NHNH2,
<tb> Smp. 2980 (Zers.), [a] r, = -200 in Dimethylformamid/Wasser (3 1).
Teilsequenz ABC:
Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl
L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl
L-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl
L-prolinamid Triacetat (H-His(Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.3 ch3cooh) a) L-Seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolin amid Tetrahydrochlorid (H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr
Pro-NH2.4HCl)
Man löst 12 g H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro NH2 in 1+00 ml Dimethylformamid und 20 ml Acetonitril bei 0 und gibt 2,1 g Hydroxysuccinimid, 8,0 g Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH, 4,0 g Dicyclohexylcarbodiimid zu, lässt Nacht bei 0 stehen, filtriert, verdampft im Vakuum und kristallisiert aus Chloroform.
Man erhält
ZSer-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB) Thr-Pro-NH2, Smp. 125-138 , [a] 20 - 44 in Dimethylformamid.
Man löst in 400 ml Dioxan und 400 ml HCl/Dioxan und hydriert bei Normaldruck in Gegenwart von Palladiumkatalysator und Säure bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert, dampft im Vakuum ein, löst in Methanol, versetzt mit Äther und erhält
H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro
NH2 4 HCl, Smp. 130 Zers., [α]d20 = -52 in Dimethylformamid.
b) Nim-Trityl-L-histioyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-L seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl-L glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-theronyl-L-prolin amid. Azetat (H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 , 3 CHsCO2H)
Man löst 9,9 g N-Trt-Nim-Trt-His-Arg-Phe- NHNHg , HCl in 100 Dimethylformamid, kühlt auf - 200, gibt 30 ml Dioxan/HCl 2n und anschliessend 1 16 ml tert-Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei -200, gibt 28 ml Triäthylamin und 9,7 g H-Ser-Gly-Nle-Gly- Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHa 4 HC1 zu, rührt 4 Stunden bei 00, filtriert und dampft zur Trockne ein.
Man löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigester/ Methanol (8 : 2) auf, wäscht mit verdünntem Ammoniak und anschliessend mit Wasser bis Neutralität, trocknet über Natriumsulfat, konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man löst den Niederschlag wiederum in Dimethylformamid auf und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man erhält
Trt-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NHo (Smp. 168 Zers.). [α]# = -43 in Dimethylformamid, das man in 500 ml Essigsäure/Wasser (8 : 2) löst. Man lässt 3 Stunden bei 400 stehen, dampft ein, wäscht den Rückstand in Diäthyläther und trocknet im Hochvakuum über KOH-Späne.
Man erhält
H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro Glu-Thr-Pro-NH, 3 CH,COOH Smp. 180 (Zers.). [α] D = 610 in Essigsäure.
Teilsequenz DE:
N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin hydrazid. diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn Phe-NHNH2- CH3COOH) a) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L tyrosinyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl
L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl alanyl)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid. diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-NH-NH-Z 2 CH3COOH)
Man kühlt 320 ml Dimethylformamid auf - 200 C, gibt 100 ml 2n Chlorwasserstoff in Dioxan zu und löst darin 68 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2 acetat (Teilsequenz E).
Anschliessend versetzt man mit 12 ml tert.-Butylnitrit, lässt 10 Minuten bei -20 rühren und tropft 35 ml Triäthylamin zu. Das so erhaltene Gemisch wird mit einer Lösung, entstanden aus 8,8 g H-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NHNH-Z Trifluoracetat (Teilsequenz D) und 17 ml Triäthylamin in 150 ml Dimethylformamid vereinigt. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 0 wird eingedampft. Man löst den Rückstand in Essigester und wäscht mit verdünnter Phosphorsäure und Ammoniaklösung.
Nach Eindampfen des Lösungsmittels verbleibt das
B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-NHNH-Z 2 CH3COOH vom Smp. 1750, [o] 20 #= - 19,50 in Dimethylformamid.
b) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl- alanin. hydrazid. diacetat (B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn Asn-Phe-NHNH2- 2CHsCOOH)
Man löst 90 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NHNH-Z 2 CH3COOH in 500 ml Dimethylformamid und hydriert mit 10 g Pd/C (10 % ig) bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand aus einem Gemisch von Äther und Äthanol kristallisiert. Man erhält BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH2 2 CH3COOH vom Smp. 2650 [o] # = - 570 in Dimethylformamid.
Teilsequenz ABCDE:
L-Seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl
L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-L-arginyl
L-phenylalanyl-L-s eryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl
L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L threonyl-L-prolinamid. hexatrifluoracetat (H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe
His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu Thr-Pro-NHo 6 CFaCOoH).
Man löst 15,2 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH2 Diacetat (Teilsequenz DE) in 200 ml Dimethylformamid, kühlt auf - 200, gibt 15 ml Dioxan/HCl 2n und anschliessend 1,16 ml tert.-Butyl nitrit zu und rührt 10 Minuten bei -200. Man gibt
14 ml Triäthylamin und eine Lösung von 18,6 g des in Teilsequenz ABC erhaltenen Tridecapeptidacetats in
Dimethylformamid zu, rührt das erhaltene Gemisch
16 Stunden bei 00, filtriert und dampft zur Trockne ein.
Man wäscht den Rückstand mit Diäthyläther und mit
Chloroform, Iöst in Dioxan/Wasser (8 : 2), behandelt die erhaltene Lösung mit 100 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat-Form), dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Wasser um. Man erhält das
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2. acetat, Smp.145 (Zers.), [α]# zu = =-71 in Essigsäure, das man unter Stickstoffatmosphäre in 50() ml Trifluoressigsäure löst. Man lässt 1 Stunde bei 25 stehen, konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von 1000 ml Diäthyl äther.
Man filtriert, löst den Rückstand in Dimethylformamid und fällt mit Diäthyläther. Nach Trocknen über KOH-Späne erhält man das
H-Ser-Ala-Try-Trp-Arg-Ans-Leu-Asn-Asn-Ph
His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Gl Thr-Pro-NH2- zu 6 CFe,CO,H,
Smp. 130 (Zers.), [α]# = -45 in Essigsäure.
Beispiel 1 tert.-Butyloxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyoxyl L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-histidyl L-arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-L-norleucylglycyl-L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl L-threonyl-L-prolinamid. Hexaacetat. Octahydrat
EMI8.1
<SEP> I
<tb> (BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Len
<tb>
Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg
Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro
NH2. Hexaacetat. Octahydrat).
Man löst 1,05 g Nonapeptid-Hydrazid (Teilsequenz F) in einem Gemisch von 50 ml Dimethylformamid und 1,2 ml DioxanlHCl 2n bei -20 . Man gibt 0,116 ml tert.-Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei -20 , gibt 1,4 ml Triä > :hylamin und 3,1 g Tricosapeptid-Hexatri- fluoracetat (Teilsequenz ABCDE) und 5 ml Wasser zu und rührt 16 Stunden bei 0 . Man dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Mäthyläther, Chloroform und Aceton.
So erhält man das rohe, geschützte Dotriacontapeptid, das man in 100 ml 0.3n Essigsäure löst, mit 20 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat) behandelt und gibt 50 ml 0,6n Ammoniumhydroxid hinzu. Man stellt das pH auf 6,5 ein und schichtet die erhaltene Lösung auf eine Carboxymethylcellulosesäule (lOXlOOcm), die mit einer 0,15n Ammoniumacetatpufferlösung equilibriert wurde. Die Elution wird mit einem steigenden Konzentrations- und pH-Gradient (0,15n auf 0,4n; pH 6,5 auf 7,0) eines Ammoniumacetatpuffers durchgeführt. Die vereinigten Fraktionen, die das reine Peptid erhalten, werden dreimal gefriergetrocknet, der Rückstand wird mit Methanol und anschliessend mit Diäthyl äther gewaschen und über Kaliumhydroxid im Hochvakuum getrocknet.
Man erhält
EMI8.2
<tb> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser
Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-A
Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro
NH2. 6 CH3CO2H. 8H2O, Smp. 220- (Zers.) [α] #= -58 in Essigsäure ln.
Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6n, 16 Stunden):
Ala1.1, Arg2,0, Asn3.0, Cys/21.6, Glu1.2, Gly3.0,
His1.1, Leu2.0, Nle1.0, Phe3.0, Pro2.1, Ser3.8,
Thr1.9, Try1.0, Val0.9 (Trp 1,0 durch Spektrophotometrie).
Beispiel 2 L-Hemicystinyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl L-threonyl-L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucyl-L-seryl-Lalanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-Lnormeucyl-glycyl-L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-Lglutamyl-L-threonyl-L-prolylamid. Octaacetat. Decahydrat
EMI8.3
<tb> (H-Cys-Ser-Asn-leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Phe-His-Arg Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro NH3. Octaacetat. Decahydrat).
EMI8.4
<SEP> I
<tb> Man <SEP> löst <SEP> 3,3 <SEP> g <SEP> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro NH3. Acetat unter Stickstoffatmosphäre in 100 ml Trifluoressigsäure, lässt 15 Minuten bei 20 stehen und dampft zur Trockne ein. WIan löst in 300 ml 0,2n Essigsäure, behandelt mit 20 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat), lyophilisiert, wäscht mit Diäthyläther und trocknet über Kaliumhydroxid im Hochvakuum. Man erhält
EMI8.5
<tb> H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-A
<tb>
Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phen-His-Arg-Phe
Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro
NH2. 8 CH3CO2H. 10 H2O, Smp. 220 (Zers.), [α]# # = ¯54 in EssilJsäure ln.
Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6n, 16 Stunden): Alar,x, Arg2.0, Asp3,s, Cys/2l,6, Glut,o, Gly30,
His1.1, Leu2.9, Nle1.0, Phe3.0, Pro2.1, ser8.8, Thrl,o, Tyrl.o ValO,s (Trp 1,0 durch Spektrophotometrie).