DE1543872C3

DE1543872C3 - D Ser hoch 1 Nie hoch 4 Pentacosapeptid sowie Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number: DE1543872C3
Application number: DE1543872A
Authority: DE
Inventors: Roger Dr. Bottmingen Boissonnas; Stephan Dr. Allschwil Guttmann; Janos Dr. Basel Pless
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Sandoz AG
Priority date: 1965-08-24
Filing date: 1966-08-20
Publication date: 1973-11-29
Also published as: FI45179B; BR6682297D0; FI45179C; DE1543872B2; OA02653A; NO120478B; FR5981M; CS151441B2; US3761459A; DE1543872A1; GB1153445A; BE685841A; AT285065B; IL26364A; CH467246A; SE345447B; ES330471A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das neue Pentacosapeptid der Formel D - Seryl - L - tyrosyl - L - seryl-L - norleucyl - L - glutamyl - L - histidyl -L- phenylalanyl-L - arginyl - L - tryptophanyl - glycyl - L - lysyl - L - prolyl-L - valyl - glycyl -L- lysyl - L - lysyl - L - arginyl -L- arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid, im nachstehenden mit D-Se^-NIe⁴-Pentacosapeptid bezeichnet, seine pharmakologisch verträglichen Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung.

D - Ser¹ - Nie⁴ - Pentacosapeptid, seine Salze und Schwermetallkomplexe besitzen eine hohe adrenocorticotrope Wirksamkeit.

Es war bereits bekannt, daß man ein Pentacosapeptid der Sequenz L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L - glutamyl :L- histidyl - L - phenylalanyl - L - arginyl-L - tryptophanyl - glycyl - L - lysyl - L - prolyl - L - valylglycyl - L -lysyl - L - lysyl - L - arginyl - L - arginyl - L - prolyl-L - valyl - L - lysyl - L - valyl - L - tyrosyl - L - prolyl - L - valinamid mit corticotroper Wirkung, im nachstehenden mit Nie⁴-Pentacosapeptid bezeichnet, synthetisieren kann.

Nie⁴-Pentacosapeptid besitzt gegenüber dem natürlichen ACTH den Vorteil, daß es keine antigenen Eigenschaften aufweist. Ein weiterer Vorteil des NIe⁴-Pentacosapeptids ist, daß es in Stellung 4 nicht wie natürliches ACTH einen Methionrest besitzt, der leicht oxydierbar ist und dadurch das Hormon in eine inaktivierte Form umwandelt, sondern einen Norleucinrest, der dieselben sterischen Eigenschaften wie der Methionrest aufweist, hingegen gegen Oxydation beständig ist. überdies weist das Nle⁴-Pentacosapeptid in Stellung 25 einen Valinamidrest auf, der beim natürlichen ACTH an dieser Stelle nicht vorkommt. Der Valinamidrest an Carboxylende schützt die Peptidkette gegen abbauende Enzyme.

Gleich dem natürlichen ACTH' weist jedoch das Nle⁴-Pentacosapeptid in Stellung 1 den endständigen

ίο L-Serinrest auf, der bekanntlich gegenüber der abbauenden Wirkung von Aminopeptidasen sehr empfindlich ist.

Es wurde aus diesem Grunde versucht, den L-Serinrest des Nle⁴-Pentacosapeptids durch einen Rest zu ersetzen, der gegenüber der abbauenden Wirkung der Aminopeptidasen stabil ist.

Tatsächlich gelang es, durch den Ersatz des endständigen L-Serinrestes mit einem D-Serinrest beim NIe⁴-Pentacosapeptid das gegenüber Aminopeptidasen

unempfindliche D-Ser¹-Nle⁴-Pentacosapeptid zu erhalten. Da aber bekanntlich D-Aminosäurereste in den natürlichen, biologisch aktiven Peptidhormonen nicht vorhanden sind, war es überraschend und (^ nicht vorauszusehen, daß durch den Ersatz eines natürlichen Aminosäureesters durch seinen in der Natur nicht vorkommenden Antipoden eine Verbindung erhalten wird, die nicht nur qualitativ dieselben biologischen und therapeutischen Eigenschaften wie das natürliche ACTH aufweist, sondern auch noch quantitativ dem natürlichen ACTH, wie später eingehend dargelegt wird, überlegen ist.

D-Se^-Nle^Pentacosapeptid kann nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden, wobei die Aminosäuren in der, in der obigen Formel festgelegten Reihenfolge, einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden. Erfindungsgemäß kann D-Ser¹ -Nie⁴- Pentacosapeptid beispielsweise hergestellt werden, indem man L - Valyl -e-N-R-L- lysyl - L - valyl - L - tyrosyl - L - prolyl-L - valinamid, worin R eine Carbo - tert. - butoxy- oder eine Carbo - tert. - amyloxy-, eine Toluolsulfonyl-, eine Phthalyl-, eine Formyl- oder eine Trifluoracetyl-Gruppe bedeutet, mit dem N - Carbobenzoxy - L - valyl- f J

glycyl-e-N-R-L-lysyl-e-N'-R-L-lysyl-nitro-L-argi- ¹^J nyl - nitro - L - arginyl - L - prolin, worin R obige Bedeutung hat, kondensiert, das erhaltene N-Carbobenzoxy-L-valyl-glycyl-e-N-R-L-lysyl-e-N-R-L-lysyl-nitro-L - arginyl - nitro - L - arginyl - L - prolyl - L - valyl - ε - N - R-L - lysyl - L - valyl - L - tyrosyl - L - prolyl - L - valinamid, worin R obige Bedeutung hat, nach Abspaltung der Carbobenzoxygruppe und der Nitrogruppen mit dem N - Triphenylmethyl - γ - O - tert. - butyl - L - glutamyl-Im-triphenylmethyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-ar- ginyl-L-tryptophanyl-glycyl-fi-N-R-L-lysyl-L-prolin, worin R obige Bedeutung hat, kondensiert, das erhalteneN-Triphenylmethyl-y-O-tert.-butyl-L-glutamyl-Im - triphenylmethyl - L - histidyl - L - phenylalanyl-L - arginyl - L - tryptophanyl - glycyl -ε-N-R-L- lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-e-N-R-L-lysyl-s-N-R-L-ly- syl - L - arginyl - L - arginyl - L - prolyl - L - valyl - ε - N - R-

■ L - lysyl - L - valyl - l - tyrosyl - L - prolyl - l - valinamid, worin R obige Bedeutung hat, nach Abspaltung der j N-Triphenylmethyl-Gruppe mit dem N-R'-D-Seryl- ί

L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucylazid, worin R' eineTri- i phenylmethyl-, eine Carbo - tert. - butoxy- oder eine Carbo - tert. - amyloxy-, eine Carbobenzoxy-, eine Trifluoracetyl-, eine Acetyl-, eine Chloracetyl- oder eine

Formylgruppe bedeutet, kondensiert, und die gesamten Schutzgruppen des erhaltenen neuen, geschützten Pentacosapeptids N-R'-D-Seryl - l - tyrosyl -L- seryl - L - norleucyl -γ-O- tert. - butyl - L - glutamyl - Im - triphenylmethyl - L-histidyl - L - phenylalanyl - L - arginyl - L - try ptophanyl - glycyl - e -N-R-L- lysyl - L - prolyl - L - valylglycyl - ε - N - R - L - lysyl - ε - N - R - l - lysyl - L - arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-8-N-R-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid^orinRundR'obige Bedeutung haben, in einer oder in mehreren Stufen im sauren Milieu abspaltet.

Die Ausgangsprodukte zur Herstellung des D-Ser¹-Nle⁴-Pentacosapeptids können, sofern sie bisher noch nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.

D-Ser'-Nle'^-Pentacosapeptid läßt sich auch in Form seiner Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxy- oder 2-Acetoxybenzoesäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzoloder Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure, SuIfanilsäure sowie polymere Säuren wie Gerbsäure, Alginsäure, Polygalacturonsäure, Polyphloretinphosphat oder Carboxymethylcellulose und Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure in Frage. Als Schwermetallkomplex kommt z. B. derjenige des Zinks in Frage.

D - Ser¹ - Nie⁴ - Pentacosapeptid, seine Salze und Schwermetallkomplexe können beispielsweise für die Behandlung der folgenden Erkrankungen verwendet werden: Akuter und chronischer Gelenkrheumatismus, Colitis ulcerosa, Nephrose, Kollagenosen, wie z. B. Lupus erythematodes, Sklerodermie usw., allergische Erkrankungen der verschiedenen Organsysteme, wie Asthma bronchiale, Ekzem, Urticaria, Dermatitis exfoliativa, anaphylaktischer Schock usw., Intoxikationen verschiedener Genese, Tumoren, wie z. B. Leukämien, Lymphosarcomen, Reticulosarcomen usw., zur Verhinderung der Nebennierenrindenatropie bei der Therapie mit Corticosteroiden, Insuffizienzerscheinungen der Hypophyse.

Ein wesentlicher Vorteil gegenüber natürlichem, aus tierischem Material extrahiertem Hormon liegt darin, daß dem synthetischen Pentacosapeptid antigene Eigenschaften fehlen. Es kann somit bei den obenerwähnten Erkrankungen auch dann unbedenklich verwendet werden, wenn beim Patienten im Verlauf einer früheren Behandlung mit natürlichem ACTH allergische Erscheinungen auftragen. ·

In den für die Standardisierung üblichen und anerkannten Tests besitzt D-Sei^-Nle^Pentacosapeptid eine biologische Wirksamkeit von 625 ± I30Corticotropin-IE pro Milligramm freies Peptid. So dienten zur Testung des verfahrensgemäß hergestellten Pentacosapeptids der 3. Internationale Standard für Corticotropin, welcher in Form des »International Standard for Corticotropin« zur Verfugung steht und die Einstellung von ACTH- Präparaten auf Internationale Einheiten ermöglicht. Es hat sich herausgestellt, daß das neue Pentacosapeptid nach intravenöser Verabreichung eine längere Wirkungsdauer besitzt als die bisher bekannten natürlichen und synthetischen ACTH-Präparate, was einen bedeutenden technischen Fortschritt darstellt.

Die Dosierung des verfahrensgemäß hergestellten Pentacosapeptids variiert ungefähr zwischen 40 und 60 IE pro Tag, in besonderen Fällen zwischen 10 und 100 IE pro Tag.

Die unerwartete, bei der Standardisierung festgestellte hohe Wirksamkeit des neuen Pentacosapeptids hat sich bei der therapeutischen Anwendung voll bestätigt, so daß das neue Pentacosapeptid auf Gewichtsbasis stärker wirkt als alle bis jetzt bekannten natürlichen und synthetischen ACTH-Präparate.

15· D-Ser¹-Nle⁴-Pentacosapeptid kann als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannte Verbindung in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit der neuen Verbindung nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche öle, Benzylalkohol, Gummi arabicum, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe wie'Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzmittel oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere, therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. Die neue Verbindung kann wie natürliches ACTH auch in Form eines Depotpräparates verabreicht werden.

D-Ser¹-Nle⁴-Pentacosapeptid und seine Salze kann auch als Zwischenprodukt zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.

Beim Aufbau des neuen Pentacosapeptids haben sich für die Blockierung der Aminogruppe des Serinrestes die Triphenylmethyl-, die Carbo-tert.-butoxy- und die Carbo-tert.-amyloxy-Gruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen wie die Carbobenzoxy-, die Trifiuoracetyl-, die Acetyl-, die Chloracetyl-, die Formylgruppe verwendet werden.

Für die Blockierung der ε-Aminogruppe des Lysinrestes hat sich die Carbo-tert.-butoxy- und die Carbotert.-amyloxy-Gruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbobenzoxy-, die Toluolsulfonyl-, die Phthalyl-, die Formyl- und die Trifluor-acetyl-Gruppe verwendet werden.

Für die Blockierung der y-Carboxyl-Gruppe des Glutaminsäurerestes hat sich die tert.-Butyloxy-Gruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Methoxy-, die Äthoxy-, die tert.-Amyloxy-, die Amid- oder die Benzyloxygruppe verwendet werden. Für die Blockierung der Imidazolgruppe des Histidinrestes hat sich die Triphenylmethylgruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbo-tert.-butoxy-, die Carbo-tert.-amyloxy-, die Carbobenzoxy- oder die Benzylgruppe verwendet werden.

Für die Blockierung der Guanidogruppe der Argininreste wurde die Nitro-Gruppe verwendet, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Tosylgruppe, die p-Nitrocarbobenzoxygruppe oder die 2 - (Isopropyloxycarbonyl) - 3,4,5,6 - tetrachlorobenzoylgruppe verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt der Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.

Es werden folsende Abkürzungen verwendet:

CBO = Carbobenzoxy,	His = L-histidyl,
Trit = Trityl = Triphenylmethyl,	Lys = L-lysyl,
CTB = Carbo-tert.-butyloxy,	Nie = L-norleucyl,
NO₂ = nitro,	Phe = L-phenylalanyl,
OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxy,	Pro = L-prolyl,
OTB = tert.-Butyloxy,	Ser = L-seryl,
OMe = Methoxy,	D-Ser = D-seryl,
OEt = Äthoxy,	Try = L-tryptophanyl,
Arg = L-arginyl,	Tyr = L-tyrosyl,
GIu = L-glutamy],	VaI = L-valyl,
GIy = glycyl,	Im = Imidazolyl.

In den folgenden Beispielen, die die Ausführung des Verfahrens erläutern, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden. '

F i g. A. Herstellung von H-Val-Gly-^Lys-^Lys-Arg-Arg-Pro-Val-^Lys-Val-Tyr-Pro-VaI-NH₂

R R

NO, NO,

Val-Gly-Lys-Lys

N₃ H--Arg-Arg-Pro-

OH

R R

CBO -- Val-Gly-Lys-Lys

NO, NO,

Arg-Arg-Pro--OH H

Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val - - NH₂

R R

CBO--Val-Gly-Lys-Lys

NO₂ NO

-Arg-Arg-Pro

■ Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val

NH,

R R

Val-Gly-Lys-Lys

-Arg-Arg-Pro

• Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val -- NH₂

F i g. B. Herstellung von N-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NHz

GBO--Tyr--OH N - - Ser-Nle - - OMe

CBO - - Tyr Ser-Nle - - OMe

N' - - D-Ser - - N₃ H - - Tyr ■— Ser-Nle - - OMe

OTB Trit

R R

N' --D-Ser — Tyr —— Ser-Nle -- OMe Tri --Glu — His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro - - OH H - - Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val — NB

OTB Trit

R R

- D-Ser Tyr Ser-Nle 4- NHNH₂ Tri --Glu —His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val - - NH₂

OTB Trit

R R

N' - - D-Ser Tyr Ser-Nle - - N₃ N — GIu — His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro _; Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val - - NH₂

OTB Trit

R R

N' - - D-Ser -

Tyr-

■ Ser-Nle -

- Glu —His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val - - NH₂

D-Ser -

■Tyr-

• Ser-Nle -

-Glu —His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val--NH₂

B e i s ρ i e ! i

L-Valyl-glycyl-carbo-tert.-butoxy-L-lysyl-carbo-

tert.-butoxy-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-

L-valyl-carbo-tert.-butoxy-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-

L-prolyl-L-valinamid. (H-Val-Gly-(CTB)Lys-

(CTB)Lys-Arg-Arg-Pro-Val-(CTB)Lys-Val-Tyr-

Pro-Val-NH,)

10

Man löst 88 g CBO-(NO₂)Arg-(NO₂)Arg-Pro-OMe in einem 90%igen Dioxan-Wasser-Gemisch und versetzt mit 220 ecm 2 η-Natronlauge. Nach 2 Stunden wird mit 1 1 Wasser verdünnt und wiederholt mit Essigester ausgewaschen. Anschließend säuert man die wässerige Lösung mit 4 η-Salzsäure an, löst das ausgefallene Produkt in einem Gemisch von Methanol-Azeton 1:1 auf und fallt durch Zugabe von Äthyläther. Man erhält 70 g CBO-(NO₂)Arg-(NO₂)Arg-Pro-OH vom Schmp. 108° (mit Zersetzung). [a]_D = —19° in Dimethylformamid. Man löst das oben erhaltene Tripeptid in 400 ml einer 33%igen Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig, läßt 1 Stunde bei 20° stehen, konzentriert auf 200 ml, fällt mit Äthyläther aus, filtriert, wäscht mit Äthylacetat und trocknet. Man erhält 72 g H-(NO₂)Arg-(NO,)Arg-Pro-OH · 3 HBr vom Schmp. 84° (mit Zersetzung), [α] ² _D' = -19° in 95%iger Essigsäure. In einer Lösung von 72 g H - (NO₂)Arg - (NO₂)Arg - Pro - OH Hydrobromid in 600 ml Dimethylformamid und 56 ml Triäthylamin wurde bei 0° 84 g CBO-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys-N₃ (aus 85 g des entsprechenden Hydrazids hergestellt) eingetragen. Man läßt die Lösung 16 Stunden stehen und dampft das Lösungsmittel ein. Der Rückstand wird in einem Gemisch von n-Butanol-Essigester 2:8 gelöst und wiederholt mit verdünnter Schwefelsäure nachgewaschen. Man konzentriert die Lösung im Vakuum ein und fällt mit Äther aus. Man erhält 90 g CBO-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys-(NO₂)-Arg-(NO₂)Arg-Pro-OH vom Schmp. 15Γ (mit Zersetzung)-[α] ο = —38° in Methanol.

Man löst 56 g CBO-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys-(NO₂)Arg-(NO₂)Arg-Pro-OH in 900 ml Dimethylformamid und 900 ml Tetrahydrofuran. Nach Zugabe von 6,2 ml Triäthylamin wird die Lösung auf —10° abgekühlt und bei dieser Temperatur mit 4,2 ml Chlorameisensäureäthylester versetzt. Nach 10 Minuten wurden 36 g H-Val(CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH₂ in 160 ml Dimethylformamid zugegeben und über 16 Stunden bei 20° weiter gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum verdampft, und der Rückstand mit Wasser ausgewaschen. Man löst das Peptid in heißem Äthanol und fällt mit Essigester aus. Nach Abnutschen und Trocknen erhält man 72 g CBO-VaI-GIy - (CTB)Lys - (CTB)Lys - (NO₂)Arg - (NO₂)Arg-Pro - VaI - (CTB)Lys - VaI - Tyr - Pro - VaI - NH₂ vom Schmp. 190° (mit Zers.); [a]_D = -36° in Dimethylformamid.

Man löst 72 g CBO-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys-(NO₂)Arg - (NO₂)Arg - Pro - VaI - (CTB)Lys - VaI - Tyr-PrO-VaI-NH₂ in 1,5 1 80%iger Essigsäure, versetzt mit Palladium Katalysator, hydriert bis zur Beendigung der Wasserstoffaufnahme und filtriert vom Katalysator ab. Nach Einengen löst man den Rückstand in 500 ml Methanol auf, kühlt auf -5°, versetzt mit 4,1 g p-Toluolsulfonsäure und fällt anschließend mit Äther. Man erhält 66 g H-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys-Arg-Arg-Pro-VaI-(CTB)Lys-VaI-Tyr-Pro-Val-NH, als Tritoluolsulfonat vom Schmp. 185" (mit Zers.); [u]iT = —42" in Dimethylformamid.

Beispiel 2

O-tert.-butyl-L-glutamyl-im-trityl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-N-carbo-

lert.-butoxy-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N-carbotert.-butoxy-L-lysyl-N-carbo-tert.-butoxy-L-lysyl- L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-N-carbo-tert.-

butoxy-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid.

(H-(OTB)Glu-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly-(CTB)Lys-Pro-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys-Arg-Arg-Pro-Val- (CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH₂)

Man löst 62 g H-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys-Arg-Arg - Pro - VaI - (CTB)Lys - VaI - Tyr - Pro - VaI NH₂ · 3TOS-OH in 300 ml Pyridin und 300 ml Acetonitril auf. Anschließend gibt man 57 g Trit-(OTB)Glu-(Trit)His - Phe - Arg - Try - GIy - (CTB)Lys - Pro - OH zu und wenn alles in Lösung ist, kühlt man auf 0° ab, versetzt mit 28,6 g Dicyclohexylcarbodiimid. Nach 24stün- f~ digem Schütteln bei 20° wird der Harnstoff abfiltriert und die Lösung mit Äther gefällt. Das Produkt wird wiederholt in Methanol gelöst und mit Essigester gefällt.

Man erhält 90 g Trit-(OTB)Glu-(Trit)His-Phe-Arg-Try - GIy - (CTB)Lys - Pro - VaI - GIy - (CTB)Lys - (CTB)-Lys -Arg- Arg - Pro - VaI - (CTB)Lys - VaI - Tyr- Pro - VaI-NH₂ Tritoluolsulfonat. Schmp. 184° mit Zersetzung. [a]^? _D° = -51° in Methanol.

Man löst 45 g Trit-(OTB)Glu-(Trit)His-Phe-Arg-Try - GIy - (CTB)Lys - Pro - VaI - GIy - (CTB)Ly s -(CTB)-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-(CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-Val- NH₂ ■ 3Tos-OHin500 ml 80%iger Essigsäure und läßt 2 Stunden bei 30° stehen. Man gibt 50 ml Amberlit IRA-410 in Acetatform zu, filtriert, verdampft im Vakuum und löst den Rückstand in Methanol auf. Nach Fällen mit Äther erhält man 40 g H-(OTB)GIu-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly-(CTB)Lys-Pro-Val-Gly-(CTB)Lys - (CTB)Lys - Arg - Arg - Pro - VaI - (CTB)Lys-VaI - Tyr - Pro - VaI - NH₂. Zersetzung bei 170°; [α]?," = —49° in Methanol.

Beispiel 3

L-Tyrosyl-L-seryl-L-norleucinmethylester (H-Tyr-Ser-Nle-OMe)

Man löst 54 g H-Ser-Nle-OMe · HCl und 63 g CBO-Tyr-OH in 860 ml Acetonitril, kühlt auf 0°, gibt 28 ml Triäthylamin zu, kühlt auf —10° und gibt 41 g Dicyclohexylcarbodiimid zu. Das Gemisch wird während 16 Stunden bei 0° gerührt, dann abfiltriert. Der Niederschlag wird mit 1400 ml Pyridin gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden abgedampft und der Rückstand aus Essigester kristallisiert. Man erhält 101 g CBO-Tyr-Ser-Nle-OMe (Schmp. 140 bis 142°; [a]^? _D° = -15° in Dimethylformamid).

Man löst 51 g von dem so erhaltenen Produkt in 2 1 einer 1 N-Lösung von HCl in Methanol und hydriert in Anwesenheit von 10 g Palladium/Kohle. Nach etwa 2 Stunden beendigt die Aufnahme des Wasserstoffs. Man filtriert, dampft ab und kristallisiert den Rückstand aus einem Gemisch von Methanol-Äther (3:1). Man erhält 42 g H-Tyr-Ser-Nle-OMe · HCl. Schmp. 227°; [a] S" = -7° in Dimethylformamid.

Beispiel 4

Carbo-tert.-butoxy-D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-

L-norleucin · hydrazid
(CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-NHNH₂)

' Man löst 60 g D-Serinmethyiester hydrochlorid in 200 ml Dimethylformamid und 54 ml Triäthylamin, kühlt auf 0° und filtriert das Triäthylaminhydrochlorid ab. Dimethylformamid wird bei Hochvakuum eingedampft und der Rückstand in 150 ml Pyridin aufgelöst. Man tropft 100 g tert.-Butyloxycarbonylazid zu und läßt 2 Tage bei 20° stehen.

Man dampft das Lösungsmittel ab und nimmt das Produkt in Essigester auf. Nach Waschen mit Wasser, verdünnter Salzsäure und Kaliumhydrogencarbonat-Lösung trocknet man über Natriumsulfat. Nach Abdampfen des Essigesters bleibt das CTB-D-Ser-OMe als ein öl zurück. Man löst den Ester in 500 ml Methanol auf und läßt mit 50 ml Hydrazinhydrat 2 Tage bei 20° stehen. Nach Verdampfen des Methanols kristallisiert das Hydrazid. Aus heißem Essigester umkristallisiert isoliert man 53 g CTB-D-Ser-NHNH₂ vom Schmp. 114°, [a] V = -3° in Dimethylformamid.

Man löst bei -10° 10 g CTB-D-Serinhydrazid in 136 ml 1 N-Salzsäure die 15 g Natriumchlorid enthält. Bei dieser Temperatur werden 160 ml Essigester und anschließend 38 g Natriumnitrit in 3 Portionen zugegeben. Unter ständigem Rühren wird bei —10° noch 5 Minuten reagieren gelassen. Die Essigesterphase wird abgetrennt, mit kalter 10%iger Kaliumhydrogencarbonatlösung gewashen und mit Natriumsulfat getrocknet. Die getrocknete Lösung wird mit einer Lösung bestehend aus 13 g H-Tyr-Ser-Nle-OMe Hydrochlorid in 60 ml Dimethylformamid und 6 ml Triäthylamin versetzt. Anschließend dampft man den Essigester im Vakuum ab und läßt 16 Stunden bei 20° stehen.

Das zurückgebliebene Lösungsmittel wird im Vakuum eingedampft und der Rückstand in Essigester gelöst. Man wäscht mit verdünnter Phosphorsäure und Kaliumhydrogencarbonailösung aus und trocknet über Natriumsulfat. Nach Einengen des Lösungsmittels und Fällung mit Äther erhält man 15 g CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-OMe. Schmp. 135°; [α] Γ = -6° in Methanol.

Man löst 11 g CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-OMe in 100 ml Methanol und versetzt mit 45 ml Hydrazinhydrat. über Nacht läßt man bei 20° stehen, worauf das Produkt auskristallisiert. Man filtriert und wäscht mit Methanol und Petroläther. Man erhält 7,7 g CTB-o-Ser-Tyr-Ser-Nle-hydrazid vom Schmp. 210°; ['»]'?" ⁼ +6,4" in Dimethylformamid.

B e i s ρ i e 1 5

D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutamyl-

L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanylglycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl- L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid (D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-

Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH;,)

Man löst 2,0 g CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-NHNHj (Beispiel 4) in 12 ml Dimethylformamid, gibt 4 ml Wasser zu, kühlt auf —10°, gibt 2 ml 6 N-Salzsäure zu, versetzt mit 280 mg Natriumnitrit, rührt 5 Minuten bei -5°, gibt 300 ml 0,2 N-Kaliumbicarbonatlösung hinzu und zentrifugiert. Man löst das erhaltene CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Nj in 50 ml Dimethylformamid, versetzt mit 10,5 g H-Glu(OTB)-(Trit)His-Phe-Arg-Try - GIy - (CTB)Lys - Pro - VaI - GIy - (CTB)Lys - VaI-GIy - (CTB)Lys - (CTB)Lys - Arg - Arg - Pro - VaI-(CTB)Lys - VaI - Tyr - Pro - VaI - NH₂ · Azetat, läßt 12 Stunden bei 0°stehen, gibt noch eine weitere, aus 2,0 g CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-NHNH₂ hergestellte Menge von Tetrapeptidazid zu, läßt 6 Stunden bei 0° stehen, dampft ab, verarbeitet mit Essigester, wäscht mit heißem Azeton und Essigester und trocknet im Vakuum. Man löst'das erhaltene Produkt in 100 ml 90%iger Trifiuoressigsäure, läßt 1 Stunde bei 20° unter Stickstoff stehen, dampft ab, verarbeitet mit Essigester, filtriert und trocknet. Man löst das erhaltene Produkt in 500 ml 0,2 N-Essigsäure, behandelt die Lösung mit Amberlit-IRA-410 in Azetatform, filtriert und lyophilisiert. Nach Trocknen über Natriumhydroxyd erhält man 7,5 g H-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Phe-Arg-Try-GIy-Lys-Pro-VaI-GIy-Lys-Lys-Arg - Arg - Pro - VaI - Lys - VaI - Tyr - Pro - VaI - NH₂ · Heptaacetat · Dekahydrat, das sich bei der Chromatographie und der Elektrophorese homogen verhält. (Totalhydrolyse gibt die folgenden Aminosäurezusammensetzungen : Se^ ,gTyq ,9NIe₁ _Λ GIu₁.0HiS₁ ^₀PhC₁ _Λ -Arg₃,₁Gly_2ioLys₄,₁Pro3,₀Val₃,₉.)

Mikroanalyse:

Berechnet ... C 51,9, H 7,5, N 16,2, O 24,4%; gefunden .... C 52,1, H 7,5, N 15,6, O 24,8%.

Schmp.: 209° mit Zersetzung, [a] ²S = -80° in 1 N-Essigsäure.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung des Pentacosapeptids der Formel D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl - L - glutamyl - L - histidyl - L - phenylalanyl-L - arginyl - l - trypt ophanyl - glycyl -L-lysyl-L- pro-IyI-L-valyl - glycyl - L - lysyl - L - lysyl - L - arginyl-L - arginyl - l - prolyl - L - valyl - L - lysyl - L - valyl-L - tyrosyl - l - prolyl - L - valinamid, seiner Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe, d adurch gekennzeichnet, daß man das Peptid der obigen Formel nach aus der Peptidchemie an sich bekannten Methoden darstellt und anschließend gegebenenfalls auf an sich bekannte Weise in seine pharmakologisch verträglichen Säureadditionssalze oder Schwermetallkomplexe überfuhrt.

2. D - Ser¹ - Nie⁴ - Pentacosapeptid der Formel D - Seryl - L - tyrosyl -L- seryl -L- norleucyl - L - glutamyl - L - histidyl - L - phenylalanyl - L - arginyl-L - tryptophanyl - glycyl - L - lysyl - L - prolyl - L - valylglycyl - L - lysyl - L - lysyl - L - arginyl - L - arginyl-L - prolyl - L - valyl - L - lysyl - L - valyl - L - tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid.

3. Pharmazeutische Präparate, dadurch gekennzeichnet, daß sie das D - Ser¹ - Nie⁴ - Pentacosapeptid bzw. dessen pharmakologisch verträglichen Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe enthalten.