DE2003421A1 - Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptids - Google Patents

Description

Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten

Polypeptids λ

Die vorliegende Erfindung betrifft ein bisher unbekanntes Polypeptid der Formel I H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe- Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHp, seine therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze, seine Schwermetallkomplexe, Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung und ihrer Säureadditionssalze sowie pharmazeutische Zubereitungen. I

Das bisher unbekannte Polypeptid der Formel I kann nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden, wobei die Aminosäuren in der, in der obigen Formel festgelegten Reihenfolge einzeln oder nach Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden, wobei auf einer geeigneten Stufe der Synthese die Disulfidbrücke verknüpft wird.

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Die Verknüpfung der Aminosäure und/oder Peptideinheiten erfolgt z.B. in der Weise, dass man eine Aminosäure mit geschützter a-Aminogruppe und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier a-Aminogruppe und freier oder geschützter terminaler Carboxylgruppe umsetzt oder dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter a-Aminogruppe und geschützter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier terminaler Carboxylgruppe und geschützer a-Aminogruppe umsetzt.

Die Carboxylgruppe kann beispielsweise durch Ueberführung in ein Säureazid, -anhydrid, -imidazolid, -isoxazolid oder einen aktivierten Ester oder durch Reaktion mittels eines Carbodiimide oder Ν,Ν'-Carbonyl-diimidazols aktiviert

15 werden.

Vorzugsweise wird als Kondensationsmethode die Carbodiimidmethode, die Azidmethode, die Methode der aktivierten Ester, die Anhydridmethode und die Merrifieldmethode verwendet. In der letzten Stufe der Kondensation sind insbesondere Methoden zu verwenden, bei denen keine Racemisierung auftritt oder bei denen die Racemisierung gering gehalten werden kann, vorzugsweise durch Verwendung der Azide oder der aktivierten Ester, wobei die Aktivierung vorzugsweise mit N-Hydroxysuccinimid vorgenommen wird.

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An der Reaktion nicht beteiligte, freie funktionelle Gruppen können beim Aufbau des bisher unbekannten Peptide wie folgt geschützt werden:

Für die Blockierung der 7-Carboxylgruppe in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz A hat sich die tert.-Butyloxygruppe bewährt, doch können auch andere Schutzgruppen, wie die Methoxy-, die Aethoxy-, die tert.-Amyloxy-, die i Amid- oder die Benzyloxygruppe verwendet werden.

Pur die Blockierung der Imidazolgruppe des Histidinrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C hat sich die Triphenylmethylgruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbo-tert.-butoxy-, die Carbo-tert.-amyloxy-, die Carbobenzoxy- oder die Benzylgruppe /erwendet werden.

Für die Blockierung der Guanidogruppe des Argininrestes beim Aufbau der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C wurde die Nitrogruppe verwendet, doch können auch andere . geeignete Schutzgruppen, wie die Tosylgruppe, die p-Nitrocarbobenzoxygruppe oder die 2-(Isopropyloxycarbonyl)-5,4, 5,6-tetra.chlorobenzoylgruppe verwendet werden. Man kann aber auch den Schutzeffekt der Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.

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Pur die Blockierung der a> -Aminogruppe des Lysinrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz D kann eine Carbo· tert.-alkoxygruppe, vorzugsweise die Carbo-tert.-butoxygruppe verwendet werden.

Als Mercaptosehutzgruppe in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz Fl und F2 verwendet man vorzugsweise die Benzyl- oder Tritylgruppe. Ueblicherweise werden die zur Synthese der Teilsequenz F zum Schutz der SH-Gruppen verwendeten Benzyl- bzw. Tritylreste am Ende der Synthese durch Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak abgespalten. Es wurde nun gefunden, dass die Abspaltung der Benzyl- bzw. Tritylschutzgruppen sowie die Herstellung Der S-S-Blndung vor der letzten Stufe zu besonders guten Ausbeuten an Endprodukt führt.

Die Umwandlung einer geschützten Mercapto- oder Aminogruppe in eine freie Gruppe sowie die Umwandlung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Laufe des Verfahrens zur Herstellung des neuen Polypeptide der Formel I erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln.

Die Ausgangsprodukte zur Herstellung des neuen Polypeptids der Formel I können, sofern sie bisher nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten

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werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.

Das neue Polypeptid der Formel I lässt sich auch in Form seiner Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen Säuren, wie beispielsweise Essigsäure, Milchsäure, Bernsteinsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure, Toluolsulfonsäure sowie polymere " Säuren, wie Gerbsäure oder Carboxymethylcellulose und Salze mit anorganischen Säuren, wie beispielsweise Halogenwasser stoff säure, z.B. Salzsäure oder Schwefelsäure und Phosphorsäure in Frage. Als Schwermetallkomplexe kommen z.B. diejenigen vom Zink ®^ in Frage.

/wertvolles Heilmittel und stellt Die neue Verbindungist ein/ein wichtiges therapeutisches Prinzip dar, das den Calciumplasmaspiegel, insbesondere den , erhöhten Calciumplasmaspiegel, senkt und als Antagonist des Parathormons eine positive Calciumbilanz im Knochen bewirkt. Die biologische Wirkung der neuen Verbindung wurde an Ratten geprüft, wobei sich aufgrund der Senkung des Blut-Calciums

ein Wert von 500 ί 100 MRC-Einheiten/mg Peptid ergab.

Die zu verabreichende Dosis hängt von der gewünschten Wirkung sowie von der Applikationsart ab. Im allgemeinen werden jedoch mit einer einmal zu verabreichenden Tagesdosis von 1-10 Ein-

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heiten pro kg Tiergewicht zufriedenstellende Resultate erzielt. Für grössere Säugetiere beträgt die Tagesdosis etwa 70-700 Einheiten, die auf einmal oder in mehreren Anteilen verabreicht werden können. Für die intramuskuläre Applikation enthält eine geeignete Verabreichungsform etwa 70-700 Einheiten der Wirksubstanz, vermischt mit einem flüssigen Träger.

Die neue Verbindung ist indiziert bei allen Zuständen, bei welchen eine Senkung des Plasmacalciumspiegels erwünscht ist, z.B. Hypercalcämien verschiedener Genese, Mangel des endogenen Thyreocalcitonins in Folge Ausfalls von Schild-

odex^
drüsengewebe /'Hyperfunktion der Nebenschilddrüsen. Die neue Verbindung ist indiziert bei allen Knochenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine vermehrte Calciumfixation im Knochen erwünscht ist, z.B. Osteoporose verschiedener Genese (z.B. postklimakteriseh, posttraumatisch, bedingt durch Corticosteroidtherapie oder Inaktivität usw.), Frakturen, Osteomalacie, Rachitis sowie insbesondere zur Kombinationstherapie mit Calcium bzw· Phosphat.

Die neue Verbindung kann als Heilmittel, z.B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannte Verbindung in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial.

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Die neue Verbindung und ihre Salze können auch als Zwischenprodukt zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.

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Es werden folgende Abkürzungen verwendet:

Z = Carbobenzoxy (Benzyloxycarbonyl)

Bzi = Benzyl

BOC = tert.-Butyloxycarbonyl

Trt = Trityl = Triphenylmethyl

OTB = tert.-Butyloxy

ONP = p-Nitrophenylester

OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxy

OSu = N-Hydroxysuccinimid

OMe = Methoxy

OEt = Aethoxy

NOp = Nitro

Ser = L-Seryl

Asn = L-Asparaginyl

Leu = L-Leucyl

Lys = L-Lysyl

Thr = L-Threonyl

VaI = L-Valyl

AIa = L-Alanyl

Tyr = L-TyrosyI

Trp = L-Tryptophanyl

Arg = L-Arginyl

Phe = L-Phenylalanyl

GIu = L-Glutamyl

His « L-Histidyl

Pro = L-Prolyl

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GIy = Glycyl Met = L-Methionyl Cy-s = L-Cysteinyl

In don folgenden Beispiel , das die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken soll , erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden. Die optischen Drehungen sind mit einer Konzentration von 1 Mol/Liter bestimmt worden. "

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Teil 1

<o OO

to to

BzI +

BzI

B0C-|cys Ser Asn Leu Ser -NHNH_g H-| Thr Cys VaI Leu |-0H

	BzI	Teilsequenz Pi	Asn	Leu	ι	Ser	Thr	BzI	VaI	Leu	-OH NJ
BOC-	Cys	Ser					Cl			O O
			Asn	Leu	Ser	Thr	rs	VaI	Leu	CO
BOC-	Cys	Ser			Teilsequenz F					FO
			Asn	Leu	Ser	Thr	Cys	VaI	Leu
BOC-	Cys	Ser
			Asn	Leu	Ser	Thr	Cys	VaI	Leu
H-	Cys	Ser
Cys

Teil 2

*63t/S£8600

BOC

8er AIa Tyr Trp

-NHNH₂ H-

Trt

Lys Asn Leu Asn Asn Tyr

	Ser	Teilsequenz	E	BOC	Asn	Leu	Teilsequenz D
Trt-		AIa Tyr	Trp	Lys			Asn Asn Tyr
	Ser			BOC	Asn	Leu
Trfc-	AIa Tyr	Trp	Lys		Asn Asn Tyr

-OMe Trt-

-OMe Trt-

Teilsequenz DS

BOG

His	Arg	Phe	Arg	Phe	-NHNH2
Teilsequenz C
Trt	Arg	Phe
His
His

Ser

H-

Ser

AIa

Tyr

Trp

Lys Asn

•

Asn

Asn

Asn

Tyr

His

Arg

Phe

Trt-

BOC j

1 Leu

AIa

Tyr

Trp

ι Lys Asn

Asn

Asn

Tyr

His

Arg

Phe

Ser

Teilsequenz ABCDE

Leu

BQC

AIa

Tyr

Trp

I Lys Asn

Asn

Asn

Tyr

His

Arg

Phe

Ser

Teilsequenz ABGDEF

Leu

Beispiel

AIa

Tyr

Trp

Lys Asn

Asn

Tyr '

His

Arg

Phe

Leu

OTB

BOC-

Ser GIy Met GIy

-OH H-

Phe GIy Pro GIu Thr Pro

Teilsequenz B

GIy

Met

GIy

GIy

Met

GIy

Teilsequenz A

GIy

Pro

OTB

Thr

Pro

BOC-

Ser

Phe

GIu

GIy

Met

GIy

GIy

Met

GIy

GIy

Pro

Thr

Pro

H-

Ser

Phe

GIu

GIy

Met

GIy

GIy

Met

GIy

GIy

Pro

Thr

Pro

Ser

Phe

GIu

GIy

Met

GIy

GIy

Met

GIy

GIy

Pro

Thr

Pro

Ser

Teilsequenz ABC

Phe

GIu

GIy

Pro

Thr

Ser

Phe

GIu

Pro

GIy

Pro

Thr

Ser

Phe

GIu

Pro

GIy

Pro

Thr

. Ser

Phe

GIu

Pro

GIy

Pro

Thr

Ser

Phe

GIu

Pro

-NH,

-NH,

-NH,

-NH,

-NH,

-NH,

-NH,

-NH,

Tell 5

-NH,

Beispiel; H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-.Val-Leu-Ser-Ala-

Tyr-Trp-Lys~Asn-Leu-Asn~Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH^, « Hexaacetat * Decahydrat

Man löst 3,3 g der Teilsequenz ABCDEF unter Stickstoffatmosphäre in 100 ml Trifluoressigsäure, lässt 15 Minuten bei 20° stehen und dampft zur Trockne ein. Man löst in 300 ml 0,2 N Essigsäure, behandelt mit 20 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat), " lyophilisiert, wäscht mit Diäthyläther und trocknet über Kaliumhydroxid im Hochvakuum. Man erhält die im Titel angegebene Verbindung, Smp. 220° (Zers.), [a]*" = -42° in 1 N Essigsäure.

Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6 N, 16 Std.):

,l' ^ArSl,0' ^AsP3,9' ^Cys/21,6' ^Glul,2

^Lysl,l' ^Leu2,9' ^Metl,0' ^Phe2,0' ^Pro2,l'

Tyr_{2 0}, VaI 0,9 (Trp 1,0 durch Spektrophotometrie). λ

Das im Beispiel verwendete Ausgangsmaterial wird wie folgt hergestellt:

?5ii^s53H?25--£ H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NHg Man löst bei -5° 134 g Z-Thr-NH-NH₂ in 2 1 1 N Salzsäure und versetzt mit 0,55 1 1 N Natriumnitrit. Nach 5 Minuten wird Kaliumcarbonat bis pH 9 zugegeben, das entstandene Azid mit Essigsäureäthylester extrahiert und eine Lösung von

8ö g H-PrO-NH₀ · hydrochlorid in 100 ml Wasser, 500 ml Di- ^d 009835/1994

methylformamid und 77 ml Triä_rthylamin hinzugefügt. Man verdampft den Essigsäureäthylester bei 20° im Vakuum und lässt über Nacht bei 25° stehen. Die restliche Lösung wird im Vakuum verdampft, der Rückstand in Essigsäureäthylester gelöst, die Lösung mit Wasser, verdünnter Salzsäure und einer wässrigen Kal-J.umcarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Man verdampft im Vakuum, löst in warmem Essigsäureäthylester und kühlt ab. Man erhält Z-Thr-Pro-NHp; Smp. 148°, [a]p° = -72° in 95 % Essigsäure. Man löst hierauf

90 g Z-Thr-Pro-NHp in 2 1 Dioxan und 260 ml 1 N Salzsäure und hydriert bei 20° und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Man filtriert, verdampft die Lösung im Vakuum, wäscht den Rückstand mit Essigsäureäthylester und erhält H-Thr-Pro-NH₂ · HCl; Smp. 2l6°, [a]^° = -64° in 95 %

Essigsäure. Dieses wird in 500 ml Dimethylformamid, 50 ml Wasser und J2 ml Triäthylamin gelöst und 118 g Z-GIu(OTB)-OCP und 800 ml Tetrahydrofuran zugegeben. Man lässt über Nacht bei 20° stehen, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand mit Diäthyläther. Man erhält Z-GIu(OTB)-Thr-Pro-

NH₂, Smp. 65° (Zers.), [a]^° = -l8° in Dimethylformamid. Man löst 8o g Z-GIu(OTB)-Thr-Pro-NHg in 1,5 1 Dioxan und 200 ml Wasser und hydriert bei 20° und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Die Lösung wird filtriert und im Vakuum verdampft und der Rückstand mit Diäthyläther versetzt« wobei H-OIu(OTB)-Thr-Pro-NH₂ erhalten wird» Smp.

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65° (Zers.), [α]Jj⁰ = -28° in Dimethylformamid. Dieses wird in 700 ml Dimethylformamid bei 0° gelöst, 200 ml Acetonitril, 68 g Z-Phe-Gly-Pro-OH, 18 g N-Hydroxysuccinimid und 52 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzugefügt, über Nacht bei 20° stehen gelassen, filtriert, im Vakuum eingedampft und mit Essigsäureäthylester versetzt. Danach wäscht man die Lösung mit Wasser, verdünnter Salzsäure und wässriger Kaliumcarbonatlösung, trocknet über Natriumsulfat, verdampft im ä Vakuum und kristallisiert den Rückstand aus Essigsäureäthyl-

ester/Diäthyläther. Man erhält Z-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thron
Pro-NHp, Smp. 120° (Zers.), [a]^ = -66° in Dimethylformamid, das man in I500 ml Dioxan und 500 ml Wasser löst. Man gibt 50 g Palladiumkohle (10 %) zu und hydriert bis zum Ende der Wasserstoffaufnähme. Man filtriert, dampft das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand aus Dioxan. Man erhält die

20
Teilsequenz A, Smp. 155°, [a]_D = -79° in Dimethylformamid.

Teilsequenz B: BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH

a) H-Met-Gly-OEt * HCl

Man löst 65 g BOC-Met-OH in 900 ml Chloroform, kühlt auf -10°, gibt 50 ml N-Methylmorpholin und 55,6 g Chlorameisensäureisobutylester zu. Nach 10 Minuten fügt man langsam eine Lösung von 50 g Glycin-äthylester in 200 ml Chloroform hinzu und lässt bei 20° eine Stunde reagieren. Man extrahiert mit 0,5 N Ammoniumhydroxid, dann mit 0,2 N Schwefel-

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säure, wäscht mit Wasser neutral, trocknet über Natriumsulfat und engt ein. Nach Umkristallisieren aus Petroläther erhält man BOC-Met-Gly-OEt; Smp. 49°, Ia]* = -19° in Aethanol. Man löst es in 750 ml 4 N HCl/Aethanol, lässt 1 Stunde bei 25° stehen, dampft ein, wäscht den Rückstand mit Diäthylather und trocknet bis zur Gewichtskonstanz. Man erhält die unter a) aufgeführte Verbindung in Form eines Oeles.

b) BOC-Ser-Gly-OEt

Man löst 12,5 g N-tert.-Butyloxycarbonyl-serin in 100 ml Chloroform und gibt 6,1 g N-Methylmorpholin dazu; danach tropft man 8,2 g Chlorameisensäureisobutylester hinzu. Nach 10 Minuten wird eine Lösung von 6,6 g Glycin-äthylester in 50 ml Chloroform hinzugefügt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit verdünntem Ammoniak, dann mit Salzsäurelösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und die organische Phase abgedampft. Man erhält die unter b) aufgeführte Verbindung als OeI; [α]* = -5° in Dimethylformamid.

20 c) BOC-Ser-Gly-NHNIU

Man löst 19,4 g BOC-Ser-Gly-OEt in 270 ml Aethylalkohol, gibt 48,6 ml Hydrazinhydrat hinzu und lässt 2 Tage bei Raumtemperatur stehen. Ansohliessend dampft man die Lösung ab und kristallisiert den Rückstand aus einem Methylalkohol/

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Diäthyläther-Gemisch (1:5). Man erhält die unter c) ange-

führte Verbindung, Smp. 157°, [aJ_D = -5° in Dimethylformamid.

d) BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt

Zu 200 ml Dimethylformamid werden 25 ml einer 4 N Chlorwasserstofflösung in Aethyläther gegeben und darin bei -10° 11 g B0C-Ser-Gly-NHNH₂ gelöst. Anschliessend tropft man bei -10° 5,4 ml tert.-Butylnitrit hinzu, fügt der Lösung zuerst 18 ml Triäthylamin und dann eine Lösung von 12 g H-Met-Gly-OEfHCl in 100 ml Dimethylformamid und 6,2 ml Triäthylamin bei. Es wird 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, nach 12 Stunden filtriert und eingedampft. Den Rückstand löst man in Chloroform, wäscht nacheinander mit verdünnter Ammoniak- und

Salzsäurelösung, trocknet über Natriumsulfat und dampft ein. Man erhält die unter d) angeführte Verbindung, [a]_D =

15 -14° in Dimethylformamid.

e) Teilsequenz B

Man löst 24 g BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt in 250 ml Dioxan, gibt 75 ml 1 N Natronlauge zu, rührt 1 Stunde bei 25°, behandelt mit 150 ml Dowex-50 (H⁺-Form), filtriert, dampft das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand aus Essigsäureäthylester/Diäthyläther. Man erhält Teilsequenz B, Smp. 87° (Zers.)# [a)S° ^β -¹T^{0 in} Dimethylformamid.

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Teilsequenz C: Trt-HisCTrt^Arg-Phe-NH-NH^ ♦ HCl

^a) Z-Arg(N0 ₂)-Phe-0Me

51,8 g H-Phe-OMe · HCl werden in 1 Liter Diäthylather und ca. 50 ml Eiswasser gelöst und unter Rühren und Kühlen genügend Natriumcarbonat zugegeben, bis alles Wasser abgebunden ist. Man filtriert und dampft das Filtrat bis zur Gewichtskonstanz ein, wobei ein farbloses OeI erhalten wird.

67,6 g Z-Arg(NOp)-OH werden in 300 ml Acetonitril und I50 ml Dimethylformamid gelöst und mit 41,2 g H-Phe-OMe versetzt.

Danach wird auf -20° abgekühlt und eine Lösung von 4j,4 g Dicyclohexylcarbodiimid in 100 ml Acetonitril zugegeben.

Das Ganze lässt man unter zeitweiligem Umschütteln während 4 Stunden im Eiskasten stehen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Eindampfrückstand wird in 1 Liter Essigsäureäthylester gelöst und hierauf in der Kälte mit 1 N Natronlauge, Wasser, 1 N Schwefelsäure, Wasser und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylesterphase

wird vollständig eingedampft. Nach Umkristallisieren aus Essigsäureäthylester/Petroläther erhält man die unter a) angeführte Verbindung, Smp. I3I-I33⁰, [a]^° = -7° in Methanol, -4° in Dimethylformamid.

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b) H-Arg(N0 ₂)-Phe-0Me '0,5 H ₂ O * 1,2 HBr 20 g Z-Arg(N0_)-Phe-OMe werden in 50 ml Eisessig gelöst und unter leichtem Kühlen 50 ml 40 $ige Bromwasserstoffsäure in Eisessig zugesetzt. Danach lässt man das Ganze unter zeitweiligem Umschütteln während 1 Stunde bei 20° stehen. Nach vollständigem Eindampfen wird der Rückstand in 200 ml Wasser gelöst und zweimal mit Diäthyläther gewaschen. Die wässrige Phase wird vollständig eingedampft und der Rückstand aus Methanol/Diäthyläther umkristallisiert. Man erhält ™ die unter b) angeführte Verbindung. Smp. I65-I67⁰ mit Zers., [α]?⁰ = +18° in Methanol, +14° in Dimethylformamid.

c) Z-His(Z)-Arg (NOQ-Phe-OMe

46,1 g Η-Arg (NO₂)-Phe-0Me·0,5 H₉O·1,2 HBr werden in 100 ml Wasser gelöst, hierauf erwärmt und anschliessend abgekühlt. Nach Zugabe von Chloroform und Eis wird mit Ammoniak auf pH gestellt. Die Chloroformphase wird noch einmal mit Wasser ge- waschen, anschliessend über Natriumcarbonat getrocknet und filtriert. Dem Filtrat wird eine Lösung von 44,5 g Z-His(Z)-OH, 12,1 g N-Hydroxysuccinimid in 200 ml Acetonitril und 100 ml Pyridin zugesetzt, danach das Ganze auf -20° abgekühlt und mit einer Lösung von 21,1 g Dicyclohexylcarbodiimid in 70 ml Acetonitril versetzt. Anschliessend wird unter zweitweiligem Rühren 4 Stunden im Eiskasten stehen gelassen. Der ent standene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat ein gedampft. Der Rückstand wird in Essigsäureäthylester aufge-

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nommen und anschliessend folgendermassen gewaschen: 10 Kaliumcarbonatlösung (pHxw 10), Wasser, gesättigte Kochsalzlösung, Wasser, gesättigte Kochsalzlösung, Schwefelsäure (pH 3), Wasser, Kochsalzlösung. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester-Phase wird vollständig eingedampft, wobei ein hellbeiger Schaum erhalten wird. Dieser Schaum wird je zweimal in wenig Methanol gelöst und mit Diäthyläther gefällt. Die Aetherphasen werden abdekantiert und der Niederschlag getrocknet; man erhält die unter c) ange·

20 führte Verbindung (amorpher Schaum), [α)_Ό = -8° in Methanol,

-8° in Dimethylformamid.

d) H-His-Arg-Phe-OMe · 4 HCl

25 g Z-His(Z)-Arg(NO₂)-Phe-0Me werden in 800 ml Eisessig

gelöst. Danach werden 10 g 10 % Palladium auf Aktivkohle in 200 ml 1 N Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer 2-stündigen Hydrierung unterworfen und anschliessend der Katalysator abfiltriert. Das Piltrat wird erneut mit 5 g 10 % Palladium auf Aktivkohle in Wasser versetzt und der Hydrierung unterworfen, die nach 5 1/2 Std.

beendet ist. Hierbei werden ca. 80 % der theoretischen Menge Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Piltrat vollständig eingedampft, wobei die unter d) ange· führte Verbindung in Form eines amorphen Schaumes erhalten wird.

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e) Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe ♦ HCl

21,5 S H-His-Arg-Phe-OMe · 4 HCl werden in 100 ml Pyridin und ca. 100 ml Dimethylformamid gelöst. Bei ca. +5° wird bis pH 9 Triäthylamin zugegeben und anschliessend eine Lösung von 29 g Tritylchlorid in 300 ml Pyridin während 5 Minuten zugetropft. Nach Beendigung der Zugabe wird von Zeit zu Zeit das pH geprüft und nötigenfalls wieder mit Triäthylamin auf ca. pH 9 gestellt. Das Ganze wird nach ä

ungefähr 4 Stunden eingedampft, der Rückstand in Chloroform und Wasser aufgenommen und unter Zugabe von wenig 1 N Salzsäure auf pH 4 gestellt. Man trennt die Chloroformphase ab, wäscht sie zweimal mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft vollständig ein. Der Rückstand wird mit Aether versetzt und vom Diäthyläther anschliessend abfiltriert, wobei die unter e) angeführte Verbindung erhalten wird.

f) Teilsequenz C

17 g Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe · HCl werden in 200 ml Methanol gelöst und mit 40 ml Hydrazinhydrat versetzt. Danach wird 2 Tage bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Man dampft ein, löst den Rückstand in Chloroform und wäscht zweimal mit Wasser. Die Chloroform-Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Hierauf wird der Rückstand mit

Diäthyläther gewaschen und abfiltriert; er besteht aus

18 Teilsequenz C, [a]_D » -9° in Dimethylformamid.

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2 O O 3 A 21 100-5044

Teilsequenz D: H-Lys(BOC)-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe

a) Z-Asn-Tyr-OMe

Man löst 89 g Z-Asn-OCP und 5I g H-Tyr-OMe in 500 ml Dimethylformamid, lässt über Nacht bei Zimmertemperatur stehen und fällt aus in Aether, filtriert ab und wäscht mit Diäthyläther. Man löst in Dimethylformamid und fällt aus in Wasser, filtriert ab, wäscht mit Wasser nach und trocknet. Man er-

20 hält die unter a) angeführte Verbindung, Smp. 199°, [a)_D =

+6° in Dimethylformamid.

b) H-Asn-Tyr-OMe · HCl

Man löst 51 g Z-Asn-Tyr-OMe in 500 ml Dioxan und 85 ml 1 N Salzsäure, hydriert bei 25⁰C in Gegenwart eines Palladiumkatalysators, filtriert ab, dampft das Filtrat ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther und trocknet. Man erhält die

20 unter b) angeführte Verbindung, [a)_D = +29° in Dimethylformamid,

c) Z-Asn-Asn-Tyr-OMe

Man löst 54,6 g H-Asn-Tyr-OMe · HCl und 57 g Z-Asn-OCP in 500 ml Dimethylformamid, gibt 6 ml Eisessig und nachher 14 ml Triäthylamin zu. Man lässt 2 Tage bei 25° stehen und fällt in Diäthyläther aus. Man löst in Dimethylformamid, fällt in Wasser aus, filtriert ab und wäscht mit Wasser nach. Man

20 erhält die unter c) angeführte Verbindung, Smp. 220°, [a)_D «

-4° in Dimethylformamid.

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d) H-Asn-Asn-Tyr-OMe · CH,COOH

Man löst 42 g Z-Asn-Asn-Tyr-OMe in 750 ml Dimethylformamid und gibt 8o ml 1 N Essigsäure zu. Man hydriert bei 25°C in Gegenwart eines Palladiumkatalysators, filtriert ab und dampft das Filtrat ein. Der Rückstand wird in heissem Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Man erhält die unter d)

PO

angeführte Verbindung, Smp. 168°, [a]p = -6° in Dimethylformamid . g

e) Z-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe

Man löst 40 g Z-Leu-OCP und 53 g H-Asn-Asn-Tyr-OMe · CH COOH in 500 ml Dimethylformamid, lässt 2 Tage bei 25° stehen und fällt in Diäthylather aus. Man löst in Dimethylformamid, fällt mit Wasser aus, filtriert ab und wäscht mit Wasser nach. Man erhält die unter e) angeführte Verbindung, Smp.

15 241°, [a]p° = -15° in Dimethylformamid.

f) Η-Leu-A sn-A sn-Tyr-OMe

Man löst 54 g Z-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe in 500 ml eines Gemisches von Diraethylformamid/Wasser (8:2) und hydriert in Gegenwart eines Palladiumkatalysators bei 20°. Man filtriert ab und dampft das Filtrat ein. Der Rückstand wird in heissem Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Man erhält die unter f) ange-

ΡΩ

führte Verbindung, Smp. 175° # Ι^α1ρ = -^l6° in Dimethylformamid.

g) Z-A sn-Leu-A sn-A sn-Tyr-OMe

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Man löst 45 g Z-Asn-OCP und 26,5 g H-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe in 500 ml Dimethylformamid, lässt 2 Tage bei 25° stehen, tropft in Diäthyläther ein, filtriert ab, wäscht mit Diäthyläther nach und trocknet. Man löst in Dimethylformamid, fällt mit Wasser aus, filtriert ab und wäscht mit Wasser nach. Man erhält die unter g) angeführte Verbindung, Smp. 255°* [α]jj° =-l8° in Dimethylformamid.

h) H-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe · CH^COOH

Man löst 52,8 g Z-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe in 2 1 Dimethylformamid, hydriert bei 20° in Gegenwart eines Palladiumkatalysators und fügt 60 ml 1 N Essigsäure zu. Die Lösung wird filtriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wird in heissem Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Man erhält die unter h) angeführte Verbindung, Smp. 210°,

on

15 1°]^ ⁼ "¹⁹° ^{in Dimetn}y^lformaniid·

i) Z-Lys(BOC)-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe

Man löst 12,6 g Z-Lys(BOC)-OCP und 11 g H-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe · CH COOH in 500 ml Dimethylformamid, lässt 2 Tage bei 25° stehen, tropft in Aether ein, filtriert ab, wäscht mit Aether nach und trocknet. Man löst in Dimethylformamid, fällt mit Wasser aus, filtriert ab und wäscht mit Wasser nach. Man erhält die unter i) angeführte Verbindung, Smp.

on

242°, [α]ρ = -20° in Dimethylformamid.

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j) Teilsequenz D

Man löst 11 g Z-Lys(BOC)-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe in

300 ml Dimethylformamid und hydriert bei 20° und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Die Lösung wird filtriert und das Produkt in Diäthyläther ausgefällt. Man wäscht mit Diäthyläther nach und erhält Teilsequenz D; Snip.

221°, fa]^° = -26° in Dimethylformamid.

Teilsequenz E^ Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-NHNHU

a) H-Tyr-Trp-OMe

Man löst 85 g Z-Tyr(Z)-Trp-OKe in einem Gemisch von 1000 ml Dioxan/V/asser (8:2) mit 145 ml 1 N Salzsäure und hydriert in Gegenwart eines Palladiumkatalysators bis zum konstanten Ende der Wasserstoffaufnähme. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird die Lösung eingedampft und mit 500 ml Wasser versetzt. Die wässrige Phase wird mit Essigsäureäthylester gewaschen und M mit festem Kaliumhydrogencarbonat alkalisch gestellt. Nach wiederholter Extraktion mit Diäthyläther und Eindampfen er-

20 hält man die unter a) angeführte Verbindung, Smp. 85⁰, l<*]^ «

-2° in Dimethylformamid.

20 b) Trt-Ser-Ala-OMe

Man löst 60 g H-AIa-OMe · HCl und I30 g Trt-Ser-OH in einem Gemisch von 1400 ml Acetonitril/Dimethylformamid (1:1) und gibt 60 ml Triäthylamin zu. Nach Versetzen mit 52 g

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N-Hydroxysuccinimid wird die' Lösung auf 0° abgekühlt und mit 97 g Dicyclohexylcarbodiimid 5 Stunden geschüttelt. Nach Filtration wird die Lösung eingedampft, mit Essigsäureäthylester versetzt und mit verdünnter Essigsäure und Kaliumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Nach Trocknen, Eindampfen und Behandeln mit Diäthyläther erhält man die unter b)

angeführte Verbindung, Smp. 146°, [a]?.⁰ = -56° in Dlmethyl-

^u formamid.

c) Trt-Ser-Ala-NHNH^

Man löst 82 g Trt-Ser-Ala-OMe in 800 ml Methanol auf und versetzt mit 80 ml Hydrazinhydrat. Nach 24-stündigem Stehenlassen bei 20° wird eingedampft und der Rückstand mit Diäthyläther und Wasser gewaschen. Man erhält die unter c) angeführte Verbindung, Snip. 126°, Ia]Jj⁰ = +38° in Dimethylformamid,

d) Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-OMe

30 g Trt-Ser-Ala-NHNHg werden in 170 ml Dimethylformamid ge löst, auf -20° abgekühlt und mit 100 ml 2 N Salzsäure in Dioxan versetzt. Nach Zugabe von 8,5 ml tert.-Butylnifcrit wird weitere 10 Minuten bei -20° gerührt und mit einer Dimethylformamidlösung, enthaltend 3I g H-Tyr-Trp-OMe · HCX und 50 ml Triethylamin, vereinigt. Nach 2-stUndigem Schütteln wird die Lösung verdampft und der Rückstand in Essigsäureäthylester aufgenommen. Nach Auswaschen mit verdünnter Essig saure, Ammoniak, Trooknen über Natriumsulfat und Eindampfen

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erhält man die unter d) angeführte Verbindung, Smp. 145°, [α]* = +16° in Dimethylformamid.

^e) Teilsequenz E

Man löst 50 g Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-OMe in 500 ml Methanol und versetzt mit 50 ml Hydrazinhydrat. Man lässt die Lösung 24 Stunden bei 20° stehen und dampft ein. Der Rückstand wird mit Diäthylather und Wasser behandelt. Die erhaltene

20 Teilsequenz E hat einen Smp. von 196°, [a]_D = +10° in

Dimethylformamid.

10 TeilsequenzJ?l: H-Thr-Cys(BzI)-Val-Leu-0H

a) H-CyS(BzI)-VaI-LeU-OMe · HBr

Man löst 21,0 g Z-Cys(BzI)-OCP und 12,5 g H-Val-Leu-OMe · HCl in 120 ml Dimethylformamid. Danach gibt man 5»9 ml Tri-

äthylamin hinzu, lässt 16 Stunden bei 25° stehen, fügt Essig- * säureäthylester hinzu, wäscht mit verdünnter Salzsäure,

trocknet über Natriumsulfat, dampft zur Trockne ab und kristallisiert den Rückstand aus Essigsäureäthylester/Diäthyl-•äther. Man erhält Z-Cys(BzI)-VaI-Leu-OMe, Smp. l60°, [a]^⁰ = -28° in Dimethylformamid, das man in 210 ml einer 40 $igen Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig löst. Man lässt 1 Std. bei 25° stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Diäthyläther um. Man erhält

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20 die unter a) angeführte Verbindung, Smp. 168°, [a)_D +14° in Dimethylformamid.

b) H-Thr-Cys(BzI)-VaI-LeU-OMe « 1,3 HBr

Man löst 20 g Z-Thr-NHNH₂ in 350 ml Dimethylformamid, kühlt auf -20°, gibt 100 ml einer Lösung von 2 N Salzsäure in Dioxan und anschliessend noch 10 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei -20° werden 45 ml Triäthylamin und 25,5 g H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe · HBr hinzugefügt und das erhaltene Gemisch während 16 Stunden bei 0° geschüttelt.

Man dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigsäureäthylester/Wasser, wäscht die organische Phase mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natrium· sulfat, dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Essigsäureäthylester um. Man erhält Z-Thr-Cys(BzI)-VaI-Leu-

15 OMe; Smp. 208°, [a]^ = -27° in Dimethylformamid.

Man löst 20 g von dem oben erhaltenen Tetrapeptid in 200 ml eines Gemisches von Trifluoressigsäure/Essigsäureäthylester (1:1) auf, leitet während 1 Stunde bei 0° einen Strom gasförmigen Bromwasserstoffs ein, dampft anschliessend ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol/Diäthyläther um. Man erhält die unter b) angeführte Verbindung, Smp. 202°, [a]p = -10° in Dimethylformamid.

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c) Teilsequenz Pl

Man löst 372 g H-Thr-Cys(BzI)-VaI-Leu-OMe · 1,3 HBr in 1800 ml Methanol, gibt 900 ml 2 N Natronlauge zu, lässt 1 Stunde bei 25° stehen, gibt 240 ml Eisessig zu und lässt 2 Stunden bei 0° stehen. Man filtriert die ausgeschiedene kristalline Masse ab, wäscht diese zuerst mit 1 N Essigsäure, anschliessend mit Wasser und trocknet bei 50° im

20 Hochvakuum. Man erhält Teilsequenz Pl, Smp. 219°, [a]_D =

-53° in 1 N Ammoniak.

10 Teilseguenz_F22 BOC-Cys(BzI^Ser-Asn-Leu-Ser-NH-NH^

a) H-Asn-Leu-Ser-OMe * HCl

Man löst 43 g H-Leu-Ser-OMe · HCl und 53 g BOC-Asn-ONP in 400 ml Dimethylformamid auf, gibt 22 ml Triäthylarain zu, lässt 1β Stunden bei 25° stehen, dampft zur Trockne ein

und kristallisiert den Rückstand aus Methanol um. Man erhält 51,6 g BOC-Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. 190°, [aJp = -24° in Dimethylformamid, das man in 500 ml einer 4 N Lösung von Salzsäure in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 25° stehen, dampft zur Trockne ein, Iö3t den Rückstand in Methanol und fällt mit Diäthyläther. Man erhält die unter a) angeführte

On

Verbindung, Smp. l80°, [α]*^υ - -23° in Dimethylformamid.

b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe » HCl

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Man löst 59,5 g B0C-Ser-NHNH₂ in 500 ml Dimethylformamid, kühlt auf -20°, gibt 200 ml einer 2 N Lösung von Salzsäure in Dioxan und anschliessend 20 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei -20° werden 40 ml Triäthylamin und 58,0 g H-Asn-Leu-Ser-OMe · HCl hinzugefügt, danach l6 Std. bei 0° gerührt, zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Chloroform/Diäthyläther umkristallisiert. Man erhält BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. 155°* [a]p° = -22° in Dimethylformamid, das man in 420 ml einer 4 N Salzsäurelösung in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 25° stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol/Essigsäureäthylester um. Man erhält die unter b) angeführte Ver-

20
bindung, Smp. 155° (Zers.), [a]^ = -15° in Dimethylformamid.

c) Teilsequenz F2

Man löst 18,5 g H-3er-Asn-Leu-Ser-0Me · HCl und l8 g BOC-Cys(BzI)-ONP in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 10 ml Wasser, 5,5 ml Essigsäure und 5,6 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 25° stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol um. Man erhält 25,1 g BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. l82°, [σ]^° = -17° in Dimethylformamid, das man unter leichtem Erwärmen in 200 ml Dimethylformamid löst. Man gibt 200 ml Methanol und 20 ml Hydrazinhydrat zu, lässt l6 Stunden bei }0° stehen, .fällt mit Diäthyläther, wäscht den Niederschlag mit Di äthyläther/Methanol (1:1) und trocknet die so erhaltene

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PO

Teilsequenz F2, Smp. 224°, [αJ^ = -15° in Dimethylformamid.

Teilsequenz P: BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH Man löst 18,4 g BOC-Cys(BzI)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH₂ (Teilsequenz P2) in 150 ml Dimethylformamid, kühlt auf -20°, gibt 40 ml einer 2 N Lösung von Salzsäure in Dioxan und 15 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei -20° gibt man noch m 28 ml Triäthylamin und 16,2 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH (Teilsequenz Fl) zu und rührt 16 Stunden bei 25°. Danach wird filtriert, die Lösung eingedampft und der Rückstand mit 1 N Essigsäure durchgewaschen. Man erhält BOC-Cys(BzI)-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH, Smp. 217°, [a]^° = -17° in Dimethylformamid.
Man löst das erhaltene Produkt in 5000 ml getrocknetem Ammoniak, gibt unter Rühren und Sieden des Ammoniaks Natriummetall bis zur tiefblauen Färbung zu. Zwecks Entfärbung wird % Ammoniumehlorid hinzugefügt. Man dampft zur Trockne ein und wäscht den Rückstand mit 1 N Essigsäure und Aceton durch. Nach Trocknen erhält man BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val- «Leu-OH, Smp. 248° (Zers.), (a]p° = -¹U⁰ in Dimethylformamid/ Wasser (5:1).

Man löst das so erhaltene Nonapeptid in 5000 ml 0,01 N Ammoniak auf, gibt unter Rühren 1 N Wasserstoffperoxyd bis zur negativen Nitroprussiatreaktion zu, dann noch 200 ml Eisessig, filtriert und lyophilisiert. Man erhält Teilsequenz F.

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Smp. 238⁰ (Zers.), [a]_D = -18° in Dimethylformamid/Wasser (3:1).

Teilsequenz ABC^ H-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-

Glu-Thr-Pro-NH ₂ · 3 CH,CO_gH

a) H-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHg · HCl Man löst 6,7 g BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH (Teilsequenz B), 12 g H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH (Teilsequenz A) und 2,1 g N-Hydroxysuccinimid in 50 ml Dimethylformamid und 20 ml Acetonitril auf, kühlt auf 0°, gibt 4,0 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzu und lässt l6 Stunden bei 0° stehen. Man dampft das Lösungsmittel ab, wäscht den Rückstand mit Wasser, Diäthyläther und Essigsäureäthylester und kristallisiert aus Chloroform um. Man erhält BOC-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH₂, Smp. 121° (Zers.), [a]^⁰ = -47° in Dimethylform-

amid, das man in 250 ml einer Lösung von 8 N Chlorwasserstoff in Dioxan löst. Man rührt während 2 Std. bei 25°, dampft zur Trockne ein und verarbeitet den Rückstand in Diäthyläther.

Man erhält die unter a) angeführte Verbindung, Smp. I30 (Zers.), [a]p = -48° in Dimethylformamid.

⁰⁰ 20 b) Teilsequenz ABC

-^ Man löst 9,9 g Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NHNH_o (Teilsequenz C) J£ In 100 ml Dimethylformamid, kühlt auf -20°, gibt I5 ml Dioxan/HCl 2 N und anschliessend 1,16 ml tert.-Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei -20°, gibt 28 ml Triäthylamin und

10,0 g H-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHg · HCl zu, rührt 4 Stunden bei 0°, filtriert und danipft zur Trockne ein. Man löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigsäureäthylester/Methanol (8:2) auf, wäscht mit verdünntem Ammoniak und anschliessend mit Wasser bis zur Neutralität, trocknet über Natriumsulfat, konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man löst den Niederschlag wiederum in Dimethylformamid auf und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man erhält Trt-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-

Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHg [Smp. 168° (Zers.), t⁰)^⁰ = -^5° in Dimethylformamid], das man in 500 ml Essigsäure/Wasser (8:2) löst. Man erwärmt während 20 Minuten bei 90°, dampft ein, wäscht den Rückstand in Diäthyläther und trocknet im Hochvakuum über KOH-Spänen. Man erhält die Teilsequenz ABC,

15 Smp. l80° (Zers.), [α]^ = -66° in Essigsäure.

Teilsequenz DE: Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu-Asn-

Asn-Tyr-NHNH ₂

a) Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe Man löst 4,5 g Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-NHNHg in 50 ml Dimethylformamid, darin bei -20⁰C 8,2 ml einer 2,5 N Chlorwasserstoff lösung in Dioxan. Anschliessend tropft man bei -20° 1,5 ml tert.-Butylnitrit/Dioxan-(l:l)-Lösung zu, fügt zuerst ■ 5,5 ml Triäthylamin und dann 4,5 g H-Lys(BOC)-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe in 200 ml Dimethylformamid zu. Es wird 5 Stunden

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bei Raumtemperatur gerührt und anschliessend filtriert. Das Piltrat wird eingedampft und der Rückstand mit Essigsäureäthylester pulverisiert. Nach Filtration und Waschen mit Essigester und Wasser erhält man die unter a) angeführte Ver-

Pf)

bindung, Smp. 240° (Zersetzung), [a)t = -2° in Dimethylformamid.

b) Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-NHNH^ Man löst 6 g Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe in 60 ml Dimethylformamid, gibt 6 ml Hydrazinhydrat zu und lässt 2 Tage bei Raumtemperatur stehen. Anschliessend dampft man die Lösung ab und verreibt den Rückstand mit Wasser, wäscht mit Wasser und Aether nach. Man erhält die

20
Teilsequenz DE, Smp. 244°, [α]^ = -9° in Dimethylformamid.

Teilsequenz ABCDE: H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-

Oly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHg » 2AcOH

a) Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-His-Arg-

Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Olu-Thr-Pro-NH,, Man löst 10,5 g Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu-Asn-Asn-TyT-NHNH₂ in 200 ml Dimethylformamid, kühlt auf -20° ab und setzt eine Salzsäurelösung in Dioxan zu. Anschliessend tropft man 1 ml tert.-Butylnitrit zu und vereinigt mit einer Lösung,

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die 10,5 g H-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHg und 15 ml Triäthylamin in 100 ml Dimethylformamid enthält. Nach 2 Std. wird die Lösung mit Aether gefällt, mit Chloroform und Wasser nachgewaschen. Man erhält die unter a) angeführte Verbindung, Smp. 242°, [a]j:⁰ = -43° in Dimethylformamid.

b) Teilsequenz ABCDE

Man löst 15 g Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH₂ in 500 ml 80 ^iger Essigsäure und lässt 2 Stunden bei 40° stehen. Nach Eindampfen und Behandeln mit Aether erhält man Teilsequenz ABCDE, Smp. 238⁰, [a] ^ = -25° in Essigsäure.

Teilsequenz ABCDEP: BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-

Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(B0C)-A5n-Leu-Asn»

Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-

Oly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHU * Acetat · trlhydrat

Man löst 1,0 g Nonapeptid (Teilsequenz P) in 10 ml Dimethylformamid, gibt 1,5 g N-Hydroxysuccinimid und 0,52 g Dicyclohexylcarbodiimid zu, rührt 6 Stunden bei 25°, filtriert und dampft das Filtrat zur Trockne ein. Man wäscht den Rückstand mit Essigester und Diäthyläther und trocknet. Man erhält

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BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-O-Su, Smp. 242°, das man in 10 ml Dimethylformamid löst. Zu dieser Lösung gibt man 3,1 g Trlcosapeptid-Diacetat (Teilsequenz ABCDE) und 1,2 g N-Hydroxysuccinimid und rührt 16 Stunden bei 25°. Man dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, Chloroform und Aceton. So erhält man das rohe, geschützte Dotriacontapeptid, das man in 50 ml eines Gemisches von Chloroform/Methanol/V/asser (70:30:5) löst: Man schichtet die erhaltene Lösung auf eine Kieselgelsäule (5 x 100 cm), die mit dem obengenannten Gemisch äquilibriert wurde. Die Elution wird mit einer steigenden Konzentration von Methanol durchgeführt. Die vereinigten Fraktionen, die das reine Peptid enthalten, werden abgedampft, anschliessend mit Diäthyläther gewaschen und über Kaliumhydroxid im Hochvakuum getrocknet. Man erhält die Teilsequenz ABCDEP, Smp. 24o° (Zers.), [aJ^⁰ -40° in Essigsäure 1 N/Methanol (2:1). Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6 N, 16 Std.):

' ^Argl,0' ^A5P3,9' ^CyS/²l,6' ^Glul,2' ^

,0' ^Metl,0' ^Phe2,0' ^Pro2,l' ^Ser3,8' 20 Tyr, _Q, VaI 0,9 (Trp 1,0 durch Spektrophotometrie).

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Claims (1)

1. Patentansprüche;

   Verfahren zur Herstellung eines neuen Polypeptids der

   Formel I H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH«, seiner Säureadditionssalze und Schwermetallkoraplexe, dadurch gekennzeichnet, dass man das Polypeptid der obigen Formel nach aus der Peptidchemie an sich bekannten Methoden darstellt und anschliessend gegebenenfalls auf an sich bekannte Weise in seine therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze mit organischen oder anorganischen Säuren oder Schwermetallkomplexe überführt.

   2. Verfahren zur Herstellung eines neuen Polypeptids der Formel I H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHp, dadurch gekennzeichnet, dass man aus BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH₂ die Schutzgruppen abspaltet.

   5. Verfahren zur Herstellung eines neuen Polypeptids der Formel I H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHp, dadurch gekennzeichnet, dass man BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH nach vorheriger

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   Aktivierung mit H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH₂ kondensiert und aus der so erhaltenen Verbindung BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC )-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met~Gly-Phe-Gly- Pro-Glu-Thr-Pro-NH₂ die Schutzgruppen abspaltet.

   4. Das Polypeptid der Formel I H-Cys-Ser-Aon-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe-

   Ser-Oly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHg.

   5· Heilmittel, enthaltend das Polypeptid der Formel I.

   DerPatentrnwaltt

   /n

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