DE2853840C2

DE2853840C2 - Cyclo-[(N epsilon -1L-lysin, 6-glycin) bradykinin]

Info

Publication number: DE2853840C2
Application number: DE2853840A
Authority: DE
Inventors: Gunar Ignatevi&ccaron; &Ccaron;ipens; Pavlovna Riga Inta; geb. Kondra&scaron;eva Misinja; Feliks Kazimirovi&ccaron; Mutulis
Original assignee: INSTITUT ORGANICESKOGO SINTEZA AKADEMII NAUK LATVIJSKOJ SSR RIGA SU
Current assignee: INSTITUT ORGANICESKOGO SINTEZA AKADEMII NAUK LATVIJSKOJ SSR RIGA SU
Priority date: 1977-12-14
Filing date: 1978-12-13
Publication date: 1982-11-25
Also published as: FR2411828A1; US4187217A; FR2411828B1; SU798098A1; JPS5498799A; DE2853840A1; JPS5811941B2

Description

(tert-butoxycarbonylphenylalanylglycylprolylphenylalanylnitroarginyl)lysylprolin; j) man versetzt die Produkte der Stufen »b« und »i« miteinander und erhält a-BenzyloxycarbonyU-(tert-butoxycarbonylphenylalanylglycylprolylphenylalanylnitroarginylj-lysylprolylprolylglycin-tertbutylester;

k) man setzt das Produkt der Stufe »j« in «-Benzyloxycarbonyte-fphenylalanylglycylprolylphenylalanylriitroarginyljlysylprolylprolylglycinhydrochlorid um;

1) man cyclisiert das Produkt der Stufe »k« und erhält Cyclo-Ka-benzyloxycarbonyU^phenylalanylglycylprolylphenylalanylnitroarginyljlysylprolylpro-

lylglycyl];

m) man hydriert das Produkt der Stufe »I« und erhält Cyclo-ßNM-L-Iysin.e-glycinJbradykinin].

Zum besseren Verständnis der Erfindung wird im folgenden Beispiel die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung im einzelnen beschrieben sowie eine schematische Darstellung der Synthese und eine Obersicht über die Ergebnisse der biologischen T.^sts beigefügt

Für die Synthese wurden Aminosäurederivate der Firma »Reanal« (Ungarn) benutzt Die Eindampfungen wurden in einem Vakuumverdampfer bei 30⁰C durchgeführt

Synthese des cyclischen Bradykinin-Analogons 1

Phe

BOC-BOC-

BOC-BOC- BOC-

BOC-H-

GIy

3	4	5	6	7	8	9
Pro	Phe	Arg	Lys	Pro	Pro	GIy

ONP H-

-OH

-OH H-

OH H--ONBTosOH

ONB

BOC—-P HBr

ONB BOC-

N₂H₃ H-

NO₂

OH Z-I-ONP-HCl NO₂

NO₂

-OH

-OH Z-

CF₃COOH OH

-OH H-

I₃PO₃

-OtBu

OH HCl

-y

-2CH₃COOH

Alle Aminosäuren mit Ausnahme des Glycins haben L-Konfiguration. Die in offenen Kapillaren festgestellten Schmelzpunkte sind unkorrigiert angegeben. Die Identität der dargestellten Verbindungen wurde mittels Dünnschiehtehromalographie mil Silufol-Platien in folgenden Systemen:

A Chloroform - Äthanol - Äthylacetat — Essigsäure - Wasser (85 : 5 : 8 : 2 : 0,25),
B Chloroform - Äthanol - n-Butanol - Äthylacetat - Wasser(10:6:4 :3: I),
C Chloroform — Methanol — Wasser (40 : 30 : 5).
D Butanol —Essigsäure —Wasser(4 : I : I),
E Äthylacetat—Pyridin —Essigsäure —Wasser

(5:5:1:3)

sowie durch Elektrophorese mit Papier FN 16 in IN oder 5 N Essigsäure geprüft. Die elektrophoretische Beweglichkeit En₁, wurde im Verhältnis zu Histidin bestimmt. Stoffliche Flecken wurden durch Betrachten

Besprühung mit Ninhydrin oder mit Hufe von Chlor und einem Benzidinreagens festgestellt. Bei allen Verbindungen stimmten die Ergebnisse der Elementaranalyse in befriedigender Weise mit dem berechneten Gehalt an C, N und H überein. Die Identifizierung der Verbindungen erfolgte weitgehend durch protonenmagnetische Resonanz bei 60 mHz. Die chemischen Schübe sowie die Form und Intensität der Signale entsprachen der Struktur von Peptiden. Die Aminosäurenanalyse wurde mit dem Gerät BIOCAL-200 durchgeführt, nachdem das jeweilige Peptid in einer zugeschmolzenen Ampulle einer 24stündigen Hydrolyse bei 110°C unterzogen worden war.

a)Benzyloxycarbonylprolylglycin-tert.-butylester(E8—9)

Man löste 10,0 g (40 mMol) Benzyloxycarbonylprolin in 50 ml Dimethylformamid, gab 4,45 ml (40 mMol) N-Methylmorpholin und bei —15° (tropfenweise) eine abgekühlte Lösung von 5,3 ml (40 mMol) Chlorkohlensäure-isobutylester in 10 ml Dimethylformamid hinzu. Dann wurde das Reaktionsgemisch 30 Minuten bei -15° gerührt und eine abgekühlte Suspension von 10.6 g (50 mMol) Glycin-tert.-butylesterphosphit in 100 ml Dimethylformamid und 036 ml (50 mMo!) N-Methylmorpholin zugegeben. Es wurde weitere 30 Minuten bei -15° gemischt und dann das Reaktionsgefäß 15 Minuten lang bei —10° stehengelassen. Die Lösungsflüssigkeit wurde im Vakuum eingedampft, der Rückstand in einer Mischung von 100 ml Äthylacetat und 100 ml Wasser aufgelöst, die Äthylacetatschicht mit 10% KaliumhydrogencarboiiJt- und Kaliumhydrogensulfatlösungen und mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, gefiltert und eingedampft. Der ölige Rückstand wurde durch Behandlung mit einer Äther-Hexanmischung (1:1) kristallisiert Ausbeute: 9,2 g (63%), F: 71-72°C; [*]?= -49,0° (C=2, in Dimethylformamid), Rf=0,55 (A); 0,64 (B); 0,68 (C).

b) Prolylglycin-tert-butylester (F 8—9)

5,0 g (133 mMol) E 8—9 wurden in einer Lösung von 50 ml Äthanol in Gegenwart von Palladiumschwarz 5 Stunden hydriert Nach Abfilterung des Katalysators wurde die Lösungsflüssigkeit eingedampft, der Rückstand in einer Mischung von trockenem Äther und Hexan (1:2) aufgelöst und nochmals eingedampft Hierbei fand ein Kristallisierungsprozeß statt, und nach völliger Eindampfung blieb eine farblose kristalline Substanz übrig. Ausbeute: 2JS g (89%), F: 56-57°G

[«]J^>=-38,6° fc=l.in Dimethylformamid), En„
(1 N Essigsäure). R( = O28(B);0,15(D);0,70(E).

cla-Benzyloxycarbonyl-i-itert.-butoxycarbonyl-. üj-nitroarginyl)lysin-p-nitrophenylester(C 5 — 6)

Einer Lösung von 12,8 g (34.3 mMol) tert.-Butoxycarbonyl-(i>-nitro-arginin und 3,8 ml (34,3 mMol) N-Methylmorpholin in 100 ml Dimethylformamid wurden bei - 15⁰C 4,63 ml (34,3 mMol) Chlorkohlensäure-isobutylester.danach IO,Og(22,8 mMol)*-Benzyloxycarbonyllysin-p-nitrophenylesterhydrochlorid in Pulverform beigegeben. Es wurde 30 Minuten bei — 10°C gemischt und dann im Laufe von zwei Stunden tropfenweise eine Lösung von 2,55 ml (22,8 mMol) N-Methylmorpholin in

π 50 ml Dimethylformamid zugesetzt. Man mischte nochmals 30 Minuten bei -2O⁰C und gab dann 1,33 ml (12,1 mMol)/?-Dimethylaminoäthylamin zu. Nach weiterem halbstündigem Umrühren wurde die Lösungsflüs-

ri»Ln>» Ainnnflnmnft ttnrl I D" Lf C t <? ns4 in .j-.-

Mischung von 100 ml Äthylacetat und 100 ml Wasser gelöst. Die Äthylacetatschicht wurde mit 10% Lösungen von Kaliumhydrogencarbonat und Kaliumhydrogensulfat (zweimal) sowie mit Wasser gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet, gefiltert und eingedampft.

Das Ergebnis war eine gelbliche amorphe Substanz. Ausbeute: 13,5 g (86.5%). R,-O.SO (A), 0,90 (D). [«]*= -20.4" (c- 1, in Dimethylformamid).

d)«-Benzylo:(ycarbonyl-e-(tert.-butyloxycarbonyl-öj-nitroarginyl)lysylprolin (D 5 — 7)

10,0 g (14,2 mMol) C 5-6 wurden in 100 ml Dimethylformamid gelöst, 2,46 g (21,4 mMol) feingeriebenes Prolin und 1.66 ml (1,49 mMol) N-Methylmorpholin zugegeben und in einem Magnetrührer 20 Stunden umgerührt. Danach wurde die Lösungs?!r:;f!gkeit eingedampft, der Rückstand in einer Mischung von 100 ml Äthylacetat und 100 ml 10% Kaliumhydrogensulfatlösung gelöst, die Wasserschicht abgeschieden, die Äthylacetatsohicht mit 10% Kaliumhydrogensulfatlö-

*o sung und anschließend mit 10% Kaliumhydrogencarbonatlösung extrahiert. Die Wasser- und Hydrogencarbonatschicht wurde abgeschieden, mit überschüssiger 10% Kaliumhydrogensulfatlösung auf pH 2 eingestellt und mit Äthylacetat (2x100 ml) extrahiert. Der Extrakt wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet, gefiltert und eingedampft. Das Ergebnis war eine farblose amorphe Substanz. Ausbeute: 7,9 g (82%). [&]% = -23,1° (c= 1, in Dimethylformamid) R, = 0,54 (A); 0,81 (D).

e)A-Benzyloxycarbonyl-£-(o)-nitroarginyl)-lysylprolintrifluoracetat(E5—7)

5,0 g (7,37 mMol) D 5-7 wurden bei 0°C in einer Mischung von Trifluoressigsäure und Methylenchlorid (1:1) gelöst 20 Minuten bei Zimmertemperatur stehengelassen und anschließend bei Zimmertemperatur zur Trockne eingedampft Der Rückstand wurde mit trockenem Äther verrieben, die hierbei entstandene feste Substanz gefiltert und auf dem Filter mit trockenem Äther gewaschen. Das Ergebnis waren 5,0 g (98%) einer farblosen amorphen Substanz. Εηκ=0,49 (5N Essigsäure), [off - -11,1° (c= 1, in Dimethylformamid). Rr=0,57 (C); 0,70 (E).

f) tert-Butoxycarbonyl-phenylalanil-glycin (C 1 —2)

6.4 g (16.6 mMol) tert-Butoxycarbonyl-phenylalaninp-nitrophenylester, 1,13 g (15 mMol) Glycin und 1,67 ml (15 mMol) N-Methylmorpholin wurden in einer Mischung von 200 ml Dimethylformamid und 20 ml Wasser

gelöst, die Lösung 20 Stunden bei Zimmertemperatur gelagert, eingedampft und das im Rückstand gebliebene Öl in einer Mischung von 80 ml 10% wäßriger Kaliumhydropencarbonatlösung und 50 ml Äthylacetat gelöst. Die Äthylacetatschicht wurde abgeschieden, die Wasserschicht mit Äther (50 ml) extrahiert und mit überschüssiger 10% wäßriger Kaliumhydrogensulfatlösuno auf pH 2 eingestellt. Die gewonnene Lösung wurde mit Äthylacetat (2 χ 50 ml) extrahiert, der Auszug mit 50 ml Wasser gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet, gefiltert und zur Trockne eingedampft. Das Ergebnis war eine farblose kristalline Substanz. Ausbeute: 4,0 g (82,7%). Für analytische Zwecke wurde aus Äthylacetat kristallisiert. F: 165°C, [«]" = -9.0° (c= I, in Dimethylformamid). R( = 0,85 (A); 0,90 (B); 0.88 (C).

gJtert.-Butoxycarbonyl-phenylalanylglvcylprolylphenylalanin-p-nitrobenzylester(D 1 —4)

2,80 g (8,7 οι Viol) Cl -2 wurden in 50 ml trockenem Dimethylformamid gelöst, 1,84 g (10 mMoi) Kentrafiuorphenol zugegeben, auf -20° abgekühlt. 1.90 g (9,2 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt, bis zur Auflösung des fetzteren geschüttelt und 30 Minuten bei 0⁼ Stehengelasien. Anschließend gab man 4,15 g (8,7 mMol) Prolylphenylalanin-p-nitrobenzylesterhydrobromid (C 3-4) (A. P. Pavar, G. I. Chipens, Zh. obshch. khim., 41, 459 [1971]) und 0,97 ml (8,7 mMol) N-Methylrnorpholin zu iviii dem Fortschreiten der Reaktion wurd; bei Zimmertemperatur unter pH-Kontrolle (durch Auftropfen der Lösungsflüssigkeit auf feuchtes Indikatorpapier) zur Aufrechterhaltung von pH 8 tropfenw;ise N-Methylmorpholin zugesetzt. Drei Stunden nach Z ugabe der Aminokomponente wurde die Mischung eingedampft, dem Rückstand 100 ml Methylenchlorid zugegeben und gefiltert. Das Filtrat wurde der Reihe nach mit 10% Kaliumhydrogencarbonat- und Kaliumhydrogensulfatlösungen und mit Wasser gewaschen, über entwässertem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eir gedampft. Das Ergebnis war eine ölige Substanz, die durch Verreiben mit trockenem Äther kristallisiert wurde. Ausbeute: 5,4 g(88,4%), F: 125-155. [«]?=■-45,6° (c=1, in Dimethylformamid). Rr = 0,88 (A);0,91(B);0,91(D).

hJtert.-Butoxycarbonylphenylalanylglycylprolylphenylalaninhydrazid (E 1 —4)

3,0 g (4,26 mMol) Dl—4 und 1,0 ml Hydrazinhydrat wurden eine Stunde bei 70° in 30 ml Äthanol gewärmt, anschließend filtriert, das Filtrat mit 50 ml Wasser versetzt und 20 Stunden bei —10° gelagert, abgefiltert und die Kristalle auf dem Filter mit 30 ml 50% wässerigen Äthanols, danach mit Wasser gewaschen, bis das Filtrat neutral reagierte. Getrocknet wurde im Exsikkator mit P₂O₅. Ausbeute: 23 g (92,8%). F: 140-160°. [«];?= -59,8° (c= 1, in Dimethylformamid). Rf = 0,93 (A); 0^2 (B); 0,9 1 (D).

Oa-Benzyloxycarbonyl-e-itert-butoxycarbonyl-

phenylalanylglycylprolylphenylalanyl-

a-nitroarginyl)iysylprolin (F 1 —7)

2,1 g (3,62 itiivioi, " ^: —4 wurden in 50 ml Dimethylformamid gelöst, auf —30° abgekühlt und unter Umrühren eine abgekühlte (—70°) Mischung von 33 ml (15,7 mMol) 43 η-Lösung trockenen Chlorwasserstoffs in Tetrahydrofuran und 20 ml Äthylacetat zugegeben. Dann wurde bei —30° tropfenweise eine abgekühlte Lösung von 0,45 ml (3,87 mMol) tert-Butylnitrit in 10 ml Äthylacetat zugesetzt, 30 Minuten bei -25° stehengelassen, 1,76 ml (15,8 mMol) N-Methylmorpholin und anschließend eine Lösung von 2,68 g (3,87 mMol) E 5 — 7 und 0,44 ml N-Methylmorpholin in 50 ml Dimethylformamid zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3 Tage bei -10° gelagert, eingedampft, der Rückstand in einem Gemisch von 100 ml Methylenchlorid und 100 ml Wasser gelöst. Die Methylenchloridschicht wurde abgetrennt, der Reihe nach mit 10% Kaliumhydrogencarbonat- und Kaliumhydrogensulfatlösungen und mit Wasser (je 100 ml) gewaschen, mit trockenem Magnesiumsulfat entwässert, gefiltert und eingedampft. Das Ergebnis war ein Öl, das beim Verreiben mit einer Mischung von Äther und Älhylacetat (1 : 1) auskristallisierte. Ausbeute: 3,50 g (85.8%), F: 140-177°. [λ]?= -44,1° (C=I, Dimethylformamid). R, = 0,53 (A); 0,84 (B); 0,87 (D).

j)«- Benzyloxycarbonyl-£-(tert.-butoxy-

carbonylphenylalanylglycylprolylphenylalanyl-

<n-nitrr>a rginylMysylnrnlylnrol viel vein-tert-

butylester(G 1—9)

2,70 g (2,40 mMol) F 1-7 wurden in 40 mi Dimethylformamid gelöst, auf 0° abgekühlt und 2,19 g (2,89 mMol) der Komplexverbindiing Dicyclohexylcarbodiimid mit Pentafluorphenol (»Komplex F«) (J. Kovacs, L. Kisfaludy, M. Q. Ceprinir, J. Am. Chem. Soc. 89,183[1967])und 1,1 g(4,8 mMol) Prolylglycin-tert.-butylester (F 8 —9) zugegeben. Danach wurde 20 Stunden bei Zimmertemperatur gelagert, eingedampft, der Rückstand in 50 ml Methylenchlorid aufgelöst, gefiltert, das Filtrat mit 50 ml 10% Kaliumhydrogensulfatlösung und 50 ml Wasser gewaschen, mit trockenem Magnesiumsulfat entwässert, gefiltert und eingedampft. Der Rückstand wurde zweimal in einer minimalen Menge Methylenchlorid gelöst und mit Äther ausgefällt. Ausbeute: 2,8 g (87,2%), F: 150-193°, [«]£=-öO,3° (c= 1, in Dimethylformamid). R_f = 0,57 (A); 0,68 (B); 0,60 (D). '

k)«-Benzyloxycarbonyl-e-(phenylalanylglycyI-

prolylphenylalanyl-£i>-nitroarginyl)lysylprolylprolylglycinhydrogenchlorid (H 1—9)

1,8 g (1,346 mMol)G 1 —9 wurden bei 0° in 50 ml einer Mischung von Trifluoressigsäure mit Methylenchlorid (1 :1) gelöst, 20 Minuten bei Zimmertemperatur stehengelassen und bei 0° eingedampft. Der Rückstand wurde durch Verreiben mit 20 ml trockenen Äthers kristallisiert, in 10 ml trockenen Dimethylformamids gelöst, 033 ml (13 mMol) einer 43 n-Lösung wasserfreien Hydrogenchlorids in Tetrahydrofuran zugegeben und mit 100 ml trockenen Äthers ausgefällt. Ausbeute: 1,55 g (95%), F: 140-192°, [α]?= -77,8°, Rf = 0,73 (C); 0,74 (E).

IJCycIo-J/x-benzyloxycarbonyl-E-iphenylalanyl-

glycylprolyl-phenylalanyl-w-nitroarginyl)-

Iysylprolylprolylglycyl](11—9)

1,1 g (031 mMol) Hl—9 wurde in 2 1 Dimethylformamid gelöst (dieses war unmittelbar vor der Benutzung mit Bariumoxid entwässert und mit Ninhydrin destilliert worden). In einer Atmosphäre wasserfreien Argons wurde unter Umrühren bei 0° 13 g die Komplexverbindung Dicyclohexylcarbodiimid mit Pentafluorphenol (1:3) (»Komplex F«) (J. Kovacs, L Kisfaludy, M. Q.

Ceprini, J. Am. Chem. Soo, 89, 183 [1967]) zugegeben. Danach setzte man unter Umrühren in Argonatmosphäre bei Zimmertemperatur im Laufe von 6 Stunden eine Lösung von 0,19 ml (138 mMol) Triethylamin in 300 ml

Dimethylformamid zu. Die so erhaltene Mischung wurde 2 Tage lang bei Zimmertemperatur stehengelassen und bei 28" eingedampft. Der ölige Rückstand wurde durch Verreiben mit trockenem Äther kristallisiert, gefiltert, der Filterrückstand mit Äther und ■> anschließend mit Wasser gewaschen. Das gewonnene Produkt untersuche man mittels Dünnschichtchromatographie im System B. Es wurde angenommen, daß die Substanz mit Rf = 0,6 das benötigte Cyclopeptid ist (eines der Hauptprodukte der Cyclisierung, chromatographisch beweglich, in UV-Licht und durch Bearbeitung mit einem Benzidinreagens erkennbar). Das Cyclisierungsgemisch wurde vorher in einer kleinen Säule (2x100 cm) mit Silikagel gereinigt (mittlere Teilchengröße 20 μηι, erhalten durch Fraktionierung r> von Silikagel 5/40 μίτ. der Firma »Chemapol«, CSSR). Als Elutionsmittel diente das System Chloroform-Äthanol-n-Butanol-Äthvlacetat (10:6:4:3); hierbei wurde Dicyclohexylharnstoff und eine Reihe von Peptidstoffen abgeschieden. Die Fraktionen, die das mutmaßliche Cyclopeptid enthielten, reinigte man nochmals in einer Säule mit Silikagel (3 χ 250 cm, mittlere Teilchengröße 20 μΓη) mit dem System B als Elutionsmittel, indem man Fraktionen je 20 ml auffing und die Sorption bei 280 nm (»Uvicord II«) registrierte. Die Fraktionen 55 bis 66 2 > wurden eingedampft und der Rückstand mit Äther bearbeitet. Das Ergebnis waren 102 mg (9,7%) einer kristallinen Substanz, F: 163—165°, chromatographisch rein (mittels Dünnschichtchromatographie auf »Merck«-Platten in 6 Systemen geprüft). Rf = 0,47 (B). Mol.-Gew. 1024(kryoskopisch mittels Harnstoffschmelze bestimmt) (A. J. Berlin, Die Technik der Laborarbeiten in der organischen Chemie, Moskau, Goschimizdat, 1963, S. 348, in Russisch) laut Formel berechnet 1163, 313. [«]£ = -64,1 fc=0,5 in Dimethylformamid), Rf = 0,37 (A); 0,43(B); 0,89 (C); 0,37 (D); 0,96 (E).

m) C). >-[(e-phenylalanylglyclyprolylphenyl-

alanylarginyl)-lysylprolylprolylglycyl]diacetat

(Cyclo-KN'-l-L-lysin^-glycinJ-bradykininJO I -9)

50 mg (0,043 mMol) I 1 — P wurden in 5 ml Essigsäure gelöst und 20 Stunden in Gegenwart von Palladiumschwarz hydriert. Dann filterte man den Katalysator ab und lyophilierte das Filtrat. Der Rückstand wurde aus 10

40 ml Wa=Sf, !yophil^:;iert, nochmals in 10 ml Wasser gelöst, durch einen »Synpor«-Membranfilter filtriert und erneut lyophilhiert. Das Ergebnis war ein weißes lockeres Pulver. chromatographisch homogen. [λ]?= -76° Cc= 0,65, in H₂O), Ausbeute: 45,7 mg (96%), En,, = 0,65(I N Essigsäure). R: = 0,69(E).

Aminosäurenanalyse:

Prolin 2.83, Glycin 1,90, Phenylalanin 1,93, Lysin 1,00, Arginin 1,23. Bei Trypsinspaltung (T. De venal, |. Gergey, Aminosäuren, Peptide und Eiweißstoffe. Moskau, Mir, 1976,S. Ib8 in Russisch)des Präparats wird nur eine Substanz (Ehu = 0,82 I N Essigsäure) gebildet, was ein Beweis für den cyclischen Aufbau des Pcptids ist.

Biologische Prüflingsergebnisse

Die blutdrucksenkende Wirkung des Cyclo-[(N'-I-L-lysin,6-glycin)-bradykinins] wurde an narkotisierten Ratten geprüft. Wie die Prüfung zeigte, besitzt das cyclische Bradykininanalogon (CBA) zum Unterschied vom natürlichen Bradykinin (BK) eine ausgeprägt prolongierte Wirkung. Die Schwellendosis des CBA beträgt 5 iig/kg diejenige des BK 0,5 ng/kg. Bei einer Konzentration von 50 μg/kg gleicht die blutdrucksenkende Wirkung des CBA derjenigen des BK, ist jedoch weitgehend prolongiert. Eine durch CBA bewirkte Senkung des Quecksilberdrucks um 30 bis 40 mm hält 1 bis 2 Stunden &n; 2 bis 3 Stunden nach der Verabreichung steigt der Druck wieder auf 40 bis 50% des ursprünglichen Standes.

Bei in-vitro-Versuchen (J. M. van Rossum, Arch. int. Pharmacodyn., 143, 299 [1963]) der isolierten Gebärmutter und dem Krummdarm von Ratten wurde festgestellt, daß das CBA in einer Konzentration von 10-'° bis IO-⁵ Mol/l keine rmotrope Wirkung hat, wie sie für das natürliche Bradykinin kennzeichnend ist. Die myotrope Wirkung des BK wird vom CBA bei den angegebenen Konzentrationen nicht beeinflußt.

Die Gefäßdurchlässigkeit (N. Isokane, The Ochanomizu Med. J., 13, 362 [1963]) wird durch CBA in geringerem Maße vergrößert als durch Bradykinin; die Reaktionen sind bei Konzentrationen von jeweils 1 mg/kg und 25 μg/kg vergleichbar.

Claims

Patentanspruch:

Cyclo-l(N^r-l-L-lysin, 6-glycin) bradykinin] der Formel

HjN—CIä—CO—Pro—Pro—Gly—Phe—GIy—Pro—PiIe-NH-CH-(CH₂)J-NH-C=NH H₂C CH₂ CH₂ CH₂ NHCO NH₂

Die Erfindung betrifft ein neues synthetisches ι ο Analogon eines bekannten Naturstoffes — des Gewebehormons iBradykinin — und seine biologische Wirkung.

Bradykinin und andere Peptide, die die Aminosäurenreihe des Bradykinins enthalten, z. B. Kallidin, Methio- is nyllysylbradykinin, die Kinine von Insekt- und anderen tierischen Giften sind in der Natur überaus verbreitet und erfüllen wichtige Funktionen bei der Regelung biochemischer und physiologischer Vorgänge im tierischen und rneiischüchcn Organismus. Mit Störungen der M Bildung und des Abbaus des Bradykinins und der ihm verwandten Peptide sind verschiedene Erkrankungen und pathologische Zustände des menschlichen Organismus verbunden. Darum besteht ein dringendes Bedürfnis nach Analoga und Antimetaboliten des Bradykinins, die geeignet si nd, die genannten Vorgänge in gewünschter Weise zu beeinflussen (A. A. Dzizinsky, O. A. Gomazkov, Kinine in der Physiologie und Pathologie des Herz- und Gefäßsystems, Novosibirsk, 1976, in Russisch).

Das in der Natur vorkommende Bradykinin selbst ist für diese Zwecke nicht geeignet. Seine Hauptmängel sind eine kurze Wirkungsdauer (die Halbwertszeit des Bradykinins im menschlichen Blut beträgt nur 30 Sekunden) (K. A. Saameli, T. K. Eskes, Am. J. Physiol. 203, 261 [1962]) und die Vielfalt der von ihm hervorgerufenen biologischen Effekte, d. h. der Mangel an Selektivität. Das Hormon wirkt auf die glatte Muskulatur und das Blutkreislaufsystem, beeinflußt die Permeabilität der Kapillargefäße und run zahlreiche andere Wirkungen hervor. Deshalb kann eine therapeutische Anwendung des Bradykinins unvertretbare Nebenwirkungen haben. Dasselbe gilt auch von den bisher bekannten synthetischen Analoga des Bradykinins, deren es mehr als 170 gibt (Handbook of Experimental Pharmacology, vo!. XXV, Bradykinin, Kallidin and Kallikrein, Ed. E. G. Erdos, Springer-Verlag, Berlin 170,1-768).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues Bradykinin-Analogon zu entwickeln, das bei seiner Anwendung in Arzneimitteln ausgeprägte Selektivität und protahierte Wirkungsdauer aufweist.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein Cyclo-[(N'-I-L-Iysin,6-glycin)bradykinin] der Formel

HjN — CH —CO—Pro—Pro—Gly—Phe—GIy-PTO-PhC-NH-CH-(CH₂)J-NH-C=NH

H₂C

-CH₂-

-CH,

-CH₂-

NHCO

NH₂

In dieser Verbindung, verkürzt als CBA bezeichnet, ist das N-endst;lndige Arginin des Bradykinins durch L-Lysin ersetzt. Serin in Stellung 6 des Bradykinins durch Glycin ersetzt, der Cyclus durch eine chemische Peptidbindung, von der Carbonylgruppe des Arginins und der ε-Aminogruppe des Lysins gebildet, zusammengeschlossen. In der Formel bedeuten »Pro« den L-Prolin-, »Gly« den L-Glycin-, »Phe« den L-Phenylalaninrest.

Diese Verbindung besitzt eine bemerkenswerte Selektivität und eine stark prolongierte Halbwertszeit und somit F.igenschaften, die im Hinblick auf die therapeutische Anwendung sehr wertvoll sind.

Die blutdrucksenkende Aktivität des CBA (in einer Dosis von 50 μg/kg) gleicht im Versuch an Ratten ungefähr derjenigen des Bradykinins. Während jedoch die biologische Wirkung des Bradykinins nicht mehr als 1,5 Minuten nach der Applikation dauert, führt eine einmalige Verabreichung des CBA zu einer stabilen Blutdrucksenkung, die drei Stunden lang anhält. Zudem ist diese Verbindung nicht mit der für die Kinine charakteristischen myotropen Aktivität (Kontraktion des Krummdiirms beim Versuch an Ratten) behaftet und vergrößert die Gefäßdurchlässigkeit in geringerem Maße als Bradykinin, d. h. die Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindung ist ausgesprochen selektiv.

Eleschreibung der Synthese des Cyclo-[(N'-1 -L-lysin,6-glycin)-bradykinins]

Die erfindiingsgemäße Verbindung kann durch ein

Mehrstufenverfahren hergestellt werden, das man folgenderweise verwirklicht:

a) Man versetzt Benzyloxycarbonylprolin mit Glycintert.-butylester und erhält Benzyloxycarbonylprolylglycin-tert.-butylester;

b) man hydriert das Produkt der Stufe »a« und erhält Prolylglycin-terL-butylester;

c) man versetzt tert.-Butoxycarbonylnitroarginin mit «-Benzyloxycarbonyllysin-p-nitrophenylester und erhält a-Benzyloxycarbonyl, e-tert.-butoxycarbo nylnitroarginyllysin-p-nitrophenylester;

d) man versetzt das Produkt der Stufe »c« mit Prolin und erhält «-Benzyloxycarbonyte-itert.-butoxycarbonylnitroarginylj-lysylprolin;

e) man bearbeitet das Produkt der Stufe »d« mit « Trifluoressigsäure und erhält «Benzyloxycarbo-e- (nitroarginyl)lysylprolintrifluoracetat;

f) man versetzt tert.-Butoxycarbonylphenylalanin-pnitrophenylester mit Glycin und erhält tert.-Butoxycarbonylphenylalanylglycin;

1·) man versetzt das Produkt der Stufe »f« mit Prolylphenylalanin-p-nitrobenzylester und erhält tert.-Butoxycarbonylphenyid'iaiiylglycylprolylphenylalanin-p-nitrobenzylester;

h) man bearbeitet das Produkt der Stufe »g« mit Hydrazinhydrat und erhält tert.-Butoxycarbonyl-

phenylalanylglycylprolylphenylalaninhydrazid; I man versetzt die Produkte der Stufen »e« und »h« miteinander und erhält «-BenzyloxycarbonyU-