DE2939522C2 - Cyclo-(N↑ε↑-kallidin), N↑α↑-Arginyl-cyclo-[(N↑ε↑-1-lysin, 6-glycin) bradykinin] und Cyclo-[(ω-aminododecanoyl) bradykinin] und deren Verwendung - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue cyklische Analoga von Kallidin.

Die vorgeschlagenen neuen Verbindungen besitzen biologische Wirksamkeit und können in der Medizin als Wirkstoffe von Hypotensiva prolongierter Wirkung Verwendung finden.

Kallidin gehört zu den Pachykininen-Substanzen mit Peptidnatur, die im menschlichen und tierischen Blut gebildet werden und die Funktionen von Bioreglern im kardiovaskulären und in anderen Systemen des Organismus erfüllen. Auf die Störung des Anabolismus und des Metabolismus von Pachykininen ist eine ganze Reihe von pathologischen Zuständen und Erkrankungen des Organismus zurückzuführen, weshalb deren Anwendung als Arzneimittel von großem Interesse ist. Der Hauptnachteil der Pachykinine und ihrer Analoga ist jedoch die Kürze der Wirkung (die Halbwertzeit von Kallidin im Organismus beträgt 0,32 min) sowie das breite Spektrum der biologischen Effekte, d. h. ihre fehlende Selektivität.

In der Literatur wurde nur ein cyklisches Analogon von Kallidin-cyklo-[(7-glycin)-kallidin] beschrieben, in welchem zur Ringbildung zum Unterschied von den von uns vorgeschlagenen Verbindungen nicht die kleines Omega-, sondern die kleines Alpha-Aminogruppe von Lysin ausgenutzt wurde. Diese Verbindung wies keine biologische Wirksamkeit auf [J. Lieb. Ann. Chem. 691 (1966) 218-224].

Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Entwicklung neuer cyklischer Kallidinanaloga, die eine hypotensive Wirkung von selektivem Charakter besitzen.

Der Erfindung wurde die Aufgabe zugrundegelegt, neue cyklische Kallidinanaloga zu entwickeln, die eine hypotensive Wirkung von selektivem Charakter besitzen.

Diese Aufgabe wird durch die folgenden drei Verbindungen mit prolongierter hypotensiver Wirkung gelöst:

1. Cyclo-(N[hoch]kleines Epsilon-kallidin) der Formel: (I)

Im Molekül von Cyclo-(N[hoch]kleines Epsilon-Kallidin) (I) sind die erste und die zehnte Aminosäure kovalent verbunden. Zur Ringbildung wird als Brückenstruktur die Seitenkette der N-Endaminosäure des Kallidins - des Lysins - ausgenutzt, und die kovalente (die Amid-) Bindung wird zwischen der kleines Epsilon-Aminogruppe des N-Endlysins und der Karbonylgruppe der C-Endaminosäure gebildet. Im Ergebnis entsteht eine cyklische Struktur, die 34 Atomgruppierungen einschließt.

2. N[hoch]kleines Alpha-Arginyl-cyclo-[(N[hoch]kleines Epsilon-1-lysin,6-glycin)bradykinin] der Formel: (II)

Im Molekül von N-Arginyl-kleines Alpha-cyclo-[(N[hoch]kleines Epsilon-1-lysin,6-glycin)-bradykinin] (II) wurden Lysin und Arginin des Naturkallidins umgestellt, und der Ring wurde zwischen dem Lysin in der Stellung 2 und dem Arginin in der Stellung 10 geschlossen. Arginin in der Stellung 1 ist außerhalb des Zyklus. Die Stellung 7 des Naturkallidins wurde modifiziert - statt des Serinrestes wurde der Glycinrest eingeführt. Ebenso wie in der Verbindung (I) ist die Carbonylgruppe des C-Endarginins mit der kleines Epsilon-Aminogruppe des Lysins unter Bildung der Peptidbindung verbunden. Im Ergebnis entsteht eine cyklische Struktur, die 31 Atomgruppierungen einschließt.

3. Cyclo-[(kleines Omega-aminododecanoyl)bradykinin] der Formel: (III)

Die genannte Verbindung (III) ist ein Kallidinanalogon, in welchem die erste Aminosäure (Lysin) durch eine kleines Omega-Aminocarbonsäure, die eine verlängerte Methylengruppenkette hat, und zwar durch die kleines Omega-Aminododecansäure (11 Methylengruppen) ersetzt wurde, und die kleines Omega-Aminogruppe des Endrestes des Analogons ist mit der C-Endcarbonylgruppe des Moleküls, d. h. mit dem Argininrest verbunden, wobei ein zyklisches System gebildet wird, das 40 Atomgruppierungen einschließt. Die gegebene Verbindung kann auch als ein Kallidinanalogon, in welchem das N-Endlysin durch die kleines Omega-Aminododecansäure ersetzt wurde, oder als ein Analogon des Bradykinins betrachtet werden, in welchem am N-Ende die kleines Omega-Aminododekansäure angegliedert wurde.

Die erwähnten Verbindungen stellen Pulver von weißer Farbe dar, die in Wasser und Alkoholen leicht löslich sind.

Die pharmakologische Wirksamkeit der genannten Verbindungen wurde im Tierversuch untersucht.

Die durchgeführten Untersuchungen des Einflusses der Verbindungen (I) und (II) auf den arteriellen Blutdruck bei der intravenösen Einführung bei urethannarkotisierten Ratten haben ergeben, daß die Verbindungen (I) und (II) zum Unterschied von Bradykinin eine ausgeprägte depressorische Wirkung besitzen. Die Schwellendosis von Bradykinin beträgt 0,5 µg/kg, die der Verbindungen (I) und (II) 5 µg/kg. In einer Dosis von 50 µg/kg rufen die Verbindungen (I) und (II) einen äquidepressorischen, jedoch im Vergleich zu Bradykinin einen bedeutend prolongierteren Effekt hervor, dessen Dauer für die Verbindungen (I) und (II) die gleiche ist. Diese Senkung des arteriellen Blutdrucks um 30 bis 40 Torr unter dem Einfluß der Verbindungen (I) und (II) hält 5 bis 7 min mit darauffolgender Wiederherstellung während 2 Stunden bis 80 % vom Ausgangsniveau des arteriellen Blutdrucks an. Die Dauer der Bradykininwirkung beträgt 30 sec. Die Erhöhung der Dosis der Verbindungen (I) und (II) auf 250 µg/kg führt zu einer scharfen Senkung des arteriellen Blutdrucks und zum Tod der Tiere.

In den in-vitro-Versuchen am isolierten Rattenuterus wurde festgestellt, daß bei der Verbindung (II) im Konzentrationenbereich von 10[hoch]-10 bis 10[hoch]-6 Mol/l die myotrope Wirkung, die dem Naturbradykinin eigen ist, ausbleibt. Zum Umterschied von der Verbindung (II) besitzt die Verbindung (I) eine myotrope Wirksamkeit, die 100 % von der Bradykininaktivität erreicht, sich aber in einer Konzentration äußert, die um 2 Größenordnungen höher liegt, als bei Bradykinin.

Die Prüfung des Einflusses der Verbindung (III) auf den arteriellen Blutdruck bei deren intravenöser Einführung bei urethannarkotisierten Ratten zeigte, daß die Verbindung (III) zum Unterschied von Bradykinin eine prolongierte depressorische Wirkung besitzt. Die Schwellendosis von Bradykinin beträgt 0,5 µg/kg, die der Verbindung (III) - 50 µg/kg. Im Dosisbereich der Verbindung (III) von 50 µg/kg bis 250 µg/kg wird die Abhängigkeit des Effekts von der Dosis beobachtet. Die äquidepressorischen Effekte (30 bis 40 Torr) entwickeln sich für Bradykinin und die Verbindung (III) bei Dosen von 50 µg/kg bzw. 250 µg/kg und halten für Bradykinin 30 sec und für die Verbindung (III) 35 min bis zur Wiederherstellung des arteriellen Blutdrucks bis 100 % des Ausgangsniveaus an. In ähnlichen Versuchen an Hunden ruft die Verbindung (I) in Dosen von 5 und 100 µg/kg einen hypotensiven Effekt um 20 bis 25 Torr hervor, das Ausgangsniveau des arteriellen Blutdrucks wird in 10 min erreicht.

In den Versuchen in vitro am isolierten Rattenuterus wurde festgestellt, daß die Verbindung (III) eine myotrope Wirksamkeit besitzt, die 81 +/- 7 % von der Bradykininaktivität beträgt, die mit 100 % angesetzt wird, jedoch äußert sich diese bei Konzentrationen, die um 3 Größenordnungen höher liegen, als bei Bradykinin. Anhand der durchgeführten Prüfungen wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen cyklischen Kallidinanaloga eine prolongierte hypotensive Wirkung vom selektiven Charakter besitzen.

Die Synthese der genannten cyklischen Analoga von Kallidin wurde nach klassischen Verfahren der Peptidchemie verwirklicht.

Die tert.-Butoxycarbonyl- oder Benzyloxycarbonylderivate der Aminosäuren oder Peptide, die durch die Herstellung der Pentafluorphenylester, p-Nitrophenylester oder Azide oder der gemischten Anhydride aktiviert wurden, werden durch Aminosäure- oder

Peptidderivate mit freier Aminogruppe mit darauffolgender Abspaltung der Schutzgruppen umgesetzt.

Dabei wird die Guanidinfunktion des Arginins durch die Nitrogruppe oder Benzyloxycarbonylgruppe blockiert, die Hydroxylfunktion des Serins wird durch Benzyläther blockiert. Nachher wird das erhaltene Peptid über die Stufe der Bildung seines Pentafluorphenylesters oder N-Hydroxysuccinimidesters mit darauffolgender katalytischer Hydrierung und Isolierung des Endproduktes cyklisiert.

Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung werden konkrete Varianten der Herstellung der genannten cyklischen Kallidinanaloga angeführt. Die Individualität der erhaltenen Verbindungen wurde nach der Methode der Dünnschichtchromatographie auf den Platten "Silufol" oder "Merck" geprüft. Es werden die chromatographischen Koeffizienten R[tief]f auf den Platten "Silufol" UV-254 in folgenden Systemen: A - Chloroform-Äthanol-Äthylacetat-Essigsäure-Wasser (85 : 5 : 8 : 2 : 0,25); B - Chloroform-Äthanol-n-Butanol-Äthylacetat-Wasser (10 : 6 : 4 : 3 : 1); C - Chloroform-Methanol-Wasser (40 : 30 : 5); D - Butanol-Essigsäure-Wasser (4 : 1 : 1); E - Äthylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser (5 : 5 : 1 : 3) sowie die elektrophoretische Beweglichkeit in bezug auf Histidin am Papier FN-16 in 1n- oder 5n-Essigsäure angeführt. Die Flecke der Substanzen wurden durch die Prüfung der Chromatogramme im Ultraviolettlicht sowie durch Anfärben mit Ninhydrin oder mit Hilfe von Benzidinchlorreagens nachgewiesen. Für alle Verbindungen stimmen die Daten der Elementaranalyse befriedigend mit dem berechneten Gehalt an C,H,N überein. Zur Identifizierung der Verbindungen wurden in weitem Umfange die Spektren der PMR (Proton-Magnet-Resonanz) ausgenutzt. Die chemischen Verschiebungen, die Form und die Intensität der Signale entsprachen der Struktur der Peptide. Die Struktur der Substanzen wurde auch durch die Aminosäurenanalyse bestätigt, die nach der Peptidanalyse in der zugeschmolzenen Ampulle bei 110°C während 20 Stunden ausgeführt wurde.

Wenn keine anderen Hinweise vorhanden sind, wird die chromatographische Reinigung der Substanzen auf dem modifizierten Gerät "Jobin-Yvon Chromatospac Prep. 100" unter Ausnutzung des Silicagels H 60 der Firma "Merck" durchgeführt.

Beispiel 1

Man löst 7,17 g (15 mMol) Propylphenylalanin-p-nitrobenzylesterhydrobromid und 6,61 g (16,5 mMol) tert.-Butoxycarbonyl-o-benzylserin-pentafluorphenylester in 50 ml Dimethylformamid, setzt N-Methylmorpholin bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 8 zu (Probe durch Auftragen eines Tropfens auf ein feuchtes Indikatorpapier). Man läßt das Gemisch bei Zimmertemperatur stehen, dampft ein, löst den Rückstand in 50 ml Äthylacetat, wäscht mit 50 ml 10%iger Kaliumhydrogensulfatlösung, dann mit 50 ml Wasser durch, trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat, filtriert und dampft bis 15 ml ein, setzt 100 ml Hexan hinzu, läßt bei einer Temperatur von 0°C stehen. Es fällt ein Öl aus, das bei 50°C und unter 1 Torr getrocknet wird. Die Ausbeute an tert.-Butoxycarbonyl-o-benzylserin-propylphenylalanin-p-nitrobenzylester (Verbindung 1) beträgt 10,0 g (99%). R[tief]f = 0,55 (Äthylacetat); 0,90 (A).

9,5 g der Verbindung 1 (14 mMol) löst man in 50 ml Trifluoressigsäure, läßt für 20 min bei Zimmertemperatur stehen, dampft bei einer Temperatur von 20°C ein, zerreibt den Rückstand mit 100 ml wasserfreiem Äther. Man filtriert den gebildeten Niederschlag ab, wäscht mit Äther durch und läßt über Kaliumhydroxyd bei 1 Torr stehen. Die Ausbeute an o-Benzylserylpropylphenylalanin-p-nitrobenzylester-trifluoracetat (Verbindung 2) beträgt 8,04 g (94%). [kleines Alpha][hoch]20[tief]D = -25,3° (c = 1, Dimethylformamid). E[tief]His = 0,60 (5n-Essigsäure), R[tief]f = 0,06 (A); 0,46 (B); 0,76 (C); 0,58 (D).

Man löst 6,89 g (10 mMol) der Verbindung 2 und 4,74 g (11 mMol) tert.-Butoxycarbonylphenylalanin-pentafluorphenylester in 50 ml Dimethylformamid, setzt N-Methylmorpholin bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 8 zu und läßt für 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen. Man dampft das Gemisch ein, fügt zum Rückstand 50 ml 10%ige wäßrige Kaliumhydrogensulfatlösung und 20 ml Äther zu. Man filtriert den gebildeten Niederschlag ab, wäscht mit Wasser, nachher mit Äther durch, trocknet über dem Phosphorpentoxid bei 1 Torr. Die Ausbeute an tert.-Butoxycarbonylphenylalanyl-o-benzylserylprolylphenylalanin-p-nitrobenzylester (Verbindung 3) beträgt 7,19 g (87,5%).

[kleines Alpha][hoch]20[tief]D = -32,5° (c = 1, Dimethylformamid). R[tief]f = 0,42 (A), 0,92 (B), 0,93 (C), 0,86 (D), 0,80 (E).

4,11 g der Verbindung 3 (5,0 mMol) und 5 ml Hydrazinhydrat in 100 ml Methanol werden 3 Stunden bei Zimmertemperatur durchgemischt, dann für 20 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Man dampft bis 20 ml ein, gibt 100 ml Wasser und 50 ml Äther hinzu, filtriert, wäscht den Niederschlag auf dem Filter mit Wasser, dann mit Äther durch. Die Ausbeute am tert.-Butoxycarbonylphenylalanyl-o-benzylserylprolylphenylalanin-hydrazid (Verbindung 4) beträgt 3,33 g (95%). [kleines Alpha][hoch]20[tief]D = -51,2° (c = 1, Dimethylformamid). R[tief]f = 0,30 (A), 0,81 (B), 0,90 (C), 0,73 (D).

Zu einer Lösung von 12,8 g (34,3 mMol) tert.-butoxycarbonylnitroarginin und 3,80 ml (34,3 mMol) N-Methylmorpholin in 100 ml Dimethylformamid werden bei einer Temperatur von -15°C 4,63 ml (34,3 mMol) Chloressigsäureisobutylester hinzugegeben, nachher werden 10,0 g (22,8 mMol) Chlorwasserstoffsalz des kleines Alpha-Benzyloxycarbonyllysin-p-nitrophenylesters in Form von Pulver zugesetzt. Man mischt 30 min bei einer Temperatur von -10°C durch, gibt dann während 2 Stunden tropfenweise die Lösung von 2,55 ml (22,8 mMol) N-Methylmorpholin in 50 ml Dimethylformamid zu. Man mischt noch 30 min bei einer Temperatur von -20°C durch, gibt dann 1,33 ml (12,1 mMol) kleines Beta-Dimethylaminoäthylamin zu. Wiederum mischt man 30 min durch, dampft ein, löst den Rückstand in einem Gemisch aus 100 ml Äthylacetat und 100 ml Wasser. Man wäscht die Äthylacetatschicht mit 10%iger Kaliumhydrogenkarbonat- und Kaliumhydrogensulfatlösung (zweimalig) und mit Wasser durch, trocknet über Magnesiumsulfat, filtriert. Man dampft das Filtrat ein. Die Ausbeute an kleines Alpha-Benzyloxycarbonyl-kleines Epsilon-(tert.-butoxycarbonyl-nitroarginyl)-lysin-p-nitrophenylester (Verbindung 5) beträgt 13,5 g (86,5%). [kleines Alpha][hoch]20[tief]D = -20,9° (c = 1, Dimethylformamid) R[tief]f = 0,80 (A), 0,90 (D).

20 g (53,6 mMol) tert.-Butoxycarbonylnitroarginin und 3/4 Molekül Tetrahydrofuran werden in 300 ml wasserfreiem Äthylacetat suspendiert, es werden unter Abkühlen (0°C) 10,3 g (56 mMol) Pentafluorphenol und 11,6 g (56 mMol) Dicyklohexylcarbodiimid zugegeben. Man mischt 10 Stunden bei 0°C, filtriert, schüttelt das Filtrat bei 0°C mit 10%iger Kaliumhydrogencarbonatlösung und Wasser (je 100 ml) auf, trocknet dann mit wasserfreiem Magnesiumsulfat, filtriert und dampft ein. Das erhaltene Öl, das tert.-Butoxycarbonylnitroargininpentafluorphenylester enthält, löst man in 300 ml

Dimethylformamid, gibt 9,25 g (80 mMol) Prolin, N-Methylmorpholin bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 8 und tropfenweise Wasser bis zum Auflösen von Prolin hinzu. Man läßt das Gemisch 2 Stunden bei Zimmertemperatur stehen, dampft ein, löst den Rückstand in 100 ml Chloroform, wäscht die erhaltene Lösung mit 50 ml 10%iger Kaliumhydrogensulfatlösung, 50 ml Wasser und dann mit 100 ml gesättigter Kaliumhydrogencarbonatlösung durch. Den Hydrogencarbonatextrakt wäscht man mit 50 ml Äther und säuert mit Kaliumhydrogensulfat bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 2 an. Man extrahiert das erhaltene Gemisch mit 100 ml Chloroform, wäscht den Extrakt mit 50 ml Wasser, trocknet mit wasserfreiem Magnesiumsulfat, filtriert, dampft ein, kristallisiert das erhaltene Öl durch das Zerreiben mit dem Äthylacetat-Hexan-Gemisch (1 : 1). Die Ausbeute an tert.-Butoxycarbonylnitroarginylprolin (Verbindung 6) beträgt 10,3 g (46,1%). [kleines Alpha][hoch]20[tief]D = -28,0° (c = 1, Dimethylformamid). R[tief]f = 0,14 (A), 0,50 (B), 0,78 (C), 0,67 (D), 0,84 (E).

Aus der Verbindung 6 wird ähnlich der Synthese der Verbindung 2 Nitroarginylprolintrifluoracetat (Verbindung 7) mit einer Ausbeute von 99 % erhalten. [kleines Alpha][hoch]20[tief]D = -24,4° (c = 1, Dimethylformamid). E[tief]His = 0,65 (1n-Essigsäure) R[tief]f = 0,08 (B), 0,20 (C), 0,22 (D), 0,40 (E). Man löst 10,0 g der Verbindung 5 und 7,78 g (18,5 mMol) der Verbindung 7 in 100 ml Dimethylformamid und gibt N-Methylmorpholin bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 8 hinzu. Man läßt das Gemisch für 20 Stunden bei Zimmertemperatur stehen, dampft ein, löst den Rückstand in 50 ml Chloroform, extrahiert dann mit 50 ml 10%iger Kaliumhydrogensulfatlösung (zweimalig) und 50 ml Wasser. Beim Eindampfen der Chloroformlösung wird der kristalline Niederschlag gebildet, der in Äther suspendiert, filtriert, am Filter mit Äther durchgewaschen wird. Die Ausbeute an kleines Alpha-Benzyloxykarbonyl, kleines Epsilon-(tert.-butoxykarbonylnitroarginyl)-lysylnitroarginylprolin (Verbindung 8) beträgt 11,7 g (96%). [kleines Alpha][hoch]20[tief]D = 23,5° (c = 1, Dimethylformamid). R[tief]f = 0,02 (A), 0,50 (B), 0,78 (C), 0,68 (D)

Aus der Verbindung 8 wird ähnlich der Synthese der Verbindung 2 (mit Ausnahme davon, daß statt der Trifluoressigsäure deren Gemisch mit Methylenchlorid in Volumenverhältnissen von 1 : 1 eingesetzt wird) kleines Alpha-Benzyloxykarbonyl, kleines Epsilon-(nitroarginyl)-lysylnitroarginylprolin-trifluoracetat (Verbindung 9) mit einer Ausbeute von 96% erhalten. [kleines Alpha][hoch]20[tief]D = -12,0° (c = 1, Dimethylformamid). E[tief]His = 0,52 (1n-Essigsäure). R[tief]f = 0,16 (B), 0,52 (C), 0,54 (D)

Man löst 1,42 g (2,03 mMol) der Verbindung 4 in 50 ml Dimethylformamid und gibt unter Abkühlen auf -30°C 0,66 ml (6,09 mMol) frisch zubereitete wasserfreie 9,25 n-Wasserstoffchloridlösung in Dioxan in 5 ml Dimethylformamid und 0,31 ml (2,64 mMol) tert.-Butylnitrit in 3 ml Dimethylformamid hinzu.

Man mischt 30 min bei einer Temperatur von -10°C, gibt dann bei einer Temperatur von -30°C die Lösung von 0,85 ml (6,09 mMol) Triäthylamin in 10 ml Dimethylformamid und die Lösung von 1,81 g (2,03 mMol) der Verbindung 9 und 0,28 ml (2,03 mMol) Triäthylamin in 20 ml Dimethylformamid hinzu. Man mischt bei 0°C durch und setzt portionsweise die Lösung von 0,28 ml (2,03 mMol) Triäthylamin in 10 ml Dimethylformamid zu (je 2 ml jede Stunde). Nachher läßt man das Reaktionsgemisch für 20 Stunden bei 0°C stehen, gießt in 2 l 1%ige Essigsäure, läßt wiederum für 20 Stunden bei 0°C stehen. Man filtriert den gebildeten Niederschlag ab, wäscht mit Wasser durch, trocknet über Phosphorpentoxid bei 1 Torr. Die Ausbeute an kleines Alpha-Benzyloxycarbonyl, kleines Epsilon-(tert.-butoxycarbonylphenylalanyl-o-benzylserylprolylphenylalanylnitroarginyl)-lysylnitroarginylprolin (Verbindung 10) beträgt 2,44 g (83%). [kleines Alpha][hoch]20[tief]D = -34,2° (c = 1, Dimethylformamid). R[tief]f = 0,66 (A), 0,62 (B), 0,87 (C), 0,80 (D).

Man löst 10,0 g (40 mMol) Benzyloxycarbonylprolin in 50 ml Dimethylformamid, gibt 4,45 ml (40 mMol) N-Methylmorpholin und bei einer Temperatur von -15°C tropfenweise die abgekühlte Lösung von 5,30 ml (40 mMol) Chlorkohlensäureisobutylester in 10 ml Dimethylformamid zu. Dann mischt man das Reaktionsgemisch noch 30 min bei einer Temperatur von -15°C und setzt die abgekühlte Suspension von 10,6 g (50 mMol) Glycin-tert.-butylesterphosphit und 5,6 ml (50 mMol) N-Methylmorpholin zu. Man mischt 30 min bei einer Temperatur von -15°C, dann läßt man das Reaktionsgemisch für 15 Stunden bei einer Temperatur von -10°C stehen. Man dampft das Gemisch ein, löst den Rückstand in einem Gemisch, bestehend aus 100 ml Äthylacetat und 100 ml Wasser, wäscht die Äthylacetatschicht mit 10%iger Kaliumhydrogenkarbonatlösung, mit 10%iger Kaliumhydrogensulfatlösung und Wasser (zu je 50 ml) durch, trocknet mit wasserfreiem Magnesiumsulfat, filtriert und dampft ein. Man kristallisiert das erhaltene Öl durch die Behandlung mit Äther-Hexan-Gemisch (1 : 1). Die Ausbeute an Benzyloxykarbonylpropylglyzin-tert.-butylester (Verbindung 11) beträgt 9,2 g (63%). Schmp. 71 - 72°C. [kleines Alpha][hoch]20[tief]D = -49,0° (c = 1, Dimethylformamid). R[tief]f = 0,55 (A), 0,64 (B), 0,68 (C).

Man hydriert 5,0 g der Verbindung 11 in 50 ml Äthanollösung in Gegenwart von Palladiumschwarz während 5 Stunden. Nachher filtriert man den Katalysator ab, dampft das Filtrat ein, löst den Rückstand im Gemisch aus Trockenäther und Hexan (1 : 2) und dampft wiederum ein. Dabei erfolgt Kristallisation und nach dem vollen Eindampfen erhält man eine farblose kristalline Substanz. Die Ausbeute an Prolylglycin-tert.-butylester (Verbindung 12) beträgt 2,8 g (89%). Schmp. 56 - 57°C. [kleines Alpha][hoch]20[tief]D = -38,6° (c = 1, Dimethylformamid). E[tief]His = 0,83 (1n-Essigsäure).

Man löst 2,44 g (1,68 mMol) der Verbindung 10 in 30 ml Dimethylformamid, gibt bei 0°C 1,40 g (1,85 mMol) Komplex von Dicyklohexylcarbodiimid und Pentafluorphenol (1 : 3) ("Komplex F") und 0,77 g (3,36 mMol) der Verbindung 12 hinzu. Man läßt das Gemisch für 20 Stunden bei Zimmertemperatur stehen, dampft ein, gibt dann 50 ml Methylenchlorid zu, filtriert, dampft das Filtrat ein, zerreibt den Rückstand mit Äther. Man trägt die erhaltene Substanz auf die Kolonne mit Silicagel (3 x 100 cm) auf, läßt durch die Kolonne zuerst das chromatographische System A (1 Liter), dann das System B durch. Man vereinigt die Fraktionen, die bei 280 µm absorbieren, und trägt diese wieder auf die Kolonne mit Silicagel (3 x 250 cm) auf, eluiert mit dem System B, vereinigt die Fraktionen, die reines Decapeptid enthalten (es wird dünnschichtchromatographisch kontrolliert), dampft ein, zerreibt mit Äther. Die Ausbeute an kleines Alpha-Benzyloxycarbonyl, kleines Epsilon-(phenylalanyl-o-benzylseryl-prolylphenylalanylnitroarginyl)-lysylnitroarginylprolylpropyl-glycin-tert.-butylester (Verbindung 13) beträgt 1,95 g (70%). [kleines Alpha][hoch]20[tief]D = - 48,0° (c = 1, Dimethylformamid). R[tief]f = 0,08 (A), 0,82 (B), 0,91 (C), 0,80 (D).

Man löst 1,0 g (0,60 mMol) der Verbindung 13 in 10 ml wasserfreiem Methylenchlorid und gibt bei 0°C 10 ml trockene 8n-Wasserstoffchloridlösung in Dioxan zu.

Man läßt das Gemisch für 15 min bei Zimmertemperatur stehen, dampft bei 20°C ein, zerreibt den Rückstand mit wasserfreiem Äther. Die Ausbeute an kleines Alpha-Benzyloxycarbonyl, kleines Epsilon-(phenylalanyl-o-benzylserylprolylphenylalanylnitroarginyl)-lysylnitroarginylprolylprolyl-glycinhydrochlorid (Verbindung 14) beträgt 0,90 g (97%). [kleines Alpha][hoch]20[tief]D = -46,5° (c = 1, Dimethylformamid). E[tief]His = 0,43 (5 n-Essigsäure). R[tief]f = 0,21 (B), 0,76 (C), 0,58 (D).

Man löst 0,33 g (0,214 mMol) der Verbindung 14 und 0,030 ml (0,216 mMol) Triäthylamin in 800 ml Dimethylformamid (man trocknet Dimethylformamid über Bariumoxid, destilliert, rektifiziert dann über Ninhydrin in Argonatmosphäre bei 1 Torr), kühlt auf eine Temperatur von -6°C ab, gibt 49,4 mg N-Oxysuccinimid (0,428 mMol) und unter Rühren (in der Argonatmosphäre) während 10 Stunden die Lösung von 66,4 mg Dicyklohexylcarbodiimid in 100 ml Dimethylformamid hinzu. Dabei hält man die Temperatur von -6°C konstant. Dann läßt man das Gemisch für 20 Stunden bei einer Temperatur von -5°C und für 36 Stunden bei Zimmertemperatur stehen. Man dampft das Gemisch ein, zerreibt den Rückstand mit Äther, wäscht nachher mit Wasser durch. Man trägt die erhaltene Substanz auf eine Kolonne mit Silicagel (2 x 100 cm) auf, eluiert mit 0,5 ml des chromatographischen Systems A, dann mit dem System B. Man vereinigt die Fraktionen, die das angestrebte Cyklopeptid enthalten (die chromatographisch beweglichste Komponente des Gemisches der Cyklisation von der Peptidnatur absorbiert bei 280 nm). Man dampft das Gemisch ein, zerreibt mit Äther. Die Ausbeute an Cyklo-[kleines Alpha-benzyloxycarbonyl, kleines Epsilon-(phenylalanyl-o-benzylserylprolylphenylalanylnitroarginyl)-lysylnitroarginyl-prolylprolyl-glycin] (Verbindung 15) beträgt 25 mg (7,9%). [kleines Alpha][hoch]20[tief]D = -71,2° (c = 0,5, Methanol). R[tief]f = 0,03 (A), 0,69 (B), 0,84 (C), 0,62 (D).

Man löst 20 mg (0,0135 mMol) der Verbindung 15 in 1 ml Methanol, gibt 1 Tropfen Essigsäure und 0,2 ml Wasser zu. Man hydriert beim Luftdruck während 70 Stunden in Gegenwart von frisch zubereitetem Palladiumschwarz. Man filtriert das Gemisch, dampft ein, lyophilisiert dreimal aus Wasser. Die Ausbeute an Cyklo-(N kleines Epsilon-kallidin) (Verbindung 1) beträgt 17 mg (93%).

Die erhaltene Substanz erweist sich chromatographisch und elektrophoretisch als vollständig rein. Bei der Inkubation mit Trypsin geht die Spaltung unter Bildung von Kallidin vor sich, das seinerseits in Lysin und Bradykinin zerfällt (Elektrophorese und Chromatographie der Abspaltungsprodukte mit Kontrollsubstanzen), was die cyklische Struktur beweist. E[tief]His = 0,85 (1 n-Essigsäure). R[tief]f = 0,60 (Methanol-Wasser-Ammoniumacetat 9,5 ml : 0,5 ml : 0,15 g); silanisierte "Merck"-Platte.

Beispiel 2

Man löst 6,4 g (16,6 mMol) tert.-Butoxycarbonylphenylalanin-p-nitrophenylester, 1,13 g (15 mMol) Glycin und 1,67 ml (15 mMol) N-Methylmorpholin im Gemisch aus 200 ml Dimethylformamid und 20 ml Wasser. Man läßt die erhaltene Lösung für 20 Stunden bei Zimmertemperatur stehen, dampft ein und löst das zurückgebliebene Öl im Gemisch aus 80 ml 10%ige wäßrige Kaliumhydrogenkarbonatlösung und 50 ml Äthylacetat. Man trennt die Äthylacetatschicht ab, extrahiert die wäßrige Schicht mit Äther (50 ml) und neutralisiert mit dem Überschuß an 10%iger wäßriger Kaliumhydrogensulfatlösung (bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 2). Die erhaltene Lösung extrahiert man mit Äthylacetat (2 x 50 ml), wäscht den Extrakt mit Wasser (50 ml) durch, trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat, filtriert und dampft bis zur Trockne ein. Man erhält eine farblose kristalline Substanz. Die Ausbeute an tert.-Butoxycarbonyl-phenylalanylglycin (Verbindung 16) beträgt 4,0 g (82,7%). Für die Analyse kristallisiert man aus Äthylacetat. Schmp. 165°C unter Zersetzung. [kleines Alpha][hoch]20[tief]D = -9,0° (c = 1, Dimethylformamid). R[tief]f = 0,85 (A), 0,90 (B), 0,88 (C).

Man löst 2,80 g (8,7 mMol) der Verbindung 16 in 50 ml trockenem Dimethylformamid, fügt 1,84 g (10 mMol) Pentafluorphenol zu, kühlt auf eine Temperatur von -20°C ab und setzt 1,90 g (9,2 mMol) Dicyklohexylcarbodiimid hinzu, schüttelt bis zum Auflösen des letzteren und läßt für 20 min bei 0°C stehen. Nachher gibt man 4,15 g (8,7 mMol) Prolylphenylalanin-p-nitrobenzylesterhydrobromid und N-Methylmorpholin bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 8 zu. Man läßt das Gemisch für 3 Stunden bei Zimmertemperatur stehen, dampft ein, gibt zum Rückstand 100 ml Methylenchlorid zu, filtriert, extrahiert das Filtrat mit 10%iger Kaliumhydrogencarbonatlösung, 10%iger Kaliumhydrogensulfatlösung und Wasser (zu je 100 ml). Man trocknet das Gemisch über wasserfreiem Magnesiumsulfat, filtriert, dampft das Filtrat ein. Dabei wird ein Öl gebildet, das man durch das Zerreiben mit wasserfreiem Äther kristallisiert. Die Ausbeute an tert.-Butoxycarbonylphenylalanylglycylprolylphenylalanin-p-nitrobenzylester (Verbindung 17) beträgt 5,4 g (88,4%); Schmp. 125 - 155°C. [kleines Alpha][hoch]20[tief]D = -45,6° (c = 1, Dimethylformamid). R[tief]f = 0,88 (A), 0,91 (B), 0,91 (D).

Man erwärmt 3,0 g (4,26 mMol) der Verbindung 17 und 1,0 ml Hydrazinhydrat während 1 Stunde in 30 ml Äthanol bei einer Temperatur von 70°C. Dann filtriert man das Gemisch, gibt zum Filtrat 50 ml Wasser hinzu und läßt für 20 Stunden bei einer Temperatur von -10°C stehen, filtriert ab und wäscht die Kristalle auf dem Filter mit 30 ml 50%igem Äthanol, dann mit Wasser bis zum Erhalten der neutralen Reaktion des Filtrats durch. Man trocknet im Exsikkator über Phosphorpentoxid. Die Ausbeute an tert.-Butoxycarbonylphenylalanylglycylpropylylphenylalanin-hydrazid (Verbindung 18) beträgt 2,30 g (92,8%). Schmp. 140 - 160°C. [kleines Alpha][hoch]20[tief]D = -59,8° (c = 1, Dimethylformamid). R[tief]f = 0,93 (A), 0,92 (B), 0,91 (D).

Man löst 10,0 g (14,2 mMol) der Verbindung 5 (s. Bsp. 1) in 100 ml Dimethylformamid, gibt 2,46 g (21,4 mMol) fein zerriebenes Prolin und 1,66 ml (14,9 mMol) N-Methylmorpholin zu und mischt mit Magnetrührwerk 20 Stunden durch. Man dampft dann das Gemisch ein, löst den Rückstand im Gemisch von 100 ml Äthylacetat und 100 ml 10%iger Kaliumhydrogensulfatlösung, trennt die wäßrige Schicht ab und extrahiert die Äthylacetatschicht mit 10%iger Kaliumhydrogensulfatlösung und dann mit 10%iger Kaliumhydrogencarbonatlösung (zu je 100 ml). Man trennt die wäßrige und Hydrogencarbonatschicht ab, neutralisiert mit dem Überschuß an 10%iger Kaliumhydrogensulfatlösung bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 2 und extrahiert mit Äthylacetat (2 x 100 ml). Man trocknet den Extrakt mit wasserfreiem Magnesiumsulfat, filtriert, dampft ein. Man erhält eine farblose amorphe Substanz. Die Ausbeute an kleines Alpha-Benzyloxycarbonyl, kleines Epsilon-(tert.-butoxycarbonyl-nitroarginyl)-lysylprolin (Verbindung 19) beträgt 7,9 g (82%). [kleines Alpha][hoch]20[tief]D = - 23,1° (c = 1, Dimethylformamid). R[tief]f = 0,54 (A), 0,81 (D). Aus der Verbindung 19 erhält man ähnlich der Synthese der Verbindung 2 kleines Alpha-Benzyloxycarbonyl, kleines Epsilon-(nitroarginyl)-lysylprolintrifluo- racetat (Verbindung 20) mit einer Ausbeute von 98%. E[tief]His = 49 (5 n-Essigsäure). [kleines Alpha][hoch]20[tief]D = -11,1° (c = 1, Dimethylformamid). R[tief]f = 0,57 (C), 0,70 (E).

Man löst 2,1 g (3,62 mMol) der Verbindung 18 in 50 ml Dimethylformamid, kühlt auf eine Temperatur von -30°C ab, gibt unter Rühren das abgekühlte (-70°C) Gemisch aus 3,5 ml (15,7 mMol) 4,5 n-Lösung des trockenen Wasserstoffchlorids in Tetrahydrofuran und 20 ml Äthylacetat zu. Dann gibt man bei einer Temperatur von - 30°C tropfenweise eine abgekühlte Lösung von 0,45 ml (3,87 mMol) tert.-Butylnitrit in 10 ml Äthylacetat hinzu. Man läßt das Gemisch für 30 min bei einer Temperatur von - 25°C stehen, gibt dann 1,76 ml (15,8 mMol) N-Methylmorpholin und nachher noch eine Lösung von 2,68 g der Verbindung 20 (3,87 mMol) und 0,44 ml N-Methylmorpholin in 50 ml Dimethylformamid hinzu. Man läßt das Gemisch für 3 Tage bei einer Temperatur von - 10°C stehen, dampft ein, löst den Rückstand im Gemisch von 100 ml Methylenchlorid und 100 ml Wasser. Man trocknet die Methylenchloridschicht ab, wäscht in bestimmter Reihenfolge mit 10%iger Kaliumhydrogencarbonatlösung, mit 10%iger Kaliumhydrogensulfatlösung und Wasser (zu je 100 ml) durch, trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat, filtriert und dampft ein. Man erhält ein Öl, das unter Zerreiben mit dem Äther-Äthylacetat-Gemisch (1 : 1) kristallisiert wird. Die Ausbeute an kleines Alpha-Benzyloxycarbonyl, kleines Epsilon-(tert.-butoxycarbonylphenylalanylglycylprolylphenylalanyl-nitroarginyl)-lysylprolin (Verbindung 21) beträgt 3,50 g (85,8%). Schmp. 140 - 177°C. [kleines Alpha][hoch]20[tief]D = - 44,1° (c = 1, Dimethylformamid). R[tief]f = 0,53 (A), 0,37 (B), 0,87 (D).

Man löst 2,70 g (2,40 mMol) der Verbindung 21 in 40 ml Dimethylformamid, kühlt auf 0°C ab und fügt 2,19 g (2,89 mMol) des "Komplexes F" und 1,1 g (4,8 mMol) der Verbindung 12 hinzu. Dann läßt man das Gemisch für 20 Stunden bei Zimmertemperatur stehen, dampft ein, löst den Rückstand in 50 ml Methylenchlorid, filtriert, wäscht das Filtrat mit 10%iger Kaliumhydrogensulfatlösung und 50 ml Wasser durch. Man trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat, filtriert, dampft ein. Man löst den Rückstand zweimal im minimalen Methylenchloridvolumen und fällt mit Äther aus. Die Ausbeute an kleines Alpha-Benzyloxycarbonyl, kleines Epsilon-(tert.-butoxycarbonylphenylalanylglycylprolylphenylalanyl-nitroarginyl)-lysylprolylprolylglycin-tert.-butylester (Verbindung 22) beträgt 2,8 g (87,2%). Schmp. 150 - 193°C unter Zersetzung. [kleines Alpha][hoch]20[tief]D = - 60,3° (c = 1, Dimethylformamid). R[tief]f = 0,57 (A), 0,80 (B), 0,60 (D).

Man löst 1,8 g (1,35 mMol) der Verbindung 22 bei 0°C in 20 ml des Gemisches aus Trifluoressigsäure und Methylenchlorid (1 : 1), läßt für 20 min bei Zimmertemperatur stehen und dampft bei 0°C ein. Man kristallisiert den Rückstand durch Zerreiben mit 50 ml trockenen Äthers, löst in 10 ml wasserfreiem Dimethylformamid, setzt 0,33 ml (1,5 mMol) 4,5 n-Lösung von wasserfreiem Wasserstoffchlorid in Tetrahydrofuran zu und fällt mit 100 ml Äther aus. Die Ausbeute an kleines Alpha-Benzyloxycarbonyl, kleines Epsilon-(phenylalanylglycylprolylphenylalanyl-nitroarginyl)-lysylprolylprolylglycinhydrochlorid (Verbindung 23) beträgt 1,55 g (95%). [kleines Alpha][hoch]20[tief]D = - 77,8°. Schmp. 140 bis 192°C. R[tief]f = 0,73 (C), 0,74 (E).

Man löst 1,1 g (0,91 mMol) der Verbindung 23 in 2 ml Dimethylformamid (getrocknet über Bariumoxid und destilliert über Ninhydrin unmittelbar vor dem Gebrauch) und gibt bei 0°C unter Rühren in der Atmosphäre des trockenen Argons 1,5 g (1,98 mMol) des "Komplexes F" zu. Dann gibt man bei Zimmertemperatur während 6 Stunden die Lösung von 0,19 ml (1,33 mMol) Triäthylamin in 300 ml Dimethylformamid zu. Man läßt das erhaltene Gemisch bei Zimmertemperatur für 2 Tage stehen und dampft ein. Den Rückstand kristallisiert man durch Zerreiben mit wasserfreiem Äther, filtriert, wäscht den Niederschlag am Filter mit Äther, dann mit Wasser durch. Das erhaltene Produkt untersucht man nach der Methode der Dünnschichtchromatographie im System B. Man nimmt an, daß die Substanz mit R[tief]f = 0,4 das gesuchte Cyklopeptid ist (eines der Hauptprodukte der Cyklisierung, ist chromatographisch beweglich, durch die Besichtigung im UV-Licht und mit dem Benzidinreagens nachweisbar). Das Cyklisierungsgemisch wird vorläufig auf der Kolonne mit Silicagel (2 x 100 cm) gereinigt, indem als Elutionsmittel das System Chloroform-Äthanol-n-Butanol-Äthylacetat (10 : 6 : 4 : 3) ausgenutzt wird. Die Fraktionen, die das gesuchte Cyklopeptid enthalten, werden wieder auf einer Kolonne mit Silicagel (3 x 250 cm) gereinigt, indem als Elutionsmittel das System B ausgenutzt wird. Die Fraktionen, die reines Cyklopeptid enthalten, werden vereinigt, eingedampft, der Rückstand wird mit Äther zerrieben. Die Ausbeute an Cyklo-[kleines Alpha-benzyloxycarbonyl, kleines Epsilon-(phenylalanylglycylprolylphenylalanylnitroarginyl)-lysylprolylprolylglycyl] (Verbindung 24) beträgt 102 mg (9,7%). Schmp. 163 - 165°C. Molekulargewicht: gefunden 1024 (wurde kryoskopisch unter Ausnutzung der Harnstoffschmelze bestimmt). Berechnet nach der Formel 1163,31. [kleines Alpha][hoch]20[tief]D = - 64,1° (c = 1, Dimethylformamid). R[tief]f = 0,37 (A), 0,43 (B), 0,89 (C), 0,37 (D), 0,96 (E).

Man löst 26 mg (0,0223 mMol) der Verbindung 24 in 0,5 ml Eisessig, gibt dann 0,2 ml frisch zubereiteter gesättigter Lösung des trockenen Wasserstoffbromids in Essigsäure zu. Man läßt das Gemisch für 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen, gibt dann 5 ml wasserfreien Äther zu. Man suspendiert den gebildeten Niederschlag 10mal in 5 ml wasserfreiem Äther und dekantiert. Dann läßt man im Exsikkator über Kaliumhydroxid bei 1 Torr stehen. Die Ausbeute an Cyklo-[(kleines Epsilon-phenylalanylglycylprolylphenylalanylnitroarginyl)-lysylprolylglycyl]-hydrobromid beträgt 23,4 mg (94,7%). E[tief]His = 0,38 (5 n-Essigsäure). [kleines Alpha][hoch]20[tief]D = - 48,0° (c = 0,5, Dimethylformamid).

Man löst 20 mg (0,018 mMol) der Verbindung 25 in 0,5 ml Dimethylformamid, gibt 26,7 mg (0,036 mMol) Tribenzyloxycarbonylarginin-pentafluorphenylester und die N-Methylmorpholinlösung in Dimethylformamid bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 8 zu. Man läßt das Gemisch für 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen, dampft ein, zerreibt den Rückstand mit 3 ml wasserfreiem Äthylacetat, suspendiert den gebildeten Niederschlag 3mal im wasserfreien Äthylacetat und dekantiert. Man trocknet dann den Rückstand mit dem Trockenluftstrahl und suspendiert 3mal in 3 ml Wasser und dekantiert. Man trocknet bei 1 Torr über Kaliumhydroxid und Phosphorpentoxid. Die Ausbeute an N[hoch]kleines Alpha-Tribenzyloxycarbonylarginylcyklo-[kleines Epsilon-(phenylalanylglycylprolylphenylalanylnitroarginyl)-lysylprolylglycyl] (Verbindung 26) beträgt 26,0 mg (91%). R[tief]f = 0,67 (B). [kleines Alpha][hoch]20[tief]D = - 61,2° (c = 0,5, Essigsäure).

Man hydriert 23 mg (0,014 mMol) der Verbindung 26 beim Luftdruck in Gegenwart von Palladiumschwarz im Gemisch von 0,4 ml Essigsäure, 0,2 ml Methanol und 0,04 ml Wasser während 20 Stunden. Man dampft das Gemisch ein, lyophilisiert aus Wasser. Man erhält ein flaumiges Pulver. Das Produkt ist elektrophoretisch und chromatographisch einheitlich. Die Ausbeute an N[hoch]kleines Alpha-Arginyl-cyklo-[(N[hoch]kleines Epsilon-1-lysyl,6-glycin)bradykinin] (die Verbin- dung 11) beträgt 17,7 mg (96%). E[tief]His = 0,80 (1 o-Essigsäure). [kleines Alpha][hoch]20[tief]D = - 0,62° (c = 0,5, H[tief]2O).

Beispiel 3

Man löst 1,03 g (22,3 mMol) tert.-Butoxycarbonyl-o-benzylserin-pentafluorphenylester und 6,7 g (23,4 mMol) Prolin-p-nitrobenzylesterhydrochlorid in 200 ml Dimethylformamid und gibt Triäthylamin bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 8 zu. Man mischt das Gemisch 2 Stunden bei Zimmertemperatur durch, dampft ein, löst den Rückstand im Gemisch aus 200 ml Äther und 100 ml Wasser. Man trennt die organische Schicht ab, extrahiert mit 100 ml 10%iger Kaliumhydrogencarbonatlösung, dann mit 100 ml 10%iger Kaliumhydrogensulfatlösung, trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat, filtriert, dampft ein. Man erhält ein Öl, das tert.-Butoxycarbonyl-o-benzylserylprolin-p-nitrobenzylester (Verbindung 27) enthält. R[tief]f = 0,95 (A), 0,77 (B), 0,95 (C), 0,76 (D) und Pentafluorphenol. Man löst es in Trifluoressigsäure, läßt 20 min bei Zimmertemperatur stehen, dampft dann ein. Man neutralisiert den Rückstand, der o-Benzylserylprolin-p-nitrobenzylester-trifluoracetat (Verbindung 28) enthält, mit Triäthylamin bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 8, gibt 10 g (23,2 mMol) tert.-butoxycarbonyl-phenylalanin-pentafluorphenylester zu. Man läßt das Gemisch 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen, setzt nachher 1 ml kleines Beta-Dimethylaminoäthylamin hinzu. Nach 10 min neutralisiert man das Gemisch mit Essigsäure bis zum Erreichen eins pH-Wertes von 6, dampft ein, löst den Rückstand im Gemisch aus 100 ml Äther und 100 ml Wasser, trennt die ätherische Schicht ab, wäscht mit 100 ml 10%iger Kaliumhydrogencarbonatlösung, 100 ml 10%iger Kaliumhydrogensulfatlösung, dann mit 100 ml Wasser durch. Man gibt 50 ml Benzol zu, dampft ein, reinigt das erhaltene dunkelbraune Öl chromatographisch [700 g Silikagel, man eluiert zuerst mit dem Heptan-Äthylacetat-Gemisch (5 : 1), dann mit dem chromatographischen System A]. Nach dem Eindampfen des Eluats erhält man ein hellbraunes Öl. Die Ausbeute an tert.-Butoxycarbonylphenylalanyl-o-benzylserylprolin-p-nitrobenzylester (Verbindung 29) beträgt 9,7 g (64,5%). Für die Analyse kristallisiert man einen geringen Teil durch Zerreiben mit Hexan. [kleines Alpha][hoch]23[tief]D = - 29,1° (c = 1, Dimethylformamid). R[tief]f = 0,94 (A), 0,77 (B), 0,96 (C), 0,81 (D).

Aus der Verbindung 29 erhält man ähnlich der Synthese der Verbindung 2 Phenylalanyl-o-benzylserylprolin-p-nitro-benzylester-trifluoracetat (Verbindung 30), das ein Öl darstellt, mit einer Ausbeute von 8,9 g (97%). Für die Analyse kristallisiert man einen geringen Ölteil durch Zerreiben mit Hexan. [kleines Alpha][hoch]23[tief]D = - 16,3° (c = 1, Dimethylformamid). E[tief]His = 0,61 (1 n-Essigsäure). R[tief]f = 0,12 (A), 0,66 (B), 0,88 (C), 0,62 (D).

Aus der Verbindung 30 erhält man ähnlich mit der Synthese der Verbindung 29 unter Ausnutzung des tert.-Butoxycarbonylglycin-pentafluorphenylesters ein Gemisch, das aus tert.-Butoxycarbonylglycylphenylalanyl-o-benzylserylprolin-p-nitrobenzylester (Verbindung 31) besteht. R[tief]f = 0,71 (A), 0,76 (B), 0,95 (C), 0,80 (D) und Pentafluorphenol, das man mit Trifluoressigsäure ähnlich der Herstellung der Verbindung 28 unter Bildung des Öls behandelt, das Glycylphenylalanyl-o-benzylserylprolin-p-nitrobenzylester-trifluoracetat (Verbindung 32) enthält. E[tief]His = 0,58 (1 n-Essigsäure); R[tief]f = 0,02 (A), 0,2 (B), 0,67 (C), 0,62 (D). Man neutralisiert das Öl, das die Verbindung 32 enthält, und setzt es für die Reaktion mit tert.-Butoxycarbonyl-prolinpentafluorphenylester ähnlich der Herstellung der Verbindung 29 ein. Man reinigt das erhaltene Öl chromatographisch [700 g Silicagel, man eluiert zuerst mit Chloroform, dann mit dem Gemisch vom chromatographischen System A und Isopropanol (4 : 1)]. Nach dem Eindampfen des Eluats erhält man ein hellbraunes Öl, das man durch das Zerreiben mit dem Äther-Hexan-Gemisch (1 : 1) kristallisiert. Die Ausbeute an tert.-Butoxycarbonylprolylglycylphenylalanyl-o-benzyl-serylprolin-p-nirobenzylester (Verbindung 33) beträgt 52%. [kleines Alpha][hoch]29[tief]D = - 43,0° (c = 1, Dimethylformamid), R[tief]f = 0,58 (A), 0,72 (B), 0,94 (C), 0,78 (D).

Man löst 2,5 g (3,0 mMol) der Verbindung 33 in 20 ml Methylenchlorid, gibt dann 4 ml Trifluoressigsäure hinzu. Man läßt das Gemisch für 2 Stunden bei Zimmertemperatur stehen, dampft ein, kristallisiert den Rückstand durch das Zerreiben mit wasserfreiem Äther. Die Ausbeute an Prolylglycylphenylalanyl-o-benzylserylprolin-p-nitrobenzylester-trifluoracetat (Verbindung 34) beträgt 2,47 g (98%). [kleines Alpha][hoch]29[tief]D = - 27,8° (c = 1, Dimethylformamid). E[tief]His = 0,57 (1-Essigsäure); R[tief]f = 0 (A), 0,13 (B), 0,81 (C), 0,26 (D). 1,36 g (3,27 mMol) der Verbindung 6, 0,60 g (3,27 mMol) Pentafluorphenol und 0,67 g (3,27 mMol) Dicyklohexylkarbodiimid löst man bei 0°C in 50 ml wasserfreiem Methylenchlorid, läßt für 1 Stunde stehen, filtriert. Im Filtrat löst man 2,36 g (2,8 mMol) der Verbindung 34, gibt Triäthylamin bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 8 hinzu, läßt für 20 Stunden bei Zimmertemperatur stehen. Man extrahiert das Gemisch mit 50 ml 10%iger Kaliumhydrogencarbonatlösung, dann mit 50 ml 10%iger Kaliumhydrogensulfatlösung und 50 ml Wasser, dampft ein, reinigt den Rückstand chromatographisch [200 g Silicagel, als Elutionsmittel wird das chromatographische System A und Isopropanol (4 : 1) ausgenutzt]. Man kristallisiert den Rückstand nach dem Eindampfen der Eluatfraktion durch Zerreiben mit Äther. Die Ausbeute an tert.-Butoxycarbonylnitroarginylprolylprolylglycylphenylalanin-o-benzylserylprolin-p-nitrobenzylester (Verbindung 35) beträgt 1,9 g (60%). [kleines Alpha][hoch]29[tief]D = - 50,0° (c = 1, Dimethylformamid). R[tief]f = 0,08 (A), 0,61 (B), 0,96 (C), 0,56 (D).

Man löst 1,45 g (1,29 mMol) der Verbindung 35 in 18 ml Aceton, fügt 7 ml Wasser, 1 mg Thymolphthalein und unter Rühren 1,3 ml 1 n-Natriumhydroxid (portionsweise zu je 0,3 ml) während 7 Stunden zu. Die nächste Alkaliportion gibt man nach dem Verschwinden der blauen Färbung zu. Man neutralisiert das Gemisch mit 10%iger Kaliumhydrogensulfatlösung bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 6, dampft bis zum Verschwinden des Acetongeruchs ein. Man gibt 30 ml Methylenchlorid zu, wäscht die organische Schicht mit 30 ml 1%iger Kaliumhydrogensulfatlösung und Wasser (dreimal zu je 30 ml), dampft ein, kristallisiert den Rückstand durch Zerreiben mit wasserfreiem Äther. Die Ausbeute an tert.-Butoxycarbonylnitroarginylprolylprolylglycylphenylalanyl-o-benzylserylprolin (Verbindung 36) beträgt 1,1 g (86%). [kleines Alpha][hoch]29[tief]D = - 56,5° (c = 1, Dimethylformamid); R[tief]f = 0,04 (A), 0,56 (B), 0,90 (C), 0,54 (D).

Man verwandelt 5 g (13,4 mMol) tert.-Butoxycarbonylnitroarginin in Pentafluorphenylester (siehe die Synthese der Verbindung 6). Man löst das Öl, das tert.-Butoxycarbonylnitroargininpentafluorphenylester enthält, in 75 ml Dimethylformamid, gibt 4,3 g (20 mMol) kleines Omega-Aminododecansäure und N-Methylmorpholin bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 8 und 20 ml Wasser zu. Man mischt das Gemisch intensiv bei Zimmertemperatur während 20 Stunden, filtriert, dampft das Filtrat ein, reinigt den Rückstand chromato- graphisch [1 kg Silicagel, man eluiert zuerst mit dem chromatographischen System A, dann mit dem Gemisch aus dem chromatographischen System A und Isopropanol (4 : 1)]. Man kristallisiert den Rückstand nach dem Eindampfen des Eluats durch Zerreiben mit Hexan. Die Ausbeute an tert.-Butoxycarbonylnitroarginyl-kleines Omega-aminododecansäure (Verbindung 37) beträgt 1,5 g (22%). [kleines Alpha][hoch]23[tief]D = - 4,1° (c = 1, Dimethylformamid); R[tief]f = 0,19 (A), 0,70 (B), 0,87 (C), 0,75 (D).

Aus der Verbindung 37 erhält man ähnlich mit der Synthese der Verbindung 2 Nitroarginyl-kleines Omega-aminododecansäuretrifluoracetat (die Verbindung 38) in einer Ausbeute von 96%. E[tief]His = 0,58 (1 n-Essigsäure); R[tief]f = 0 (A), 0,33 (B), 0,48 (C), 0,55 (D).

Man löst 1,3 g (2,45 mMol) der Verbindung 38 in 30 ml Dimethylformamid, gibt N-Methylmorpholin bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 8, dann 2,0 g (4,6 mMol) tert.-Butoxycarbonylphenylalaninpentafluorphenylester zu. Man läßt eine Stunde bei Zimmertemperatur stehen, dampft ein, löst den Rückstand in 50 ml Methylenchlorid und wäscht mit 50 ml 10%iger Kaliumhydrogensulfatlösung und 50 ml Wasser (zweimal) durch. Man dampft das Gemisch ein, reinigt den Rückstand chromatographisch (200 g Silicagel, man eluiert chromatographisch mit dem System A). Den Rückstand nach dem Eindampfen der Eluatfraktion kristallisiert man durch das Zerreiben mit Hexan. Die Ausbeute an tert.-Butoxycarbonylphenylalanylnitroarginyl-kleines Omega-aminododecansäure (Verbindung 39) beträgt 0,5 g (31%). [kleines Alpha][hoch]29[tief]D = - 13,5° (c = 0,2, Dimethylformamid). R[tief]f = 0,19 (A), 0,76 (B), 0,91 (C), 0,80 (D).

Man löst 0,45 g (0,68 mMol) der Verbindung 39 in 10 ml Eisessig und gibt 1 ml gesättigte Lösung wasserfreien Wasserstoffchlorids in Dioxan hinzu. Man läßt das Gemisch für 30 min bei Zimmertemperatur stehen, dampft ein, kristallisiert den Rückstand durch Zerreiben mit wasserfreiem Äther, trocknet im Exsikkator über Kaliumhydroxid. Die Ausbeute an Phenylalanylnitroarginyl-kleines Omega-aminododecansäurehydrochlorid (die Verbindung 40) beträgt 0,4 g (98%). [kleines Alpha][hoch]29[tief]D = + 3,8° (c = 1, Dimethylformamid). E[tief]His = 0,44 (1 n-Essigsäure); R[tief]f = 0 (A), 0,79 (C), 0,50 (D).

Man löst 0,76 g (0,77 mMol) der Verbindung 36 und 0,53 g (0,70 mMol) des "Komplexes F" in 20 ml wasserfreiem Dimethylformamid. Man läßt das Gemisch für 12 Stunden bei Zimmertemperatur stehen, gibt dann 0,4 g (0,67 mMol) der Verbindung 40 und Diisopropyläthylamin bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 8 zu. Man läßt das Gemisch für 20 Stunden bei Zimmertemperatur stehen, dampft dann ein, zerreibt den Rückstand mit wasserfreiem Äther. Man reinigt das Gemisch chromatographisch (1 kg Silicagel, man führt die fünfmalige Rezirkulation unter Ausnutzung des chromatographischen Systems B als Elutionsmittel durch). Den Rückstand nach dem Eindampfen der Eluatfraktion kristallisiert man durch Zerreiben mit wasserfreiem Äther. Die Ausbeute an tert.-Butoxycarbonylnitroarginylprolylprolylglycylphenylalanyl-o-benzylserylprolylphenylalanylnitroarginyl-kleines Omega-aminododecansäure (Verbindung 41) beträgt 0,56 g (54%). [kleines Alpha][hoch]29[tief]D = - 47,5° (c = 1, Dimethylformamid). R[tief]f = 0 (A), 0,89 (C), 0,64 (D).

100 mg (0,065 mMol) der Verbindung 41 und 67,3 mg (0,089 mMol) des "Komplexes F" löst man in 20 ml wasserfreiem Methylenchlorid. Man läßt das Gemisch für 20 Stunden bei Zimmertemperatur stehen, dampft ein, kristallisiert den Rückstand durch Zerreiben mit wasserfreiem Äther. Dann löst man ihn wieder in 2 ml Methylenchlorid, filtriert, dampft das Filtrat ein, zerreibt den Rückstand mit wasserfreiem Äther. Die Ausbeute an tert.-Butoxycarbonylnitroarginylprolylprolylglycylphenylalanyl-o-benzylserylprolylphenylalanylnitroarginyl-kleines Omega-amino-dodecansäure-pentafluorphenylester (Verbindung 42) beträgt 105 mg (95%).

100 mg (0,059 mMol) der Verbindung 42 löst man in 2 ml wasserfreiem Methylenchlorid, gibt dann 0,1 ml gesättigte Lösung des wasserfreien Wasserstoffchlorids in Dioxan zu. Man läßt das Gemisch für 30 min bei Zimmertemperatur stehen, gibt dann 20 ml wasserfreien Äther zu. Man filtriert den gebildeten Niederschlag ab, wäscht mit wasserfreiem Äther durch, läßt im Vakuumexsikkator über Kaliumhydroxid stehen. Die Ausbeute an Nitroarginylprolylprolylglycylphenylalanyl-o-benzyl-serylprolylphenylalanylnitroarginyl-kleines Omega-aminododecansäure-pentafluorphenylesterhydrochlorid (Verbindung 43) beträgt 92 g (95%).

Zu einer Lösung aus 0,11 ml (0,64 mMol) Diisopropyläthylamin in 200 ml Dimethylformamid gibt man unter intensivem Rühren die Lösung von 90 mg (0,055 mMol) der Verbindung 43 in 10 ml Dimethylformamid hinzu. Man läßt das Gemisch für 2 Tage bei Zimmertemperatur stehen, dampft ein, kristallisiert den Rückstand durch Zerreiben mit wasserfreiem Äther, chromatographiert nachher [200 g Silikagel, als Elutionsmittel werden das chromatographische System A und Isopropanol (4 : 1), dann das chromatographische System B ausgenutzt]. Die Eluatfraktion, die Cyklopeptid enthält, dampft man ein, chromatographiert den Rückstand wiederholt (100 g Silicagel, als Elutionsmittel wird Alkohol verwendet). Nach dem Eindampfen der Eluatfraktion kristallisiert man den Rückstand durch Zerreiben mit wasserfreiem Äther, trocknet dann und mischt mit 30 ml Wasser durch, dekantiert und wäscht wiederum mit Wasser durch. Man trocknet im Vakuumexsikkator über Phosphorpentoxid. Die Ausbeute an Cyklo-(nitroarginylprolylprolylglycylphenylalanyl-o-benzylserylprolylphenylalanylnitroarginyl-kleines Omega-aminododekanoyl) (Verbindung 44) beträgt 20 mg (26%). [kleines Alpha][hoch]24[tief]D = - 46,2° (c = 1, Methanol). R[tief]f = 0 (A), 0,59 (B), 0,88 (C).

Man löst 20 mg (0,014 mMol) der Verbindung 44 in 2 ml Methanol, gibt 1 Tropfen Essigsäure zu und hydriert 24 Stunden in Gegenwart von Palladiumschwarz. Man filtriert das Gemisch, dampft ein, löst den Rückstand in 2 ml Wasser, filtriert und lyophilisiert. Man erhält ein weißes Pulver, die Ausbeute an Cyklo-[(kleines Omega-aminododecanoyl)bradykinin]diacetat beträgt 13 mg (68%). [kleines Alpha][hoch]20[tief]D = - 63,2° (c = 0,5, Wasser). E[tief]His = 0,67 (1 n-Essigsäure); R[tief]f = 0,32 (D)

Claims (4)

1. Cyclo-(N[hoch]kleines Epsilon-kallidin) der Formel: (I)

2. N[hoch]kleines Alpha-Arginyl-cyclo-[(N[hoch]kleines Epsilon-1-lysin,6-glycin)bradykinin] der Formel: (II)

3. Cyclo-[(kleines Omega-aminododecanoyl)bradykinin] der Formel: (III)

4. Verwendung der Verbindungen gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 bei der Bekämpfung von Bluthochdruck.