DE2341798A1 - Octapeptid und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents
Octapeptid und verfahren zu seiner herstellungInfo
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Description
Eisai Co·, Ltd.
6-10, 4—chome, Koishikawa, Bunkyo-ku, Tokyo, Japan
Octapeptid und Verfahren zu seiner Herstellung
Die Erfindung betrifft ein neues Octapeptid·und ein Verfahren
zu seiner Herstellung; sie betrifft insbesondere ein Verfahren zur Gewinnung eines neuen Octapeptids mit einer kontrahierenden
Wirkung auf einen Fundus-Streifen eines Rattenmagens und auf ein Meerschweinchenil'eum in vitro sowie einer
hypotensiven Wirkung auf Ratten aus der Haut eines afrikanischen Frosches.
Aus Fröschen wurden bereits in früheren Zeiten wertvolle chinesische
Arzneimittel, z.B. ein Krötengift "toad-cake" hergestellt. Aus Froschhäuten wurden bereits Steroidverbindungen,
Histaninverbindungen, Adrenalinverbindungen und Serotoninverbindungen
isoliert.
Kürzlich wurde gefunden, daß in Froschhäuten neben diesen Verbindungen noch Peptide mit verschiedenen biologischen und
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pharmakologischen Aktivitäten enthalten sind. Von derartigen
Peptiden sind nicht nur die Gruppe der Bradykinine und der Derivate davon, sondern auch Coerulein mit einer stark kontrahierenden
Wirkung auf die Gallenblase ("Arch. Biocheia. Biophys.", 125, 57 (1968)), Phyllomedisin mit einer hypotensiven
Wirkung ("Experientia", 26, 282 (197O)), Ranatensin
mit sowohl einer kontrahierenden Wirkung auf die glatte Muskulatur als auch einer hypertensiven Wirkung ("Fedr. Proc",
22, 282 (1970)) und Alytesin und Bombesin mit einer kontrahierenden
Wirkung auf die glatte Muskulatur und einer hypertensiven Wirkung ("Experiehtia", 2J£, 166 (1971)) bekannt.
Es wurde nun gefunden, daß aus der Haut des afrikanischen Frosches Xenopus laevis pipidae ein neues Peptid gewonnen
werden kann, das eine kontrahierende Wirkung auf einen Rattenmagenstreifen
und eine hypotensive Wirkung aufweist.
Das den Gegenstand der Erfindung bildende neue Octapeptid wird erhalten durch Extrahieren der Haut eines afrikanischen
Frosches (Xenopus laevis pipidae) mit einem niederen Alkohol, Entfernen des Lösungsmittels aus dem Extrakt und Durchführung
einer stark sauren Ionenaustauscherharzchromatographiebehandlung, einer stark basischen Ionenaustauscherharzchromatographiebehandlung,
einer Gelfiltration und einer Tropfchen-Gegenstromverteilungschromatographiebehandlung
mit dem Rückstand in beliebiger Reihenfolge.
Gegenstand der Erfindung ist ein Octapeptid, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß es aus den folgenden Aminosäuren besteht, die in der nachfolgend angegebenen Reihenfolge angeordnet sind:
Pyroglutaminsäure - Glycin - Lysin - Arginin - Prolin !Tryptophan - Isoleucin - Leucin.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung des Octapeptids der vorstehend angegebenen Zusammensetzung,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Alkohol-
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extrakt der Haut eines afrikanischen Frosches (Xenopus laevis
pipidae) herstellt, zur Gewinnung des extrahierten Produktes das Extraktionslösungsniittel entfernt und dann das extrahierte
Produkt zur Gewinnung des Octapeptids einer stark sauren Ipnenaustauscherharzchromatographiebehandlung,
einer stark basischen Ionenaustauscherharzchromatographiebehandlung, einer GeIfiltrations-
und einer Tröpfchen-Gegenstromverteilungschromatographiebehandlung unterwirft.' Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens wird die Haut des afrikanischen Frosches fein zerschnitten und dann mit einem niederen Alkohol
(ROH, worin R Alkyl mit 1 bis 4- Kohlenstoffatomen bedeutet) extrahiert. Bevorzugte niedere Alkohole sind Methanol, Äthanol,
Isopropanol und dgl. Vorzugsweise wird diesem niederen Alkohol eine sehr geringe Menge innerhalb des Bereiches von 0,01 bis
1 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des niederen Alkohols, einer wäßrigen Trichloressigsäurelösung zugegeben. Die Trichloressigsäure
inhibiert die Wirkungen von Enzymen und verhindert die Zersetzung de"s erfindungsgemäßen Peptidproduktes. Das Lösungsmittel
wird dann aus dem Extrakt entfernt und der Rückstand wird in beliebiger Reihenfolge den folgenden Behandlungen unterzogen:
(1) einer stark säuren Ionenaustauscherliarzchromatographie,
(2) einer stark basischen Ionenaustauscherharzchromatographie, (3) einer Gelfiltration und (4-) einer TrÖfchengegenstromverteilungschromatographie.
Auf diese Weise erhält man eine Fraktion mit einer kontrahierenden Wirkung auf einen Rattenmagenstreifen
und einer hypotensiven Wirkung auf Ratten. Eine oder mehrere der vorstehend angegebenen Behandlungen (1) bis
(4) können, je nach Erfordernis, mehrere Male wiederholt v/erden.
Die Reihenfolge dieser vier Behandlungen ist nicht kritisch. Sie können in verschiedener Reihenfolge durchgeführt werden,
wobei stets zufriedenstellende Ergebnisse erhalten werden.
Als stark saures Ionenaustauscherhars können z.B. SE-Sephadex
(Handelsname für ein Produkt der Firma Pharmacia Co.), SP-Gephadex
(Handelsname für ein Produkt der Firma Pharmacia Co.),
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— if _
Dowex 50W (Handelsname für ein Produkt der Firma Dow Chemical
Co.), Amberlite GG-120 (Handelsname für ein Produkt der Firma Rohm & Haas Co.) und dgl. verwendet v/erden. Als
stark basisches Ionenaustauscherharz können z.B. QAE-Sephadex (Handelsname für ein Produkt der Firma Pharmacia Co.),
Dowex 1 oder 2 (Handelsname für ein Produkt der Firma Dow Chemical Co.), Amberlite CG 400 (Handelsname für ein Produkt
der Firma Rohm & Haas Co.) und dgl. verwendet werden. Als Gelfilter können z.B. Sephadex G-25 (Handelsname für ein
Produkt der Firma Pharmacia Co.), Bio-Gel P-A (Handelsname für ein Produkt der Firma Bio-Laboratories Co.) und dgl.
verwendet werden.
Ein Beispiel für eine geeignete Tröpfchengegenstromverteilungschromatographie
ist das folgende: Bei Verwendung einer aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser im Volumenverhältnis
von 4-:1:5 Teilen bestehenden Flüssigkeit wird als obere Schicht
eine stationäre flüssige Phase gebildet und die zu reinigende Substanz wird.im gelösten Zustand in die untere Schicht der
Säule eingeführt. Die dabei erhaltene Fraktion mit einer kontrahierenden Wirkung auf einen Rattenraagenstreifen wird in dem
erforderlichen Maße getrocknet. Auf diese Weise erhält man das erfindungsgemäße Peptidprodukt.
Durch Aminosäureanalyse des dabei erhaltenen Peptidproduktes
wurde bestätigt, daß das Peptidprodukt jeweils 1 Moläquivalent von Prolin, Glycin, Glutaminsäure, Lysin, Arginin, Isoleucin
und Leucin enthält. Tryptophan wurde auch durch die optische Dichte bei 280 mn bestimmt. Somit besteht das erfindungsgemäße
Peptidprodukt aus 8 Aminosäuren. Die Struktur des erfindungsgemäßen
Peptids wurde wie folgt analysiert:
Wenn das dimethylaiainonaphthalin-sulfonylierte (dansylierte)
Peptid (D-P) einem Chymotrypsin-Abbau unterworfen wird, entsteht
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ein dansyl-abgebautes Peptid (C-1). Wie die Aminosäureanalyse
zeigt, ist das C-1 aus Lysin (1), Arginin (1), Glutaminsäure (1), Prolin (1), Glycin (1) und Tryptophan (1) aufgebaut.
Daraus geht im Hinblick auf die Substratspezifität von
Chymotrypsin hervor, daß die C-endständige Aminosäure von C-1 aus Tryptophan besteht.
£2) Trjps_in-Spaltung_
Wenn D-P der Einwirkung von Trypsin ausgesetzt wird, entsteht ein dansyl-abgebautes Peptid (T-1). Wie die Aminosäüreanalyse
zeigt, ist T-1 aus Lysin (1), Arginin (1), Glycin (1) und Glutaminsäure (1) aufgebaut. Im Hinblick auf die Substratspezifität
von Trypsin ergibt sich somit, daß die C-endständige Aminosäure von T-1 aus Arginin besteht.
Wenn D-P der Einwirkung von Papain ausgesetzt wird, entsteht ein dansyl-abgebautes Peptid (P-1). Wie die Aminosäureanalyse
zeigt, ist P-1 aus Lysin (1), Glutaminsäure (1) und Glycin (1) aufgebaut.
C-1 wird durch Carboxypeptidase A zersetzt und die dabei erhaltene
Reaktionsflüssigkeit wird unter Verwendung eines Aminosäureanalysators
direkt analysiert. Dabei ist nur die Anwesenheit von Tryptophan festzustellen. Die restliche Reaktionsflüssigkeit
wird der Einwirkung von Carboxypeptidase B ausgesetzt und mit einem Aminosäureanalysator wird die Reaktionsflüssigkeit
direkt analysiert. Dabei zeigt sich, daß eine andere Aminosäure außer Tryptophan nicht freigesetzt worden ist. Aus den obigen
Ergebnissen ergibt sich unter Berücksichtigung der Aminosäurezusammensetzungen von T-1 und P-1, daß es sich bei der vorletzten
Aminosäure, die vor dem Tryptophan angeordnet ist, um Prolin handelt.
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Das Peptid wird einer Birch-Reduktion unterworfen und die
dabei erhaltene Reaktionsflüssigkeit wird einer Aminosäureanalyse
unterzogen. Dabei zeigt sich, daß das Arginin drastisch reduziert worden ist. Daraus ergibt sich, daß es sich bei der
vor Prolin angeordneten Aminosäure um Arginin handelt.
Wenn die vorstehend beschriebenen Ergebnisse (1) bis (5) gemeinsam
betrachtet werden, so ist daraus zu ersehen, daß das Peptid eine Aminosäureanordnung (Lysin - Glycin - Glutaminsäure) Arginin
- Prolin - Tryptophan - (Isoleucin - Leucin) aufweist. Bezüglich der in Klammern angegebenen Teile sei bemerkt, daß
aus den obigen Ergebnissen die Aminosäureanordnung nicht entnommen werden kann.
D-P wird mit Chymotrypsin digeriert und dansyliert zur Abtrennung von dansyliertem (Isoleucin-Leucin) (C-2). Dann wird das
C-2 hydrolysiert. Dabei zeigt sich, daß dansyliertes Isoleucin vorhanden ist. Das Peptid wird außerdem der Einwirkung von
Carboxypeptidase A ausgesetzt und die Reaktionsflüssigkeit
wird mit einem Aminosäureanalysator direkt analysiert. Dabei wird Leucin und nur eine sehr geringe Menge Isoleucin nachgewiesen.
Aus diesem Ergebnis ist zu ersehen, daß die Reihenfolge von C-2 folgende ist: Isoleucin - Leucin (freie Form).
D-P wird 16 Stunden lang mit 6 η Chlorwasserstoff säure bei 1000C hydrolysiert und die dansylierte Aminosäure wird bestimmt
und dabei zeigt sich, daß es sich bei der dansylierten Aminosäure um ε-dansyliertes Lysin handelt· Daraus ist zu ersehen,
daß die N-Stelle blockiert ist. D-P wird in 1 η Natriumhydroxyd
hydrolysiert und 75 Stunden lang bei 27°C stehen-
.4.09809/12,-1 2
gelassen. Dann wird es mit Essigsäure neutralisiert, dansyliert und mit Chlorwasserstoffsäure hydrolysiert» Die Identifizierung
der dansylierten Aminosäure ergibt, daß zusätzlich zu 6-dansyliertem
Lysin noch dansylierte Glutaminsäure vorhanden ist. Daraus ist zu ersehen, daß die N-endständige Aminosäure aus
Pyroglutaminsäure besteht.
P-1 weist die folgende Aminosäureanordnung auf: Pyroglutaminsäure
- (Lysin-Glycin). Die C-endständige Aminosäure von P-1 wird bestimmt nach dem Tritium-Markierungsverfahren ("Biochemi
cal and Biophysical Research Communication", 4£, 1334 (1971)).
Dadurch wird bestätigt, daß die C-endständige Aminosäure aus Lysin besteht. Damit ergibt sich für P-I die folgende Aminosäure
anordnung: Pyroglutaminsäure - Glycin - Lysin.
Aus den vorstehenden Ergebnissen geht hervor, daß das erfindungsgemäße
Peptid die folgende Struktur aufweist: Pyroglutaminsäure - Glycin - Lysin - Arginin - Prolin Tryptophan
- Isoleucin - Leucin.
Die folgende Figur zeigt die Angriffszentreh jedes Enzyms an
dem dansylierten Peptid bei dem oben erwähnten Verfahren zur Strukturbestimmung.
PyrGlu.GIy.Lys.Arg.Pro.Trp,Heu Leu-OH
< p-i4 · ;
C- 1 —»!«- C - 2
*Carboxypeptidase A
Das erfindungsgevnäße Peptid v/eist im Tierversuch die folgenden
phariaakologischen Aktivitäten auf:
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(1) eine kontrahierende Wirkung auf einen Eattenmagenstreifen
(gemessen nach der Methode von Magnus): Sehwellenwerts-Dosis =0,1 ng/ml
Dosenansprecheinpfindlichkeit: positiv
Dosenansprecheinpfindlichkeit: positiv
(2) kontrahierende Wirkung auf ein Meerschweinchenileum (ge-"
messen nach der Methode von Magnus): Schwellenwerts-Dosis =10 ng/ml
Dosenansprechempfindlichkeit: negativ (eines wurde relaxiert
und dann kontrahiert)
(3) hypertensive Wirkung auf Ratten
Schwellenwerts-Dosis = 1,2 lxg/kg
lachyphylaxie: positiv
Schwellenwerts-Dosis = 1,2 lxg/kg
lachyphylaxie: positiv
Daraus ist zu ersehen, daß das erfindungsgemäße Peptid eine wertvolle Substanz darstellt, die hypotensive und gastrointestinal
-bewegungsfordernde Eigenschaften aufweist. Außerdem
hat das erfindungsgemäße Peptid die folgenden physikalischen Eigenschaften:
Rf~Werte des dansylierten Peptids bei der Dünnschichtchromatographie
auf Silikagel:
Rf*: 0,37 (Lösungsmittelsystem: Methylac et at/ Isopropano l/Ammoniak
(9/7A))
R^: 0,27 (Lösungsmittelsystem: n-Butanol/Essigsäure/Wasser (4/1/5) ).
R^: 0,27 (Lösungsmittelsystem: n-Butanol/Essigsäure/Wasser (4/1/5) ).
Die Erfindung wird nachfolgend an Hand eines Beispiels näher erläutert,
ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. In diesem Beispiel ist unter dem Ausdruck "aktive Fraktion" eine Fraktion
mit einer kontrahierenden Wirkung auf einen Rattenmagenstreifen zu verstehen.
2 1 Methanol, das 5 Vol.-% einer 6 gew.-zeigen wäßrigen Trichlor-
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essigsäurelösung enthielt, wurden zu frischen Häuten von 30 afrikanischen Fröschen zugegeben und die Häute wurden
eine Woche lang in einen Kühlschrank bei etwa -200C stehengelassen.
Der dabei erhaltene Extrakt wurde von dem festen Rückstand abgetrennt und dann wurde der Extrakt unter vermindertem
Druck eingeengt und getrocknet unter Bildung von Feststoffen (1,2 g).
Eine Säule mit einem Innendurchmesser von 3 cm und einer Länge von 60 cm wurde mit SE-Sephadex C-25 gefüllt, das mit 0,1 M
AmmoniumfOT'miat (pH 7»5) gut gepuffert war. Die Feststoffe
wurden in 20 ml einer 0,001 η Ameisensäure gelöst und die Lösung wurde in die Säule gegossen. Die Gradientenelution wurde
unter Verwendung von 2 1 Wasser und 2 1 0,5 M Ammoniumformiat
(pH 6,5) mit einer Elutionsgeschwindigkeit von 60 ml/Std. und
bei einem Einheitsfraktionsvolumen von I5 ml durchgeführt.
Die aktiven Fraktionen (die 75· bis 90. Fraktion) wurden gesammelt
und lyophilisiert.
Eine zweite Säule mit einem Innendurchmesser von 4,5 cm und
einer Länge von 50 cm wurde mit Sephadex G-25, das mit 0,1 η
Essigsäure gut gepuffert war, gefüllt. Das lyophilisierte
Produkt wurde in 5 ml 0,1 η Essigsäure gelöst und die Lösung wurde in die Säule gegossen. Die Entwicklungselution wurde
unter- Verwendung des gleichen Lösungsmittels mit einer Elutionsgeschwindigkeit
von 20 ml/Std. und bei einem Einheitsfraktionsyolumen
von 3 ml durchgeführt. Die aktiven Fraktionen (die
bis 55. Fraktion) wurden gesammelt und lyophilisiert. Dieses lyophilisierte Produkt wurde in 1 ml 0,001 η wäßrigem Ammoniak
gelöst und die Lösung wurde in eine dritte Säule mit einem Durchmesser von 0,9 cm und einer Länge von 50 cm eingeführt,
die mit QAE-Sephadex (A-25), das mit 0,001 η wäßrigem Ammoniak
ausreichend gepuffert war, gefüllt war. Die Entwicklungselution
wurde unter Verwendung von 0,001 η wäßrigem Ammoniak mit einer
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Elutionsgeschwindigkeit von 12 ml/ßtd. und einem Einheitsfraktionsvo
lumen von 3 ml durchgeführt. Die aktiven Fraktionen
(die 8. bis 15. Fraktion) wurden gesammelt und lyophilisiert.
Das lyophilisierte Produkt wurde durch Tröpfchengegenstrom--Verteilungschromatographie
gereinigt unter Verwendung einer Säule mit einer Innenkapazität von 240 ml. Als stationäre
Phase wurde eine obere Schicht aus einer Flüssigkeit aus n-Butanol/Essigsäure/Wasser
(4/1/5) verwendet und das lyophilisierte Produkt wurde in der Wasserschicht als der unteren
Schicht gelöst. Die dabei erhaltene wäßrige Lösung wurde zu der stationären Phase zugetropft und die Elution wurde mit
einer Elutionsgeschwindigkeit von 3 ml/Std. und bei einem Einheitsfraktionsvolumen von 3 ml durchgeführt. Es wurden die
aktiven Fraktionen (die 48. bis 100. Fraktion) gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt und unter Bildung von
Feststoffen getrocknet. Die Feststoffe wurden in 0,5 ml
einer 0,001 η Ameisensäure gelöst und die Lösung wurde in eine Säule mit einem Durchmesser von 0,9 cm und einer Länge
von 30 cm gegeben, die mit SE-Sephadex C-25 gefüllt war,
das mit einer 0,1 M Ammoniumformiatflüssigkeit (pH 6,5) ausreichend
gepuffert war. Die Entwicklungselution wurde bei einer Elutionsgeschwindigkeit von 15 ml/Std. und mit einem
Einheitsfraktionsvo lumen von 3 ml unter Verwendung von 0,05 M
Ammoniumformiat (pH 6,5) durchgeführt. Die aktiven Fraktionen
(die 47. bis 63. Fraktion) wurden gesammelt und lyophilisiert, wobei man 750 iig eines weißen pulverförmigen Peptids erhielt.
Dieses Peptid wurde aimethylaminonaphthalin-sulfonyliert (dansyliert)
und unter Verwendung von zwei Arten von Entwicklungslösungsmitteln, nämlich einer Flüssigkeit aus Butanol/Essigsäure/Wasser
(4/1/5) und einer Flüssigkeit aus Methylacetat/ Isopropanol/Ammoniak (9/7/4/) einer Silikagel-Dünnschichtchromatographie
unterworfen. Diese bestätigte, daß es sich bei dem erhaltenen Peptid um eine einzige Substanz handelte.
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Die Erfindung wurde zwar vorstehend unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen näher erläutert, es ist jedoch
für den Fachmann klar, daß diese in vielerlei Hinsicht abgeändert und modifiziert werden können, ohne daß dadurch der
Rahmen der vorliegenden Erfindung verlassen wird.
Patentansprüche:
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Claims (2)
- Patentansprüche/Η Octapeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es aus den folgenden Aminosäuren besteht, die in der nachfolgend angegebenen !Reihenfolge angeordnet sind:Pyroglutaminsäure - Glycin - Lysin - Arginin _ Prolin Tryptophan - Isoleucin - Leucin.
- 2. Verfahren zur Herstellung des Octapeptids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Alkoholextrakt der Haut eines afrikanischen 3?rosches (Xenopus laevis pipidae) herstellt, zur Gewinnung des extrahierten Produktes das Extraktionslösungsiiiittel entfernt und dann das extrahierte Produkt zwc Gewinnung des Octapeptids einer stark sauren lonenaustauscherharzchroraatographiebehandlung, einer stark basischen IonenaustauscherharzchroEiatographiebehandlung, einer GeIfiltrations- und einer Tropfchen-Gogenstromverteilungöchroraatographiebehandlung unterwirft.409809/ 1212
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US5643876A (en) * | 1987-03-04 | 1997-07-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Biologically active synthetic magainin peptides |
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Non-Patent Citations (1)
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