DE2341798A1

DE2341798A1 - Octapeptid und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2341798A1
Application number: DE19732341798
Authority: DE
Inventors: Kengo Araki; Shinro Tachibana
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 1972-08-18
Filing date: 1973-08-17
Publication date: 1974-02-28
Also published as: FR2196148B1; GB1438008A; DE2341798C2; FR2196148A1; JPS4936815A; US3883499A

Description

Eisai Co·, Ltd.

6-10, 4—chome, Koishikawa, Bunkyo-ku, Tokyo, Japan

Octapeptid und Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung betrifft ein neues Octapeptid·und ein Verfahren zu seiner Herstellung; sie betrifft insbesondere ein Verfahren zur Gewinnung eines neuen Octapeptids mit einer kontrahierenden Wirkung auf einen Fundus-Streifen eines Rattenmagens und auf ein Meerschweinchenil'eum in vitro sowie einer hypotensiven Wirkung auf Ratten aus der Haut eines afrikanischen Frosches.

Aus Fröschen wurden bereits in früheren Zeiten wertvolle chinesische Arzneimittel, z.B. ein Krötengift "toad-cake" hergestellt. Aus Froschhäuten wurden bereits Steroidverbindungen, Histaninverbindungen, Adrenalinverbindungen und Serotoninverbindungen isoliert.

Kürzlich wurde gefunden, daß in Froschhäuten neben diesen Verbindungen noch Peptide mit verschiedenen biologischen und

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pharmakologischen Aktivitäten enthalten sind. Von derartigen Peptiden sind nicht nur die Gruppe der Bradykinine und der Derivate davon, sondern auch Coerulein mit einer stark kontrahierenden Wirkung auf die Gallenblase ("Arch. Biocheia. Biophys.", 125, 57 (1968)), Phyllomedisin mit einer hypotensiven Wirkung ("Experientia", 26, 282 (197O)), Ranatensin mit sowohl einer kontrahierenden Wirkung auf die glatte Muskulatur als auch einer hypertensiven Wirkung ("Fedr. Proc", 22, 282 (1970)) und Alytesin und Bombesin mit einer kontrahierenden Wirkung auf die glatte Muskulatur und einer hypertensiven Wirkung ("Experiehtia", 2J£, 166 (1971)) bekannt.

Es wurde nun gefunden, daß aus der Haut des afrikanischen Frosches Xenopus laevis pipidae ein neues Peptid gewonnen werden kann, das eine kontrahierende Wirkung auf einen Rattenmagenstreifen und eine hypotensive Wirkung aufweist.

Das den Gegenstand der Erfindung bildende neue Octapeptid wird erhalten durch Extrahieren der Haut eines afrikanischen Frosches (Xenopus laevis pipidae) mit einem niederen Alkohol, Entfernen des Lösungsmittels aus dem Extrakt und Durchführung einer stark sauren Ionenaustauscherharzchromatographiebehandlung, einer stark basischen Ionenaustauscherharzchromatographiebehandlung, einer Gelfiltration und einer Tropfchen-Gegenstromverteilungschromatographiebehandlung mit dem Rückstand in beliebiger Reihenfolge.

Gegenstand der Erfindung ist ein Octapeptid, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es aus den folgenden Aminosäuren besteht, die in der nachfolgend angegebenen Reihenfolge angeordnet sind: Pyroglutaminsäure - Glycin - Lysin - Arginin - Prolin !Tryptophan - Isoleucin - Leucin.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung des Octapeptids der vorstehend angegebenen Zusammensetzung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Alkohol-

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extrakt der Haut eines afrikanischen Frosches (Xenopus laevis pipidae) herstellt, zur Gewinnung des extrahierten Produktes das Extraktionslösungsniittel entfernt und dann das extrahierte Produkt zur Gewinnung des Octapeptids einer stark sauren Ipnenaustauscherharzchromatographiebehandlung, einer stark basischen Ionenaustauscherharzchromatographiebehandlung, einer GeIfiltrations- und einer Tröpfchen-Gegenstromverteilungschromatographiebehandlung unterwirft.' Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Haut des afrikanischen Frosches fein zerschnitten und dann mit einem niederen Alkohol (ROH, worin R Alkyl mit 1 bis 4- Kohlenstoffatomen bedeutet) extrahiert. Bevorzugte niedere Alkohole sind Methanol, Äthanol, Isopropanol und dgl. Vorzugsweise wird diesem niederen Alkohol eine sehr geringe Menge innerhalb des Bereiches von 0,01 bis 1 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des niederen Alkohols, einer wäßrigen Trichloressigsäurelösung zugegeben. Die Trichloressigsäure inhibiert die Wirkungen von Enzymen und verhindert die Zersetzung de"s erfindungsgemäßen Peptidproduktes. Das Lösungsmittel wird dann aus dem Extrakt entfernt und der Rückstand wird in beliebiger Reihenfolge den folgenden Behandlungen unterzogen: (1) einer stark säuren Ionenaustauscherliarzchromatographie, (2) einer stark basischen Ionenaustauscherharzchromatographie, (3) einer Gelfiltration und (4-) einer TrÖfchengegenstromverteilungschromatographie. Auf diese Weise erhält man eine Fraktion mit einer kontrahierenden Wirkung auf einen Rattenmagenstreifen und einer hypotensiven Wirkung auf Ratten. Eine oder mehrere der vorstehend angegebenen Behandlungen (1) bis (4) können, je nach Erfordernis, mehrere Male wiederholt v/erden. Die Reihenfolge dieser vier Behandlungen ist nicht kritisch. Sie können in verschiedener Reihenfolge durchgeführt werden, wobei stets zufriedenstellende Ergebnisse erhalten werden.

Als stark saures Ionenaustauscherhars können z.B. SE-Sephadex (Handelsname für ein Produkt der Firma Pharmacia Co.), SP-Gephadex (Handelsname für ein Produkt der Firma Pharmacia Co.),

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— if _

Dowex 50W (Handelsname für ein Produkt der Firma Dow Chemical Co.), Amberlite GG-120 (Handelsname für ein Produkt der Firma Rohm & Haas Co.) und dgl. verwendet v/erden. Als stark basisches Ionenaustauscherharz können z.B. QAE-Sephadex (Handelsname für ein Produkt der Firma Pharmacia Co.), Dowex 1 oder 2 (Handelsname für ein Produkt der Firma Dow Chemical Co.), Amberlite CG 400 (Handelsname für ein Produkt der Firma Rohm & Haas Co.) und dgl. verwendet werden. Als Gelfilter können z.B. Sephadex G-25 (Handelsname für ein Produkt der Firma Pharmacia Co.), Bio-Gel P-A (Handelsname für ein Produkt der Firma Bio-Laboratories Co.) und dgl. verwendet werden.

Ein Beispiel für eine geeignete Tröpfchengegenstromverteilungschromatographie ist das folgende: Bei Verwendung einer aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser im Volumenverhältnis von 4-:1:5 Teilen bestehenden Flüssigkeit wird als obere Schicht eine stationäre flüssige Phase gebildet und die zu reinigende Substanz wird.im gelösten Zustand in die untere Schicht der Säule eingeführt. Die dabei erhaltene Fraktion mit einer kontrahierenden Wirkung auf einen Rattenraagenstreifen wird in dem erforderlichen Maße getrocknet. Auf diese Weise erhält man das erfindungsgemäße Peptidprodukt.

Durch Aminosäureanalyse des dabei erhaltenen Peptidproduktes wurde bestätigt, daß das Peptidprodukt jeweils 1 Moläquivalent von Prolin, Glycin, Glutaminsäure, Lysin, Arginin, Isoleucin und Leucin enthält. Tryptophan wurde auch durch die optische Dichte bei 280 mn bestimmt. Somit besteht das erfindungsgemäße Peptidprodukt aus 8 Aminosäuren. Die Struktur des erfindungsgemäßen Peptids wurde wie folgt analysiert:

Wenn das dimethylaiainonaphthalin-sulfonylierte (dansylierte) Peptid (D-P) einem Chymotrypsin-Abbau unterworfen wird, entsteht

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ein dansyl-abgebautes Peptid (C-1). Wie die Aminosäureanalyse zeigt, ist das C-1 aus Lysin (1), Arginin (1), Glutaminsäure (1), Prolin (1), Glycin (1) und Tryptophan (1) aufgebaut. Daraus geht im Hinblick auf die Substratspezifität von Chymotrypsin hervor, daß die C-endständige Aminosäure von C-1 aus Tryptophan besteht.

£2) Trjps_in-Spaltung_

Wenn D-P der Einwirkung von Trypsin ausgesetzt wird, entsteht ein dansyl-abgebautes Peptid (T-1). Wie die Aminosäüreanalyse zeigt, ist T-1 aus Lysin (1), Arginin (1), Glycin (1) und Glutaminsäure (1) aufgebaut. Im Hinblick auf die Substratspezifität von Trypsin ergibt sich somit, daß die C-endständige Aminosäure von T-1 aus Arginin besteht.

Wenn D-P der Einwirkung von Papain ausgesetzt wird, entsteht ein dansyl-abgebautes Peptid (P-1). Wie die Aminosäureanalyse zeigt, ist P-1 aus Lysin (1), Glutaminsäure (1) und Glycin (1) aufgebaut.

C-1 wird durch Carboxypeptidase A zersetzt und die dabei erhaltene Reaktionsflüssigkeit wird unter Verwendung eines Aminosäureanalysators direkt analysiert. Dabei ist nur die Anwesenheit von Tryptophan festzustellen. Die restliche Reaktionsflüssigkeit wird der Einwirkung von Carboxypeptidase B ausgesetzt und mit einem Aminosäureanalysator wird die Reaktionsflüssigkeit direkt analysiert. Dabei zeigt sich, daß eine andere Aminosäure außer Tryptophan nicht freigesetzt worden ist. Aus den obigen Ergebnissen ergibt sich unter Berücksichtigung der Aminosäurezusammensetzungen von T-1 und P-1, daß es sich bei der vorletzten Aminosäure, die vor dem Tryptophan angeordnet ist, um Prolin handelt.

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Das Peptid wird einer Birch-Reduktion unterworfen und die dabei erhaltene Reaktionsflüssigkeit wird einer Aminosäureanalyse unterzogen. Dabei zeigt sich, daß das Arginin drastisch reduziert worden ist. Daraus ergibt sich, daß es sich bei der vor Prolin angeordneten Aminosäure um Arginin handelt.

Wenn die vorstehend beschriebenen Ergebnisse (1) bis (5) gemeinsam betrachtet werden, so ist daraus zu ersehen, daß das Peptid eine Aminosäureanordnung (Lysin - Glycin - Glutaminsäure) Arginin - Prolin - Tryptophan - (Isoleucin - Leucin) aufweist. Bezüglich der in Klammern angegebenen Teile sei bemerkt, daß aus den obigen Ergebnissen die Aminosäureanordnung nicht entnommen werden kann.

D-P wird mit Chymotrypsin digeriert und dansyliert zur Abtrennung von dansyliertem (Isoleucin-Leucin) (C-2). Dann wird das C-2 hydrolysiert. Dabei zeigt sich, daß dansyliertes Isoleucin vorhanden ist. Das Peptid wird außerdem der Einwirkung von Carboxypeptidase A ausgesetzt und die Reaktionsflüssigkeit wird mit einem Aminosäureanalysator direkt analysiert. Dabei wird Leucin und nur eine sehr geringe Menge Isoleucin nachgewiesen. Aus diesem Ergebnis ist zu ersehen, daß die Reihenfolge von C-2 folgende ist: Isoleucin - Leucin (freie Form).

D-P wird 16 Stunden lang mit 6 η Chlorwasserstoff säure bei 100⁰C hydrolysiert und die dansylierte Aminosäure wird bestimmt und dabei zeigt sich, daß es sich bei der dansylierten Aminosäure um ε-dansyliertes Lysin handelt· Daraus ist zu ersehen, daß die N-Stelle blockiert ist. D-P wird in 1 η Natriumhydroxyd hydrolysiert und 75 Stunden lang bei 27°C stehen-

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gelassen. Dann wird es mit Essigsäure neutralisiert, dansyliert und mit Chlorwasserstoffsäure hydrolysiert» Die Identifizierung der dansylierten Aminosäure ergibt, daß zusätzlich zu 6-dansyliertem Lysin noch dansylierte Glutaminsäure vorhanden ist. Daraus ist zu ersehen, daß die N-endständige Aminosäure aus Pyroglutaminsäure besteht.

P-1 weist die folgende Aminosäureanordnung auf: Pyroglutaminsäure - (Lysin-Glycin). Die C-endständige Aminosäure von P-1 wird bestimmt nach dem Tritium-Markierungsverfahren ("Biochemi cal and Biophysical Research Communication", 4£, 1334 (1971)). Dadurch wird bestätigt, daß die C-endständige Aminosäure aus Lysin besteht. Damit ergibt sich für P-I die folgende Aminosäure anordnung: Pyroglutaminsäure - Glycin - Lysin.

Aus den vorstehenden Ergebnissen geht hervor, daß das erfindungsgemäße Peptid die folgende Struktur aufweist: Pyroglutaminsäure - Glycin - Lysin - Arginin - Prolin Tryptophan - Isoleucin - Leucin.

Die folgende Figur zeigt die Angriffszentreh jedes Enzyms an dem dansylierten Peptid bei dem oben erwähnten Verfahren zur Strukturbestimmung.

PyrGlu.GIy.Lys.Arg.Pro.Trp,Heu Leu-OH

< p-i4 · ;

C- 1 —»!«- C - 2

*Carboxypeptidase A

Das erfindungsgevnäße Peptid v/eist im Tierversuch die folgenden phariaakologischen Aktivitäten auf:

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(1) eine kontrahierende Wirkung auf einen Eattenmagenstreifen (gemessen nach der Methode von Magnus): Sehwellenwerts-Dosis =0,1 ng/ml
Dosenansprecheinpfindlichkeit: positiv

(2) kontrahierende Wirkung auf ein Meerschweinchenileum (ge-" messen nach der Methode von Magnus): Schwellenwerts-Dosis =10 ng/ml

Dosenansprechempfindlichkeit: negativ (eines wurde relaxiert und dann kontrahiert)

(3) hypertensive Wirkung auf Ratten
Schwellenwerts-Dosis = 1,2 lxg/kg
lachyphylaxie: positiv

Daraus ist zu ersehen, daß das erfindungsgemäße Peptid eine wertvolle Substanz darstellt, die hypotensive und gastrointestinal -bewegungsfordernde Eigenschaften aufweist. Außerdem hat das erfindungsgemäße Peptid die folgenden physikalischen Eigenschaften:

R_f~Werte des dansylierten Peptids bei der Dünnschichtchromatographie auf Silikagel:

Rf*: 0,37 (Lösungsmittelsystem: Methylac et at/ Isopropano l/Ammoniak (9/7A))
R^: 0,27 (Lösungsmittelsystem: n-Butanol/Essigsäure/Wasser (4/1/5) ).

Die Erfindung wird nachfolgend an Hand eines Beispiels näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. In diesem Beispiel ist unter dem Ausdruck "aktive Fraktion" eine Fraktion mit einer kontrahierenden Wirkung auf einen Rattenmagenstreifen zu verstehen.

Beispiel

2 1 Methanol, das 5 Vol.-% einer 6 gew.-zeigen wäßrigen Trichlor-

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essigsäurelösung enthielt, wurden zu frischen Häuten von 30 afrikanischen Fröschen zugegeben und die Häute wurden eine Woche lang in einen Kühlschrank bei etwa -20⁰C stehengelassen. Der dabei erhaltene Extrakt wurde von dem festen Rückstand abgetrennt und dann wurde der Extrakt unter vermindertem Druck eingeengt und getrocknet unter Bildung von Feststoffen (1,2 g).

Eine Säule mit einem Innendurchmesser von 3 cm und einer Länge von 60 cm wurde mit SE-Sephadex C-25 gefüllt, das mit 0,1 M AmmoniumfOT'miat (pH 7»5) gut gepuffert war. Die Feststoffe wurden in 20 ml einer 0,001 η Ameisensäure gelöst und die Lösung wurde in die Säule gegossen. Die Gradientenelution wurde unter Verwendung von 2 1 Wasser und 2 1 0,5 M Ammoniumformiat (pH 6,5) mit einer Elutionsgeschwindigkeit von 60 ml/Std. und bei einem Einheitsfraktionsvolumen von I5 ml durchgeführt. Die aktiven Fraktionen (die 75· bis 90. Fraktion) wurden gesammelt und lyophilisiert.

Eine zweite Säule mit einem Innendurchmesser von 4,5 cm und einer Länge von 50 cm wurde mit Sephadex G-25, das mit 0,1 η Essigsäure gut gepuffert war, gefüllt. Das lyophilisierte Produkt wurde in 5 ml 0,1 η Essigsäure gelöst und die Lösung wurde in die Säule gegossen. Die Entwicklungselution wurde unter- Verwendung des gleichen Lösungsmittels mit einer Elutionsgeschwindigkeit von 20 ml/Std. und bei einem Einheitsfraktionsyolumen von 3 ml durchgeführt. Die aktiven Fraktionen (die bis 55. Fraktion) wurden gesammelt und lyophilisiert. Dieses lyophilisierte Produkt wurde in 1 ml 0,001 η wäßrigem Ammoniak gelöst und die Lösung wurde in eine dritte Säule mit einem Durchmesser von 0,9 cm und einer Länge von 50 cm eingeführt, die mit QAE-Sephadex (A-25), das mit 0,001 η wäßrigem Ammoniak ausreichend gepuffert war, gefüllt war. Die Entwicklungselution wurde unter Verwendung von 0,001 η wäßrigem Ammoniak mit einer

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Elutionsgeschwindigkeit von 12 ml/ßtd. und einem Einheitsfraktionsvo lumen von 3 ml durchgeführt. Die aktiven Fraktionen (die 8. bis 15. Fraktion) wurden gesammelt und lyophilisiert.

Das lyophilisierte Produkt wurde durch Tröpfchengegenstrom--Verteilungschromatographie gereinigt unter Verwendung einer Säule mit einer Innenkapazität von 240 ml. Als stationäre Phase wurde eine obere Schicht aus einer Flüssigkeit aus n-Butanol/Essigsäure/Wasser (4/1/5) verwendet und das lyophilisierte Produkt wurde in der Wasserschicht als der unteren Schicht gelöst. Die dabei erhaltene wäßrige Lösung wurde zu der stationären Phase zugetropft und die Elution wurde mit einer Elutionsgeschwindigkeit von 3 ml/Std. und bei einem Einheitsfraktionsvolumen von 3 ml durchgeführt. Es wurden die aktiven Fraktionen (die 48. bis 100. Fraktion) gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt und unter Bildung von Feststoffen getrocknet. Die Feststoffe wurden in 0,5 ml einer 0,001 η Ameisensäure gelöst und die Lösung wurde in eine Säule mit einem Durchmesser von 0,9 cm und einer Länge von 30 cm gegeben, die mit SE-Sephadex C-25 gefüllt war, das mit einer 0,1 M Ammoniumformiatflüssigkeit (pH 6,5) ausreichend gepuffert war. Die Entwicklungselution wurde bei einer Elutionsgeschwindigkeit von 15 ml/Std. und mit einem Einheitsfraktionsvo lumen von 3 ml unter Verwendung von 0,05 M Ammoniumformiat (pH 6,5) durchgeführt. Die aktiven Fraktionen (die 47. bis 63. Fraktion) wurden gesammelt und lyophilisiert, wobei man 750 iig eines weißen pulverförmigen Peptids erhielt.

Dieses Peptid wurde aimethylaminonaphthalin-sulfonyliert (dansyliert) und unter Verwendung von zwei Arten von Entwicklungslösungsmitteln, nämlich einer Flüssigkeit aus Butanol/Essigsäure/Wasser (4/1/5) und einer Flüssigkeit aus Methylacetat/ Isopropanol/Ammoniak (9/7/4/) einer Silikagel-Dünnschichtchromatographie unterworfen. Diese bestätigte, daß es sich bei dem erhaltenen Peptid um eine einzige Substanz handelte.

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Die Erfindung wurde zwar vorstehend unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen näher erläutert, es ist jedoch für den Fachmann klar, daß diese in vielerlei Hinsicht abgeändert und modifiziert werden können, ohne daß dadurch der Rahmen der vorliegenden Erfindung verlassen wird.

Patentansprüche:

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Claims

Patentansprüche

/Η Octapeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es aus den folgenden Aminosäuren besteht, die in der nachfolgend angegebenen !Reihenfolge angeordnet sind:

Pyroglutaminsäure - Glycin - Lysin - Arginin _ Prolin Tryptophan - Isoleucin - Leucin.
2. Verfahren zur Herstellung des Octapeptids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Alkoholextrakt der Haut eines afrikanischen 3^?rosches (Xenopus laevis pipidae) herstellt, zur Gewinnung des extrahierten Produktes das Extraktionslösungsiiiittel entfernt und dann das extrahierte Produkt zwc Gewinnung des Octapeptids einer stark sauren lonenaustauscherharzchroraatographiebehandlung, einer stark basischen IonenaustauscherharzchroEiatographiebehandlung, einer GeIfiltrations- und einer Tropfchen-Gogenstromverteilungöchroraatographiebehandlung unterwirft.

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