DE2364883C2

DE2364883C2 - Des-Lys↑2↑↑9↑-Ala↑3↑↑0↑-Schweine- und -Rinderinsulin, Verfahren zu deren Herstellung und diese Insuline enthaltende injizierbare Präparate

Info

Publication number: DE2364883C2
Application number: DE2364883A
Authority: DE
Inventors: Harold Gregory; Peter Leslie Macclesfield Cheshire Walton
Original assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Current assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Priority date: 1972-12-28
Filing date: 1973-12-28
Publication date: 1984-07-19
Also published as: FR2212136A1; SE404600B; ATA1084473A; IL43751A; PL91158B1; ES421864A1; DE2364883A1; NL7317159A; CH599927A5; HU170437B; AU6297973A; US3903069A; JPS4994698A; CA1009974A; LU69075A1; IL43751A0; AU474971B2; AT348152B; FR2212136B1; IE38539B1

Description

mit folgenden Bedeutungen von R¹ und R²:

zu A) R'Threonyl.R-Isoleucyl. zu B) R'AIanyl.R-'Valyl.

2. Verfahren zur Herstellung der Insuline gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die aus ausgereiften Samenkörpern des Pilzes Armillaria mellea gewonnene AM-Protease in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert von 7 bis 9, einer Temperatur von 30 bis 50⁰C und einem Enzym/Substrat-Verhältnis von 1 :1000 bis 1 -.10 000 auf Schweine- oder Rinderinsulin einwirken läßt, wobei die Konzentration an Insulin in der Nähe seiner Löslichkeitsgrenze in wäßrigem Medium iiegt, und das jeweilige Des-Lys^-Ala^-Insulin gewinnt.

3. Injizierbares Präparat, dadurch gekennzeichnet, daß es Des-Lys-^-Ala^-Schweineinsulin oder Des-Lys^-Ala^-Rinderinsulin gemeinsam mit einem pharmazeutisch zulässigen Verdünnungsmittel oder Trägermittel enthält.

Es ist bekannt, daß die Verabfolgung von Insulin von sehr großer Bedeutung bei der Behandlung des Diabetes bei Menschen ist. Insulin wird gewöhnlich von Schweinen, das sogenannte »Schweineinsulin«, oder von Rindern, das sogenannte »Rinderinsulin«, gewonnen. Es ist weiterhin bekannt, daß bei der Verabfolgung von Schweinc- oder Rinderinsulin in der gewöhnlich verfügbaren Form häufig eine antigene Reaktion hervorgerufen wird. Bei Menschen kann diese antigene Reaktion bei einer längeren Vcrabfolgung dieses Medikaments zu einer Vergrößerung der täglichen Dosis führen, die für den Diabetespatienten erforderlich ist. um die Krankheit zu bekämpfen.

Es wurde nunmehr gefunden, daß modifizierte Schweine- und Rinderinsulin, wie sie im vorstehenden Patentanspruch 1 angegeben sind, hinsichtlich der Senkung des Blutzuckerspiegels ebenso wirksam sind wie natürliches Schweine- und Rinderinsulin, aber eine wesentlich geringere Bildung von Antikörpern hervorrufen, welche insulinähnliche Materialien bei der späteren Verabreichung binden.

Die erfindungsgemäßen modifizierten Insuline unterscheiden sich von den entsprechenden natürlichen Insulinen lediglich dadurch, daß in der B-Kette die C-terminalen Reste Lysyl und Alanyl fehlen, welche den 29. und 30. Rest der B-Kette von Schweine- bzw. Rinderinsulin bilden.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen modifizierten Insuline ergibt sich aus dem vorstehenden Patentanspruch 2.

Die beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete AM-Prolcase kann in der in der GB-PS 12 63 956 beschriebenen Weise gewonnen werden. Dieses Enzym kann auch etwas zweckmäßiger durch Abwandlung des in der GB-PS 12 63 956 beschriebenen Verfahrens in der Weise hergestellt werden, daß die Chromatographicstufe (IV) in zwei Stufen durchgeführt wird, indem zunächst das rohe Enzym bei einem pH-Wert von 4,5 auf Carboxymethylcellulose absorbiert und dann mit einem Puffer mit einem pH-Wert von 5,5 eluiert wird und hierauf das konzentrierte Eluat auf die in der Arbeitsstufc (IV) der genannten Patentschrift beschriebenen

60 Kolonne aufgegeben wird.

Die Behandlung des Schweine- oder Rihderinsulins mit der ΛΜ-1'rolcasc kann in einfacher Weise mit dem in dem wäßrigen Medium gelösten Enzym erfolgen. Sie kann aber auch mit dem an einem Trager gebundenen Enzym durchgeführt werden, der in dem wäßrigen Medium löslich sein kann oder auch nicht.

Die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Umsetzung zwischen dem als Ausgangsmaterial verwendeten

ti5 Insulin und dem Enzym hangt von dem En/ym/Subslrat-Verhältnis, dem pH-Wert und der Temperatur des Inkubationsmediums, der Konzentration des Insulins und der Inkubationszeit ab. Im allgemeinen wird naturgemäß die Zeit /um Abtrennen des Lysylalanins von dem als Ausgangsmatcrial verwendeten Insulin dadurch abgekürzt, daß entweder die Konzentration des Insulins oder das !-!nzym/Substral-Verhältnis vergrößert wird.

In ähnlicher Weise beeinflußt eine Veränderung des pH-Werts oder der Temperatur des Inkubationsmediums die Zeit, die erforderlich ist, das Lysyl-alanin abzutrennen. Das Fortschreiten der Reaktion kann dadurch verfolgt werden, daß Proben des Reaktionsmediums untersucht werden, und zwar entweder durch Elektrophorese bei einem pH-Wert von 2,1 oder durch Trennung in einem automatischen Aminosäureanalysator.

Es ist zweckmäßig, dem Inkubationsmedium Metailioncn zuzusetzen, beispielsweise Calcium oder Magnesium in Form ihrer Chloride mit einer Konzentration von 10-² bis 10—' molar.

Wie bereits erwähnt, kann die Reaktion unter Verwendung des an einen Träger, vorzugsweise kovalent. gebundenen Enzyms durchgeführt werden. Eine große Anzahl von Trägern und Bindungsmethoden sind möglich. Bezüglich Einzelheiten wird auf eine Arbeit von E Katchalski in »Biochemical Aspects of Reactions on Solid Supports«, herausgegeben von G. R. Stark, Academic Press 1971, verwiesen. Ein zweckmäßiges Verfahren zum Binden von AM-Protease an einen Träger besteht darin, daß man Agarosegelkügelchen mit Bromcyan aktiviert, und zwar mit oder ohne Einbau von Abstandsgruppen, die sich beispielsweise von Hexylamin oder Hexansäure ableiten, worauf man dann die aktivierte Agarose mit der AM-Proteasc reagieren läßt. Alternativ können die Agarosegelkügelchen unter Verwendung von 2,4-Dichlor-6-carboxymethyIamirio-s-triazin als Kupplungsmittel aktiviert werden. Eine andere brauchbare Alternative ist die Verwendung von Carboxymethylcellulosehydrazid.

Wenn die Umsetzung mit dem einfach im wäßrigen Medium aufgelösten Enzym durchgeführt wird, kann das gewünschte Des-Lys^-AIa^-Schweine- oder Rinderinsulin von den anderen Komponenten der Inkubationsmischung durch irgendeine der üblichen Arbeitsweisen zum Trennen von Polypeptiden abgetrennt werden, jedoch ist die Anwendung einer Molekularsiebtechnik besonders zweckmäßig. So kann das wäßrige Medium, das zurückbleibt, nachdem das gesamte Ausgangsinsulin abgebaut worden ist, durch eine Kolonne von vernetzten! Dextrangel oder einem Polyacrylamidgel filtriert werden, das sich zum Fraktionieren von Verbindungen mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 10 000 bei einem brauchbaren pH-Wert eignet, worauf die Kolonne mit einem Puffer eluiert wird, der aus Komponenten besteht, die beim Gefriertrocknen unter hohem Vakuum flüchtig sind, beispielsweise wäßrige Essigsäure. Ammoniumcarbonat oder Ammoniumacetat, um so das gewünschte Produkt zu erhallen, das durch Gefriertrocknung des Eluats isoliert wird.

Wenn die Umsetzung mit dem an einem Träger gebundenen Enzym durchgeführt wird, dann kann die Abtrennung des gewünschten Polypeptids vom Enzym durch Filtrieren in üblicher Weise durchgeführt werden, sofern der Träger unlöslich ist. Wenn der Träger in dem wäßrigen Medium löslich ist, dann kann ein Filter für Hochpolymere verwendet werden.

Wie bereits oben angegeben, besitzen die erfindungsgemäßen modifizierten Insuline die gleiche Wirkung wie natürliche Insuline, haben aber eine wesentlich geringere Bildung von Antikörpern zur Folge, welche bei der späteren Verabreichung Insulin binde-, als es bei den Ausgangsmaterialicn der Fall ist. Die Wirkung läßt sich nachweisen durch Messen der Srnkung des Blutzuckerspiegels, welche durch die erfindungsgemäßen Produkte bei Kaninchen hervorgerufen wird, bei:· ;ielsweise unter Anwendung der Arbeitstechnik, die in »United States Pharmacopeia«, Band 18, Seite 883, beschrieben ist.

Die Aktivität von Des-Lys^-AlaW-Sehweineinsulin und Des-Lys^-Ala^-Rindcrinsulin bei der Senkung des Blutzuckerspiegels wurde mil natürlichem Schweineinsulin und Rinderinsulin wie folgt verglichen:

1. 24 Kaninchen mit einem Gewicht von jeweils ungefähr 2 kg wurden in vier Gruppen von 6 'Kaninchen unterteilt. Die Tiere wurden vor der Versuchausführung 17 h fasten gelassen. Auch während der Versuchsperiode wurde ihnen keine Nahrung und kein Wasser gegeben. Es wurden vier Testlösungen wie folgt hergestellt:

WHO 4 th I NT Standard Insulin 40 ng/nil (S 1) und 80 μg/ml (S2)

Des-Lys-'^-Ala'"-Schweineinsulin 40 iig/mi (TI) und 80 μg/ml (T2)

Natürliches Schweineinsulin 40 ng/m!(Ul)und80 μg/ml(U2)

|e Kaninchen wurden 0,5 ml einer der Lösungen verwendet, so daß die Mengen der verabreichten Testverbindungen 20 μg bzw.40 μg waren.

Von der Ohrenvene eines jeden Kaninchens wurde eine Blutprobe entnommen, und jedem Kaninchen wurde dann subkutan 0,5 ml einer Testlösung verabreicht. 1 und 2 h na;hder Injektion wurden Blutproben entnommen, und alle Proben wurden auf Blutzucker untersucht. Der Versuch wurde an fünf anderen Tagen in Intervallen von fünf Tagen unter Verwendung der Testlösungcn wiederholt, wobei die folgende Sequenz für jede Gruppe von 6 Kaninchen verwendet wurde:

1 Ul Sl TI S2 T2 U2

2 U2 S2 Sl Tl UI T2 m>

3 TI U2 T2 Ul Si S2

4 S2 T2 U2 SI Tl Ul

5 T2 Tl Ul U2 S2 Sl
6 SI Ul S2 T2 U2 T!

j..: Die prozentuale Verringerung der Kon/.entni lion des Blutzuckers nach 1 h bzw. nach 2 h wurde bestimmt. Für

|j jede Testinjektion wurde dann die Summe aller Werte ermittelt, woraus die mittlere Summe für alle Injektionen H einer bestimmten Testlösung errechnet wurde. Ks wurden die folgenden Resultate erhalten:

WHO Standard

51 63 ± 4

52 94 ±4
Des-Lys^-AIa^-Schweineinsulin

T1 82 ± 4

T 2 93 + 5

Natürliches Schweineinsulin

UI 78 ± 5

U 2 103 ± 5

Die Resultate zeigen, daß Des-Lys^-Ala^-Schwcineinsulin praktisch die gleiche Insulinaktivität aufweist wie natürliches Schweineinsulin.
2. Es wurden zwei Kaninchen verwendet, an denen die folgenden Tcstlösungen verglichen wurden:

15 Kochsalzlösung

Des-Lys^-Ala³⁰· Rinderinsulin Natürliches Rinderinsulin

Die letzteren beiden Lösungen wurden bei einer Dosis von 80 μg je Kaninchen von 2 kg getestet. Die Konzentration des Blutzuckers wurde vor der Injektion der Testlösung und 30, 60 und 120 min nach der injektion bestimmt. Es wurden die folgenden Resultate erhalten:

Testlösung Konzentration des Blutzuckers in mg/100 ml

i.u den angegebenen Zeiten

0 30 60 120 min

76	96	99	82
65	30	35	32
70	34	28	29

Kochsalzlösung Des-Lys^-Ala^'-Rinderinsulin 30 Natürliches Rinderinsulin

Diese Resultate zeigen, daß Des-Lys^-Ala^'-Rinderinsulin eine ähnliche Insulinaktivität wie natürliches Rinderinsulin zeigt.

Die geringere Bildung von Antikörpern wird nachgewiesen durch ein Verfahren, wie es beispielsweise von Schlichtkrull et al. in »Diabetes«, Band 2I.Supplement 2, Seiten 649 bis 656(1972) beschrieben ist.

Die Immunisierungswirkung von Des· Lys-^-Ala '"-Schweineinsulin und von natürlichem Schweineinsulin wurde durch das folgende Verfahren verglichen:

Die Testverbindung wurde in einem 50 : 50-Gemisch aus vollständigem Freund-Adjuvant und Kochsalzlösung

aufgelöst, und 1,0 ml der Lösung, die 0,5 mg der Testverbindung enthielt, wurde durch intramuskuläre Injektion an ein Kaninchen verabreicht. Einen Moinat später wurde eine Serumprobe genommen, und mit)-125 markiertes Insulin wurde zugegeben. Die Probe wurde 16 h bei 4°C aufbewahrt, währenddessen das markierte Insulin an anwesende Antikörper gebunden wurde. Die Menge des markierten Insulins, das an das Serum gebunden worden war, wurde dadurch bestimmt, daß das ungebundene Insulin an Aktivkohle absorbiert wurde, die Aktivkohle abgetrennt wurde und die Radioaktivität der überstehenden Flüssigkeit gemessen wurde. Der Prozentsatz des an Serum gebundenen markierten Insulins, d. i. also ein Maß für die im ursprünglichen Serum anwesenden Antikörper, wurde dann errechnet. Es wurden die folgenden Resultate aus einem Durchschnitt von

8 Kaninchen erhalten:

Kochsalzlösung 4 ± 0,6

Natürliches Schweineinsulin 55 ± 6

⁵⁽¹ Des-Lys-^N-Ala^Jr Schweineinsulin 4 ± 0.4

Diese Resultate zeigen, daß Des-Lys^'-Ala^-Schweineinsulin eine geringere Erzeugung von Antikörpern zur Folge hat als natürliches Schwcineinsulin

Die neuen modifizierten Insuline werden für die Behandlung von Diabetes in im wesentlichen der gleichen Weise benutz?, wie es für Schweine- oder Rinderinsulin der Fall ist. So werden sie parenteral, gewöhnlich subcutan, verabfolgt, und zwar entweder als Lösung oder als Depolformulierungen. welche verschiedene Dauer der Wirksamkeit besitzen. Solche Formulierungen ermöglichen eine Wirksamkeitsdauer bis zu 24 Stunden. Die verabfolgten Dosen werden für die Erfordernisse der einzelnen Patienten ausgewählt. Sie können bis zu 200 Einheiten pro Tag betragen,
bo Demgemäß betrifft die Erfindung auch injizierbare Präparate gemäß dem obigen Patentanspruch 3.

Die Erfindung isl in den folgenden Beispielen näher erläutert. Die in den Beispielen genannten Stoffe Scphadex® und Sephamse* sind eingetragene Warenzeichen.

Beispiel 1

10 mg Schweineinsulin. das lOmal umkristallisicrt worden w;ii\ wurden in 1,0 ml 0,1 M Ammoniumbicarbonat aufgelöst, und die lösung wurde mit 50 ng AM-Proiensc 16 Stunden lang bei 37T inkubiert. Der oM-Wcrt

10 μΙ der Inkubationsmisehung wurden dann /weeks Bestimmung der N-endständigen Aminosäuren analysiert, und zwar durch die bekannte Dansylieningstechnik unter Verwendung von I-Dimethyluminonaphthalin-5-sulfonylchlorid (Hartley, Biochcm. ). 1470, 119,805). Ks wurden Glycin (von der Insulin-A-Ketie). Phenvlnlanin (von der Insulin-B-Keuc) und Lysin (von Lysyl-alanin) gefunden.

Eine zweite Probe der Mischung wurde durch Papierelektrophorese in Essigsäure/Ameisensäure bei pH 2.1 i untersucht (20 ml Ameisensäure und 80 ml Essigsäure wurden mit Wasser zu I I aufgefüllt). Sie zeigte H-I.ys-AIa-OH und eine weitere Komponente (Mobilitäten in bezug auf λ-DNP-Lysin 2,9 b/.w. 1,5). F.lulion der /weilen Komponente und Analyse auf N-endsiändige Aminosäuren /eigie Glycin und Phenylalanin. EineGesamtaminosäurcanalyse ergab Aininosäiircvcrhültnisse \on Asparaginsäure 3, Serin J. Threonin 2. Glutaminsäure 7. Prolin I, Glycin 4, Alanin I, Valin 4. Isoleucin 2. Leucin b. Phenylalanin J. Tyrosin 4. Histidin 2 und Arginin 1 sowie w Cystein in einer Menge, die niehl genau bestimmt wurde. Die Verbindung unterscheidet sich somit dadurch von Schweineinsulin, daß sie kein Lysin und nur einen Alaiiinresl enthalt.

Eine drille Probe der Mischung wurde auf die Oberseite der llarzkolonne eines l.ocarte· Nminosäureanalysators aufgegeben und die 23 cm lange Har/kolunne wurde in üblicher Weise bei 55 C mil folgendem Programm eluicrl:90 Minuten (pH J,28). 55 Minuten (pH 4.25). 155 Minuten (pH 6.b5). wobei das Insulin nach 234 Minuten, r, Ly s-AIa nach 255 Minuten und Des l.vs-*'-AIa '" Schueineinsulin nach 223 Minuten erschien Ls wurden nun zwei Spitzen entsprechend dem Dcs-Lys-^-Ala"¹-.Schweineinsulin und l.ysAla festgestellt.

Der Rest der Inkiibalionsmischung wurde auf eine 60 · 0.9 cm Kolonne mit porösem vernetzten Dextrangcl (»Sephadex« G-50) aufgegeben, das mit 0,1 M Ammoniumcarbonat in Gleichgewich! gebracht worden war. Die Kolonne wurde mit 0,1 M Ammoniumcarbonat mit einer Fallgeschwindigkeit von 3 ml/Stunde entwickelt, und >m Fraktionen von 30 Tropfen (I ml) wurden gesammelt. Die Fraktionen wurden hinsichtlich ties Peplidmaterials untersucht, und zwar durch Messung der UV-Absorption bei 280 mn. Die Fraktionen 25 bis 35. welche die Hauptspit/e enthielten, wurden vereinigt und lyophilisierl. wobei Des-I.ys^-Ala^-Schweiiicinsulin erhallen wurde.

2 j Beispiel 2

F.ine Lösung von 120 mg Schweineinsulin (einnuil umkristallisiertcs Schweineinsulin. gereinigt durch Gelfiltration (»Sephadcx« G-50) in 0.1 M Ammoniumcarbonat) in 14 ml Wasser, deren pH-Wert auf 8.0 eingestellt worden war und die 3 IO ⁴M Calciumchlorid enthielt, wurde bei 37 C mit 120 ng AM-Protease 5 Stunden w lang inkubiert. Während der Inkubation wurde der pH Wert auf 8.0 gehalten, und zwar durch automatischen Zusatz von 0.005 M Nalriumhydroxidlösung. Die erhaltene Lösung wurde dann einer Kolonne (100 ■ 1.4 cm) von porösem vernetzten Dextrangel (»Scphadex« G-50) zugeführt, und die Kolonne wurde mit 0,1 M Ammoniumcarbonat mit einer FlieLSgeschwindigkeit von 13 inl/Siunde bei 4 C entwickelt. Fraktionen von je 150 Tropfen (5 ml) wurden gesammelt und durch Messen ihrer UV-Absorption bei 280 mn hinsichtlich des Peptidmaterials untersucht. Die Fraktionen 22 bis 30. welche die Hauptspit/e enthielten, wurden vereinigt und lyophilisicrt. wobei 100 mg Dcs-Lys^-Ala"'-Schweineinsulin erhalten wurden. Durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese bei pH 8,9 wurde festgestellt, daß dieses Material aus einer ein/igen Komponente bestand, wenn es mit Amidoschwarz angefärbt worden ist. Es besaß in bc/ug auf Schweineinsulin eine Beweglichkeit von 1,2 in Richtung auf die Anode. Es wurden die gleichen Gesamtaminosäureverhüllnisse wie in Beispiel 1 festgestellt.

Beispiel 3

Eine Lösung von 1 mg .Schweineinsulin in I ml 0.1 M Ammoniumbicarbonaipuffer nut pH 8.2 wurde der Oberseite einer Kolonne (10 · 0.5 cm) zugeführt, welche 3 ml 4%ige Agarosegelkörner enthielt, an denen kovalent 5 mg AM-Protea.se gebunden waren und die mil dem gleichen Ammoniumbicarbonatpuffer bei 22°C ins Gleichgewicht gebracht war. Die Kolonne wurde mit Ammoniumbicarbonatpuffer mit einer Fließgeschwindigkeit von 7 ml/Stunde während 1 Stunde eluierl. und die Fraktionen wurden durch Messen der UV-Absorption bei 280 nni hinsichtlich des Pepiidniaierials untersucht. Die Fraktionen, welche das Peptidmateria! enthielten. wurden vereinigt und lyophilisierl, wobei Des-Lys-"'-Ala '"-.Schweineinsulin erhalten wurde, das die gleichen physikalischen Eigenschaften besaß, wie das Produkt des Beispiels 2.

Das Agarosegel mil der gebundenen AM-Protease wurde wie folgt hergestellt:

Eine Suspension von 3 ml 4%igcm Agarosegelkörnern (»Scpharosc« 4 B) in 10 ecm Wasser wurde mit 450 mg Bromcyan 20 Minuicn lang gerührt, wobei der pH-Wert der Mischung durch Zusatz von 4 N Natriumhydroxid auf 10 bis 11 gehalten wurde. Die Suspension wurde dann mit Eis gemischt und mit 2 I einer kalien Pufferlösung mit pH 8.0 gewaschen, weiche 0,1 M Natriumbicarbonat und 1.0 M Natriumchlorid in Wasser enthielt. Die gewaschene Suspension wurde dann mit 13.5 ml einer Lösung von 5 mg AM-Protease in der oben angegebenen Pufferlösung mit pH 8.0 bei 4' C 12 Stunden lang gerührt. Der Feststoff wurde mit 1 I der oben angegebenen Pufferlösung mit pH 8,0 gewaschen und dann 2 Stunden lang in einer 1 M Lösung von Äthanolamin bei pH 8,0 w> gehalten. Der Feststoff wurde gewaschen mit

(u) 0,1 M Natriumacetat/Essigsäure-Puffer mit pH 4.0. die t,0 M Natriumchlorid enthielt, und dann
(b) mit 0.1 M Natriumboratpuffer mit pH 8,5. die 1.0 M Natriumchlorid enthielt.

Die Waschbehandlungcn mit (a) und dann mit (b) wurden viermal wiederholt. Die Agarosekörner. welche kovalent gebundenes Enzym enthielten, wurden dann mit 0.1 M Ammoniumbicarbonat bei pi I 8.2 ins Gleichgewicht gebracht.

Beispiel 4

[line Lösung von 150 mg kristallinem Rinderinsulin in 2 ml Wasser, die auf einen pH-Wert 8,i eingestellt worden war und 10 -¹M Calciumchlorid enthielt, wurde mit 140 ng AM-Protease !Stunden lang bei 37'C ) inkubiert. Wehrend der Inkubation wurde der pH-Wert bei 8,3 gehalten, und /war durch automatischen Zusatz einer 0,02 M Natritimhydroxidlösiing. Line Menge von Iϋ μI der Lösung wurde unter Verwendung des in Beispiel I genannten Aminosäureanalysators untersucht, jedoch mit dem folgenden Programm: I Minute (pi I i.28), 1 Minute (pi I 4.25). 60 Minuten (pi I b,65) untl dann der Kolonnenregenerationszyklus. Ls wurde keine \·* aliiispitze (F.lulinnszcit 40 Minuten) festgestellt, während sowohl Des-Lys-^K'-Ala^l"-Ringerin.sulin (Elutions/cit

in 80 Minuten) als auch Ly-AIa (Eliiiions/cit 120 Minuten) festgestellt wurden. Die inkubierte Lösung wurde dann lyophylisiert. und der Feststoff wurde in 2 ml M Lssigsaure aufgelöst. Diese Lösung wurde einer Gelfiltration bei 4^CC in der in Beispiel 2 beschriebenih Weise unterworfen, jedoch unter Verwendung von M Essigsäure als Lösungsmittel. Die die Hauptspitze enthaltenden Fraktionen, gemessen durch UV-Absorption bei 280 nm. wurden vereinigt und lyophylisiert. wobei IU mg Des-Lys"'Ala'"-Rindelinsulin erhalten wurden. Durch Poly- f>

π aerylamidgel-Elektrophore.se (pH 8,4) wurde festgestellt, dal! dieses Material aus einer einzigen Komponente bestand, wenn es mit Amidoschwarz angefärbt wurde. Fs besaß im Verhältnis zu Rinderinsulin eine Beweglichkeit von 1,2 in Richtung auf die Anode. Line Gesamiaminosäurcünalyse ergab die gleichen Aminosäurevcrhällnisse wie Rinderinsulin. außer daß kein Lysin und nur zwei Alaninreste zu finden waren. Durch die Dansylierungstechnik, die in Beispiel I beschrieben ist. wurden nur Glycin und Phenylalanin als N-endsiändige Amino-

B e i s ρ i e I 5

I 50 mg einmal umkristallisiertes Schweineinsulin wurden in Wasser durch Zusatz, von N Ammoniumhydroxid 2^r> aufgelöst, und die Lösung wurde mit 0 1 M Ammoniumbicarbonat auf 3.0ml aufgefüllt. Der pll der Lösung betrug 8,2. 0.5 ml einer 150 jig enthaltenden AM-Proteaselösung wurden zugesetzt, und die Lösung wurde 11 Stunden lang bei 37' C gehalten. Durch eine Analyse des Produktes in der in Beispiel 4 beschriebenen Weise wurde festgestellt, daß die Umsetzung vollkommen war. Die Lösung wurde mit 3 ml 40%iger (V/V) wäßriger Lssigsaure verdünnt, und die erhaltene Lösung wurde einer Kolonne von »Sephadex« G-50 (160 · 2,0 cm) jo zugeführt. Die Kolonne wurde mit 20%igcr (V/V) wäßriger Essigsäure eluiert. und das Eluai wurde durch Messen der UV-Absorption bei 280 nm untersucht. Traktionen von je 300 Tropfen wurden bei einer Durchfließ- I jschwindigkeit von 15 ecm pro Stunde gesammelt. Die Insulinspit/c erschien zwischen den Fraktionen 45 bis 56. Diese Fraktionen wurden vereinigt und getrocknet, wobei 135 mg Des-Lys-'^l)-Ala^l"-Schweincinsulin erhalten warden. Unter diesen Arbeitsbedingungen erschien die mit |-125 markierte AM-Proteasc zwischen den Fraktionen 36 bis 43.

Claims

Patentansprüche:

1. A) Des-Lys^-Ala^-Schweineinsuiin und
B) Des-Lys^M-A!a^M-Rinderinsulin

der allgemeinen Formel:

Gly^e-Val^lu^in-Qrs-Cys-R'-Ser-^-Cys-Ser-Leu-TVr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

Phe-Val-Asn-Gin-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro