DE2364883A1 - Polypeptide - Google Patents
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Description
PATENTANWÄLTE
DR.-ING. H. FINCKE DIPL.-ING. H. BOHR
PIPL.-ING. S. STAEGER
Fernrufi '266060
Bankverbindung
Bayer. Verein»banlc Mönchen, Konto 620404
23388 - Dr.F/hr
PH.2572V25826
München 5, 28. Dezember 1973
IMPERIAL CHEMICAL INDUSTRIES LIMITED, London, Grossbritannien
"Polypeptide".
Prioritäten: 28. Dezember 1972, GROSSBRITANNIEii 59742/72
29. Januar 1973, GROSSBRITANNIEN 43.87/73
Die vorliegende Erfindung bezieht sich, auf Polypeptide
und insbesondere auf solche Polypeptide, die durch Modifizieren von Schweine- oder Rinderinsulin erhalten werden.
Es ist bekannt, dass die Verabfolgung von Insulin von sehr
grosser Bedeutung bei der Behandlung der Diabetes bei Menschen ist. Zu diesem Zweck wird das Insulin gewöhnlich
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ORlGlMAL INSPECTED
von Schweinen, das sogenannte "Schweineinsuiin", oder von Rindern, das sogenannte "Rinderinsulin", gewonnen. Es ist
weiterhin "bekannt, dass bei der Verabfolgung von Schweine-
oder Rinderinsulin in der gewöhnlich verfügbaren Form häufig
eine antigene Reaktion hervorgerufen wird. Bei Menschen
kann diese antigene Reaktion bei einer längeren Verabfolgung dieses Medikaments zu einer Vergrösserung der täglichen
Dose führen, die für den Diabetespatienten erforderlich ist, um die Krankheit zu bekämpfen.
Es wurde nun gefunden, und dies ist di£ Grundlage der vorliegenden
Erfindung, dass, wenn Schweine- oder Rinderinsulin, wie es gewöhnlich verfügbar ist, mit einer lysinspezifischen
Aminoendopeptidase behandelt wird, d.h. eine Peptidase, die
ein Polypeptid an dem Peptidglied abspaltet, welches an die Aminogr.uppe von Lysin gebunden ist und bei der es nicht
erforderlich ist, dass der Lysinrest an 'dem C-Ende der
Peptidkette steht, in diesem Falle die erhaltenen Produkte ebenso wirksam sind als Schweine- oder Rinderinsulin, um
eine hypoglycämische Reaktion hervorzurufen, und dass
weiterhin jede derselben eine bemerkenswert geringere Entstehung von Antikörpern hervorruft, welche insulinähnliche
Materialien bei der nachfolgenden Verabfolgung binden, als
es bei dem Ausgangsschweine- oder -rinderinsulin der Fall
ist. Das Enzym entfernt das Dipeptid-L-lysyl-L-alanin von
dem C-Ende der B-Kette des Schweine- oder Rinderinsulins.
Die so erhaltenen Polypeptide sind bisher nicht beschrieben worden.
Die Erfindung betrifft elso ein Polypeptid der Formel
0 9-827/Ί TO 6
3 S 1
1 2 '
Gly.Ile.Val.Glu.Gln.Cys.Cys.R .Ser.R .Cys.Ser.Leu.Tyr.Gln.Leu.GluJten.Tyr.Cys.Asn
Phe.Val.Asn.Gln.His.Leu.Cys.Gly.Ser. His. Leu. VaI. GIu. Ala. Leu. Tyr.Leu.Val.Cys. GIy. GlU
-Arg » GIy. Phe. Phe»Ty r. Ihr. Pro
1 2 1
worin entweder R Threonin und R Isoleucin oder R Alanin
und R Valin ist. ·
α ο
Das Polypeptid, in dem R Threonin und R Isoleucin ist,
unterscheidet sich von dem Schweineinsulin lediglich dadurch, dass in der B-Kette, d.h. der längeren Kette, die C-Enden
Lysyl-· und Alanylreste fehlen, welche die 29· und 30. Reste
der B-Kette von Schweineinsulin bilden. Dieses Polypeptid kann daher als des-Lys -AIa^ -Schweineinsulin bezeichnet
werden und diese Bezeichnung wird im folgenden gebraucht.
Λ ' ο
Das Polypeptid, in dem R Alanin und R^ Valin ist,' unterscheidet
sich von dem Rinderinsulin.lediglich insofern, als in der B-Kette die Lysyl- und Alanyl-G-Endreste fehlen.
29 30
Dieses Polypeptid kann daher als des-Lys -AIa -Rinderinsulin
bezeichnet werden und diese Bezeichnung wird im folgenden gebraucht.
Gemäss einem weiteren Merkmal der Erfindung wird ein Ver-
29 30
fahren zur Herstellung von des-Lys -AIa -Schweineinsulin
29 aus Schweineinsulin vorgeschlagen oder von des-Lys -AIa Rinderinsulin
aus Rinderinsulin, welches darin besteht, dass das Schweine- oder Rinderinsulin in einem wässrigen
Kedium der Einwirkung einer lysinspezifischen Aminoendopeptidase
unterworfen wird, worauf das des-Lys -AIa Schweineinsulin
oder des-Lys ^-Ala^ -Rinderinsulin von dem
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verbleibenden Enzym und Lysyl-alanin abgetrennt wird.
Als Beispiele von geeigneten lysinspezifischen Aminoendopeptid'asen
seien "genannt die Enzym AM-Protease und die Enzym Myxobacter AL-1-Protease II.
Die Enzym AM-Protease kann aus den ausgereiften Samenkörpern des Pilzes Armillaria'mellea in der in der GB-PS 1 263 956
beschriebenen Weise gewonnen werden. Dieses Enzym kann auch etwas zweckmässiger durch Abwandlung des in der GB-PS
1 265 956 beschriebenen Verfahrens in der Weise hergestellt w-erden, dass die Chroraatographxestufe (IV) in zwei Stufen
durchgeführt wird, indem zunächst das rohe Enzym mit Carboxymethylcellulose bei einem pH-Wert von 4,5 absorbiert
und dann mit einem Puffermittel mit einem pH-Wert von 5,5 gewaschen wird, und zweitens, indem die konzentrierte
Waschflüssigkeit der in der Arbeitsstufe (IV) der genannten Patentschrift beschriebenen Kolonne zugeführt wird.
Das Enzym Myxobacter AL--1-Protease II kann aus dem
Myxobacterstamm AL-1 gewonnen werden, wie von Wingard,
Matsueda und Wolfe in dem "Journal of Bacteriology", Band
112, Seiten 940 bis 949 beschrieben ist.
Die Einwirkung des Schweine- oder Rinderinsulins mit der lysinspezifischen Aminoendopeptidase kann in einfacher Weise
mit dem in dem wässrigen Medium gelösten Enzym erfolgen oder es kann mit dem an einem !Träger gebundenen Enzym
durchgeführt werden, der in dem wässrigen Medium löslich sein kann oder auch nicht»
Die Geschwindigkeit und das Ausmass der Umsetzung zwischen
dem als Ausgangsmaterial verwendeten Insulin und dem Enzym hängt von dem Enzym/Substrat-Verhältnis, dem pH-Wert und
der Temperatur des -Inkubationsmediums, der Konzentration
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_ 5 —
des Insulins und der Inkubationszeit ab. Im allgemeinen wird naturgemäss die Zeit zum Abtrennen des Lysyl—alanins
von dem Insulin, das als Ausgangsmaterial verwendet wird, dadurch abgekürzt, dass entweder die Konzentration des
Insulins oder das Enzym/Substrat-Verhältnis vergrössert wird. In ähnlicher Weise beeinflusst eine Veränderung des
pH-Werts oder der Temperatur des Inkubationsmediums die Zeit, die erforderlich ist, um das Lysyl-alanin abzutrennen.
Das Fortschreiten der Reaktion kann dadurch überprüft werden, dass Proben-des Reaktionsmediums entweder durch
Elektrophorese mit einem pH-Wert von 2,1 geprüft werden oder durch Abscheidung an einem automatischen Aminosäureanalysator,
um so den gewünschten Endpunkt der Reaktion zu ermitteln, der wesentlich ist für eine vollkommene Abtrennung
des Lysyl-alanins, wobei auch die Wirkung irgendeiner Veränderung der Reaktionsbedingüngen leicht bestimmt werden
kann. " .
Wenn die Enzym AM-Protease verwendet wird, so lässt sich
die Reaktion innerhalb eines weiten Bereiches des Enzym/ Substrat-Verhältnisses durchführen,und in der Tat kann mit
nur 1 Teil Enzym auf 10 000 Teile Substrat gearbeitet werden. Die Umsetzung kann auch mit einem pH-Wert des Inkubationsmediums von 3 bis 10 erfolgen und bei einer Temperatur von
10 bis 600C durchgeführt werden. Bei einer gegebenen
Insulinkonzentration verläuft die Reaktion am schnellsten
bei einem pH-Wert von H- bis 9, jedoch wird in dem niedrigeren
Teil dieses pH-Bereichs die Löslichkeit des Insulins ver*-
hältnismässig gering, so dass eine grö'ssere Erzeugung von
mit Enzym behandeltem'Insulin in den höheren Bereichen der
pH-Werte erzielbar ist, wo die Löslichkeit des Insulins
grosser ist. Demgemäss bestehen die bevorzugten Reaktionsbedingungen zur Erreichung einer vollkommenen Abtrennung
des Lysyl-alanins innerhalb einer verhältnismässig kurzen Zeit, beispielsweise von 3 bis 12 Stunden, darin, dass eine
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— O —
Konzentration en Insulin in der Nähe der Löslichkeit in dem
Inkubatiohsmedium verwendet wird, ein pH-Wert von ? bis 9, eine Temperatur -von 30 bis 500C und ein so niedriges
Enzym/Substrat-Verhältnis wie nur möglich, beispielsweise 1 zu 1000 oder weniger. Es ist weiterhin zweckmäs/sig,
Metallionen dem Inkubationsmedium zuzusetzen, beispiels-' weise Calcium oder Magnesium in Form ihrer Chloride mit
—2 — U-einer Konzentration von 10 bis 10 molar.
Wenn das Enzym myxobacter AL-1-Prote8§e II verwendet wird,
so sind die Reektionsbedingungen ganz ähnlich denjenigen, ■die mit AM-Protease angewendet werden. Es^ kann ein Enzym/
Substrat-Verhältnis verwendet werden, das nur 1 .zu 10 000 beträgt bei einem pH-Wert von 4 bis 10 und einer Temperatur
von 25 bis 75°C. Bevorzugte Arbeitsbedingungen sind solche,
bei denen eine Konzentration von Insulin.in der Nähe seiner
Löslichkeit in dem Inkubationsmedium verwendet'wird, ein
pH-Wert von 6 bis 9» eine Temperatur von 30 bis 500C und
ein so niedriges Enzym/Substrat-Verhältnis wie nur möglich,
beispielsweise 1. zu 1000 oder darunter. Dem Inkubationsmedium können Metallionen, beispielsweise Calcium oder Magnesium,
zugesetzt sein. , .. '·."■■ \ ~
Wie bereits erwähnt, kann die Reaktion unter Verwendung des einen Trägers, vorzugsweise kovalent gebundenen Enzyms,
durchgeführt werden. Eine grosse Anzahl von Trägern und Bindungsmethoden sind möglich und bezüglich Einzelheiten
wird auf eine Arbeit von E. Katchalski in "Biochemical Aspects of Reactions on Solid Supports", herausgegeben von
G.R. Stark, Academic Press 1971f verwiesen. Ein zweckmässiges
Verfahren zum Binden von AM-Protease an einen Träger besteht darin, dass Agerosegelkugelchen mit Cyanogenbromid
aktiviert werden, und zwar mit oder ohne Abstandsgruppen, die sich beispielsweise von Hexylamin oder Hexanonsäure ableiten,
worauf man denn die aktivierte Agarose mit der AM-
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Protease reagieren lasst. Gegebenenfalls können die Agarosegelkügelchen
unter Anwendung von 2,4-Dichlor^6-carboxymethylamino-s-triazin
als Kupplungsmittel aktiviert werden. Eine andere brauchbare Abwandlung ist die Verwendung von
Carboxymethylcellulosehydrazid. .
Wenn die Umsetzung mit dem Enzym mit dem einfach in dem
wässrigen Medium aufgelösten Enzym durchgeführt wird, kann
29 -50
das gewünschte des-Lys -AIa^ -Schweine- oder- -Rinderinsulin von den anderen Komponenten der Inkubationsmischung durch irgendeine der üblichen Arbeitsweisen zum Trennen von •Polypeptiden durchgeführt v/erden, jedoch ist die Anwendung einer Molekularsiebtechnik besonders zweckmässig. So kann das wässrige Medium, das zurückbleibt, nachdem das gesamte Ausgangsinsulin abgebaut worden ist, durch eine Kolonne von vernetztem Dextrangel oder einem Polyacrylamidgel filtriert werden, das geeignet ist zum Fraktionieren von Verbindungen mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 10 000 bei einem passenden pH-Wert, und zwar vorzugsweise entfernt von und vorzugsweise beträchtlich unterhalb des1 isoelektri- ■ sehen Punktes der Polypeptide, worauf die Kolonne mit einem Puffermediutn gespült wird, das aus Komponenten besteht, die beim Gefriertrocknen unter hohem.Vakuum flüchtig sind, beispielsweise wässriger Essigsäure, Ammoniumcarbonat oder Ammoniumacetat, um so das gewünschte Produkt zu ergeben, das durch Gefriertrocknung des Eluats isoliert wird.
das gewünschte des-Lys -AIa^ -Schweine- oder- -Rinderinsulin von den anderen Komponenten der Inkubationsmischung durch irgendeine der üblichen Arbeitsweisen zum Trennen von •Polypeptiden durchgeführt v/erden, jedoch ist die Anwendung einer Molekularsiebtechnik besonders zweckmässig. So kann das wässrige Medium, das zurückbleibt, nachdem das gesamte Ausgangsinsulin abgebaut worden ist, durch eine Kolonne von vernetztem Dextrangel oder einem Polyacrylamidgel filtriert werden, das geeignet ist zum Fraktionieren von Verbindungen mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 10 000 bei einem passenden pH-Wert, und zwar vorzugsweise entfernt von und vorzugsweise beträchtlich unterhalb des1 isoelektri- ■ sehen Punktes der Polypeptide, worauf die Kolonne mit einem Puffermediutn gespült wird, das aus Komponenten besteht, die beim Gefriertrocknen unter hohem.Vakuum flüchtig sind, beispielsweise wässriger Essigsäure, Ammoniumcarbonat oder Ammoniumacetat, um so das gewünschte Produkt zu ergeben, das durch Gefriertrocknung des Eluats isoliert wird.
Wenn die Umsetzung mit dem Enzym mit dem an einem Träger
gebundenen Enzym durchgeführt wird, so kann die Abtrennung des gewünschten Polypeptide von dem Enzym durch Filtrieren
in üblicher Weise durchgeführt werden, wenn der Träger unlöslich ist oder wenn ein Filter für hohe Polymere verwendet
wird, falls der Träger in dem wässrigen Medium löslich sein sollte.
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Das gewöhnlich zur Verfügung stehende Schweine- oder
Rinderinsulin enthält, selbst wenn es mehrmals umkristallisiert sein sollte, auch noch andere Polypeptide als Verunreinigungen.
Diese Verunreinigungen sind gewö.hnlich in einer Menge zugegen, die 3 bis 5 Gew.-% der Gesamtmenge
ausmacht, und sie bestehen aus Stoffen wie Proinsulin, Proinsulinfragmepten und Glucagon, die nur schwierig von
dem Insulin abgetrennt werden können-, Da mindestens einige
•dieser Verunreinigungen beim Inberuhrungbringen mit einer
lysinspe^ifischen Aminoendopeptidase zu kleineren Polypeptiden
abgebaut werden, führt die Inkubation von Schweineqder Rinderinsulin mit einer lysinspezifischen Aminoendopeptidase
und die Abtrennung des von dem Enzym erhaltenen Produkts, dem Lysyl-alanin und Polypeptide von geringerem
Molekulargewicht als Insulin, z„Bo Oligopeptide, zu einem
Produkt, das geringere Anteile von Verunreinigungen enthält als sie in dem Ausgangspräparat vorlagen. Da es begreiflich
ist, dass die in einem Insulinpräparat vorliegenden Verunreinigungen zu deren Antigenezität beitragen, kann die Behandlung
des Insulinpräparats mit einer lysinspezifischen Aminoendopeptidase zur Antigenezität des Ausgangsmaterials
beeinträchtigen, indem die Struktur der Hauptkomponente modifiziert und die Menge a'n Verunreinigungen verringert
wird«
So wird gemäss einer etwas abgewandelten Ausführungsform
der Erfindung ein Verfahren zur Überführung von gewöhnlich verfügbarem Schweine- oder Rinderinsulin in ein Produkt, das
insulinähnliche Wirksamkeit besitzt, jedoch weniger wirksam ist, um die Entstehung von Antikörpern hervorzurufen, welche
insulinähnliche Stoffe bei der nachfolgenden Verabfolgung binden,, im Gegensatz zu dem Ausgangsmaterial vorgeschlagen,
das darin besteht, dass das Schweine- oder Rinderinsulin in einem wässrigen Medium der Einwirkung einer lysinspezifischen
Aminoendopeptidase unterworfen wird, wobei das Material mit der
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insulinähnlichen Wirksamkeit von dem Enzym, dem Lysylalänin
und den Oligopeptiden abgetrennt wird.
Die Inkubationsbedingungen und die Isolierungsbehandlungen sind naturgemäss die gleichen wie oben zur Herstellung von
29 -50 __ _-
des-Lys y-Ala^ -Schweineim
Rinderinsulin.beschrieben.
des-Lys ^-Ala^ -Schweineinsulin oder des-Lys -AIa"5
Wie bereits oben angegeben, besitzen die Produkte und Polypeptide gemass der Erfindung eine insulinähnliche Wirksamkeit
und sie haben auch^ eine wesentlich geringere Bildung von Antikörpern zur Folge, welche bei der nachfolgenden
Verabfolgung insulinartige Materialien binden, als es bei den Ausgangsmaterialien der Fall ist. Die insulinartige
Wirksamkeit lässt sich nachweisen durch Messen der hypoglycämischen Reaktion, welche durch die Produkte bei
Kaninchen hervorgerufen wird, und zw8r unter Anwendung der
Arbeitstechnik, wie sie in "United States Pharmacopeia", Band 18, Seite 883, beschrieben ist. Gleiche Gewichtsraengen
der Produkte und des W.H.O.-Standardpräparats zeigten die gleiche hypoglycämische Reaktion innerhalb der Genauigkeitsgrenzen dieses Verfahrens. Die geringere Bildung von Antikörpern
wird nachgewiesen,'indem die Testverbindungen, gelöst in-einer 50:50-Misehung von vollkommenen Freund 1S
.■ . . " zur Anwendung komm.en
Adjuvans und Salm, bei Kaninchen/, worauf dann einen Monat
später die Insulihbindungsfähigkeit von Kaninchenserum
gemessen wird, indem eine bekannte Menge des unter der Bezeichnung 1-125 bekannten Insulins dem Serum zugefügt wird
und dann die Menge des freien und gebundenen Insulins bestimmt wird. Diese Arbeitsweise beruht auf bekannten Verfahren,
wie sie beispielsweise von Schlichtkrull und anderen in "Diabetes", Band 21, Supplement 2, Seiten 64-9 bis 656
(1972) beschrieben ist.
Die neuen Polypeptide gemäss der Erfindung werden für die
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Behandlung von Diabetes in im wesentlichen der gleichen
Weise benutzt, wie es für Schweine— oder Hinderinsulin der
Fell ist. So werden sie parenteral, gewöhnlich subcutan, verabfolgt entweder als Lösung oder als Depotformulierungen,-welche
verschiedene Dauer der Wirksamkeit besitzen* Solche Formulierungen ermöglichen eine Wirksamkeitsdauer bis zu
24- Stunden. Die verabfolgten Dosen werden für die Erfordernisse der einzelnen Patienten ausgewählt, um die Diabetes
zu regeln und sie können so hoch sein, dass sie 200 Einheiten pro Tag betragen.
Ein weiteres Merkmal der Erfindung besteht darin, dass eine ingizierbare Formulierung vorgeschlagen wird, welche das
29 30 29 30
des-Lys -AIa -Sehweineinsulin oder des-Lys 7-Ala
Rinderinsulin als wesentlichen wirksamen Bestandteil enthält. .
Die Erfindung ist in den folgenden Beispielen näher erläutert,ohne
darauf beschränkt zu sein«.-Die in den Beispielen genannten Stoffe "Sephadex" und "Sepharose" sind
eingetragene Wsrenzeichen»
Beispiel 1 ' ■ ' ■ 10 mg Schweineinsulin, das 10 mal umkristallisiert worden
ist, wurde in 1,0 ecm 091 M Ammoniumbicarbonat aufgelöst
und die Lösung wurde mit ^O ng AM-Protease 16 Stunden lang
bei 37 C inkubiertο
.10 til der Inkubationsraisehung wurden dann zwecks Bestimmung
der N-endständigen Iminosäuren analysiert durch die bekannte
Dsnsylierungstechnik unter Verwendung von 1-Dimethylsminonaphthalin-5-sulfonylchlorid
(Hartley, Biochem« Jo 1970,
119, 805). Glycin (von der Insulin-A-Kette), Phenylalanin
(von. der Insulin-B~Kette) und Lysin (von Lysyl-alsnin). wurden
gefunden.
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Eine zweite Probe der Mischung wurde durch Papierelektrophorese
in Essigsäure/Ameisensäure bei pH 2,1 untersucht (20 ecm Ameisensäure, 80 ecm Essigsäure wurden mit Wasser
zu 1 1 aufgefüllt) und sie zeigten H-Lys-Ala-OH und eine
weitere Komponente (Mobilitäten mit Bezug auf £-DNP~Lysin
2,9 bzw. 1,5)· Eine EIution der zweiten Komponente und die
N-endständige Aminosäureanalyse zeigte Glycin und Phenyl- ■
alanin. Eine Gesamtaminosäureanalyse ergab Aminosäureverhältnisse
von Aspartinsäure· 3? Serin J5 Threonin 2,
Glutaminsäure 7, Prolin 1, Glycin 4, Alanin 1, Valin 4, Isoleucin 2, Leucin 6, Phenylalanin 5? Tyrosin 4,
Histidin 2 und Arginin 1, neben Cystein in einer Menge, die nicht gensu bestimmt wurde. Diese Verbindung unterscheidet
sich somit von Schweineinuslin, indem sie kein Lysin enthält
und nur einen Rest an Alanin.
Eine dritte Probe der Mischung wurde zugeführt"der Oberseite der
Harzkolonne eines Locarte Aminosäureanalysators (Locarte Ltd., 24 Emperor's Gate, London S.Wa 7) und in der 23 cm langen
Harzkolonne in üblicher Weise bei 55°G das Programm durchgeführt,
und zwar 90 Minuten (pH 3,28), 55 Minuten (pH 4,25),-155
Minuten (pH 6,65)? wooei das Insulin nach 234 Minuten,
PQ -50 Lys-Ala nach 255 Minuten und des-Lys" ~Ala -Schweineinsulin
nach 223 Minuten erschien. Es wurden nun zwei Spitzen entsprechend dem des-Lys -AIs^ -Schweineinsulin und Lys-Ala
festgestellt.
Der" Rest der Inkubationsmischung wurde einer 60 χ 0,9 cm
grossen Kolonne, von porösem vernetzten Dextrangel ("Sephadex" G-50) zugeführt, das mit 0,1 M Ammoniumcarbonat
in Gleichgewicht gebracht wurde.· Die Kolonne wurde mit 0,1 M Ammoniumcarbonat mit einer Fliessgeschwindigkeit von
3 ccm/Stunde gefahren und Fraktionen von 30 Tropfen (1 ecm) ·
wurden gesammelt. Die Fraktionen wurden hinsiehtlicht des Peptidmaterials untersucht, und zwar durch Messung der UV-
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Absorption bei 280 nm, und die Fraktionen 25 bis 35* welche
die Hauptspitze enthielten, wurden vereinigt und lyophilisiert, um des-Lys "-AIa^ -Schweineinsulin zu ergeben.
Beispiel 2 ·
Schweineinsulin,, das 10 mal umkristallisiert worden ist,
wurde in 0,1 M Ammoniumbicarbonat, das Calciumchlorid enthielt,
aufgelöst, um eine Lösung zu ergeben, die 2 mg Insulin pro ecm enthielt und eine Calciumchloridkonzentra-
_ ä.
tion von 3 χ 10 molar besass. Portionen dieser. Lösung wurden dann bei pH 8,2 und einer Temperatur von 37 0 40r Stunden lang mit AM-Protease inkubiert, um folgende· Enzym/ Substrat-Verhältnisse zu ergeben: 1/625, 1/1250, 1/2500 und 1/5000. Eine Analyse der Inkubationsmischungen in Intervallen durch die im Beispiel 1 beschriebene Arbeitsweise zeigte eine- vollkommene Abtrennung in jedem Falle mit Ausnahme 'der 1/5000-Reaktion, wo am Ende· des Versuchs eine 88 #ige Abtrennung erhalten wurde.
tion von 3 χ 10 molar besass. Portionen dieser. Lösung wurden dann bei pH 8,2 und einer Temperatur von 37 0 40r Stunden lang mit AM-Protease inkubiert, um folgende· Enzym/ Substrat-Verhältnisse zu ergeben: 1/625, 1/1250, 1/2500 und 1/5000. Eine Analyse der Inkubationsmischungen in Intervallen durch die im Beispiel 1 beschriebene Arbeitsweise zeigte eine- vollkommene Abtrennung in jedem Falle mit Ausnahme 'der 1/5000-Reaktion, wo am Ende· des Versuchs eine 88 #ige Abtrennung erhalten wurde.
Schweineinuslin, das 10 mal umkristallisiert worden ist,
wurde in Pufferlösungen.aufgelöst, welche aus Ammoniak und Essigsäure mit einem pH-Wert von 4,0, 6,0,. 8,0 und.10,0
hergestellt wurden und die Calciumchlorid enthielten, um 2 mg/ccm Insulin und 3 x 10 Mol Calciumchlorid zu erhalten.
Diese Lösungen wurden mit AM-Protease bei einem Enzym/Substrat-Verhältnis von 1/100 bei 37 C 6 Stundenlang inkubiert.
Eine gemäss Beispiel 2 durchgeführte Analyse zeigte, dass
in jedem Fall eine Abtrennung stattgefunden hat.
Schweineinuslin, das 10 mal umkristallisiert worden ist,
wurde in einer 0,1 M Ammoniumbicar'bonatpufferlösung von pH
.8,2, die Calciumchlorid enthielt, aufgelöst, um eine Lösung zu ergeben, die 2 mg/ccm Insulin und 3 x 10" Mol Calcium-
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Chlorid enthielt. Portionen dieser Lösung wurden mit AM-Protease
in einem Enzym/Substrat-Verhältnis von 1/1000 3 Stunden lang bei Temperaturen von 23, 37, 45 und 55°C
inkubiert. Eine gemäss Beispiel 2 durchgeführte Analyse zeigte eine vollkommene Abtrennung bei 37 und 45 C, eine
etwa 50 #ige Abtrennung bei 55 G und eine geringe Abtrennung
bei 230C
Eine Lösung von Schweineinsulin '(120 mg, einmal umkristallisiertes
Schweineinsulin, gereinigt durch Gelfiltrierung ("Sephadex" G-50) in 0,1 M Ammoniumcarbonat) in 14 ecm
Wasser, deren pH-Wert auf 8,0 eingestellt wurde und die
—4. ο
3 x 10 M Calciumchlorid enthielt, wurde bei 37 C mit
120 ;jg AM-Protease 5 Stunden lang inkubiert. Während der
Inkubation wurde der pH-Wert auf 8,0 gehalten durch automatischen Zusatz von 0,005 M Natriumhydroxidlösung. Die sich
ergebende Lösung wurde dann einer Kolonne (100-x 1,4 ecm) '
von porösem vernetzten Dextrangel ("Sephadex11 G-50) zugeführt und die Kolonne wurde in Gang gesetzt mit 0,1 M
Ammoniumcarbonat mit einer Fliessgeschwindigkeit von 13 ecm
pro Stunde bei 4°C. Fraktionen von je 150 Tropfen (5 ecm)
wurden gesammelt und hinsichtlich des Peptidmaterials durch Messen ihrer UV-Absorption bei 280 nm untersucht. Die Fraktionen
22 bis 30, welche-die Hauptspitze enthielten, wurden
29· 30
vereinigt und lyophilisiert, um 100 mg des-Lys -AIe^
Schweineinsulin zu ergeben. Durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese bei pH 8,9 wurde festgestellt, dass dieses Material
aus einer einzigen Komponente bestand, wenn es mit Amidoschwarz angefärbt worden ist. Es besass eine Beweglichkeit
gegenüber der Anode von .1λ,2 mit Bezug auf die von Schweineinsulin.
Es wurden auch die Gesamtaminosäure-Verhältnisse festgestellt, wie in Beispiel 1.
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Eine Lösung von 1 mg Schweineinsulin in 1 ecm 0,1 H Ammoniumbicarbonatpufferlösung von pH 8,2 wurde der Oberseite
einer Kolonne (10 χ 0,5 cm) zugeführt, welche 5 ecm
4· #ige Agarosege!körner enthielt, an denen !covalent 5 tag
AM-Protease gebunden waren und die in Gleichgewicht versetzt wurden mit der gleichen Ammoniumbicarbonatpufferlösung
bei 22°C. Die Kolonne wurde mit Ammoniumbicarbonatpuffermit einer Fliessgeschwindigkeit von 7 ecm pro Stunde
1 Stunde lang bespült und die Fraktionen hinsichtlich des Peptidmaterials durch Messen der UV-Absorption bei 280 nm
untersucht. Die Fraktionens welche das Peptidmaterial ent-
hielten, wurden vereinigt und lyophilisiert, um des-Ljs ~
•50 '
AIa -Schweineinsulin zu ergeben^ das die gleichen physikalischen
Eigenschaften besitzt, wie das Produkt des Beispiels 5» ' ' '"
Das Agarosegel mit der gebundenen AM-Protease wurde wie
folgt hergestellt;
Eine Suspension von J ecm 4· $ Agarosegelkörnern ("Sepharose"
4-B) in 10 ecm Wasser wurde mit 4-50.mg Cyanogenbromid 20
Minuten lang gerührt, wobei der pH-Wert der Mischung durch Zusatz von 4-N Natriumhydroxid auf 10 bis 11 gehalten wurde.
Die Suspension wurde dann mit Eis gemischt und mit 2 1 einer kalten Pufferlösung von pH 850 gewaschen, welche
0,1 M Natriumbicarbonat und 1?0 M Natriumchlorid im Masser
enthielt. Die gewaschene Suspension wurde dann mit 13»5 ecm
einer Lösung von 5 mg AM-Protease in der obea angegebenen
Pufferlösung mit pH 8,0 bei 40C 12 Standen lang'gerührt.
Der -Feststoff wurde mit 1 1 der oben angegebenen Pufferlösung von pH 8,0 gewaschen und dann 2·Stunden lang in einer
1 M Lösung von Äthanolamin bei pH S9O gehalten« Der Feststoff
wurde gewaschen mit (a) OyI M Natriumacetst/Essigsäure
Pufferflüssigkeit von pH 4-9O? die 1,0 M Natriumchlorid ent-
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hielt, und denn (b) mit 0,1 M Natriumboratpufferflüssigkeit
von pH 8,5» die 1,0 M Natriumchlorid enthielt. Die Waschbehandlungen mit (a) und dann mit (b) wurden viermal wiederholt.
.Die Agarosekörner, welche kovalent gebundenes Enzym
enthielten, wurden dann in Gleichgewicht gebracht mit 0,1 M Ammoniumbicarbonat .von .pH 8,2.
Beispiel 7 - · .
Lösungen von 10 χ umkristallisiertem Schweineinsulin, die 1 mg/ccm enthielten, wurden bei pH 8,0 und 4-00C 2 Stunden
lang mit AM-Protease inkubiert, und zwar mit einem Enzym/
Substrat-Yerhältnis von 1/1000 in Gegenwart von Magnesiura-
—1 · —2 —3 —4-chlorid
mit Konzentrationen von 10 , 10 , 10 . bzw. 10 Hol. Eine gemäss Beispiel 2 durchgeführte Analyse zeigte
—1
eine 90 #ige Abtrennung .mit 10" Mol Mg, 75 #ige Abtrennung
eine 90 #ige Abtrennung .mit 10" Mol Mg, 75 #ige Abtrennung
mit 10~2 und 10"^ Mol Mg und 65 #ige Abtrennung mit
Mol Mg. Bei Abwesenheit von Magnesium·fand eine 68 Abtrennung statt.
Eine Lösung von 150 mg kristallinem Einderinsulin in 2 ecm
Wasserr die auf einen pH-Wert 8,3 eingestellt war und
10 M Calciumchlorid enthielt, wurde mit 14-0 jig AM-Protease
3 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Während der Inkubation wurde der pH-Wert bei 8,3 gehalten, und zwar durch automatischen
Zusatz einer 0,02 M Natriumhydroxidlösung. Eine Menge von 10 -^uI der Lösung wurde unter Verwendung des
Aminosäureanalysators in der in Beispiel 1 beschriebenen
Weise untersucht, jedoch mit dem Programm 1 Minute (pH 3j28),
1 Minute (pH 4·,25), 60 Minuten (pH 6,65), worauf dann der
Kolonnenregenerationszyklus durchgeführt wurde. Es wurde
■keine Insulinspitze bei einer Bespülungszeit von 90 Minuten
festgestellt, während sowohl des-Lys °-Äla^ -Rinderinsulin
(Spülzeit 80 Minuten) und Lysr-Ala (Spülzeit 120 Minuten)
beide festgestellt wurden. Die inkubierte Lösung wurde dann
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lyophilisiert und der Feststoff wurde in 2 ecm M Essigsäure
aufgelöst. Diese Lösung wurde einer Gelfiltration bei 4- C
in der in Beispiel 5 beschriebenen Weise-, jedoch unter Verwendung
von M Essigsäure als Lösungsmittel, unterworfen. Die die Hauptspitze enthaltenden Fraktionen, gemessen durch
UV-Absorption bei 280 nm, wurden vereinigt und lyophylisiert,
29 -50
um 113 rag des-Lys -AIa -Einderinsulin zu ergeben. Durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese (pH 8,9) wurde festgestellt, dass dieses Material aus einer einzigen Komponente bestand, wenn es mit Amidoschwarz angefärbt wurde. Es besass eine Beweglichkeit von dem 1,2-fachen derjenigen von Rinderinsulin gegenüber der Anode. Eine Gesamtaminosäureanalyse ergab die gleichen AminosäureVerhältnisse wie Rinderinsulin, ausser, dass kein Lysin zugegen war und nur Spuren von zwei Alanin. Es wurden nur Glycin und Phenylalanin als N-endständige Aminosäuren festgestellt durch die Dansylierungstechnik, wie sie in Beispiel 1 beschrieben worden ist.
um 113 rag des-Lys -AIa -Einderinsulin zu ergeben. Durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese (pH 8,9) wurde festgestellt, dass dieses Material aus einer einzigen Komponente bestand, wenn es mit Amidoschwarz angefärbt wurde. Es besass eine Beweglichkeit von dem 1,2-fachen derjenigen von Rinderinsulin gegenüber der Anode. Eine Gesamtaminosäureanalyse ergab die gleichen AminosäureVerhältnisse wie Rinderinsulin, ausser, dass kein Lysin zugegen war und nur Spuren von zwei Alanin. Es wurden nur Glycin und Phenylalanin als N-endständige Aminosäuren festgestellt durch die Dansylierungstechnik, wie sie in Beispiel 1 beschrieben worden ist.
Eine Menge von I50 mg einmal umkristallisiertem Schweineinsulin
wurde in ¥asser durch Zusatz von N Ammoniumhydroxid aufgelöst und die Lösung wurde auf 3,0 ecm mit 0,1M Ammoniumbicarbonat
aufgefüllt. 0,5'ccm einer I50 ug enthaltenden
AM-Proteaselösung wurde zugesetzt und die Lösung wurde 11
Stunden lang bei 37°C gehalten. Durch eine Analyse des Produktes in der"in Beispiel 8 beschriebenen Weise'wurde festgestellt, dass die Umsetzung vollkommen war. Die Lösung
wurde mit 3 ecm 40 #iger (V/V) wässriger Essigsäure verdünnt
und die sich ergebende Lösung wurde einer Kolonne von "Sephadex" G 50 (160 χ 2,0 cm) zugeführt. Die Kolonne wurde
mit 20 $iger (V/V) wässriger Essigsäure gespült und das Eluat wurde durch Messen der UV-Absorption bei 280 nm untersucht.
Fraktionen von je 300 Tropfen wurden bei einer Durchfliessgeschwindigkeit
von 15 ecm pro Stunde gesammelt. Die Insulinspitze erschien zwischen den Fraktionen 45 bis 56 und
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diese Fraktionen wurden vereinigt und getrocknet, um 135 des-Lys -AIa -Schweineinsulin zu ergeben. Unter diesen
Arbeitsbedingungen erschien die mit 1-125 bezeichnete AM-Protease zwischen den Fraktionen 36 bis 4-3.
Patentansprüche:
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Claims (18)
- PATENTANSPRÜCHE:1v a Ein Polypeptid der Formelps —Gly.Ile.Val.Glu.Gln.Cys.Cys.R.Ser.R .Cys.SeroLeUcTyr.Gln.Leu.Glu.Asn.Tyr.Cys.AsnS ■. S ·? '■■ /Ite.Val.Asn.Gln.His.Iieu.^s.Gly.Ser.His.Leu.Val.Gle.Ala.Leu.Tyr.Leu.Väl.Cys.Gly.Glu -Arg.Gly.Phe.Phe.Tyr.Dir.Pro' . "1 2 1worin entweder R Threonin und R Isoleucin oder R Alaninρ
und R Valin ist.pn 50 · ' - 2. Des-Lys ^-AIa -Schweineinsulin.
- 29 50
3- Des-Lys -AIa^ -Rinderinsulin. - 4. " Verfahren zur Herstellung von des-Lys -Ala"* -Schweineinsulin aus Schweineinsulin, dadurch gekennzeichnet, dass das Schweineinsulin in einem wässrigen Medium der Einwirkung einer lysinspezifischen Aminoendopeptidase unterworfen wird, worauf das des-Lys -AIa -Schweineinsulin von dem verbleibenden Enzym und Lysyl-alanin abgetrennt wird.
- 5·. Verfahren zur Herstellung von des-Lys -AIa^ -Rinderinsulin 8US Rinderinsulin, dadurch gekennzeichnet, dass das Rinderinsulin in einem wässrigen Medium der Einwirkung einer lysinspezifischen Aminoendopeptidase unterworfen wird, worauf das des-Lys -Als «-Rinderinsulin von dem verbleibenden Enzym und Lysyl-alanin abgetrennt wird.4 0 9 8 2 7/110 6
- 6. Verfahren zur Umwandlung von Schweineinsulin, wie es üblicherweise verfügbar ist, in ein Produkt, das eine insulinähnliche Wirksamkeit besitzt, jedoch weniger wirksam hinsichtlich der Bildung von Antikörpern ist, welche insulinähnliche Materialien bei der nachfolgenden Verabfolgung binden, .als es beim Ausgangsmaterial der lall ist, dadurch gekennzeichnet,' dass das Schweineinsulin in einem wässrigen Medium der Einwirkung einer lysinspezifischen Aminoendopeptidase unterworfen wird und das eine insulinähnliche Wirksamkeit aufweisende Material von dem Enzym, Lysyl-alanin und den Oligopeptiden abgetrennt wird.
- 7. ■ Verfahren zur Umwandlung von Rinderinsulin, wie es üblicherweise verfügbar ist, in ein Produkt, das eine insulinähnliche Wirksamkeit besitzt, jedoch weniger wirksam hinsichtlich der Bildung von Antikörpern ist, welche insulinähnliche Materialien bei der nachfolgenden Verabfolgung binden, als es beim Ausgangsmaterial der Fall ist, " dadurch gekennzeichnet, dass das Rinderinsulin in einem wässrigen Medium der Einwirkung einer lysinspezifischen Aminoendopeptidase unterworfen wird und das eine insulinähnliche Wirksamkeit aufweisende Material von dem Enzym, Lysyl-alanin und den Oligopeptiden abgetrennt wird.
- 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4· bis 7? dadurch gekennzeichnet, dass die lysinspezifische Aminoendopeptidase aus AM-Protease besteht.
- 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 4- bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die lysinspezifische Aminoendopeptidase aus Myxobacter AL-1-Protease II besteht.
- 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 4- bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung mit dem Enzym in einer Lösung mit einem pH-Wert von 3 bis 10 und bei einer Tempera-409827/1106tür von 10 bis 600C durchgeführt wird.
- 11. Verfahren nach Ansprach 10, dadurch..gekennzeichnet, dass der pH-Wert 7 bis 9 und die Temperatur 30 bis 5O0C beträgt und die Konzentration an Insulin in der Nähe seiner Löslichkeit in dem Inkubationsmedium liegt, wobei das Enzym/Substrat-Yerhältnis von 1/1000 bis 1/10 000 beträgt.
- 12. "Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7 und 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung mit dem Enzym in einer Lösung" mit einem pH-Wert von .4 bis 10, bei einer Temperatur von 25 bis 75°C und einem Enzym/Substrat-Verhältnis von 1/1000 bis' 1/10 000 durchgeführt wird.
- 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 4- bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung in Gegenwart von Calcium oder Magnesiumionen durchgeführt wird.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 13» dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym in einer Form angewendet wird, in der es an einen Träger gebunden ist.
- 15· Verfahren nach Anspruch 14, dadurch-gekennzeichnet, dass die Enzym AM-Protease an einen Agaroseträger unter Verwendung von Cyanogenbromid gebunden ist.
- 16. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 15S dadurch gekennzeichnet, dass die Abtrennung in der Weise durchgeführt wird, dass die Inkubationsmischung durch ein Molekularsieb geleitet wird.
- 17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekularsieb aus einem vernetzten. Dextrangel oder Polyacrylamidgel besteht, das geeignet ist zum Fraktionieren von Verbindungen mit einem Molekulargewicht von4 0 9 8 2 7/11065000 bis 10 000.
- 18. Eine injizierbare Formulierung, bestehend aus29 30
des-Lys -Ala*' -Schweineinsulin und einem pharmazeutdanwendbaren Verdünnungs- oder Lösungsmittel.19· Eine injizierbare Formulierung, bestehend aus29 50
des-Lys -Ala^ -Rinderinsulin und einem pharmazeutiscanwendbaren Verdünnungs- oder Lösungsmittel.4098 27/1106
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