DD289544A5

DD289544A5 - Stabile bioaktive somatotropine

Info

Publication number: DD289544A5
Application number: DD89332530A
Authority: DD
Inventors: Zafar I Randawa; James E Seely
Original assignee: Pitman-Moore,Inc.,Us
Priority date: 1988-09-12
Filing date: 1989-09-11
Publication date: 1991-05-02
Also published as: RU2073686C1; UA26853C2; HU206375B; ES2018397A6; AU4330889A; GR1002144B; NZ230610A; HU910787D0; WO1990002758A1; GR890100562A; HUT56856A; CN1041160A; PL162822B1; JPH04500519A; US5079230A; EP0433395A1; CA1339759C; ZA896914B; CN1037845C

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von stabilen und bioaktiven Somatotropinen, deren Sulfhydrylgruppen der kleinen Schleife derivatisiert sind. Das Somatotropin mit derivatisierter kleiner Schleife ist waehrend der langfristigen Lagerung stabil, d. h. es bildet sehr wenige Dimere, Oligomere und Zusammenballungen, die das Somatotropin inaktivieren und es hat eine gleich grosze oder groeszere Bioaktivitaet als das nicht derivatisierte Somatotropin.{Somatotropine-Herstellung, lagerstabil, bioaktiv; Pharmazeutika}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Somatotropinen, insbesondere stabilen und bioaktiven Somatotropinen.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Isolierung, Reinigung und Eigenschaften der Somatotropine sind im Fachgebiet gut bekannt. Im allgemeinen wird Somatotropin, im Fachgebiat manchmal als Wachstumshormon bezeichnet, während der gesamten Lebenszeit des Tieres durch die Hypophyse gebildet. Es ist bekannt, daß Somatotropin das Skelettwachstum, die Stickstoffrotention im Blut, die Proteinsynthese ff rdert und den Glucose- und Lipidstoffwechsel br sinträchtigt. ,

Somatotropin wird deshalb als ein allgemeines anabolisches Mittel angesehen.

Somatotropin kann ai,s ausgeschnittenem Hypophysengewebe isoliert werden. Siehe z. B. Li, J. Biol. Chem. 211,55 (1954). Somatotropin kann auch mittels gentechnischer Verfahren aus Mikroorganismen gewonnen werden, die rekombinante DNA speziell für die Produktion von Somatotropin enthalten. Siehe z.B. Seeburg, u.a., Nature, 276,795-798 (1978); Seeburg, u.a.. Nature, 270,486-494 (1978); Martial, Science, 205,602-607 (1979); und Seeburg u.a., DNA, 2,37-45 (1983). Die Somatotropine von besonderen Spezies wurden untersucht und charakterisiert. Beispielsweise ist bekannt, daß Rinder-Somatotropin ein im Hypophysenvorderlappen synthetisiertes und von diesem abgegebenes Polypeptid ist. Eine Nucleotidcodiersequenz und eine Aminosäuresequenz von natürlichem Rinder-Somatotropin wurden mitgeteilt; z. B. Miller u.a., J. Biol. Chem., 255,7521-7524 (1980); und Wallis, FEBS Lett, 35,11-14 (1973). Rinder-Somatotropin ist ein Protein aus 191 Aminosäuren und wurde erstmalig als ein Rinder-Presomatotropin aus 217 Aminosäuren synthetisiert; wobei die Signalsequenz von 26 Aminosäuren während der Synthese und Sekretion aus der N-terminalen Position entfernt wurde, z. B. Lingapa u.a., Proc. Natl. Acad. ScI. USA, 74,2432-2436 (1977).

Die Herstellung von Rinder-Somatotropln ist Im Fachgebiet gut bekannt. Beispielsweise wird Rinder-Sometotropin aus den Hypophysen von Rindern extrahiert oder mittels Rekomblnant-DNA-Verfahren in geeigneten Wirten erzeugt z. B. Miller u. a., J. BIoI. Chem., 255,7521-7524 (1980). In US-Patent Nr.4,443,539 an Frazier u. a„ wird ein Verfahren zur Herstellung von Rinder-Somatotropin mittels Rekombinan iNA-Methoden offenbart, bei deren das Rinder-Somatotropinstrukturgen in Hefezellen eingeführt wird. In US-Patent Nr.4,d71,462 an Hecht wird ein Verfahren zur Reinigung von Hypophysenvorderlappenpeptidon offenbart. Die EP-Patentanmeldenummern 83304574.3, eingereicht am 8. August 1983, mit der Veröffentlichungsnummer 103,395; 82304880.6, eingereicht am 16. September 1982, mit der Veröffentlichungsnummer 075,444; und 81303824.7, eingereicht am 21.August 1981, mit der Veröffentlichungsnummer 047,600; und die Britische Patentanmeldenummer 2,073,245A offenbaren Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Rinder-Somatotropin in hohen Ausbeuten. Stämme von E. coil, die Rinder-Somatotropin produzieren, stehen von der American Type Culture Collection unter den Bezugsnummern ATCC 31826,31840,31841,31842 und 31843 zur Verfügung.

In gleicher Weise ist die Herstellung von natürlichem und rekombinantem Schweine- und Human-Somatotropin gut bekannt. Zusätzlich zu den obengenannten Veröffentlichungen, die Verfahren zur Gewinnung von Schweine- und Human-Somatotropin offenbaren, werden beispielsweise in US-Patent Nr. 4,604,359 Verfahren zur mikrowellen Expression von Human-Somatotropin offenbart; werden in US-Patent Nr. 4,332,717 Verfahren zur Reinigung von Human-Somatotropin offenbart, und in der EP-Patentanmeldenummer 83305717.7, eingereicht am 26. September 1983, mit Veröffentlichungsnummer 104.920, werden Verfahren zur Erzeugung von rekombinantom Schweine-Somatotropin in hohen Ausbeuten offenbart. Das US-Patent Nr. 4.604.359 offenbart Verfahren zur Synthese von bioaktivem Human-Somatotropin, einschließlich von Verfahren zur Synthetisierung eines bioaktiven Tetra-S-carbamidomethylderivats. Viele andere einschlägige Veröffentlichungen und Verfahren für verschiedene Somatotropine sind den Fachleutun auf diesem Gebiet bekannt, z. B. offenbart US-Patent Nr. 4.645.755 ein Verfahren für die Erzeugung von Fisch-Somatotropin.

Obwohl die Verfahren zur Herstellung der Somatotropine gut bekannt sind, so sind die Lagerungsmethoden für Somatotropin während des oftmals langen Zeitraums zwischen Herstellung und Verwendung des Somatotropins nicht gut entwickelt. Somatotropin)} neigen dazu, während der Lagerung bioinaktive Dienere, Oligomers und unlösliche Zusarnmenballungen zu bilden. Diese bioinaktiven Formen des Somatotropins senken die zur Verwendung verfügbare Somatotropinmenge und verursachen Probleme bei der Verabreichung, insbesondere, wenn die unlöslichen Zusammenballungen in den Somatotropinlösungen Niederschläge bilden.

Es sind daher Verfahren erforderlich, die zur Herstellung eines stabilen und bioaktiven Somatotropins dienen, das während der Lagerung keine bioinaktiven Di/nere, Oligomere und Zusammenballungen bildet.

Ziel der Erfindung

Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden lagerstabile, bioaktive Somatotropin« zur Verfügung gestellt, die wertvolle pharmazeutische Eigenschaften aufweisen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen und bioaktiven Somatotropins zur Verfügung zu stellen, das während der Lagerung keine bioinaktiven Dimere, Oligomere und Zusammenballungen bildet.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß ein Verfahren Anwendung findet, das die selektive Reduzierung der O'sulfidbindungen der kleinen Schleife des Somatotropins zur Bildung von Sulfhydrylgruppen und die Dorivatisierung der Disulfidbindungen der kleinen Schleife umfaßt. Die Derivatisierung der Sulfhydrylgruppen der kleinen Schleife verhindert, daß die Sulfhydrylgruppen intramolekulare Disulfidbindungen bilden, die die Somatotropindimere, -oligomere und -zusnmmenballungen verursachen sowie das Somatotropin inaktivieren. Das nach diesem Verfahren hergestellte Somatotropin ist während einer längerfristigen Lagerung stabil und besitzt eine Bioaktivität, die gleich groß oder größer als die Bioaktivität des nicht derivatisierten Somatotropins ist. Das derivatisierte Somatotropin wird gewonnen und, wenn erforderlich, weiter verarbeitet, um eine für die langfristige Lagerung und anschließende Verabreichung an ein Tier geeignete Somatotropinform herzustellen.

Weitere erfindungsgemäße Ziele, Vorteile und neuartigen Merkmale werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung deutlich werden.

Die aus unterschiedlichen Tierspiezies isolierten Somatotropine zeigen einen hohen Grad an Sequenzhomologie (etwa 96%); die Somatotropine der unterschiedlichen Spezies unterscheiden sich jedoch in der Anzahl und der Sequenz der in der Somatotropinkette vorhandenen Aminosäuren. Zum Beispiel ist natürliches Human-Sornatotropin (nhST) ein aus 188 Aminosäuren bestehendes Polypeptid. Das Somatotropinmolekül hat zwei Disulfidbindungen; eine zwischen den Aminosäuren 179 und 186 und eine zwischen den Aminosäuren 68 und 162. Diese Disulfidbindungen bilden eine „kleine Schleife" aus 94 Aminosäuren. Die vollständige Sequenz und Struktur für Human-Somatotropin, das die „kleine Schleife" und die „große Schleife" aufweist, sind in US-Patent Nr. 3.853.832 illustriert, das hier unter Bezugnahme mit aufgenommen wird. In ähnlicherWeise ist natürliches Schweine-Somatotropin (npST) ein aus 190 Aminosäuren bestehendes Polypeptid, das 2 Disulfidbindungen besitzt, die die charakteristischen kleinen und großen Schleifen bilden; und zwar eine zwischen den Aminosäuren 180 und 188 und eine zwischen den Aminosäuren 163 und 52. Auch natürliches Rinder-Somatotropin (nbST) ist ein aus 191 Aminosäuren bestehendes Polypeptid, das 2 Disulfidbindungen besitzt, die die charakteristischen kleinen und großen Schleifen bilden; eine zwischen den Aminosäuren 181 und 189 und eine zwischen den Aminosäuren 53 und 164. Zahlreiche und rekombinante Somatotropine haben unterschiedliche Anzahlen und Sequenzen von Aminosäuren. Bioaktive Somatotropine haben jedoch eine Tertiärkonformation bei der charakteristischen kleinen Schleife und großen Schleife.

Der Begriff „Somatotropin" in der hier gebrauchten Bedeutung umfaßt alle Somatotropin, die eine „kleine Schleife" besitzen und schließt nicht nur „natürliche Somatotropin" ein, sondern auch „synthetische Somatotropine" und „rekombinante Somatotropine", die die Aminosäuresequenz von natürlichem Somatotropin aufweisen, sowie ihnen im wesentlichen ähnliche Aminosäuresequenzen oder o^lrie gekürzte Sequenzform davon, und ihre Analoga und Mutatinen, die substituierte, deletierte, verlängerte, ausgetauschte oder anderweitig modifizierte Sequenzen haben. Insbesondre schließt Somatotropin in der hier gebrauchten Bedeutung ein rekombinantes Protein der gleichen Sequenz wie das native Somatotroprln ein, dem jedoch Aminosäuren vom Aminosäuren- und/oder Carboxyterminusende fehlen. Beispiele dieser Proteine schließen Delta-7-rekombinantes-Schweine-Somatotropin, Delta-4-rekombinantes-Rinder-Somatotropin (native Somatotropine, denen 7 bzw. 4 Reste vom Aminosäurenterminusende fehlen) und dergleichen ein.

Der Begriff .Somatotropin mit derivatisierter kleiner Schleife" in der hier gebrauchten Bedeutung beschreibt „Somatotropine", die eine durch eine Disulfidbindung gebildete große Schleife, jedoch keine kleine Schleife besitzen; wobei die Sulfydrylgruppen der kleinen Schleife derivatisiert wurden, um die Bildung der Disulfidbindungen der kleinen Schleife zu verhindern. Das „Somatotropin mit derivatisierter kleiner Schleife" ist in der Aminosäuresequenz mit dem nicht derivatisierten „Somatotropin" identisch, mit Ausnahme der Anwesenheit der derivatisierenden Gruppen an den Cystein-Sulfhydryl-Gruppen, die normalerweise die für die kleine Schleife verantwortliche Disulfidbindung bilden.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen und bioaktiven Somatotropins zur Verfügung gestellt. Das Verfahren umfaßt die selektive Reduzierung der Somntotropindisulfidbindungen der kleinen Schleife zur Bildung von Sulfhydrylgruppen und die Derivatisierung der Sulfhydrylgruppen der kleinen Schleife. Die Derivatisierung der Sulfhydrylgruppen der kleinen Schleife verhindert, daß die Sulfhydrylgruppen intramolekulare Disulfidbindungen bilden, die Somatotropindimere, -oligomere und -zusammenballungen verursachen sowie das Somatotropin inaktivieren. Dau nach diesem Verfahren erzeugte Somatotropin ist während einer langen Lagerungszeit stabil und besitzt eine Bioaktivität, die gleich groß oder größer als die Bioaktivität des nicht derivatisierten Somatotropins ist. Das derivatisierte Somatotropin wird gewonnen, und wenn erforderlich, weiter verarbeitet, um eine Somatotropinform herzustellen, die sich für die langfristige Lage und anschließende Verabreichung an ein Tier eignet.

Das erfindungsgemäß verwendete Somatotropin kann aus allen geeigneten Quellen gewonnen werden. Verfahren zur Herstellung, Isolierung und Reinigung von natürlichen, synthetischen und rekombinanten Somatotropinen sind im Fachgebiet gut bekannt.

Erfindungsgemäß können Somatotropine aus beliebigen Tierspezies verwendet werden; diese Somatotropine schließen Human-, Rinder-, Schweine-, Hunde-, Katzen-, Pferde-, Vogel-, Fisch- und Schaf-Somatotropine ein, sind aber nicht darauf beschränkt.

Die Disulfidbindung der kleinen Schleife des Somatotropins wird selektiv reduziert durch Umsetzen des Somatotropins mit einem geeigneten Reduktionsmittel unter Bedingungen, die die Disulfidbindungen der kleinen Schleife, aber nicht die Disulfidbindungen der großen Schleife reduzieren. Es kann jedes geeignete Reduktionsmittel, das mit Proteinsulfhydrylgruppen reagiert, verwendet werden. In der Regel ist das Reduktionsmittel eine beliebige organische Mercaptoverbindung, die durch die Formel R-SH dargestellt wird, worin R ein organisches Kohlenwasserstoffradikal mit etwa 1 bis 30 Kohlenstoffatomen ist. Bevorzugte Reduktionsmittel schließen 2-Mercaptoethanol und Dithiothreitol ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Im allgemeinen wird eine Lösung, die etwa 1-20 Milligramm pro Milliliter (mg/ml) Somatotropin enthält, mit ausreichend Reduktionsmittel gemischt, um die Konzentration des Reduktionsmittels auf einen Wert von etwa 15-300 Millimol (mM) zu bringen. Der pH-Wert der Lösung wird auf etwa 6 bis 10 eingestellt, und das Reduktionsmittel läßt man etwa 0,5 bis 3 Stunden bei einer Temperatur von etwa 15-30°C mit Somatotropin reagieren. Überschüssiges Reduktionsmittel wird durch beliebige geeignete Maßnahmen, vorzugsweise Dialyse, entfernt, und das erhaltene Somatotropin mit reduzierter kleiner Schleife, das 2 Sulfhydrylgruppen der kleinen Schleife enthält, wird wie unten beschrieben derivatisiert.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird ausreichend Somatotropin in Carbonatpuffer (CB^-) gelöst (CB^- enthält 25mM NaCO₃,18 mM Na₂COj, pH etwa 9,5), um eine Lösung von etwa 5 mg/ml herzustellen. Dithiothreitol wird in ausreichender Menge zugefügt, um eine Lösung von 2OmM herzustellen, der pH-Wart wird auf etwa 8 eingestellt, und die Reduktion wird im Dunklen etwa 1 Stunde lang bei etwa 37⁰C durchgeführt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird eine CB~-Lösung (pH etwa 9,8) von etwa 5mg/ml Somatotropin, die 2-Mercaptoethanoi in einer Konzentration von etwa 5OmM erhält, im Dunklen für etwa 1 Stunde bei etwa 20-37⁰C umgesetzt. Das überschüssige Reduktionsmittel wird entfernt, und das Somatotropin wird derivatisiert, um ein stabiles und bioaktives Somatotropin zj bilden.

Die Sulfhydrylg,ruppen der kleinen Schleife, die bei der Reduktion entstehen, werden durch Umsetzung des reduzierten Somatotropins mit einem entsprechenden Derivatisierungsmittel derivatisiert. Das zur Derivatisierung der reduzierten Sulfhydrylgruppen der kleinen Schleife verwendete Derivatisierungsmittel kann ein beliebiges Derivatisierungsmittel sein, das mit Sulfhydrylgruppen reagiert. Dem Fachmann auf diesem Gebiet sind viele Klassen von DerVatisierungsgruppen, die mit Sulfhydrylgruppen reagieren, bekannt. Beispiele solcher Klassen umfassen Derivatisierungsmittel wie Ethylenimin, Acrylnitril, N-Ethylmaleimid, 3-Brompropionsäure, 3-Brompropionamid, lodacetamin, lodessigsäure, N-(lodethyl)-trifuloracetamid, 4-Vinylpyridin und Methylmethanthiosulfonat, sind aber nicht darauf beschränkt. Am besten ist das Derivatisicrungsmittel ein Alkylierungsmittel, das die Formel R-X hat,, worin X ein Halogen, vorzugsweise I, Broder Cl ist, und R eine Alkylkette, verzweigt oder linear, mit etwa 1 bis 30 Kohlenstoffetomen, vorzugsweise etwa 1-12 Kohlsnstoffatome, ist. Im allgemeinen wird eine Lösung aus 1-200mg/ml Somatotropin mit reduzierter kleiner Schleife mit ausreichend Derivatiserungsmittel gemischt, um die Konzentration des Derivatisierungsmittels auf etwa 50-800 Millimol (mM) zu bringen. Der pH-Wert der Lösung wird auf etwa 6-10 eingestellt, und das Derivatisierungsmitte! läßt man etwa 0,5-3 Stunden bei einer Temperatur von etwa 15-20⁰C mit dem Somatotropin reagieren. Das überschüssige Derivatisierungsmittel wird durch geeignete Maßnahmen, vorzugsweise Dialyse, entfernt, und das erhaltene Somatotropin mit reduzierter kleiner Schleife, das 2 derivatisierte Sulfhydrylgruppen enthält, wird verarbeitet, um Somatotropin in einer Form herzustellen, die sich für die langfristige Lagerung und anschleißende Verabreichung an ein Tier eignet, im allgemeinen ist dies eine lyphilisierte Form.

In der bevorzugten Ausführungsform wird eine CB~-Lösung von etwa 5mg/ml Somatotropin mit reduzierter kleiner Schleife, dos lodacetamid in einer Konzentration von etwa 20OmM bei einem pH-Wert von etwa 8,5-9 enthält, im Dunklen etwa 1 Stunde lang bei etwa 20-37⁰C umgesetzt. Das überschüssige lodacetamid wird durch Dialyse gegen 2% CB" entfernt. Das entstandene derivatisierte Somatotropin wird durch herkömmliche Maßnahmen weiter gereinigt, wenn dies erforderlich ist, lyophilisiert, um ein Somatotropin herzustellen, das während der langfristigen Lagerung stabil ist und eine Bioaktivität besitzt, die gleich oder größer als diejeniqe von nicht derivatisiertem Somatotropin ist.

Erfindungsgemäß wird ein Somatotropin mit derivatisierter kleiner Schleife zur Verfügung gestellt, das während der langfristigen Lagerung stabil ist und eine Bioaktivität bestitzt, die gleich oder größer als diejenige von nicht derivatisiertem Somatotropin ist. Das derivatisierte Somatotropin unterscheidet sich von dem nicht derivatisiertem Somatotropin insofern, als die Sulfhydrylgruppen an den Cysteinen, die normalerweise die Disulfidbindung der kleinen Schleife bilden, derivatisiert sind; die Sulfhydrylgruppen an den Cysteinen, die normalerweise Hie Disulfidbindung der großen Schleife bilden, sind nicht derivatisiert worden. Das Somatotropin mit kleiner Schleife besitzt deshalb des Merkmal der großen Schleife des nicht derivatisierten Somatotropin, hat jedoch keine kleine Schleife, da die derivatisierten Sulfhydrylgruppen keine Disulfidbindungen bilden können.

Das Somatotropin mit derivatisierter kleiner Schleife hat überraschenderweise eine gleich große oder größere Bioaktivität als das nicht derivatisierte Somatotropin. Das Somatotropin mit kleiner Schleife hat außerdem den Vorteil, daß es zwischen den Sulfhydrylgruppen der kleinen Schleife keine intramolekularen Disulfidbindungen bilden kann, die Somatotropindimere, -oligomere und -zusammenballungen verursachen and das Somatotropin inaktivieren. Das Somatotropin mit derivatisierter kleiner Schleife ist daher während einer langfristigen Lagerung stabil.

In einem weiteren Apsekt der Erfindung wird eine Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, die ein Gemisch aus Somatotropin mit derivatisierter kleiner Schleife in Kombination mit pharmazeutisch annehmbaren Trägermitteln wie beispielsweise verschiedenen Verdünnungsmitteln und Trägersubstanzen enthält. Das Trägermittel kann ein beliebiges bioverträgliches und mit Somatotropin mit derivatisierter kleiner Schleife verträgliches Mittel, vorzugsweise phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung, Tris-HCI, Arginin, Histidin und dergleichen sein. Im allgemeinen kann jede bioverträgliche Lösung oder jedes bioverträgliche Trägermittel mit einem pH zwischen 6 und 11 erfindungsgemäß als ein Trägermittel für das Somatotropin mit derivatisierter kleiner Schleife wirken. Das Somatotropin mit derivatisierter kleiner Schleife wird mit pharmazeutisch annehmbaren Trägermitteln gemischt, um eine Zusammensetzung zu bilden, die während einer langfristigen Lagerung stabil ist und die leicht dosiert und verabreicht werden kann. Die Zusammensetzung ist vorzugsweise eine lyophilisierte Form des Somatotropins mit derivatisierter kleiner Schleife und des Trägermittels.

Ausföhrungsbelsplele

Nach der allgemeinen Beschreibung der Erfindung werden die folgenden Beispiele als besondere Ausführungsfoimen der Erfindung angegeben, die die praktische Anwendung und ihre Vorteile demontieren. Das in den folgenden Beispielen verwendet rekombinante Schweine-Somatotropin (rpST) wurde mittels eines f.coll Mikroorganismus, deponiert an American Type Culture Collection, Rockville MD, unter Nt.53031, hergestellt. Eine vollständige Beschreibung des Mikroorganismus ist in US-Patent Nr.4.656.255 gegeben, das durch Bezugnahme hier aufgenommen wurde. Es ist klar, daß die zur Veranschaulichung angegebenen Beispiele nie ht die Beschreibung oder die Ansprüche in irgendeiner Form einschränken.

Beispiel 1 Selektive Reduktion der Disulfidbindungen der kleinen Schleife mit 2-Mercaptoethanol

5-mg/ml-Lösungen von rekombinanten Schweine-Somatotropin (rpST) in Carbonatpuffer (25mM NaHCO₃,18Na₂CO₃, pH 9,8) wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur in Gegenwart von 0,30,40,50,60,70,80,90, und 10OmM 2-Mercaptoothanol (ME) reduziert. Nach der Reduktion wurde jede Probe bei Raumtemperatur im Dunklen 1 Stunde lung mit 20OmM lodacetamid (IA) umgesetzt, um die von den reduzierten Cystinen gebildeten Sulfhydrylgruppen zu derivatisieren. Die Proben wurden durch SDS-PAGE analysiert.

Die Analyse der SDS-PAGE-GeIs zeigte, daß eine vollständige Reduktion der Disulfidbindungen der kleinen Schleife durch Inkubation mit 5OmM ME erreicht worden war, während dij Disulfidbindungen der großen Schleife unversehrt blieben. Da die kleine Schleife reduziert ist, gibt es einen geringen Rückoinp (1-2 mm) in der Mobilität des rpST infolge der „Extension" der C-terminalen Schleife. Derartige Mobilitätsveränderungun für kreuzvernetzte gegen nicht-kreuzvernetzte Proteine auf SDS-PAGE wurden bereits zuvor mitgeteilt, Griffith, Biochem. J., 126,553-560 (1972). Wenn mehr Reduktionsmittel zugsgeben wird, wird die große Schleife ebenfalls reduziert, was zu einem noch größeren Rückgang in der Mobilität (10-12mm) führt. Das reduzierte Material der großen Schleife ist im wesentlichen unlöslich, so daß, wenn das in >30mM ME reduzierte Material zentrifugiert Wird, nur intaktes Material der großen Schleife im Überstand verbleibt. Diese Ergebnise zeigen, daß etwa 40-5OmM ME eine optimale Ausbeute an reduziertem, carbamidomethyliertem rpST der kleinen Schleife ergibt.

Beispiel 2

Selektive Reduktion der Disulfidbindungen dor kleinen Schleife mit Dithiothreitol 5-mg/ml-Lösungen von rekombinanten Schweine-Somatotropin (rpST) in Carbonatpuffer (25mM NaHCO₃,18mM Na₂CO₃, pH 9,25) wurden 1 Stunde lang in Gegenwart von 0,10,20,30,4C, 50,60 und 10OmM Dithiothreitol (DTT) unter einer Stickstoffatmosphäre bei 37°C reduziert. Nach der Reduktion wurde jede Probe im Dunklen 1 Stunde lang bei 37⁰C bei einem pH zwischen 8,5-9,0 mit 150 mM IA umgesetzt, um die von den reduzierten Cystinen erzeugten Sulfhydrylgruppen zu derivatisieren.

Das überschüssige/nicht umgesetzte IA wurde mit leichtem molearem Überschuß von DTT über IA ausgelöscht und über Nacht gegen 0,1 mM NH₄HCO₃, pH 7,8-8,2 dialysiert. Das dialysiertc rpST wurde nach zweistündiger Hydrolyse mitTPCK-behandeltem Trypsin durch Peptidkartierung analysiert. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.

In Tabelle 1 zeigen die Daten, daß eine vollständige Reduktion der Disulfidbindungen der kleinen Schleife durch Inkubation mit 2OmM DTT erreicht worden war, wobei die Disulfidbindungen der y roßen Schleife unversehrt blieben. Dies wurde später bestätigt, wie in Beispiel 3 gezeigt wird.

Beispiel 3

Charakterisierung des Somatotropin mit derivatlslerjer kleiner Schleife

Nicht derivatisiertes rpSV und nach dem Verfahren vdn Beispiel 1 hergestelltes derivatisiertes rpST wurden unter Verwendung von Trypsin 2 Stunden digeriert. Die dabei entstandenen Trypsinaufschlüsse wurden mittels Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatograph! j (RP-HPLC) analysiert. Die Ergebnisse zeigen HPLC-Zonen mit Retentionszeiten von 40,4 und 98 Minuten, die für die kleine bzw. die große Schleife stehen. Nach der selektiven Reduktion und Carbamidomethylierung dar kleinem Schleife verschwand die HPLC-Zoni mit einer Retentionszeit von 40,4 Minuten vollständig und gleichzeitig tauchten 2 Zonen mit Retentionszeiten von 3,6 und 50,9 Minuten auf. Die Analyse der neuen HPLC-Zonen durch automatischen Edman-Abbau bestätigte, daß die modifizierte rpST-Probe wie vorhergesagt rpST mit derivatisierter kleiner Schleife enthielt. Die Aminosäuresequenzwerte für nicht derivatisierte und denvaiisiörte tryptische Peptide der kleinen Schleife sind in Tabelle 2 angegeben. Ein zusätzlicher Beweis für die Carbamidomethylierung der beiden Cysteine des modifizierten rpST wurde durch die AminosSureanalyse erhalten. Es wurde ein Wert von 1,6 von 2 Carboxymethylcysteinon (CMC) für die theoretische Derivatisierung der eine Schleife erhalten. Diese Werte sind in Tabelle 3 aufgeführt.

Beispiel 4

Bioaktivität des derlvatislerten Somatotroplns

Die Bioaktivität des nicht derivatisierten rpST und des nach dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellten rpST mit derivatisierter kleiner Schleife wurde mittels pST-Bindungstests mit Lebermembranen von trächtigen Kaninchen und '"-!-markiertem rpST bestimmt. Es wurde eine modifizierte Version des Tests, die in Tsushima u.a., Radioreceptor Assay for Growth Hormone, J.CIin.Endocrlnol, Met ab., 37:334-337 (1973) beschrieben ist, angewandt. Die rpST-Probe wurde bei 30°C 3,5 Stunden mit 16000cpm ^U5-l-rpST inkubiert. Der für die Verdrängungskurve dos rpST-Sundards und des rpST mit derivatisierter kleiner Schleife verwendete Konzentrationsbereich lag zwischen 0,38 und 200 ng/ ml. Weitere Informationen über die pST-Bindungstest sind in Tsushima u. a., Radioreceptor Assay für Growth Hormone, J. CIIn. Endocrlnot. Metab, 37:334-337 (1973) beschrieben. Die Ergebnise zeigen, daß die berechnete lodkonzentration bei 50% (IC-SO) des carbamidomethylierten pST 1,24ng/0,5ml Bindungsäquivalent lag, während die nicht derivatisierten und dialysierten Proben einen Wert von 3,0ng/ml bzw. 2,9ng/0,5ml ergaben. Der Standard ergab ein ICw von 2,35 ng/0,5 ml. Aus diesen Werten wurde die prozentuale Aktivität des pST mit derivat'sierter kleiner Schleife mit 181 % im Gegensatz zum Wer* des nicht derivatisierten Somatotropins mit etwa 75% berechnet.

Beispiel 5

Bioaktivität des derivatisierten Somatotroplns

Die Bioaktivität des nicht derivatisierten rpST und des nach dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellten rpST mit derivatisierter kleiner Schleife wurde mittels der Bindungsaktivität in Schweinelebermembranen nach einer Modifizierung des Verfahrens von Haro u.a., Homologous Somatotropin Radio Receptor Assay Utilizing Recombinant Bovine Growth Hormone, MoI. Cell.

Endocrinol., 38:109-116 (1985) bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, daß die berechneten IC-50-Werte des pST mit carbamidomethylierter kleiner Schleife 1,29ng/0,5ml im Vergleich zu 1,61 ng/0,5ml für das nicht derivatisierte pST und den rpST-Standard betrugen. Die Ergebnisse zeigen, daß derivatisiertas rpST eine 125%ige Aktivität im Vergleich zu 100% bei nicht modifiziertem (nicht derivatisiertem rpST) aufwies. Diese Ergebnisse zeigen die völlig unerwartete Erkenntnis, daß die erfindungsgemäß hergestellten Somatotropine nicht nur stabiler, sondern auch bioaktiver sind als ihre nicht modifizierten Vorläufer-Somatotropine.

Beispiel β

Bioaktivität und Biopotenz des derivatisierten Somatotroplns

Die relative Bioaktivität und Biopotenz des nicht derivatisierten prST und des nach dem Verfahren in Beispiel 1 hergestellten rpSTmit derivatisierter kleiner Schleife wurden bestimmt, indem die Körpergewichtszunahme von Ratten, denen die Hypophyse entfernt worden war, gemessen wurde. 4 Gruppen von jeweils 10 dieser Ratten erhielten 9 Tage lang 24pg pST/Tag des pST-Standards, dialysiertes Zn-rpST, Zn-rpST mit derivatisierter kleiner Schleife oder nicht derivatisiertes Zn-rpST. Die Ratten wurden täglich überwacht und ihre Gewichtszunahme wurde über einen Zeitraum von 10 Tagen aufgezeichnet. Die Gewichtszunahme wurde gemessen und die prozentuale relative Bioaktivität wurde als Prozent des Standards berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 ausgewiesen.

In Tabelle 4 zeigen die Werte, daß das derivatisierte rpST eine mittlere prozentuale Gewichtszunahme von 13,5% im Vergleich zu 14,4% des nicht derivatisierten rpST ergab. Die Ergebnisse zeigen außerdem, daß das Carboxy-Ende der kleinen Schleife nicht notwendig ist, damit Somatotropin das Wachstum fördert.

Beispiel 7

Lösungsstabilität des derivatislerton Somatotropins

Lösungen aus 8mg/rnl nicht derivatisiertem rpST und aus rpST mit derivatisierter kleiner Schleife (nach Beispiel 1 mit IA hergestellt), die 0,5% Natriumazid enthielten, wurden entweder in 46mM Carbonatpuffer (pH 9,8) oder phosphatgepuffertcr physiologischer Kochsalzlösung (pH 7,4) hergestellt. Aliqoute Mengen von 1,25ml wurden in Röhrchen für die Eppendorfer Milchzentrifuge bei 37⁰C 0,6,4,6,8,8,22 und 120Tage inkubiert.

Am Ende jeder Inkubationsperiode wurden die aliqouten Mengen herausgenommen und mittels Superose-12-Größenausschluß-Chromatographie mit einer mobilen Phase von 46mM Carbonatpuffer (pH 9,8) analysiert. Die relative Menge an Monomer, Dimer und Zusammenbällungen mit höherer Molekülmasse, die sich gebildet hatten, zeigt, daß es einen höheren prozentualen Anteil an gewonnenem Mc.-iumer gibt, wenn die kleine Schleife reduziert und derivatisiert ist.

Beispiel 8 Stabilität des derivatlslerten Somatotroplns Im nasseryliustand Nicht derivatisiertes rpST und rpST mit derivatisierter kleiner Schleife (nach Beispiel 1 mit IA hergestellt), dio 5 mg/ml enthielten,

wurden gegen 0,46mM Carbonatpuffer dialylsiort und lyophilisiert, um für die weitere Prüfung trockene rpSt-Probenherzustellen. 5 mg trockenes rpST mit derivatisierter kleiner Schleife und nicht derivatisiertes rpST wurden mit 0,01 ml 5OmM

Tris-HCI, pH 7,4,0,05% Natriumazid oder 46mM Carbonatpuffer, pH 9,8,0,05% Natriumazid befeuchtet. Die Paste wurde

14 T'ige lang bei 37⁰C inkubiert. Nach Ablauf dieser Zeit wurde das rpST bis zu einer Endkonzentration von etwa 1,8mg/ml h46mM Carbonatpuffer, pH 9,8, verdünnt, in einem Beschallungsinstrument Branisonic 220 mehrere Minuten beschallt, und bei15000 χ G 5 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde durch das in Beispiel 6 beschriebene chromatographische

Verfahren auf seinen Monomergehalt analysiert. Die Ergebnisse zeigen, daß die Gewinnung von rpST-Monorner bei rpST mit derivfltisiertor kleiner Schleife ungeachtet des Feucht-pH-Wertes viel größer war als bei nicht derivatisiertem rpST. Es sind in Anbetracht der vorangegangenen Erläuterungen offensichtlich viele Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung möglich. Es wird daher davon ausgegangen, daß die Erfindung im Rahmen der anhängigen Ansprüche auf andere als

hier beschriebene Art und Weise praktisch angewandt werden kann. ^J

Tabelle 1 Retentlonsverhalten von mit den kleinen und großen Schleifen pST verbunden tryptlschen Peptlden

Probe	Kleine Schleife	Große Schleife
Nicht modifiziert /T-5 + T-18/	40,4 /T-23 + T-25/	98,0
Reduziert (Nur kleine Schleife) /T-5 + T-18/	3.6/T-23/, 45,0/T-25/	98,0
Reduziert /T-5/, (Kleine und große Schleifen) /T-18/	3,6/T-23/ 45,0/T-25/	80,6» 60,0
Derivatisiert** (Nur kleine Schleife) /T-5 + T-18/	3,6/T-23/, 50,9/T-25/	98,0
Derivatisiert·· /T-5/, (Kleine und große Schleifen) /T-18/	3.6/T-23/ 50,9/T-25/	85,6 74,3

Abkürzungen: Die Retentionszeit (RT) Jeder HPLC-Zone wird in Minuten angegeben.

/T-X/ = Jede Zone wurde analysiert und erhielt elno Bezeichnung als tryptisches Peptid entsprechend der Position von der Aminoterminalsequenz aus.

/T-X + T-Y/ = Zwei tryptische Peptide, die durch oino Disulfidbrücke kovalent verbunden sind.

In nicht modifiziertem pST besteht die kleine Schleife aus zwei tryptischen Peptiden T-23 und T-25, die durch eine Disulfidbrücke kovalent verbunden sind. In gleicher Weise sind T-5 und T-18 in der großen Schleife miteinander verbunden. • = Die Zone T-I eluiert auch an dieser Position

** = Die reduzierten Cysteine wurden mit IA derivatieieit.

Die Trennung von 100pg Tryptisinaufschluß von rpST wurde durch eine RP-HPLC-SSuIe Aquapore C-8 (Brown Lee) erreicht, die mit 0,1%iger Trifluoressigsäure (TFA) voräquliDriert wurde und bei 0,5ml/mln mit 50%igem 2-Propanol in 0,1%iger TFA eluierte.

Tabelle Amlnoslurezusammensetzung* von nicht modifiziertern und modifiziertem rpST

Aminosäure	Nicht modifizierte Probe	Modifizierte Probe	TheoretischerWert
	Mol/Mol	Mol/Mol
ASP	16,5	17,0	16
THR	/,6	7,7	8
SER	12,3	12,6	14
GLU	26,8	27,7	25
PRO	6,1	5,/	5
GLY	8,0	8,0	8
ALA	17,0	15,7	16
CYS"	3,8	2,4	4
VAL	7,6	5,3	8
MET	1,8	1,7	2
ILE	5,5	5,5	24
LEU	23,3	23,2	24
TYR	6,7	6,8	7
PHE	11,6	11,7	12
LYS	10,3	12,6	11
HIS	5,0	5,0	3
ARG	12,6	12,6	13
CMC»»·	0	1,6	siehe CYS
gesamt	182	182	182

PTH-Rest	Menge (pmol)	PTH-Rest	Menge (pmol
PHE	609	Leerwert	-_
VAL	638	ARG	113
GLU	243	ARG	109
SER	223	Leerwert	-
SER	154	Leerwert	_
CYSTIN (-S-S-)	(++)*	Leerwert	-
ALA	214	Leerwert	_
PHE	116	Leorwert	—
Leerwert	_	Leerwert	_

* = durch Aminosäureanalyse nach 24stündiger Hydrolyse bestimmt.

CYS* * = Dieser Wert wurde als Cystin erhalten und wurde mit einem Faktor 2 multipliziert, um den Cysteinwert zu erhalten

(eis Mol/Mol ausgedrückt). CMC" = Der Wert von Carboxymethylcystein wurde unter Verwendung eines geeigneten Standards berechnet.

Tabelle Aminosäuresequenzanalysen von HPLC-Zonen, die für die carbamldomethyllerten Τ-23-Peptlde der kleinen Schleife stehen

(A) HPLC-Zone RT: 40,5 aus der Peptidkarte des nicht modifizierten rpST

Zyklus-Nr.

4 5 6 7 8 9

* - Das Cystin-PTH eluiert bei 14,8 Minuten. Die exakte Menge wurde nicht berechnet, da kein Cystln-PTH-Standard zur Verfü; ung stand. Da

während dss 2. und 3. Edman-Zyklus 2 PTH-Reste freigesetzt wurden, stoht auch fest, daß sich die carboxyterminalen Arg-; rg-Aminsäuren nach 2stündiger Hydrolyse mit Trypsin nicht spalteten. Trypsin kann diese Bindungen nicht hydrolysieren. Es scheint auch, d. ¹Q die Cystin-Arg-Bindung gegen die Trypsinhydrolyse resistent ist.

(B) HPLC-Zone RT: 50,9 aus der Peptidkarte des rpST mit modifizierter kleiner Schleife

Zyklus-Nr.

* = Das Auftrauchan einer neuen PTH-Zone bei RT: 9,24 ist auf das Carbamido' nethylcystein zurückzuführen.

* * = Diese Menge wurde nicht berechnet, da kein CAM-Cys-PTH-Standard zur Verfügung stand.

PTH-Rest	Menge (pmol)
PHE	114
VAL	54
GLU	44
SER	+ +
SER	++
CAM-CYSTEIN	(++)*·
ALA	56
PHE	r>7
Leerweri	_

Tabelle 4

Bestimmung der Bioaktivität von Schwelne-Somatotropln

Somatotropin (ST)	Dosis	% Gewichtszunahme	Standard	% Relative
	M9	Mittelwert	abweichung	Bioaktivität*
			2,9
pST-Standard	24	23,1··	2,5	55···
Dialysiertes Zn-rpST	24	14,4··		62
Zn-rpST mit darivatisierter			2,8
•kleiner Schleife	24	13,5··		58
Nicht derivatisiertes			2,2
Zn-rpST	24	17,1··	74

Im Verhältnis zu dem in gleicher Konzentration getesteten, aus der Hypophyse gewonnenem pST-Standard. Signifikant höher (P < 0,01) als die negative Kontrolle (4,6%, Standardabweichung 3,4). Wenn ST in Hoch-pH-Puffer von 9,5 gelö3t war, betrug seine relative Bioaktivität bei äquivalenter Dosis 51 %.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines stabilen und bioaktiven Somatotropins, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Stufen umfaßt: selektive Reduzierung der Disulfidbindung der kleinen Schleife des Somatotropins zur Erzeugung von Sulfhydrylgruppen; und Derivatisierung der Sulfhydrylgruppen der kleinen Schleife, um ein Somatotropin mit derivatisierter kleiner Schleife herzustellen, wodurch die Sulfhydrylgruppen keine intramolekularen Disulfidbindungen bilden können, die Somatotropindimere, -oligomere und -zusammenballungen verursachen und das Somatotropin inaktivieren.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Somatotropin ausgewählt wird aus der aus Human-, Rinder-, Schweine-, Hunde-, Katzen-, Pferde-, Vogel- und Schaf-Somatotropinen bestehenden Gruppe.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Somatotropin ein rekombinantes Somatotropin ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Somatotropin ausgewählt wird aus der aus Human-, Rinder- und Schweine-Rekombinantsomatotropinen bestehenden Gruppe.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Disulfidbindung der kleinen Schleife des Somatotropins durch eine durch die Formel R-SH dargestellte organische Mercaptoverbindung reduziert wird, worin R ein organischer Kohlenwasserstoff rest mit etwa 1 bis 30 Kohlenstoffatomen ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Disulfidbindung der kleinen Schleife des Somatotropins durch ein Reduktionsmittel, das aus der aus Dithiothreitol und 2-Mercaptoethanol bestehenden Gruppe ausgewählt wird, reduziert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sulfhydrylgruppen der kleinen Schleife des Somatotropins mittels eines aus der aus Ethylenimin, Acrylomitril, N-Ethylmaleimid, 3-Brompropionsäure, 3-Brornpropionamid, lodacetamid, lodessigsäure, N-(lodethyl) trifluoracetamid, 4-Vinylpyridin und Methylmethanthiosulfonat bestehenden Gruppe ausgewählten Derivatisierungsmittels derivatisiert werden.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sulfhydrylgruppen der kleinen Schleife des Somatotropins mit einem Alkylierungsmittel, das die Formel R-X hat, worin X ein Halogen und R eine Alkylkette mit etwa 1-30 Kohlenstoffatomen ist, derivatisiert wird.

0. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß X, I, Br oder Cl ist, und R eine Alkylgruppe mit etwa 1-12 Kohlenstoffatomen ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sulfhydrylgruppen der kleinen Schleife des Somatotropins mit lodacetamid derivatisiert werden.