JPH04500519A - 安定で生物活性のある成長ホルモン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 安定で生物活性のある成長ホルモン 本発明は広義には成長ホルモンに関し、特に安定で生物活性のある成長ホルモン と、安定で生物活性のある成長ホルモン産生法に関する。

発明の背景 成長ホルモンの単離、精製および性状は当業者周知である。一般に、成長ホルモ ン（ｓｏｍａｔｏｔｒｏｐｉｎｅ）、当業者では成長ホルモン（ｇｒｏｗｔｈ　 ｈｏｒ＋＋＋ｏｎｅ）と呼ばれることもあるが、は動物の生涯を通じて下垂体に より産生される。成長ホルモンは骨格の成長、窒素保持、タンパク合成を促進し 、糟および脂質代謝に影響することが知られている。従って、成長ホルモンは全 身同化側として認識されている。

成長ホルモンは摘出下垂体組織がら単離できる。１例として、Ｌｉ、Ｊ、Ｂｉｏ ｌ、Ｃｈｅｗ、２１１．５５（１９５４）を参照のこと、成長ホルモンはまた、 成長ホルモンの産生を特定する組み換えＤＮＡを含む遺伝子工学処理した微生物 からも得られる。たとえば、Ｓｅｅｂｕｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ＋２７６、７９５ −７９８（１９７Ｂ）；Ｓｅｅｂｕｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２７０．４８６−４ ９４（１９７Ｂ）；Ｍａｖｔｉｄ、５ｃｉｅｎｃｅ、２０５．６０２−６０７（ １９７９）：Ｓｅｃｂｕｒｇら、ＤＮＡ、２．３７−４５（１９８３）を参照の こと。

特定種からの成長ホルモンが研究され特性づけられてきた、たとえば、ウシ成長 ホルモンは下垂体前葉で合成され分泌されるポリペプチドであることが知られて いる。

天然ウシ成長ホルモンのヌクレオチドコード順序とアミノ酸配列が報告されてい る；例、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、２２５．７５２１−２４　（１９８０）；Ｗａｌｌｉｓ 、　ＦＯＢＳ　Ｌｅｔｔ、３５．　１１−１４　（１９７３）。

ウシ成長ホルモンはアミノ酸１９１個から成るタンパク質で、最初はアミノ酸２ １７個のウシ成長ホルモン前駆体として合成されることが分っている；アミノ酸 ２６個の信号配列は合成と分泌の途中でＮ末端位がらはずされる０例、Ｌｉｎｇ ａｐａ　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。

７４．２４３２−３６　（１９７７）。

ウシ成長ホルモンの調製は当業者周知である。たとえば、ウシ成長ホルモンは牛 の下垂体膣から抽出されるか、あるいは適当な宿主で組み換えＤＮＡ技法により 産生される０例、Ｍｉｌ　Ｉｅｒら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５５．７５ ２１−２４（１９８０）、　Ｆｒａｚｊｅｒらへの合衆国特許第４，４４３゜５ ３９号は、ウシ成長ホルモン構造遺伝子を酵母細胞内に植えつける組み換えＤＮ Ａ法を利用したウシ成長ホルモンの調製法を開示している＊　Ｈｅｅｈｔへの合 衆国特許第４，３７１，４６２号は、下垂体前葉ペプチドの精製法を開示してい る。１９８３年８月８日捷出、公示番号第１０３．３９５号の欧州特許申請番号 第８３３０４５７４．３号；１９Ｂ２年９月１６日提出、公示番号第０７５．４ ４４号の第８２３０４８８０゜６号；１９Ｂ１年８月２１日提出、公示番号第０ ４７゜６００号の第８１３０３８２４．７号：および英国特許申請番号第２．０ ７３，２４５Ａ号は高収率で組み換えウシ成長ホルモンを産生ずる方法を開示し ている。

ウシ成長ホルモンを産生ずる大腸菌（Ｅ、Ｃｏ１１）株は、受は入れ番号ＡＴＣ Ｃ３１８２６，３１８４０゜３１８４１．３１８４２および３１８４３で＾＊ｅ ｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｔｉｏｎから入手できる。

同様に、ブタとヒトの天然および組み換え成長ホルモンも周知である。たとえば 、ブタとヒトの成長ホルモンを得る方法を開示する上記雑文に加え、合衆国特許 第４．６０４，３５９号はヒト成長ホルモンの微生物による発現法を開示し；合 衆国特許第４，３３２゜７１７号はヒト成長ホルモンの精製法を開示し１１９８ ３年９月２６日提出、公示番号第１０４，９２０号の欧州特許申請番号第８３３ ０５７１７．７号は高収率の組み換えブタ成長ホルモン産生法を開示している。

合衆国特許第４，６０４，３５９号は生物活性のあるヒト成長ホルモンの合成法 を開示し、これには生物活性のあるテトラ−Ｓ−カルバミドメチル誘導体の合成 法も含まれる。その他の多くのこのような雑文や種々の成長ホルモンを得る方法 は当業者周知であり、たとえば、合衆国特許第４．６４５．７５５号はサカナ成 長ホルモンの産生法を開示している。

成長ホルモン産生法は周知であるが、長期間となることが多い成長ホルモン産生 から使用までの期間の成長ホルモン保存方法は十分に開発されていない、成長ホ ルモンは保存中に生物活性のない二量体、低重合体および不溶性集合体を形成す る傾向がある。このような成長ホルモンの生物活性のない形態は利用できる成長 ホルモン量を減少させ、特に不溶性集合体が成長ホルモン溶液中に沈殿を作る場 合は投与中の問題の原因となる。

従って、保存中に生物活性のない二量体、低重合体および集合体を形成しない、 安定で生物活性のある成長ホルモンを産生ずる方法が必要とされる。

ｌ奥皇互！ 従って、本発明の目的は保存中に生物活性のない二量体、低重合体および集合体 を形成しない、安定で生物活性のある成長ホルモンを提供することである。

本発明のもうひとつの目的は、保存中に生物活性のない二量体、低重合体および 集合体を形成しない、安定で生物活性のある成長ホルモン産生法を提供すること である。

さらに本発明の目的は、保存中に生物活性のない二量体、低重合体および集合体 を形成しない、安定で生物活性のある成長ホルモンを含む組成物を提供すること である。

この組成物は長期保存に適し、用量調製や投与が簡単なものでなければならない 。

上記およびその他の目的は、成長ホルモンの小環ジスルフィド結合を選択的に還 元してメルカプト基を産生じ、小環メルカプト基を誘導体化することから成る方 法を用いて達成される。小環メルカプト基の誘導体化は、メルカプト基が分子内 ジスルフィド結合を形成して成長ホルモンの二量体、低重合体および集合体を作 り、成長ホルモンを不活性化することを防ぐ。

本性を用いて産生じた成長ホルモンは長期保存期間中安定で、非誘導、成長ホル モンと同等あるいはそれ以上の生物活性を有する。

誘導成長ホルモンを回収し、必要であればさらに加工して長期保存とそれに続く 動物への投与に適した形の成長ホルモンを産生ずる。

本発明の他の目的、利点、新奇特徴は次の発明の詳細な説明で明らかにする。

１里皇川史星脱貝 異なる動物種から単離した成長ホルモンには高度な配列相同性がある（約９０％ ）；シかじ、異なる種からの成長ホルモンは成長ホルモン鎖中のアミノ酸の数と 配列に違いがある。たとえば、天然ヒト成長ホルモン（ｎ　ｈ　ＳＴ）はアミノ 酸１８８個から成るポリペプチドである。成長ホルモン分子には２つのジスルフ ィド結合がある；１つはアミノ酸１７９とアミノ酸１８６間で、もう１つはアミ ノ酸６８とアミノ酸１６２間にある。このジスルフィド結合は各々アミノ酸６個 の「小環」とアミノ酸９４個の「大造」を形成する。

「小環」とｒ六環Ｊを示すヒト成長ホルモンの完全な配列と構造は文献として援 用される合衆国特許第３゜８５３．８３２号に図解されている。

同様に、天然ブタ成長ホルモン（ｎｐｓＴ）も特有の小環と大造を形成する２つ のジスルフィド結合を有するアミノ酸１９０個のポリペプチドである；１つはア ミノ酸１８０と１８８間、１つはアミノ酸１６３と５２間にある。

天然ウシ成長ホルモン（ＮｂＳＴ）も特有の小環と大造を形成する２つのジスル フィド結合を有するアミノ酸１９１個のポリペプチドである；１つはアミノ酸１ ８１と１８９間、１つはアミノ酸５３と１６４間にある。多数の合成および組み 換え成長ホルモンは種々のアミノ酸数と配列を有する。しかし生物活性のある成 長ホルモンは特有の小環と大造のある三次コンフォーメーシジンを有する。

ここで用いる「成長ホルモン」という術語は「小環」を有するすべての成長ホル モンを含み、「天然成長ホルモン」のみならず、天然成長ホルモンのアミノ酸配 列、実質的にそれと［４１のアミノ酸配列あるいはそれを短縮した配列を有する 「合成成長ホルモン」と「組み換え成長ホルモン」、および置換、削除、伸長、 置き換えその他の変更を受けた配列ををするこれらの類偵体やｍｕｔｅｔｎｓ　 も含む。特に、ここで用いられる成長ホルモンには、天然成長ホルモンと同一配 列であるが、アミノ酸がアミノ末端および／あるいはカルボキシ末端から削除さ れた組み換えタンパク質を含む。このようなタンパク質の例は、デルターフ組み 換えブタ成長ホルモン、デルタ−４組み換えウシ成長ホルモン（天然成長ホルモ ンのアミノ末端から残基を各々４個と７個削除したもの）などがあるが、これに 限られているわけではない。

ここで用いられる「小環誘導成長ホルモンＪという術語はジスルフィド結合によ り形成された大造はあるが、小環のない「成長ホルモン」と表ず；小環メルカプ ト基は小環ジスルフィド結合の形成を妨げるために誘導体化されている。「小環 誘導成長ホルモン」は、常態では小環の原因となるジスルフィド結合を形成する システィンメルカプト基上に誘導基が存在することを除けば、非誘導「成長ホル モン」のアミノ酸配列と同一である。

本発明により、安定で生物活性のある成長ホルモン産生法が提供される。この方 法は成長ホルモン小環ジスルフィド結合を選択的に還元してメルカプト基を産生 ずることと小環メルカプト基を誘導体化することから成る。

小環メルカプト基の誘導体化はメルカプト基が成長ホルモンの二量体、低重合体 および集合体の原因となる分子内ジスルフィド結合を形成して成長ホルモンを不 活性化することを妨げる。本性を用いて産生じた成長ホルモンは長期保存期間中 安定で非誘導成長ホルモンと同等あるいはそれ以上の生物活性を存する。

誘導成長ホルモンを回収し、必要であればさらに加工して長期保存とそれに続く 動物への投与に通した形の成長ホルモンを産生ずる。

ここで用いる成長ホルモンは適合するいずれの供給源からでも得ることができる 。

天然、合成および組み換え成長ホルモンの産生、単離、精製法はこの分野で周知 である。

いずれの動物種由来の成長ホルモンでもここで用いることができる；この成長ホ ルモンにはヒト、ウシ、ブタ、イヌ１、ネコ、ウマ、トリ、サカナおよびヒツジ 成長ホルモンが含まれるが、これらに限られるわけではない。

成長ホルモン小環ジスルフィド結合は、小環ジスルフィド結合を還元するが天理 ジスルフィド結合は還元しない条件下で成長ホルモンを適当な還元剤と反応させ ることにより選択的に還元される。タンパク質メルカプト基と反応する適当な還 元剤を用いることができる。一般的には、還元剤は式Ｒ−３Ｈで表される有機メ ルカプト化合物であり、式中Ｒは炭素原子約１〜３０個を有する有機炭化水素基 である。好ましい還元剤には、２−メルカプトエタノールとジチオスレイトール が含まれるが、これに限られるわけではない。

一般に、単位ミリリットル中約１〜２０ミリグラム（ｍｇ／＋ａ　ｅ　）の成長 ホルモンを含む溶液を還元剤濃度が約１５〜３００ミリモル（ｍＭ）となるに足 る量の還元剤と混合する。溶液のｐＨを約６〜１０に調整し還元剤を約１５〜５ ０℃の温度で約０．５〜３時間、成長ホルモンと反応させる。過剰の還元剤を適 当な方法、透析が好ましいが、で除去し、結果として得られる２つの小環メルカ プト基のある小環還元成長ホルモンを下記のように誘導体化する。

好まし１い１只体例では約５　ｍｇ／ｍ　ｌ　溶液を作るに足る量の成長ホルモ ンを炭酸塩緩衝液（Ｃ，Ｂ−）（ＣＢ−は２５＋ｎＭ　Ｎａ　ＣＯ，，１８ｍＭ 　ＮａｔＣＯｓを含有り、、　ｐＩＩ約９．５）に溶解する。２０ｍＭ溶液を作 るに足る量のジチオスレイト−ルを加え、ｐＨを約８に調整し１、約３７℃で約 １時間、暗所で還元反応を起こす。

もう１例の好ましい具体例では、２−メルカプトエタノールを約５０ｍＭ？１１ 度で含む成長ホルモン５　ｍｇ／ｍｌのＣＢ−溶液（ｐＨ約９．８）を約２０〜 ３７℃で約１時間暗所で反応させる。過剰の還元剤を除去し、成長ホルモンを誘 導体化し、安定で生物活性のある成長ホルモンを生成する。

還元の結果性じる小環メルカプト基は、還元成長ホルモンを適当な誘導剤と反応 させることにより誘導体化される。小環還元メルカプト基の誘導体化には、メル カプト基と反応する適当な誘導剤を用いる。

メルカプト基と反応する多種の誘導剤が当業者既知である。このような種類の例 としては、エチレンイミン、アクリロニトリル、Ｎ−エチルマレイミド、３−ブ ロムプロピオン酸、３−ブロムプロピオンアミド、ヨードアセトアミド、ヨード 酢酸、Ｎ−（ヨードエチルノートリフルオロ−アセトアミド、４−ビニルピリジ ンおよびメチルメタンチオスルホン酸等の誘導剤があるが、これらに限られるも のではない。

最も好ましい誘導剤は、弐Ｒ−Ｘを有するアルキル化剤で、式中Ｘはハロゲン、 Ｉ、ＢｒあるいはＣｊ２が好ましいが、Ｒは炭素原子約１個から３０個、好まし くは約１個から１２個を有する有枝あるいは直鎖のアルキル鎖である。

一般に、１〜２００ｍｇ／ｍｌの小環還元成長ホルモン溶液を誘導剤濃度が約５ ０〜８００ミリモル（ｍＭ）になるに足る量の誘導剤と混合する。

溶液のＰＨを約６〜１０に調整し誘導剤を約１５〜５０℃の温度で約０．５〜３ 時間、成長ホルモンと反応させる。過剰の誘導剤を適当な方法、透析が好ましい が、で除去し結果として得られる２つの誘導体化メルカプト基を含む小環誘導成 長ホルモンを加工し長期保存と動物への投与に適した形態、凍結乾燥形態が一般 的であるが、の成長ホルモンを産生ずる。

好ましい具体例では、ｐＨ約８．５〜９でヨードアセトアミドを約２００ｍＭの 濃度で含む約５　ｓ＋ｇ／ｓ　ｌの小環還元成長ホルモンＣＢ−溶液を約２０〜 ３７°Ｃで約１時間、暗所で反応させる。過剰のヨードアセトアミドを２％ＣＢ −に対して透析して除去する。必要であれば結果として得られた誘導成長ホルモ ンを従来法でさらに精製し、凍結乾燥して長期保存期間中安定で、非誘導成長ホ ルモンと同等あるいはそれ以上の生物活性を有する成長ホルモンを産生ずる。

本発明により長期保存期間中安定で、９非誘導成長ホルモンと同等あるいはそれ 以上の生物活性を有する小環誘導成長ホルモンが提供される。誘導成長ホルモン は、常態で小環ジスルフィド結合を形成するシスティン上のメルカプト基が誘導 体化されている点で、非誘導成長ホルモンと異なる；常態で天理ジスルフィド結 合を形成するシスティン上のメルカプト基は誘導体化されない。従って、小環成 長ホルモンは非誘導成長ホルモンの大造特性を有するが、誘導メルカプト基がジ スルフィド結合を形成できないので小環を持たない。

小環誘導成長ホルモンは驚くべきことに非誘導成長ホルモンと同等あるいはそれ 以上の生物活性を有する。

加えて、小環成長ホルモンは成長ホルモンニ量体、低重合体、集合体の原因とな り成長ホルモンを不活性化する小環メルカプト幕間の分子内ジスルフィド結合を 形成できないという付加利点もある。小環誘導成長ホルモンは従って長期保存期 間中、より安定である。

本発明のもう１つの面では、小環誘導成長ホルモンと種々の希釈液や賦形剤のよ うな製薬上認容できる担体との混合物から成る組成物が提供される。この担体は 生物学的適合性と小環誘導成長ホルモン適合性のある担体で、リン酸塩緩衝塩水 、Ｔｒｉｓ　−ＭＣＩ、アルギニン、ヒスチジン等が好ましい。一般に、ｐＨが ６から１１の間にある生物学的適合性のある溶液あるいは担体で本発明中の小環 誘導成長ホルモンの担体として機能する。小環誘導成長ホルモンを製薬上認容で きる担体と混合し、長期保存期間中安定で用量調製と投与が容易な組成物を形成 する０本組成物は小環誘導成長ホルモンと担体の凍結乾燥形態が好ましい。

本発明を一般的に記述してきたが、本発明の特定具体例として下記の例を挙げそ の実践と利点を説明する。

下記実施例中に用いられる組み換えブタ成長ホルモン（ｒ　ｐ　ＳＴ）はＡｍｅ ｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｔｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ量ｏｎ　、　Ｒｏｃｋ ｖｔｌｌｅＭＤ、で寄託された受け入れ番号５３０３１の大腸菌（Ｅ、Ｃｏ１１ ．）を用いて産生された。

微生物の完全な説明は、文献として援用される合衆国特許第４，６５６，２５５ 号にある。

実施例は実例として与えるものであり、明細書あるいは請求項がこの方法に従う よう限定することを意図するものではない。

１１糎上 ２−メル友ズ上−毛叉ノーｙｖｋ、Ｊ：６小１ｙノ己ヒ乙り上鯖立ｐ１韮力１況 ５　ｅａｇｌ請１の組み換えブタ成長ホルモン（ｒｐＳＴ）炭酸塩緩衝液（２５ ＋＋＋Ｍ　ＮａＨＣＯｓ、　１８５Ｍ　ＮａｔＣＯｓ、　ｐＨ９，８）溶液を室 温で１時間、２−メルカプトエタノール（ＭＥ）０．３０．４０，５０．６０， ７０，８０．９０および１００ｍＭ存在下で還元した。還元後、各標本を室温、 暗所で１時間、２００＋ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡ）と反応させ還元シス ティンから産生じたメルカプト基を誘導体化した。標本を５ＤＳ−ＰＡＧＥによ り分析した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルの分析から５０ｍＭのＭＥとの定温放置（インキュベーシ ヨン）で小環のジスルフィド結合は完全に還元されたが、天理ジスルフィド結合 はそのままであることが示された。小環が還元されると、Ｃ−末端環の「伸長」 によりｒｐｓＴに移動性が少しく１−２日）減少する。架橋結合タンパク質を非 架橋結合タンパク質の５ＤＳ−ＰＡＧＥ上のこのような移動性の変化は既にＧｒ ｉｆｆｉｔｈ、　Ｂ　ｔｏｃｈｅｍ　Ｊ　、＋　１２６．５５３−５６０　（１ ９７２）で報告されている。

より多くの還元剤を加えると天理も還元され、移動性がさらに大きく減少する（ １０−１２ｍ）。３０ｍＭ以上のＭＥで還元した原料を遠心分離すると、天理が 未変化の原料だけが上澄に残ることから、天理還元物質は本質的に不溶性である 。これらの結果から、４０〜５０Ｊ１１ＭのＭＥが小環還元、カルバミドメチル 化ｒｐｓＴの至適収率を与えることが示される。

１施ＬＬ ジチオスレイトールによる砒ｍ≦５仁１１１９１天 ５　ｍｇｌ■ｌの組み換えブタ成長ホルモン（ｒｐＳＴ）炭酸塩緩衝液（２５ｓ ＋Ｍ　ＮａＨＣＯ３，１８５Ｍ　ＮａｔＣＯ，、ｐＨ９，２５）溶液を１時間、 ０，１０，２０，３０，４０，５０゜６０および１００ｍＭのジチオスレイトー ル（ＤＴＴ）存在下で窒素ガス中３７℃で還元した。還元後、各標本を３７℃で ｐ）１８．５〜９．０の間で暗所で１時間１５０ｍＭのＩＡと反応させ還元シス ティンから産生したメルカプト基を誘導体化した。過剰／未反応のＩＡをＩＡよ り若干モル量の多いＤＴＴで消滅させ、１晩０　、　１　Ｍ　Ｎ　Ｈａ　ＨＣＯ ｓ、　ｐ　Ｈ７、８〜８．２に対して透析した。透析したｒｐｓＴをＴＰＣに処 理トリプシンと２時間加水分解した後、ペプチド地図作成により分析した。結果 を表１に示す。

表１のデータから２０ｍＭ　ＤＴＴとの定温放置（インキュベーシヨン）により 小環のジスルフィド結合は完全に還元されたが天理ジスルフィド結合はそのまま であることが示される。これは後に実施例３に示すように確認された。

スｍ ハ　ホルモンの　・け 非誘導ｒｐＳＴと実施例１の方法に従って調製した小環誘導ｒｐｓＴをトリプシ ンを用いて２時間消化した。トリプシン消化物を逆相高圧液体クロマトグラフィ ーＣＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて分析した。その結果、小環と天理に相当する保持 時間各々４０．４分と９８分の）（ＰＬＣ帯が示される。しかし小環の選択的還 元とカルバミドメチル化の後は、保持時間４０，４分のＨＰＬＣ帯は完全に消失 し保持時間３．６分と５０゜９分の２帯が付随して出現した。自動エドマン減成 による新しいＨＰＬＣ帯の分析により変形ｒｐｓＴ標本には予測どうり小環誘導 ｒｐＳＴが含まれることが確認された。非誘導および小環誘導トリプシン性ペプ チドのアミノ酸配列データを表２に示す、変形ｒｐＳＴの２つのシスティンのカ ルバミドメチル化の証拠はさらにアミノ酸分析によっても得られた。１環誘導体 化のカルボキシメチルシスティン（ＣＭＣ）の理論値は２であるが、１．６の値 が得られた。このデータを表３に示す。

裏腹医土 ホルモンの 非誘導ｒｐＳＴと実施例１の方法に従って調製した小環誘導ｒｐｓＴの生物活性 を妊娠ウサギ肝ＩＩＭとｌｔＪ標ｒＩｉｒｐｓＴを用いたｐｓ’ｒ結合分析によ りめた。ツシマら、Ｒａｄｉｏｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　Ｇｒｏ ｗｔｈＨｏｒｍｏｎｅ＋１．Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　Ｍｅｔａｂ＋ 　３７：３３４−３３７（１９７３）が開示した分析変法を用いた：ｒｐＳＴ標 本を３０℃で３．５時間１６０００ｃｐ−の”’Ｉ−ｒｐＳＴと定温放置（イン キユベート）シた。ｒｐｓＴ標準品と小環誘導ｒｐＳＴの置換曲線をめるために 用いた濃度範囲は０．３８〜２００ｒａｇ／＋ｗｌであった。ｐＳＴ結合分析に 関する追加情報はツシマら、　＊　Ｒａｄｉｏｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａ　５ｓａｙ ｆｏｒ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ、　１．Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎ ｏＩ　Ｍｅｔａｄ、　３７：３３４−３３７（１９７３）に記載されている。こ の結果、小環カルバミドメチル化ｐＳＴの算定５０％ヨウ素濃度（ＩＣ−５０＞ は１．２４ｎｇ１０．５＠ｌ結合当量であるが、非誘導および通板標本の値は各 々３．０　ｎｇ／ｍｌを２．９ｎｇ１０．５ｍ　ｌであった。標準品のＩＣｓ＊ は２．３５ｎｇ１０．５ｍ　ｌであった。これらのデータから、小環誘導ｐＳＴ の活性パーセントは１８１％と算定され非誘導成長ホルモンの値である約７５％ とは対照的であった。

犬隻■エ ホルモンの 非誘導ｒｐｓＴと実施例１の方法に従って調製した小環誘導ｒｐＳＴの生物活性 をＨａ　ｒ　ｏらの［組み換えウシ成長ホルモンを利用した同族成長ホルモン放 射受容体分析Ｊ　（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　Ｓｏｍａｔｏｔｒｏｐｉｎ　Ｒａｄ ｉｏ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ａｓ５ａｙ　ＬｉｔｉｌｉｊｉＢ　Ｒｅｃｏｍｂｊｎ ａｎｔ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　）ｔ。

ｒｍｏｎｅ）、　Ｍｏｌ、Ｃｅ１ｌ　Ｅｎｄｏｃｒｔｒ＋ｏ１．、　３８　：　 １０９　１１６（１９８５）の変法に従い、ブタ肝臓膜における結合活性を用い てめた。結果、小環カルバミドメチル化ｐＳＴの算定ＩＣ−５０は１．２９ｎｇ １０．５ｍ　ｌであったが、非誘導ｐｓＴとｒｐｓＴ標準品では１．６１ｎｇ１ ０．５ｍｆｆ１であった。結果から誘導ｒｐＳＴの活性１２５％であったが非変 形（非誘導）ｒｐＳＴでは１００％であったことが示される。

これらの結果から本発明に従って産生される成長ホルモンはその未変形前駆成長 ホルモンより安定なだけではなく生物活性が高いというほとんど予期していなか った所見が示される。

ｌ１性ｉ ホルモンの生　活　と　を 非誘導ｒｐＳＴと実施例１の方法に従って調製した小環誘導ｒｐｓＴの相対生物 活性と生物効力を下垂体切除（ｈｙｐｏｘ）ラットの体重増加測定によりめた。

１群１０例のｈｙｐｏｘラットからなる４群に、ｐｓ’ｒ標準品、透析Ｚｎ＝ｒ ｐＳＴ、小環誘導Ｚｎ−ｒｐＳＴ、あるいは非誘導Ｚｎ−ｒｐＳＴの２４ｕｇＰ ＳＴ／日を９日間投与した。ラットを毎日観察し体重増加を１０日間に渡って記 録した。体重増加を測定し標準品の百分率としての相対生物活性パーセントを算 出した。結果を表４に示す。

表４のデータから非誘導ｒｐｓＴの平均体重増加パーセント１４．４％に対して 、誘導ｒｐＳＴでは１３゜５％であることが示される。さらに、データからカル ボキシ末端小環は成長ホルモンの成長促進作用に欠かせないものではないことが 論証される。

叉腹涯エ ホルモンのｒ ０．５％のアジドナトリウムを含有する非誘導ｒｐＳＴと小環誘導ｒｐｓＴ（実 施例１に従ってＩＡで調製した）の８ｌ１ｇ／ＩＩ２溶液を４６ｍＭ炭酸塩緩衝 液（ｐＨ９，８）がリン酸塩緩衝塩水（ｐＨ７，４）で調製した。

１．２５ｍｆｆ１の部分標本をＢｐｐｅｎｄｏｒｔ　Ｍｉｃｒｏｃｅｔｉｔｒｉ ｆｕｇｅ管に入れ３７℃で０．６．４．６．８．８．２２および１２０日間定温 放置（インキュベート）シた。

各インキエベーシゴン期間終了時に部分標本を取り出し移動相を４６ｍＭ炭酸塩 緩衝液（ｐＨ９，８）とする５ｕｐｅｒｏｓｅｌ　２５ｉｊｅ　−ｅｘｃｌｕｓ ｆｏｎ　７はマドグラフィーを用いてｒｐｓＴ単量体を分析した。単量体、二量 体および高分子量、集合体の相対量から小環が還元され誘導体化された場合は単 量体回収百分率がより高いことが示された。

ス１班ｌ −゛　での“　ホルモンの ５　ｗｇ／ｓｉ　１含有の非誘導ｒｐｓＴと小環誘導ｒｐｓＴ（実施例１に従っ てＩＡで調製し７た）を０．４６ｍＭ炭酸緩衝液に対して透析し凍結乾燥して以 降の試験用の乾燥ｒｐＳＴ１１本を産生した。乾燥小環誘導および非誘導ｒｐｓ Ｔを０．０１ｍｆｆ１の５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７，４，０，０５％ アジドナトリウムあるいは４６ｍＭ炭酸塩緩衝液、ｐ　Ｈ９，８，０，０５％ア ジドナトリウムで湿らせた。ペーストを３７°Ｃで１４日間定温放置した。この 期間終了時にｒｐｓＴを最終濃度約１．８ｍｇ／■ｌとなるように４６ｍＭ炭酸 塩緩衝液、ｐ）（９，８で希釈し、数分間Ｂｒａｎｉｓｏｎｉｃ２２０ソニケー ターで超音波処理し、１５．０００　Ｘ　Ｇで５分間遠心分離した。

上澄を実施例６に記載のクロマトグラフ法で単量体含有量について分析した。結 果がら、湿潤ｐＨにもかかわらず小環誘導ｒｐＳＴは非誘導ｒｐＳＴと比べてｒ ｐＳＴ単量体回収がずっと多がったことが示される。

上記教義に照して多くの変法が可能であることは明らかである。

従って、添付の特許請求範囲内で本発明は明細に記載されたもの以外の方法でも 実行可能であると理解される。

表１ ｐＳＴの小環および天頂と関連するトリプシン性ペプチドの保持行動 ハ　ＲＴ　）　ＲＴ　） 未変化　４０．４　９８．０ −σづ＋Ｔ−１８Ｔ〜２３６−２５ 還元　３．６　（Ｔ−２３） （小環のみ）　４５．０　（Ｔ−２５３９８，０”Ｔ−５＋Ｔ−１８ 還元　３．６　（Ｔ−２３）　８０．６゜〔丁−５〕 （小環および天頂）　４５．０　［Ｔ−２５）　６０．０丁−１８。

誘導体化”　３．６　［Ｔ−２３］　９８．０（小環のみ）　５０．９　ＥＴ− ２５）丁−５＋Ｔ−１８ 誘導体化”　３．６　（丁−２３）　８５．６〔丁−５〕 （小環および天頂３　５０．９　（Ｔ−２５）　７４．３丁−１８ 嶌１０【乳： 各ＨＰＬＣ帯の保持時間（ＲＴ）は分で表す。

（Ｔ−Ｘ）＝各帯を分析し、アミノ末端配列が始まる位置に従ってトリプシン性 ペプチドとして命名した。

（Ｔ−Ｘ＋Ｔ−Ｙ）＝ジスルフィド橋により共有結合する２つのトリプシン性ペ プチド 未変形ｐＳＴでは、小環はジスルフィド結合で共有結合する２つのトリプシン性 ペプチドＴ−２３とＴ−２５から成る。同様に天理ではＴ−５とＴ−１８が結合 している。

＊＝Ｔ−１帯もこの位置で溶出する。

＊＊＝還元システィンがＴＡで誘導体化された。

ｒｐＳＴのトリプシン消化物１１００ｕの分離はＡｑｕａｐｏｒｅ　Ｃ−８ＲＰ 　−ＨＰ　Ｌ　Ｃカラム（Ｂｒｏｗｎ　Ｌｅｅ）で行ったが、これは０．１％ト リフルオロ酢酸（ＴＦ＾）であらかじめ平衡化させ０．１％ＴＦＡ中５０％２− プロパツールを用いて０．５ｍ１１分で溶出した。

表２ ・ノおよび・　ｒ　ＳＴのアミノ　０ アミノ酸　未変形櫟本　変形標本　理論値モル１モル　モル１モル ＴＯＴＡＬ　１８２　１８２　１８２ ＋＝２４時間加水分解後のアミノ酸分析により決定した。

ＣＹＳ”＝この値はシスチンとしてめ、その値を２倍してシスティン値をめた（ モル１モルとして表す）。

ＣＭＣ”−カルボキシメチルシスティンの値は適当な準備高を用いて算出した。

表３ 小環およびカルバミドメチル化Ｔ−２３ペプチドを表すＨＰＬＣ帯のアミノ酸配 列分析 （Ａ）　未変化ｒｐＳＴのペプチド地図のＲ７４０，５分のＨＰＬＣ帯 周期＃　ＰＴＨ残基　量（０モル）　ＰＴＨ残基　量（ｐモル）本　シスチン− ＰＴＨは１４．８分で溶出する。

シスチン−ＰＴＨ標準品が利用できないので正確な量は算出しなかった。第２． 第３のエドマン周期中に２つのＰＴＨ−残基がはずされたことから、トリプシン での２時間の加水分解後、カルボキシ末端のＡｒｇ−Ａｒｇアミノ酸は切れない ということも確証された。

トリプシンはこの結合を加水分解できない。

シスチン−アルギニン結合もトリプシン加水分解に抗する。

（Ｂ）　小環誘導変形ｒｐＳＴのペプチド地図のＲＴ５０．９分のＨＰＬＣ帯 周期＃　ＰＴ）ｌ−残基　量（ｐモル）９　ＢＬＡＮＫ　〜 ＊　ＲＴ：９．２４での新ＰＴＨ帯の出現はカルバミドメチル−システィンによ る。

＊＊ＣＡＭ−Ｃｙｓ　ＰＴＨ標準品が利用できないため量は算出しなかった。

表４ ブタ成長ホルモンの生物活性決定 ＊　同濃度の下垂体由来ｐｓＴ標準品との比較。

＊＊　負の対照群（４，６χ、１ｉｕｓ偏差（５０）３．４）　ニ比ヘテ有意に 高い（ＰＣ，０１） ＊＊＊３１’を９．５の高いｐＨＷｉ衝液に溶解した場合の等用量では、相対生 物活性は５１％であった。

国際ｖＩ４Ｉ４前 グ際調査報告 Ｉ

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．成長ホルモン小環ジスルフィド結合を選択的に還元しメルカプト基を産生す ることと、小環メルカプト基を誘導体化して小環誘導成長ホルモンを産生するこ とによって、成長ホルモンの二量体、低重合体および集合体の原因となり成長ホ ルモンを不活性化する分子内ジスルフィド結合形成を妨げることから成る安定で 生物活性のある成長ホルモン産生法。
2. ２．成長ホルモンがヒト，ウシ，ブタ，イヌ，ネコ，ウマ，トリおよびヒツジ成 長ホルモンから成る群から選択したものである請求項１記載の方法。
3. ３．成長ホルモンが組み換え成長ホルモンである請求項１記載の方法。
4. ４．成長ホルモンがヒト，ウシ，ブタ組み換え成長ホルモンからなる群から選択 したものである請求項３記載の方法。
5. ５．成長ホルモン小環ジスルフィド結合が式Ｒ−ＳＨで麦される有機メルカプト 化合物を用いて還元される請求項１記載の方法で、式中Ｒは炭素原子約１〜３０ 個を有する有機炭化水素基である方法。
6. ６．成長ホルモン小環ジスルフィド結合がジチオスレイトールと２−メルカプト エタノールから成る群から選択した還元剤を用いて還元される請求項１記載の方 法。
7. ７．成長ホルモン小環メルカプト基がエチレンイミン，アクリロニトリル，Ｎ− エチルマレイミド，３−ブロムプロピオン酸，３−ブロムプロピオンアミド，ヨ ードアセトアミド，ヨード酢酸Ｎ−（ヨードエチル）−トリフルオロアセトアミ ド，４−ビニルピリジン，メチルメタンチオスルホン酸から成る群から選択した 誘導剤を用いて誘導体化される請求項１記載の方法。
8. ８．成長ホルモン小環メルカプト基が式Ｒ−Ｘを有するアルキル化剤を用いて誘 導体化される請求項１記載の方法で、式中ＸはハロゲンでＲは約１〜１０個のア ルキル基である方法。
9. ９．Ｘが１，ＢｒあるいはＣｌでＲが炭素原子約１〜１２個を有するアルキル基 である請求項８記載の方法。
10. １０．成長ホルモン小環メルカプト基がヨードアセトアミドを用いて誘導体化さ れる請求項１記載の方法。
11. １１．請求項１の方法に従って産生した成長ホルモン。
12. １２．小環誘導成長ホルモンを含む安定で生物活性のある成長ホルモン。
13. １３．ヒト，ウシ，ブタ，イヌ，ネコ，ウマ，トリ，サカナおよびヒツジ成長ホ ルモンから成る群から選択した請求項１２記載の成長ホルモン。
14. １４．成長ホルモンが組み換え成長ホルモンである請求項１２記載の成長ホルモ ン。
15. １５．ヒト，ウシ，ブタ組み換え成長ホルモンから成る群から選択した請求項１ ４記載の成長ホルモン。
16. １６．成長ホルモン小環メルカプト基がエチレンイミン，アクリロニトリル，Ｎ −エチルマレイミド，３−ブロムプロピオン酸，３−ブロムプロピオンアミド， ヨードアセトアミド，ヨード酢酸，Ｎ−（ヨードエチル）ートリフルオロアセト アミド，４−ビニルピリジン。 およびメチルメタンチオスルホン酸かむ成る群から選択した誘導剤を用いて誘導 体化される請求項１２記載の成長ホルモン。
17. １７．成長ホルモン小環メルカプト基が式Ｒ−Ｘを有するアルキル化剤を用いて 誘導体化される請求項１２記載の成長ホルモンで、式中ＸはハロゲンでＲは炭素 原子約１〜３０個を有するアルキル鎖である成長ホルモン。
18. １８．Ｘが１，Ｂｒ，あるいはＣｌで、Ｒが炭素原子約１〜１２個を有するアル キル基である請求項１７記載の成長ホルモン。
19. １９．放し長ホルモン小環メルカプト基がヨードアセトアミドを用いて誘導体化 される請求項１２記載の成長ホルモン。
20. ２０．製薬上認容できる担体と、小環誘導成長ホルモンから成る安定で生物活性 のある成長ホルモン組成物。
21. ２１．小環誘導成長ホルモンと担体が凍結乾燥されている請求項２０記載の組成 物。
22. ２２．成長ホルンがヒト，ウシ，ブタ，イヌ，ネコ，ウマ，トリ，サカナおよび ヒツジ成長ホルモンから成る群から選択したものてあ請求項２０記載の組成物。
23. ２３．成長ホルモンか組み換え成長ホルモンである請求項２０記載の組成物。
24. ２４．成長ホルモンがヒト，ウシ、ブタ組み換え成長ホルモンかむ成る群から選 択したものである請求項２３記載の組成物。
25. ２５．成長ホルモン小環メルカプト基がエチレンイミン，アクリロニトリル，Ｎ −エチルマレイミド，３−プロムプロピオン酸，３−ブロムプロピオンアミド， ヨードアセトアミド，ヨード酢酸，Ｎ−（ヨードエチル）ートリフルオロアセト アミド，４−ビニルピリジン，およびメチルメタンチオスルホン酸から成る群か ら選択した誘導剤を用いて誘導体化ちれる請求項２０記載の組成物。
26. ２６．成長ホルモン小環メルカプト基が式Ｒ−Ｘを有するアルキル化剤を用いて 誘導体化される請求項２０記載の組成物で、式中ＸはハロゲンでＲが炭素原子約 １〜３０個を有するアルキル鎖である組成物。
27. ２７．ＸがＩ，Ｂｒ，あるいはＣｌでＲが炭素原子約１〜１２個を有するアルキ ル基である請求項２６記載の組成物。
28. ２８．成長ホルモン小環メルカプト基がヨードアセトアミドを用いて誘導体化さ れる請求項２０記載の組成物。