CN1037845C - 稳定的生物活性生长激素的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种具有衍生小环氢硫基的稳定的生物活性生长激素，以及产生小环衍生生长激素的方法。该小环衍生生长激素在长期贮藏期间是稳定的，即，它形成极微量灭活生长激素的二聚体、低聚体和聚集体。该生长激素的生物活性等于或大于非衍生生长激素的生物活性。

Description

稳定的生物活性生长激素的制备方法
本发明涉及生长激素，尤其涉及稳定的生物活性生长激素及其制备方法。
在本领域中，生长激素的分离、纯化和性质是众所周知的。一般来说，生长激素是在动物整个生命期间由垂体产生的。已知生长激素可促进骨骼生长、氮的保留、蛋白质合成及影响糖和脂肪代谢。因此，生长激素被公认为是全面合成代谢剂。
可从切除的垂体组织分离出生长激素(参见Li，J.Biol，Chem.211，55(1954))，还可从通过遗传工程方法处理的含特定产生生长激素的重组体DNA的微生物中得到(参见Seeburg，et al.，Nature，276，795-789(1978)；Seeburg，et al.，Nature，270，486-494(1978)；Martrial，Science，205，602-607(1979)和Seeburg，et al.，DNA，2，37-45(1983))。
业已研究了特种生长激素，揭示了其特性。例如，已知牛生长激素是一种在垂体前叶中合成的并由其分泌的多肽。已报导了天然牛生长激素的核苷酸密码顺序和氨基酸顺序(参见Miller，et al.，J.Biol.Chem.，255，7521-24(1980)及Wallis，FEBS Lett，35，11-14(1973))。牛生长激素是一种具有191个氨基酸的蛋白质，并且开始合成为217个氨基酸的牛生长激素前体，在合成和分泌期间，从N-末端位置除去26个氨基酸的信号顺序(参见Lingapa，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，2432-36(1977))。
在本领域中，牛生长激素的制备是众所周知的。例如，从牛垂体腺提取牛生长激素或通过重组体DNA技术在合适的宿主中产生牛生长激素(参见Miller，et al.，J.Biol.Chem.，255，7521-24(1980))。授于Frazier等人的美国专利4,443,539号公开了一种制备牛生长激素的方法，即，利用重组体DNA方法，将牛生长激素结构基团置于酵母细胞中。授于Hecht的美国专利4,371,462号公开了一种垂体前叶肽的纯化方法。1983年8月8日提交的欧洲专利申请83304574.3号(公开号为103,395)、1982年9月16日提交的82304880.6号(公开号为075,444)和1981年8月21日提交的81303824.7号(公开号为047,600)以及英国专利申请2,073,245A号公开了高得率产生重组体牛生长激素的方法。产生牛生长激素的大肠杆菌株(E.Coli)可从美国典型培养物保藏中心得到，收藏号为ATCC31826、31840、31841、31842和31843。
同样地，天然和重组体的猪和人生长激素的制备也是众所周知的。例如，除以上公开的制备猪和人生长激素的方法之外，美国专利4,604,359号公开了人生长激素的微生物表达方法；美国专利4,332,717公开了人生长激素的纯化方法；1983年9月26日提交的欧洲专利申请83305717.7号(公开号为104,920)公开了高得率产生重组体猪生长激素的方法；美国专利4,604,359号公开了合成具有生物活性的人生长激素的方法，其中包括合成具有生物活性的四-S-脲基甲基衍生物的方法。各种生长激素的其它许多这类文献和方法对熟悉本技术领域的技术人员来说是熟知的，例如美国专利4,645,755号公开了产生鱼生长激素的方法。
虽然产生生长激素的方法是众所周知的，但是在生长激素产生和使用之间的一个很长时期内的贮藏生长激素的方法并没有得到充分研究。在贮藏期间，生长激素易于形成无生物活性的二聚体、低聚体和不溶性聚集体。生长激素的这种无生物活性的形成降低了可以加以利用的生长激素量，这样给药期间会发生一些问题，当生长激素溶液中不溶性聚集体形成沉淀时更是如此。
因此，需要研制一些产生稳定的具有生物活性生长激素的方法，使生长激素在贮藏期间不会形成无生物活性二聚体、低聚体和聚集体。
本发明的目的之一是提供一种稳定的具有生物活性的生长激素，在贮藏期间，它不会形成无生物活性的二聚体、低聚体和聚集体。
本发明的目的之二是提供一种产生稳定的具有生物活性的生长激素的方法，使生长激素在贮藏期间不形成无生物活性的二聚体、低聚体和聚集体。
本发明的目的之三是提供一种含稳定的生物活性生长激素的组合物，该生长激素在贮藏期间，不会形成无生物活性的二聚体、低聚体和聚集体。该组合物应适于长期贮藏、便于剂量制备和给药。
使用下述方法可以实现上述目的和其它目的。该方法包括选择性地还原生长激素小环二硫键，以产生氢硫基和衍生小环氢硫基。衍生小环氢硫基可以避免该氢硫基形成分子内二硫键，该键会形成生长激素二聚体、低聚体和聚集体及灭活生长激素。使用这种方法产生的生长激素在长期贮藏中是稳定的，具有的生物活性等于或大于非衍生生长激素的生物活性。需要时，可回收该衍生生长激素，进一步加工成适于长期贮藏的及施用于动物的生长激素。
从以下对本发明所作详细叙述，使本发明的其它目的、优点和新的特征更为显明。
从各种动物分离得到的生长激素有高度顺序同源性(约96％)，然而，由不同种类的动物得到的生长激素在存在于生长激素链上的氨基酸数量和顺序也是不同的。例如，天然的人生长激素(nhST)是一种含188个氨基酸的多肽。该生长激素分子有2个二硫键，即氨基酸179和186之间的一个及氨基酸68和162之间的一个。这两个二硫键分别形成6个氨基酸“小环”和94个氨基酸“大环”。美国专利3,853,832号介绍了表示“小环”和“大环”的人生长激素的完全顺序和结构。本文将该专利说明书作为参考文献。
同样地，天然的猪生长激素(nhST)是一利含190个氨基酸的多肽，它具有2个二硫键，形成小环和大环的特征，其中一个在氨基酸180至188之间，另一个在氨基酸163至52之间。另外，天然牛生长激素(nhST)是一种含191个氨基酸的多肽，它具有2个二硫键，形成小环和大环的特征，分别在氨基酸181和189之间及氨基酸53和164之间。许多合成和重组体生长激素有各种氨基酸的数量和顺序，但是生物活性生长激素具有带小环和大环特征的三级构形。
本文所用“生长激素”一词包括具有“小环”的任何生长激素，不仅包括“天然生长激素”，还包括具有天然生长激素的氨基酸顺序、(其氨基酸顺序基本上类似于天然生长激素)或其缩短顺序形式的“合成生长激素”和“重组体生长激素”，以及具有取代、缺失、延长、置换或其它修饰顺序的类似物和突变蛋白质。尤其是本文所用生长激素包括氨基酸顺序与天然生长激素顺序相同的重组体蛋白质，但其具有从氨基和/或羧基末端缺失的氨基酸。此类蛋白质的例子包括但并不局限于δ-7重组体猪生长激素、δ-4重组体牛生长激素(分别为具有从氨基末端缺失7个和4个残基的天然生长激素)等。
本文所用“小环衍生生长激素”一词表示具有由二硫键形成的大环但不具有小环的“生长激素”；小环氢硫基已衍生，以防止小环二硫键的产生。除在半胱氨酸硫氢基上存在衍生基团之外，该“小环衍生生长激案”与非衍生“生长激素”在氨基酸顺序方面是相同的。所述半胱氨酸硫氢基通常形成二硫键，是造成小环的主要原因。
本发明提供了产生稳定的生物活性生长激素的方法。该方法包括选择性还原生长激素小环二硫键，以产生氢硫基和衍生小环氢硫基。衍生小环氢硫基可以避免该氢硫基形成分子内二硫键，该键会形成生长激素二聚体、低聚体和聚集体及灭活生长激素。使用这种方法产生的生长激素在长期贮藏中是稳定的，所具有的生物活性等于或大于非衍生生长激素的生物活性。需要时，可回收该衍生生长激素，进一步加工成适于长期贮藏及施用于动物的的生长激素。
本文所用生长激素可从任何合适的来源得到。在本技术领域中，产生、分离和纯化天然、合成和重组体生长激素的方法是众所周知的。本发明可采用来自任一种动物的生长激素，这些生长激素包括但并不局限于人、牛、猪、狗、猫、马、鸟、鱼和羊的生长激素。
在还原小环二硫键而不还原大环二硫键的条件下，使生长激素与合适还原剂反应，可选择性还原生长激素小环二硫键。可以采用能与蛋白质氢硫基反应的任何合适还原剂。一般说来，还原剂是由式R-SH表示的任何有机巯基化合物，式中R是具有大约1-30个碳原子的有机烃基。最佳还原剂包括但并不局限于2-巯基乙醇和二硫苏糖醇。
一般说来，将含约1-20mg/ml生长激素的溶液与足量还原剂混合，使还原剂浓度约为15-300mM。该溶液pH值调节约至6-10，在约15-50℃下，使还原剂与生长激素反应约0.5-3小时。借助任何适宜方法，最好用渗析法除去过量还原剂，将形成的含2个小环氢硫基的小环还原生长激素按下述方法衍生。
在一个最佳实施例中，将足量生长激素溶于碳酸盐缓冲液(CB-)(CB-含25mM NaHCO3，18mM Na2CO3，pH约为9.5)中，产生约5mg/ml溶液。加入足以产生约20mM溶液的二硫苏糖醇，把pH调节至8左右，在37℃下避光还原约1小时。
在另一最佳实施例中，将含约50mM 2-巯基乙醇的约5mg/ml的生长激素的CB-溶液(pH约为9.8)在约20-37℃下避光反应约1小时。除去过量还原剂，生长激素被衍生形成稳定的生物活性生长激素。
由还原生长激素与适当衍生剂反应衍生由还原产生的小环氢硫基。用来衍生小环还原氢硫基的衍生剂可以是任何适宜与氢硫基反应的衍生剂。可与氢硫基反应的许多种衍生剂对熟悉本领域的技术人员来说是熟知的。这类例子包括但并不局限于下述衍生剂：乙撑亚胺，丙烯腈，N-乙基马来酰亚胺，3-溴丙酸，3-溴丙酰胺，碘乙酰胺，碘乙酸，N-(碘乙基)-三氟-乙酰胺，4-乙烯基吡啶和甲醇硫代磺酸甲酯。最佳衍生剂是具有式R-X的烷化剂，式中X是卤素，以I、Br或Cl为佳，R是具有约1-30个碳原子的烷基链(直链或支链)，碳原子数以1-12为佳。
一般说来，将1-200mg/ml小环还原生长激素溶液与足量衍生剂混合，使衍生剂浓度约为50-800mM。将该溶液的pH值调节至约6-10，在约15-50℃下，使衍生剂与生长激素反应约0.5-3小时，用任何适宜方法，最好用渗析法除去过量衍生剂，得到含2个衍生氢硫基的小环衍生生长激素，经处理产生适于长期贮藏和施用于动物的生长激素(一般为冻干剂型)。
在该最佳实施例中，将约5mg/ml含有约200mM碘乙酰胺的小环还原生长激素的CB-溶液(pH约为8.5-9)在约20-37℃下避光反应约1小时。用2％CB-溶液，通过渗析除去过量碘乙酰胺。需要时，将得到的衍生生长激素通过常规方法进一步纯化，并冻干以产生在长期贮藏期间保持稳定的生长激素，它所具有的生物活性等于或大于非衍生生长激素的生物活性。
本发明提供的小环衍生生长激素在长期贮藏中是稳定的，它所具有的生物活性等于或大于非衍生生长激素的生物活性。该衍生生长激素不同于非衍生生长激素，因为在通常形成小环二硫键的半胱氨酸上的氢硫基已衍生，而在通常形成大环二硫键的半胱氨酸上的氢硫基则没有衍生。由于衍生的氢硫基不能形成二硫键，因此，该小环生长激素有非衍生生长激素的大环特征而无小环特征。
意想不到的是，该小环衍生生长激素所具有的生物活性等于或大于非衍生生长激素。此外，该小环生长激素还具有附加优点，即它不能在小环氢硫基之间形成分子内二硫键，该键会产生生长激素二聚体、低聚体和聚集体，以及灭活生长激素。因此，小环衍生生长激素在长期贮藏时更为稳定。
本发明的另一方面，提供了一种组合物，它包括小环衍生生长激素和药物上可接受的载体(如各种稀释剂和赋形剂)的混合物。该载体可以是任何生物上相容的和与小环衍生生长激素相容的载体，最好是磷酸盐缓冲盐水、Tris-HCl、精氨酸、组氨酸等。一般说来，pH值为6-11的任何生物上相容的溶液或载体在本发明中起小环衍生生长激素的载体作用。该小环衍生生长激素与药物上可接受的载体混合，形成长期贮藏中稳定的组合物，制成简便的剂量制剂和给药。该组合物最好是冻干型小环衍生生长激素和载体的混合物。
业已概述了本发明，以下实例作为本发明的具体实施例，论述实际应用及其优点。使用收藏在ATCC，Rockville MD、收藏号为53031号的大肠杆菌(E.Coli)，可产生用于以下实例中的重组体猪生长激素(rpST)。美国专利4,656,255号对该衍生物作了全面说明，本文引作参考文献。很清楚，这些实例用来说明而非限制说明书或权利要求。
实例1
用巯基乙醇选择性还原小环二硫键
在0、30、40、50、60、70、80、90和100mM 2-巯基乙醇(ME)的存在下，于室温将5mg/ml重组体猪生长激素(rpST)的碳酸盐缓冲溶液(25mM NaHCO，18mM Na2CO3，pH9.8)还原1小时。还原后，每个试样在室温避光下，与200mM碘乙酰胺(IA)反应1小时，衍生由还原胱氨酸产生的氢硫基。这些试样用SDS-PAGE分析。
对SDS-PAGE凝胶的分析显示用50mM ME保温，可达到小环二硫键的完全还原，而大环二硫键仍保持完整。当小环还原时，由于C-末端环的“延伸”，rpST的迁移有少量(1-2mm)减少。在先已报导了在SDS-PAGE上交联对非交联蛋白质的这种迁移度变化(参见Griffith，Biochem J.，126，553-560(1972))。当加入更多还原剂时，大环也被还原，迁移度减少更多(10-12mm)。该大环还原物质基本上是不可溶的，因为当还原的物质在＞30mM MEQ中离心时，只有完整的大环物质仍保留在上清液中。这些结果表明，约在40-50mM MEQ中可得到小环还原的、脲基甲基化rpST的最佳得率。
实例2
用二硫苏糖醇选择性还原小环二硫键
在0、10、20、30、40、50、60和100mM二硫苏糖醇(DTT)的存在下，在氮气氛和37℃下，将5mg/ml重组体猪生长激素(rpST)的碳酸盐缓冲液(25mM NaHCO，18mM Na2CO3，pH9.25)还原1小时。此后，每一试样在pH8.5-9.0和37℃避光下，与150mM IA反应1小时，衍生从还原的胱氨酸产生的氢硫基。在IA上，用稍过量摩尔于IA的DTT抑制过量/未反应的IA，并于0.1M NH4HCO3(pH7.8-8.2)中渗析过夜。用TPCK处理的胰蛋白酶水解2小时后，借助肽图分析经渗析的rpST。结果示于表1。
参照表1，表中数据显示用20mM DTT保温，可达到小环二硫键的完全还原，而大环二硫键仍保持完整。这在下面实例3中进一步证实。
实例3
小环衍生生长激素的特性
按实例1的方法制备的非衍生rpST和小环衍生rpST，用胰蛋白酶消化2小时，采用反相高压液相色谱法(RP-HPLC)分析胰蛋白酶消化液。结果显示小环和大环在HPLC区滞留时间分别为40.4和98分钟。然而，在小环选择还原和脲基甲基化之后，该保留时间为40.4分钟的HPLC区完全消失，随之出现滞留时间为3.6和50.9分钟的两个区。如预先估计的，通过自动操纵的埃德曼降解法对新的HPLC区作分析证实了修饰rpST试样含有小环衍生rpST。非衍生的和小环衍生胰蛋白酶分解形成的肽段的氨基酸顺序数据示于表2。通过氨基酸分析，可获得修饰rpST的2个半胱氨酸的脲基甲基化附加数据。得到理论上1环衍生的2个羧甲基半胱氨酸(CMC)中的值为1.6。这些数据示于表3。
实例4
衍生生长激素的生物活性
采用妊娠兔肝膜和125I-标记rpST，通过pST结合测定方法测定按实例1的方法制备的非衍生rpST和小环衍生rpST的生物活性。使用公开于Tsushima的Radioreceptor Assay for Growth Hormoe，J.Clin.Endocrinol.Metab.，37：334-337(1973)中的改进分析方法，即：用16,000cpm125I-rpST将rpST试样在30℃保温3.5小时。用来表示rpST标准和小环衍生rpST移置曲线的浓度范围为0.38-200ng/ml。用于pST结合测定的其它资料参见Tsushima等人的Radioreceptor Assay forGrowth Hormone.J.Clin.Endocrinol.Metab.，37：334-337(1973)。这些结果说明，在50％(IC-50％)小环脲基甲基化pST的计算碘浓度是1.24ng/0.5ml，相当于结合测定浓度，而由非衍生和渗析试样得出的浓度值分别为3.0ng/ml和2.9ng/0.5ml。IC50标准值为2.35ng/0.5ml。由这些数据计算出小环衍生pST的百分活性是181％，而非衍生生长激素的值约为75％。
实例5
衍生生长激素的生物活性
按照Haro等人在Homologous Somatotropin Radio Receptor AssayUtilizing Recombinant Bovine Growth Hormone，Mol.CellEndocrinol.，38：109-116(1985)中介绍的改进方法，采用猪肝膜的结合活性来测定按实例1的方法制备的非衍生rpST和小环衍生rpST的生物活性。这些结果说明小环脲基甲基化pST的IC-50计算值是1.29ng/0.5ml，而非衍生pST和rpST标准值为1.61ng/0.5ml。这些结果表明，与活性为100％未修饰(非衍生)rpST相比，衍生rpST具有125％活性。这些结果显示了本发明意想不到优点，即按本发明产生的生长激素与未修饰的生长激素前体相比，不仅更稳定而且生物活性更高。
实例6
衍生生长激素的生物活性和生物效力
通过测量垂体切除(hypox)鼠的体重增量来测定按实例1方法制备的非衍生rpST和小环衍生rpST的相对生物活性和生物效力。以10只hypox鼠为一组(共计4组)进行试验，每天使其接受24ngpST(属于标准pST、渗析Zn-rpST、小环衍生Zn-rpST或非衍生Zn-rpST)，共计9天。每天检查这些鼠，记录它们十天内的体重增加量，根据标准百分比测定体重增量和计算百分比生物活性，结果示于表4。
参照表4，表中数据显示与非衍生rpST 14.4％相比，衍生rpST产生的平均百分重量为13.5％。此外，该数据证明，羧基末端小环不需要生长激素促进生长。
实例7
衍生生长激素溶液的稳定性
在46mM碳酸盐缓冲液(pH9.8)或磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)中制备含有0.5％叠氮化钠的8mg/ml非衍生rpST和小环衍生rpST(按实例1用IA制备)溶液。将1.25ml的等分试样置于Eppendorf微量离心管中，于37℃保温0.6、4.6、8.8、22和120天。
在每一保温期末，移出等分试样用Superose-12筛析色谱法和46mM碳酸盐缓冲液(pH9.8)流动相分析rpST单体。形成的单体、二聚体和高分子量聚集体的相对量表明，当小环被还原和衍生时，可回收高百分率的单体。
实例8
呈湿态衍生生长激素的稳定性
用0.46mM碳酸盐缓冲液渗析含5mg/ml的非衍生rpST和小环衍生rpST(按实施例1用IA制备)，并冻干制成无水rpST试样，以便进一步试验。用0.01ml 50mM Tris-HCl(pH7.4)、0.05％叠氮化钠或46mM碳酸盐缓冲液(pH9.8)、0.05％叠氮化钠湿润5mg无水小环衍生和非衍生rpST。该糊状物可在37℃保温14天，在这一时期末，将该rpST置于46mM碳酸盐缓冲液(pH9.8)中稀释至最终浓度约为1.8mg/ml，放在Branisonic220超声破碎器中进行超声处理几分钟，以15000×G离心5分钟。通过实例6中所述色谱法分析上清液的单体含量。结果表明，与非衍生rpST比较时，小环衍生rpST的rpST单体回收率要高得多，而这与湿pH无关。
显然，按照上述教导，对本发明作出许多修改和变更是可能的。因此，可以理解除了作特殊说明之外均属所附的权利要求范围内实施本发明。
表1
与小环和大环pST结合的胰蛋白酶分解形成肽的保留状态
试样          小环(RT分钟)    大环(RT分钟)未修饰的              40.4           98.0
              〔T-23+T-25〕  〔T-5+T-18〕还原的(仅小环)     3.6〔T-23〕，     98.0
               45.0〔T-25〕  〔T-5+T-18〕还原的，           3.6〔T-23〕，  80.6*〔T-5〕(小环和大环)       45.0〔T-25〕   60.0〔T-18〕衍生的**(仅小环)  3.6〔T-23〕，     98.0
               50.9〔T-25〕  〔T-5+T-18〕衍生的**，        3.6〔T-23〕，  85.6〔T-5〕(小环和大环)       50.9〔T-25〕   74.3〔T-18〕
缩写词注释：
每一HPLC区的保留时间(RT)以分钟计。
〔T-X〕＝分析每一端带，并按氨基末端顺序开始的位置标明胰蛋白酶分解形成的肽段。
〔T-X+T-Y〕＝由二硫桥共价连接的2个胰蛋白酶分解形成的肽段。
在未修饰的pST中，小环包括2个胰蛋白酶分解形成的肽段T-23和T-25，它们由二硫键共价连接。在大环中同样地连接T-5和T-8。
*＝在该位置上洗脱T-1区。
**＝用IA衍生还原的半胱氨酸。
通过Aquapore C-8 RP-HPLC柱(Brown-Lee)分离100ng rpST胰蛋白酶消化液，用0.1％三氟乙酸(TFA)预平衡，用50％ 2-丙醇的0.1％TFA溶液以0.5ml/min速度洗脱。
表2
未修饰和修饰的rpST的氨基酸组分+氨基酸    未修饰试样(摩尔)    修饰试样(摩尔)   理论值ASP           16.5              17.0             16THR           7.6               7.77             8SER           12.3              12.6             14GLU           26.8              27.7             25PRO           6.1               5.7              5GLY           8.0               8.0              8ALA           17.0              15.7             16CYS*         3.8               2.4              4VAL           7.6               5.3              8MET           1.8               1.7              2ILE           5.5               5.5              24LEU           23.3              23.2             24TYR           6.7               6.8              7PHE           11.6              11.7             12LYS           10.3              12.6             11HIS           5.0               5.0              3ARG           12.6              12.6             13CMC**        0                 1.6              见CYS总计          182               182              182
+＝24小时水解后，由氨基酸分析测定。
CYS*＝得到的胱氨酸值，乘以系数2，得到半胱氨酸的值(以摩尔表示)，
CMC**＝用合适的标准，计算出的羧甲基半胱氨酸的值。
表3
HPLC区的氨基酸顺序分析表示小环和脲基甲基化T-23肽
(A)HPLC区RT：40.5(根据未修饰rpST的肽图)
周期#     PTH残基   量(pmol)     PTH残基    量(pmol)
  1       PHE         609         空白         -
  2       VAL         638         ARG         113
  3       GLU         243         ARG         109
  4       SER         223         空白         -
  5       SER         154         空白         -
  6       胱氨酸    (-S-S-)(++)* 空白         -
  7       ALA         214         空白         -
  8       PHE         116         空白         -
  9       空白         -          空白         -
*该胱氨酸-PTH洗脱14.8分钟。由于胱氨酸-PTH标准值的不可靠性，不能计算精确值。因为在第2和第3埃德曼周期中释放两个PTH残基，所以还可以证实，在用胰蛋白酶水解2小时后，羧基末端Arg-Arg氨基酸未裂解。胰蛋白酶不能水解这些键。还可明显看出，胱氨酸-Arg键具有耐胰蛋白酶水解的特性。
(B)HPLC区RT：50：9(根据小环修饰rpST的肽图)
       周期#       PTH残基        量(pmol)
         1         PHE              114
         2         VAL              54
         3         GLU              44
         4         SER              ++
         5         SER              ++
         6         CAM-半胱氨酸*    (++)**
         7         ALA              56
         8         PHE              37
         9         空白              -
*由于脲基甲基-半胱氨酸，在RT9.24分钟出现新PTH区。
**由于CAM-Cys PTH标准值的不可靠性，未计算该值。
表4
猪生长激素的生物活性测定生长激素(ST)    剂量ng  ％增量    标准编差  ％相对生物活性*PST标准             24    23.1**      2.9          55***渗析Zn-rpST         24    14.4**      2.5          62小环衍生Zn-RpST     24    13.5**      2.8          58非衍生Zn-rpST       24    17.1**      2.2          74
*相对于以相似浓度试验的垂体衍生pST标准值
**显著高(p＜0.1)于负对照(4.6％，标准偏差(SD)3.4)
***当ST在相同剂量溶于pH9.5缓冲液时，其相对生物活性为51％。

Claims (10)

1.一种产生稳定的生物活性生长激素的方法，其特征在于该方法包括：
选择性还原生长激素小环二硫键，以产生氢硫基，其中所用还原剂是由式R-SH表示的有机巯基化合物，其中R是具有1-6个碳原子的烃基，该烃基任选被羟基或巯基取代，选择性还原的条件是：生长激素的浓度为1-20mg/ml，还原剂浓度为15-300mM，pH值为6-10，反应温度为15-50℃，反应时间为0.5-3小时；及
衍生小环氢硫基，以产生小环衍生生长激素。
2.按权利要求1的方法，其中所述生长激素选自人、牛、猪、狗、猫、马、鸟和羊的生长激素。
3.按权利要求1的方法，其中所述生长激素是重组体生长激素。
4.按权利要求3的方法，其中所述生长激素选自人、牛和猪的重组体生长激素。
5.按权利要求1的方法，其中，用由式R-SH表示的有机巯基化合物还原生长激素小环二硫键，式中R是具有1-6个碳原子的烃基，所述烃基任选被羟基或巯基取代。
6.按权利要求1的方法，其中，用选自二硫苏糖醇和2-巯基乙醇的还原剂还原生长激素小环二硫键。
7.按权利要求1的方法，其中，用衍生剂衍生生长激素小环氢硫基，所述衍生剂选自：乙撑亚胺，丙烯腈，N-乙基马来酰亚胺，3-溴丙酸，3-溴丙酰胺，碘乙酰胺，碘乙酸，N-(碘乙基)-三氟乙酰胺，4-乙烯基吡啶和硫代甲磺酸甲酯。
8.按权利要求1的方法，其中，用具有式R-X的烷化剂衍生生长激素小环氢硫基，式中X是卤素，R是具有1-7个碳原子的氨基甲酰基烷基。
9.按权利要求8的方法，其中X是I、Br或Cl，R是具有约1-12个碳原子的烷基。
10.按权利要求1的方法，其中用碘乙酰胺衍生生长激素小环氢硫基。
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