HU206375B - Process for producing biologically active, stable somatotropins and pharmaceutical compositions comprising same as active ingredient - Google Patents
Process for producing biologically active, stable somatotropins and pharmaceutical compositions comprising same as active ingredient Download PDFInfo
- Publication number
- HU206375B HU206375B HU895729A HU572989A HU206375B HU 206375 B HU206375 B HU 206375B HU 895729 A HU895729 A HU 895729A HU 572989 A HU572989 A HU 572989A HU 206375 B HU206375 B HU 206375B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- somatotropin
- loop
- derivatized
- small
- small loop
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 36
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 title claims description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 5
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 103
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 103
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 25
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 8
- -1 mercapto compound Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 6
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 2
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000003111 growth hormone derivative Substances 0.000 claims 1
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 claims 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 13
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 10
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 9
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 8
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 8
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 8
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101000664737 Homo sapiens Somatotropin Proteins 0.000 description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- JJVXHDTWVIPRBZ-VKHMYHEASA-N (2r)-2-[carboxy(methyl)amino]-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)N(C)[C@@H](CS)C(O)=O JJVXHDTWVIPRBZ-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N cystine group Chemical group C([C@@H](C(=O)O)N)SSC[C@@H](C(=O)O)N LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 2
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 210000004198 anterior pituitary gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 2
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBIVLAVBOICUQX-UHFFFAOYSA-N 3-bromopropanamide Chemical compound NC(=O)CCBr DBIVLAVBOICUQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHXNZYCXMFBMHE-UHFFFAOYSA-N 3-bromopropanoic acid Chemical compound OC(=O)CCBr DHXNZYCXMFBMHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 4-ethenylpyridine Chemical compound C=CC1=CC=NC=C1 KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N N-tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)N[C@H](C(=O)CCl)CC1=CC=CC=C1 MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 241000011102 Thera Species 0.000 description 1
- 241000656145 Thyrsites atun Species 0.000 description 1
- RAMJAOQFYZREOM-UHFFFAOYSA-N [I].CC(N)=O Chemical compound [I].CC(N)=O RAMJAOQFYZREOM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229940124325 anabolic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003263 anabolic agent Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 235000021053 average weight gain Nutrition 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- UYMKPFRHYYNDTL-UHFFFAOYSA-N ethenamine Chemical compound NC=C UYMKPFRHYYNDTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical group 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 229960001913 mecysteine Drugs 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000012488 skeletal system development Effects 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004532 somatropin Drugs 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Description
A találmány általában szomatotropinokra, különösen stabil és biológiailag aktív szomatotropinokra, valamint stabil és biológiailag aktív szomatotropinok előállítására szolgáló eljárásokra vonatkozik.
A szomatotropinok izolálása, tisztítása és tulajdonságai a szakirodalomból ismertek. A szomatotropin, más néven növekedési hormon általában az állat egész élete során termelődik a hipofízisben, A szomatotropin ismerten elősegíti a csontváz fejlődését, a niírogén-retenciót, a protein-szintézist, és befolyásolja a glükózés lipid-metabolizmust. Ennek megfelelően a szomatotropint általános anabolikus szerként tartják számon.
A szomatotropint kimetszett hipofízisszövetből lehet izolálni [Li, J. Bioi; Chem. 211, 55 (1954)]. A szomatotropin genetikailag átalakított mikroorganizmusokkal is előállítható, amelyek szomatotropin termelésére képes rekombináns DNS-t tartalmaznak [Seeburg és munkatársai, Natúré, 270, 486-494 (1978); Martial, Science, 205, 602-607 (1979); és Seeburg és munkatársai, DNA, 2,37-45 (1983)].
Különböző fajokból származó szomatotropinokat tanulmányoztak és jellemeztek már. A marha-szomatotropin például egy polipeptid, amely a hipofízis elülső lebenyében termelődik és onnan választódik ki. A natív marha-szomatotropinnak ismert a nukleotid kódoló szekvenciája és aminosav-szekvenciája is [Miller és munkatársai, J. Bioi. Chem. 255, 7521-24 (1980)]; és Wallis, FEBS Letters, 35 11-14 (1973)]. A marha-szomatotropin egy 191 aminosavból álló protein, amely eredetileg 217 aminosavból álló marhapreszomatotropinként szintetizálódik; a 26 aminosavból álló szignálszekvencia a szintézis és kiválasztás során hasad le az N-terminális helyzetből [Lingapa és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 243236 (1977)].
A marha-szomatotropin előállítása a szakirodalomból jól ismert. A marha-szomatotropin például a szarvasmarha hipofíziséből extrahálható vagy megfelelő gazdaszervezetben rekombináns DNS technikával állítható elő [Miller és munkatársai, J. Bioi. Chem. 255, 7521-7524 (1980)]. A 4 443 539 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint Frazier és munkatársai úgy állítanak elő marha-szomatotropint, hogy a marha-szomatotropin struktúrgént élesztősejtekbe viszik be. Hecht a 4371462 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban eljárást ismertet a hipofízis elülső lebenyéből származó peptidek tisztítására. A 83 304574.3 számon 1983. 08. 08-án bejelentett, 103395 számon publikált, a 82304880.6 számon 1982. 09. 16-án bejelentett, 075 444 számon publikált, és a 81303824.7 számon 1981. 08. 21-én bejelentett, 047600 számon publikált európai szabadalmi leírásokban, valamint a 2 073 245A számú nagybritanniai szabadalmi leírásban eljárásokat ismertetnek rekombináns marha-szomatotropin magas hozammal való előállítására. A marha-szomatotropint termelő E. coli törzsek az American Type Culture Collection-ben ATCC 31826,31840,31841,31842 és 31843 számon vannak letétbe helyezve.
Hasonlóképpen jól ismert a természetes és rekombináns sertés- és humán szomatotropinok előállítása is. így például a fent megadott irodalmi helyeken kívül, amelyek ismertetik a sertés- és humán szomatotropin előállítására alkalmas eljárásokat, a 4332717 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetik a humán szomatotropin expresszióját mikroorganizmusokban; és a 83 305717.7 számon 1983. 09. 26-án bejelentett, 104920 számon publikált európai szabadalmi leírásban eljárásokat ismertetnek rekombináns sertés-szomatotropinok előállítására, magas hozamokkal. A 4604359 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, eljárást ismertet biológiailag aktív humán szomatotropin szintetizálására; többek között a biológiailag aktív teíra-(S-karbamoil-metil)-származékok szintetikus előállítását is ismerteti. Számos más irodalmi helyen is ismertetnek eljárásokat különféle szomatotropinok előállítására, így például a 4645755 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás hakszomatotropin előállítására ismertet eljárást.
Noha a szomatotropin előállítására szolgáló eljárások jól ismertek, nem fejlesztettek ki módszereket a szomatotropin tárolására a szomatotropin előállítása és felhasználása közötti - gyakran hosszú - időtartamra. A szomatotropinok hajlamosak inaktív dimerek, oligomerek és oldhatatlan aggregátumok képzésére a tárolás során. A szomatotropin fenti inaktív formái miatt csökken a hasznos szomatotropin mennyisége és ez problémát okoz a felhasználás során, különösen akkor, ha a szomatotropin oldatában az oldhatatlan aggregátumok csapadékot képeznek.
A fentiek miatt szükség van olyan eljárásokra, amelyekkel stabil és biológiailag aktív szomatotropinok állíthatók elő, melyek nem képeznek biológiailag inaktív dimereket, oligomereket és aggregátumokat raktározásuk során.
Célunk ennek megfelelően egyrészt stabil és biológiailag aktív szomatotropin előállítása volt, amely nem képez biológiailag inaktív dimereket, oligomereket és aggregátumokat raktározása során.
A találmány további célja olyan eljárás kidolgozása volt, amely alkalmas stabil, biológiailag aktív szomatotropin előállítására, amely szomatotropin nem képez biológiailag inaktív dimereket, oligomereket és aggregátumokat raktározása során.
A találmány további célja gyógyászati készítmények előállítása volt, amelyek hatóanyagként stabil, biológiailag aktív szomatotropint tartalmaznak, amely nem képez biológiailag inaktív dimereket, oligomereket és aggregátumokat raktározása során. A készítménynek hosszú időn keresztül tárolhatónak kell lennie, amelyből könnyen elkészíthető a beadandó forma, és az egyszerűen beadható.
A fenti célokat azáltal érjük el, hogy a szomatotropin kis hurokját alkotó diszulfid-kötéseket szelektíven merkaptocsoportokká redukáljuk és az így kapott merkaptocsoportokat egyéb csoportokká alakítjuk. A kis hurokból származó merkaptocsoportok ilyen derivatizálásával megakadályozzuk azt, hogy azok intramole1
HU 206 375 Β kuláris diszulfid-hidakat képezzenek, vagyis szomatotropin dimerek, oligomerek, és aggregátumok alakuljanak ki, amelyek a szomatotropin inaktiválódásához vezetnek. A találmány szerinti eljárással előállított szomatotropin hosszú időn keresztül stabil, és biológiai aktivitása azonos, vagy nagyobb, mint a derivatizálatlan szomatotropiné. A derivatizált szomatotropint kinyerjük, és kívánt esetben további feldolgozásnak vetjük alá, ezáltal olyan szomatotropint nyerünk, amely hosszú időn keresztül tárolható, és adagolható állatoknak.
A találmány további céljai, előnyei és új vonásai az alábbi részletes leírásból ismerhetők meg.
A különböző fajokból izolált szomatotropinok szekvenciájának homológiája magas (mintegy 96%), azonban a különböző fajokból származó szomatotropinok különböznek egymástól a szomatotropin láncában lévő aminosavak számában és szekvenciájában.
így például a natív humán szomatotropin (nhST) 188 aminosavból álló polipeptid. A szomatotropin molekulában két diszulfid-kötés van; az egyik a 179. és 186. aminosavak között, a másik a 68. és a 162. aminosavak között. Ezek a diszulfid-hidak egy hat aminosavból álló ún. kis hurkot és egy 94 aminosavból álló ún. nagy hurkot alkotnak A humán szomatotropin teljes szerkezetét, amelyből látható a kis hurok és a nagy hurok, a 3 853 832 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetik
Hasonlóképpen, a natív sertés-szomatotropin (npST) egy 190 aminosavból álló, két diszulfid-kötéssel rendelkező polipeptid, amelyek jellegzetes kis és nagy hurkot képeznek, egyiket a 180. és 188. aminosavak, másikat a 163. és 52. aminosavak között
A natív marha-szomatotropin (nbST) egy 191 aminosavból álló, jellegzetes kis és nagy hurkot képező két diszulfid-kötéssel rendelkező polipeptid, az egyik diszulfidkötés a 181. és 189. aminosavak, a másik az 53. és 164. aminosavak között található.
Számos szintetikus és rekombináns szomatotropin ismert, amelyekben az aminosavak száma és szekvenciája eltérő. Azonban a biológiailag aktív szomatotropinok tercier konformációjában mindig megtalálható a kis hurok és a nagy hurok.
A leírásban szomatotropin alatt minden olyan szomatotropin értendő, amelyben a nagy hurkon kívül megtalálható a kis hurok, nemcsak a natív szomatotropinok, hanem a szintetikus szomatotropinok és rekombináns szomatotropinok is, amelyek a natív szomatotropinnal azonos, vagy azzal lényegében hasonló aminosav-szekvenciával rendelkeznek, továbbá ezek analógjai és mutánsai, amelyek szubsztituált, törölt, megM hosszabbodott, kicserélt vagy egyéb módon megváltoztatott szekvenciával rendelkeznek. A leírásban szomatotropin alatt különösen natív szomatotropinnal azo< nos szekvenciájú rekombináns proteint értünk, amelyből azonban az amino- és/vagy karboxil-terminális végről bizonyos aminosavak hiányoznak. A fenti proteinekre példaként említhetjük a 8-7 rekombináns sertés-szomatotropint, a δ-4 rekombináns marha-szomatotropint (natív szomatotropinok, amelyek amino-terminális végéről 7, illetve 4 aminosavmaradék hiányzik), és a hasonló szomatotropinokat.
A leírásban kis hurokban derivatizált szomatotropin alatt olyan szomatotropinokat értünk, amelyekben megtalálható a diszulfid-kötés által kialakított nagy hurok, de nincs bennük kis hurok; a kis huroknak megfelelő merkaptocsoportok derivatizálásával megakadályoztuk a kus hurkot alkotó diszulfid-kötés kialakulását A kis hurokban derivatizált szomatotropin ami10 nosav-szekvenciáját tekintve azonos a nem-derivatizált szomatotropinnal, azzal az eltéréssel, hogy azokat a cisztein-merkaptocsoportokat, amelyek normális esetben diszulfid-kötéssel a kis hurkot alkotják, megfelelő csoportok bevitelével merkapto-származékokká alakít15 juk.
A találmány szerinti eljárással stabil és biológiailag aktív szomatotropin állítható elő. A találmány szerinti eljárás értelmében a szomatotropin kis hurokját alkotó díszulfid kötést szelektíven merkaptocso20 porttá redukáljuk, és a kis hurokból származó merkaptocsoportokat derivatizáljuk. A kis hurokból származó merkaptocsoportok derivatizálásával megakadályozzuk, hogy a merkaptocsoportok intramolekuláris diszulfid-kötések kialakítása révén szomatotropin dimereket, oligomereket és aggregátumokat képezzenek, és inaktiválják a szomatotropint. A találmány szerinti eljárással előállított szomatotropin hosszú időn keresztüli tárolás esetén is stabil, és biológiai aktivitása azonos, vagy nagyobb, mint a nem deriva30 tizált szomatotropin biológiai aktivitása. A derivatizált szomatotropint kinyerjük, majd kívánt esetben további feldolgozással hosszú időn keresztüli tárolásra és azt követően állatoknak való adagolásra alkalmas formává alakítjuk.
A találmány szerinti eljárásban bármilyen forrásból származó szomatotropin használható. A natív, szintetikus és rekombináns szomatotropinok előállítása, izolálása és tisztítása a szakirodalomból jól ismert. A találmány szerinti eljárásban bármely állati szomatotropin alkalmazható; ezekre példaként a humán eredetű, a marha-, sertés-, kutya-, macska-, ló-, madár-, hal- és birka-szomatotropinokat említjük.
A szomatotropin kis hurokját alkotó diszulfid-kötést szelektíven úgy redukáljuk, hogy a szomatotropint megfelelő redukálószerrel reagáltatjuk, olyan körülmények között, hogy az csak a kis hurkot alkotó diszulfidkötést redukálja, a nagy hurkot akotó diszulfid-kötést nem. A proteinek merkaptocsoportjaival reagáló bármely redukálószer használható. Redukálószerként egy
R-SH általános képletű szerves merkaptovegyületet a képletben
R jelentése adott esetben egy hidroxil- vagy merkaptocsoporttal szubsztituált 1-6 szénatomos szénhidrogéncsoport 55 használunk. Előnyös redukálószerként például a 2merkapto-etanolt és a ditiotreitet említhetjük.
Általában úgy járunk el, hogy mintegy 1-20 mg/ml szomatotropint tartalmazó oldatot redukálószerrel elegyítünk, a redukálószerre nézve a koncentráció mint60 egy 15-300 mmól/1. Az oldat pH-ját mintegy 6-10-re
HU 206 375 Β állítjuk, és a redukálószert mintegy 0,5-3 órán keresztül reagáltatjuk a szomatotropinnal, mintegy 15-30 °Con. A redukálószer feleslegét megfelelő módszerrel, előnyösen dialízissel eltávolítjuk, és a kapott, kis hurokban redukált, kis hurokból származó két merkaptocsoportot tartalmazó szomatotropint az alábbiak szerint derivatizáljuk.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint a szomatotropinból karbonát-pufferrel (CB) (a CB összetétele: 5 mmól/1 nátrium-hidrogén-karbonát, 18 mmól/1 nátrium-karbonát, pH-ja mintegy 9,5) 5 mg/ml koncentrációjú oldatot készítünk. Az oldathoz ditiotreitet adunk, 20 mmól/1 koncentrációban, a pH-t mintegy 8-ra állítjuk, és a redukálást sötétben, mintegy 37 °C-on, mintegy 1 órán keresztül lejátszatjuk.
Egy másik előnyös megvalósítási mód szerint mintegy 5 mg/ml koncentrációjú, CB“-vel (pH=9,8) készült szomatotropin oldatot - amely mintegy 50 mmól/1 2-merkapto-etanolt tartalmaz - sötétben, 20-37 °C-on mintegy 1 órán keresztül reagáltatunk. A redukálószer feleslegét eltávolítjuk, és a szomatotropint stabil és biológiailag aktív származékká alakítjuk.
A redukálás eredményeként kapott kis hurokból származó merkaptocsoportokat úgy derivatizáljuk, hogy a redukált szomatotropint megfelelő derivatizálószerrel reagáltatjuk. A kis hurokból származó merkaptocsoportok derivatizálására bármely arra alkalmas, merkaptocsoportokkal reagálni képes derivatizálószer alkalmazható. Szakemberek számára számos olyan csoport ismert, amely képes a merkaptocsoportokkal reagálni. A fenti derivatizálószerekre példaként az etilénamint, akrilsav-nitrilt, N-etil-maleinsavimidet, 3-bróm-propionsavat, 3-bróm-propionsavamidot, jód-acetamidot, 4-vinil-piridint és metil-metántioszulfonátot említjük. Derivatizálószerként legelőnyösebben egy R’-X általános képletű alkilezőszert - a képletben
X jelentése halogénatom, előnyösen jód-, bróm- vagy klóratom, és
R’ jelentése karbamoilcsoporttal szubsztituált egyenes vagy elágazó szénláncú, 1-6 szénatomos alkilcsoport használunk.
Általában a kis hurokban redukált szomatotropin
1-200 mg/ml koncentrációjú oldatához mintegy 50800 mmól/1 koncentrációban adjuk a derivatizálószert. Az oldat pH-ját mintegy 6-10-re állítjuk, és a szomatotropint mintegy 0,5-3 órán keresztül mintegy 1550 °C-on reagáltatjuk a derivatizálószerrel. A derivatizálószer feleslegét megfelelő módszerrel, előnyösen dialízissel eltávolítjuk, és a kapott, kis hurokban derivatizált, két derivatizált merkaptocsoportot tartalmazó szomatotropint hosszan tartó tárolásra, és állatoknak való adagolására alkalmas formába, általában liofilizát formába alakítjuk.
A találmány előnyös megvalósítási módja szerint a kis hurokban redukált szomatotropin mintegy mg/ml koncentrációjú, mintegy 200 mmól/1 jódacetamidot tartalmazó CB“-vel készült oldatát mintegy 8,5-9 pH-értéken, sötétben, 20-37 °C-on mintegy 1 órán keresztül reagáltatjuk. A jód-acetamid feleslegét 2%-os CB-vel szemben dializálva eltávolítjuk. A kapott derivatizált szomatotropint kívánt esetben ismert módon tovább tisztítjuk és liofizáljuk, így hosszabb időn át tartó tárolás esetén is stabil szomatotropint kapunk, amelynek biológiai aktivitása azonos, vagy nagyobb, mint a nem derivatizált szomatotropiné.
A találmány értelmében kis hurokban derivatizált szomatotropint állítunk elő, amely hosszú időn keresztüli tárolás során stabil, és biológiai aktivitása azonos, vagy nagyobb, mint a nem derivatizált szomatotropiné. A derivatizált szomatotropin annyiban különbözik a nem derivatizált szomatotropintól, hogy a normális körülmények között diszulfid-kötéssel kis hurkot alkotó ciszteín-merkaptocsoportok merkaptoszármazékká vannak alakítva, míg azon cisztein-maradékok merkaptocsoportjai, amelyek ismert módon diszulfid kötéssel a nagy hurkot alkotják, változatlanok. A kis hurokban derivatizált szomatotropinban tehát jelen van a nem derivatizált szomatotropinra jellemző nagy hurok, de nincs benne kis hurok, mivel a derivatizált merkaptocsoportok nem tudnak diszulfid-kötést kialakítani,
A kis hurokban derivatizált szomatotropin biológiai aktivitása meglepő módon azonos, vagy nagyobb, mint a nem derivatizált szomatotropiné. Ezenkívül a kis hurokban derivatizált szomatotropin további előnye, hogy nem tud a kis hurkot alkotó merkaptocsoportok révén dimerek, oligomerek és aggregátumok képződéséhez vezető, és ezáltal a szomatotropint inaktiváló intramolekuláris diszulfid-kötéseket kialakítani. A kis hurokban derivatizált szomatotropin ezért stabilabb hosszabb időn keresztüli raktározás esetén, mint a nem derivatizált szomatotropin.
A találmány gyógyászati készítményekre is vonatkozik, amelyek a kis hurokban derivatizált szomatotropin és gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagok és/vagy egyéb segédanyagok elegyéből állnak. Hordozóanyagként bármely, biológiailag összeférhető, és kis hurokban derivatizált szomatotropinnal összeférhető hordozóanyag alkalmazható, előnyösen foszfáttal pufferolt sóoldatot. Tris-HCl-t, arginint, hisztidint és hasonló hordozóanyagokat használunk. A találmány szerinti készítményben hordozóanyagként általában minden biológiailag összeférhető, 6 és 11 közötti pH-értékű oldat vagy hordozó alkalmazható a kis hurokban derivatizált szomatotropin hordozóanyagaként. A kis hurokban derivatizált szomatotropint a gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagokkal összekeverve hosszú időn keresztül tárolható készítményt kapunk, amelyből egyszerűen előállítható az egyszerű módon adagolható dózisforma. A készítmény általában a kis hurokban derivatizált szomatotropin és a hordozóanyag liofilizált formája.
A találmányt közelebbről az alábbi példákkal kívánjuk ismertetni, a korlátozás szándéka nélkül. A példákban alkalmazott rekombináns sertés-szomatotropint az American Type Culture Collectionben (Rockville MD,
HU 206 375 Β
USA) letétbe helyezett E. coli ATCC 53031 alkalmazásával állítjuk elő.
1. példa
Kis hurkot alkotó diszulfid-kötések szelektív redukálása 2-merkapto-etanollal
Rekombináns sertés-szomatotropin 5 mg/ml koncentrációjú, karbonát-pufferrel (25 mmól/1 NaHCO3, 18 mmól/1 Na2CO3, pH 9,8) készült oldatát szobahőmérsékleten 1 órán keresztül redukáljuk 0, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 és 100 mmól/1 2-merkapto-etanoI (ME) jelenlétében. A redukálást követően minden egyes mintát 200 mmól/1 jód-acetamiddal (IA) szobahőmérsékleten, sötétben, 1 órán keresztül reagáltatva derivatizáljuk a redukált cisztinekből származó merkaptocsoportokat. A mintákat ezután SDS-PAGE módszerrel analizáljuk.
SDS-PAGE géllel végzett analízis szerint a kis hurkot alkotó diszulfid-kötés teljes mértékben redukálódik 50 mmól/1 ME-lal végzett inkubálással, míg a nagy hurkot alkotó diszulfid-kötés sértetlen marad. Mivel a kis hurok redukálódik, az rpST mobilitása kis mértékben (1-2 mm) csökken, a C-terminális hurok „kiterjedése” következtében. A térhálós és nem-térhálós proteinek ilyen mobilitásbeli eltérése SDS-PAGE módszerrel már ismert [Griffíth, Biochem., J., 126, 553-560 (1972)]. Ha a redukálószert nagyobb mennyiségben adagoljuk, a nagy hurok is redukálódik, ami még nagyobb (10-12 mm) mobilitáscsökkenést okoz. A nagy hurokban redukált anyag lényegében oldhatatlan, ugyanis ha a 30 mmól/1 koncentrációnál nagyobb mennyiségű ME-lal redukált anyagot centrifugáljuk, csak az érintetlen nagy hurkot tartalmazó anyag marad a felülúszóban. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy mintegy 40-50 mmól/1 ME kell a kis hurokban redukált, karbamoil-metilezett rpST optimális hozamának biztosítására.
2. példa
Kis hurkot alkotó diszulfid-kötések szelektív redukálása ditiotreittel
Rekombináns sertés-szomatotropin 5 mg/ml koncentrációjú, karbonát-pufferrel (25 mmól/1 NaHC3, 18 mmól/1 Na2O3, pH 9,25) készült oldatát nitrogénatmoszférában, 37 ’C-on 1 órán keresztül redukáljuk 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60 és 100 mmól/1 ditiotreitol (DTT) jelenlétében. A redukálást követően minden egyes mintát 150 mmól/1 jód-acetamiddal (IA) 37 ’C-on, sötétben pH 8,5 és 9,0 között, 1 órán keresztül reagáltatva derivatizáljuk a redukált cisztinekből származó merkaptocsoportokat. A feleslegben lévő, vagy reagálatlan IA-ot a IA-hoz képes kis molekuláris feleslegben lévő DTT-vel elbontjuk, és egy éjszakán keresztül 0,1 mmól/1 ammónium-hidrogénkarbonát-oldattal (pH 7,8-8,2) szemben dializáljuk. A dializált rpST-t 2 órán keresztül TPCK-val kezelt tripszinnel hidrolizáljuk, majd meghatározzuk peptidtérképét.
Az 1. táblázat adatai szerint 20 mmól/1 DTT-lal inkubálva a kis hurkot alkotó diszulfid-kötések teljes mértékben redukálódnak, míg a nagy hurkot alkotó diszulfid-kötések érintetlenül maradnak. Ezt az eredményt az alábbi 3. példa eredményei is alátámasztják.
1. táblázat
Tripszinnel hidrolizált peptidek pST kis és nagy hurokjával kapcsolatos retenciós viselkedése
| Minta | Kis hurok (RT, perc) | Nagy hurok (RT, perc) |
| módosítatlan | 40,4 [T-23+T-25] | 98,0 |
| redukált (csak kis hurokban) [T-5+T-18] | 3,6 [T-23] 45,0 [T-25] | 98,0 |
| redukált [T-5], (kis és nagy hurokban) {T-l 8] | 3,6 [T-23], 45,0 [T-25] | 80,6* 60,0 |
| derivatizált** (csak kis hurokban) ΓΓ-5+Τ-18] | 3,6 [T-23], 50,9 [T-25] | 98,0 |
| derivatizált** [T-5], (kis és nagy hurokban) [Γ-18] | 3,6 [T-23] 50,9 [T-25] | 85,6 74,3 |
Rövidítések
RT - az egyes HPLC-zónák retenciós ideje, percben [T-X] - az egyes zónákat analizáljuk és mint triptikus peptideket jelöljük, az amino-terminális szekvenciából kiinduló helyzetnek megfelelően [T-X+T-Y] két triptikus peptid, diszulfid-híddal kovalensen összekötve * ebben a helyzetben a T-l zóna is eluálódik ** a redukált ciszteineket ΙΑ-dal derivatizáltuk
A módosítatlan pST-ben a kis hurok két triptikus peptidből - a T-23 és Τ-25-ből - áll, amelyek diszulfidhíddal kovalens kötéssel kapcsolódnak egymáshoz. A nagy hurokban a T-5 és T-l8 kapcsolódik hasonló módon.
A rpST tripszines emésztési termékéből 100 pg-ot Aquapore C-8 RP-HPLC oszlopon (Brown-Lee) választunk szét, amelyet 0,1 %-os trifluor-ecetsavval (TFA) ekvilibráltunk, és az eluálást 0,5 ml/perc sebességgel 50% 2-propanolt tartalmazó 0,1 %-os TFA-val végezzük.
3. példa
Kis hurokban derivatizált szomatotropin jellemzése
A nem derivatizált rpST-t és az 1. példában leírtak szerint előállított, kis hurokban derivatizált rpST-t tripszinnel emésztjük 2 órán keresztül. A tripszines emésztés termékeit fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással (RP-HPLC) analizáljuk. Az eredmények azt mutatják, hogy a kis huroknak megfe5
HU 206 375 Β lelő HPLC-zőna retenciós ideje 40,4 perc, a nagy huroknak megfelelő zónáé 98 perc. A kis hurok szelektív redukciója és azt követő karbamoil-metilezése után azonban a 40,4 perc retenciós idejű zóna teljesen eltűnik, és ezzel egyidejűleg megjelenik két, 3,6 perc, illetve 50,9 perc retenciós idejű zóna.
A két új HPLC-zóna automatizált Edman-lebontásos analízise megerősíti, hogy a módosított rpST minta várt módon a kis hurokban derivatizált rpST-t tartalmazza.
A nem derivatizált és a kis hurokban derivatizált triptikus peptidek aminosav-szekvenciája a 2. táblázatban látható.
2. táblázat
Módosítatlan és módosított rpST aminosav-szekvenciája+
| Aminosav | Módosítatlan minta (mól/mól) | Módosított minta (mól/mól) | Elméleti érték |
| Asp | 16,5 | 17,0 | 16 |
| Thr | 7,6 | 7,7 | 8 |
| Ser | 12,3 | 12,6 | 14 |
| Glu | 26,8 | 27,7 | 25,5 |
| Pro | 6,1 | 5,7 | 5 |
| Gly | 8,0 | 8,0 | 8 |
| Alá | 17,0 | 15,7 | 16 |
| Cys* | 3,8 | 2,4 | 4 |
| Val | 7,6 | 5,3 | 8 |
| Met | 1,8 | 1,7 | 2 |
| He | 5,5 | 5,5 | 24 |
| Lcu | 23,3 | 23,2 | 24 |
| Tyr | 6,7 | 6,8 | 7 |
| Phe | 11,6 | 11,7 | 12 |
| Lys | 10,3 | 12,6 | 11 |
| His | 5,0 | 5,0 | 3 |
| Arg | 1,6 | 12,6 | 13 |
| CMC** | 0 | 1,6 | lásd Cys-t |
| Összesen | 182 | 182 | 182 |
+ : aminosav-analízissel meghatározva 24 órás hidrolízis után : ezt az értéket, mint cisztint kaptuk, és 2-vel szorozva kapjuk a cisztein-értéket (mól/mól)-ban kifejezve) : a karboxi-metil-cisztein-értékét megfelelő standard alkalmazásával számítjuk ki
A módosított rpST két ciszteinje karbamoil-metilezésének további bizonyítékát aminosav-analízissel kapjuk. A karboxi-metil-ciszteinre (CMC) 1,6 értéket kapunk, míg az elméleti, egy hurokban végbemenő derivatizálással kapható érték 2.
Ezeket az adatokat a 3. táblázat tartalmazza.
3. táblázat
A kis hurkot alkotó peptidet és a karbamoil-metilezett T-23 peptidet tartalmazó HPLC-zónák aminosav-szekvencia analízise (A) 40,5 perc retenciós idejű HPLC-zóna: módosítatlan rpST
| Ciklus száma | PTH-mara- dék | Mennyisége (pmól/1) | PTH-mara- dék | Mennyisége (pmól/1) |
| 1 | Phe | 609 | üres | - |
| 2 | Val | 638 | Arg | 113 |
| 3 | Glu | 243 | Arg | 109 |
| 4 | Ser | 223 | üres | - |
| 5 | Ser | 154 | üres | - |
| 6 | cisztin (-S-S-) (++)* | üres | - | |
| 7 | Alá | 214 | üres | - |
| 8 | Phe | 116 | üres | - |
| 9 | üres | - | üres | - |
Acisztin-PTH 14,8 percnél cluálódik. Pontos mennyiségét nem számoltuk ki, mivel nem volt cisztin-PTH standardunk. Mivel a 2. és 3. Edman-ciklusban két PTH-maradék szabadul fel, azt is megállapítottuk, hogy 2 órán keresztül tripszinnel hidrolizálva a karboxil-terminális Arg-Arg aminosavak nem hasadnak. A tripszin nem tudja hasítani ezeket a kötéseket. Úgy tűnik, hogy a cisztin-arginin kötés is rezisztens a tripszines hidrolízissel szemben.
(B) 50,9 perc retenciós idejű HPLC-zóna: kis hurokban módosított rpST
| Ciklus szám | PTH-maradék | Mennyisége (pmól/1) |
| 1 | Phe | 114 |
| 2 | Val | 54 |
| 3 | Glu | 44 |
| 4 | Ser | ++ |
| 5 | Ser | ++ |
| 6 | CAM-cisztin* | (++) |
| 7 | Alá | 56 |
| 8 | Phe | 37 |
| 9 | üres | - |
egy új PTH-zóna jelenik meg 9,4 perc retenciós idővel a karbamido-metil-cisztein miatt a mennyiséget nem számítottuk ki, mivel nem rendelkeztünk CAM-Cys standarddal
4. példa
Derivatizált szomatotropin biológiai aktivitása A nem derivatizált rpST és az 1. példa szerint előállított, kis hurokban derivatizált rpST biológiai aktivitását pST-kötődési vizsgálattal határozzuk meg, vem1
HU 206 375 Β hes nyúl máj-membránt és 125I-jelzett rpST-t használva. A vizsgálat Tsushima és munkatársai [Radioreceptor Assay fór Growt Hormoné, J. Clin. Endocria. Metab., 37, 334-337 (1973)] által módosított változatát használjuk. Az ipST-mintát 30 °C-on 3,5 órán keresztül inkubáljuk 16000 cpm I25I-ipST-nal. Az rpST standard és a kis hurokban derivatizált rpST kiszorítási görbéjét 0,38-200 ng/ml koncentráció-tartományban vesszük fel. A pST-kötődési vizsgálat további részletei Tsushima és munkatársai fent említett munkájában találhatók.
A vizsgálat eredményei szerint a számított 50%-os jód-koncentráció a kis hurokban karbamoil-metilezett pST-re (ICs0) 1,24 ng/0,5 ml kötődési ekvivalens, míg a nem derivatizált és dializált minták értéke 3,0 ng/ml, illetve 2,9 ng/0,5 ml. Ezekből az adatokból számítva a kis hurokban derivatizált pST aktivitása 181%, a nem derivatizált szomatotropin mintegy 75% aktivitásával szemben.
5. példa
Derivatizált szomatotropin biológiai aktivitása
A nem derivatizált rpST és az 1. példa szerint előállított, kis hurokban derivatizált ipST biológiai aktivitását a kötődési aktivitás mérésével határozzuk meg, sertésmáj-membránt alkalmazva, Haro és munkatársai [Homologous Somatotropin Rádió Receptor Assay Utilizing Recombinant Bovine Growht Hormoné, Mól. Cell Endocrinol., 38, 109-116 (1985)] módszere szerint.
A vizsgálati eredmények szerint a kis hurokban karbamoil-metilezett rpST számított ICJ0 értéke 1,29 ng/0,5 ml, a nem derivatizált pST és az rpST standard 1,61 ng/0,5 ml értékével összehasonlítva. Ezen eredmények szerint a derivatizált rpST aktivitása 125%, a módosítatlan (nem derivatizált) rpST 100% aktivitásával szemben.
Ezek az eredmények meglepő módon azt bizonyítják, hogy a találmány szerinti eljárással előállított szomatotropinok nemcsak stabilabbak, hanem biológiailag is aktívabbak, mint a módosítatlan, kiindulási szomatotropinok.
6. példa
Derivatizált szomatotropinok biológiai aktivitása és biológiai potenciálja
A nem derivatizált rpST és az 1. példa szerint előállított, kis hurokban derivatizált rpST relatív biológiai aktivitását és potenciálját hopifízis-irtott (hypox) patkányok testtömeg-gyarapodásának mérésével határozzuk meg.
Négy csoport hypox patkánynak (csoportonként 10 állatnak) 9 napon keresztül naponta 24 gg-ot adunk a pST standardból, dializált Zn-rpST-ból, kis hurokban derivatizált Zn-rpST-ból, illetve nem derivatizált ZnrpST-ból. A patkányokat naponta ellenőrizzük, és testtömeg-gyarapodásukat 10 napon keresztül feljegyezzük. Mérjük a tömeggyarapodást, és a relatív biológiai aktivitást a standard %-ában adjuk meg. Az eredményeket a 4. táblázatban ismertetjük.
A 4. táblázat adatai szerint a derivatizált rpST 13.5% átlagos tömeggyarapodást eredményezett, míg a nem derivatizált rpST 14,4%-ot. Ezenkívül az adatok azt bizonyítják, hogy a szomatotropin kis hurokja nem szükséges a szomatotropin növekedést serkentő hatásához.
4. táblázat
Sertés-szomatotropin biológiai aktivitásának meghatározása
| Szomatotropin (SO | Dózis (gg) | Tömeggyarapodás (%) | Relatív biológiai aktivitás | |
| Átlag | SD | |||
| pST standard | 24 | 23,1** | 2,9 | 55** |
| dializált Zn-rpST | 24 | 14,4** | 2,5 | 62 |
| kis hurokban derivatizált Zn-rpST | 24 | 13,5** | 2,8 | 58 |
| nem derivatizált Zn-rpST | 24 | 17,1** | 2,2 | 74 |
* azonos koncentrációban vizsgált, hipofízis-eredetű pST standardhoz viszonyítva ** szignifikancia nagyobb (P,01), mint a negatív kontrolié [4.6%, standard deviáció (SD) 3,4] *** ekvivalens dózisban, 9,5 pH értékű pufferban oldva az ST relatív aktivitása 51%.
7. példa
Derivatizált szomatotropin stabilitása oldatban mg/ml koncentrációjú, 0,5% nátrium-azidot tartalmazó oldatokat készítünk nem derivatizált rpST-ból és kis hurokban derivatizált rpST-ból (az 1. példa szerint IA-dal előállítva), 46 mmól/1 koncentrációjú karbonátpufferrel (pH 9,8) vagy foszfáttal pufferolt sóoldattal (pH 7,4). 1,25 ml-es alikvotokat Eppendorf mikrocentrifugacsövekben inkubálunk 37 °C-on, 0,6,4,6,8, 22 és 120 napon keresztül.
Az inkubálás befejeztével az alikvotokban meghatározzuk az rpST monomer mennyiségét Superose-12vel végzett gélszűréses kromatográfiás eljárással, mozgó fázisként 46 mmől/l koncentrációjú karbonát-puffért (pH 9,8) használva. A monomerek és a képződött dimerek és nagyobb móltömegű aggregátumok relatív mennyiségei azt mutatják, hogy a monomert nagyobb %-ban nyerjük vissza akkor, ha a kis hurkot redukáltuk és derivatizáltuk.
8. példa
Derivatizált szomatotropin stabilitása nedves állapotban
Nem derivatizált rpST és az 1. példa szerint IA-dal előállított, kis hurokban derivatizált rpST 5 mg/ml koncentrációjú oldatait 0,46 mmól/1 koncentrációjú karbonát-pufferrel szemben dializáljuk, majd liofilizáljuk, és az így kapott száraz rpST mintákat vizsgáljuk a továbbiakban.
mg száraz, kis hurokban derivatizált, illetve nem derivatizált rpST-t 0,01 mmól/1 koncentrációjú, 0,05%
HU 206 375 Β nátrium-azidot tartalmazó Tris-HCl-pufferrel (pH 7,4), vagy 46 mmól/1 koncentrációjú, 0,05% nátrium-azidot tartalmazó karbonát-pufferrel (pH 9,8) megnedvesítünk. A kapott pépet 14 napon keresztül 37 °C-on inkubáljuk. Ezután az rpST-t mintegy 1,8 mg/ml koncentrációra hígítjuk 46 mmól/1 koncentrációjú karbonát-pufferrel (pH 9,8), Bransisonic 220 ultrahang-készülékben néhány percen keresztül kezeljük, majd 15 000 g-vel 5 percen keresztül centrifugáljuk. A felülúszóban a 7. példában ismertetett kromatográfiás eljárással meghatározzuk a monomer-tartalmat.
Az eredmények szerint az rpST monomer visszanyerése sokkal nagyobb a kis hurokban derivatizált rpST esetén, függetlenül a nedvesítőszer pH-jától, mint a nem derivatizált rpST esetén.
Claims (13)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás stabil és biológiailag aktív szomatotropinok előállítására, amelyekben a kis hurkot alkotó diszulfid-kötés helyén kialakított két merkaptocsoport karbamoil-(l-6 szénatomos)-alkil-csoporttal van szubsztituálva, azzal jellemezve, hogy- a szomatotropin kis hurokját alkotó diszulfid-kötést egy R-SH általános képletű szerves merkaptovegyületíel - a képletbenR jelentése adott esetben egy hidroxil- vagy merkaptocsoporttal szubsztituált 1-6 szénatomos szénhidrogéncsoport szelektíven merkaptocsoporttokká redukáljuk, és- a kapott két merkaptocsoportot 1-7 szénatomos karbamoil-alkil-halogeniddel reagáltatjuk.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szomatotropinként sertés-szomatotropint alkalmazunk.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szomatotropinként rekombináns szomatotropint alkalmazunk.
- 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szomatotropinként rekombináns sertés-szomatotropint alkalmazunk.
- 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szomatotropin kis hurokját alkotó diszulfid-kötést egy R-SH általános képletű szerves merkaptovegyülettel - a képletbenR jelentése adott esetben egy merkaptocsoporttal vagy egy hidroxilcsoporttal szubsztituált 1-6 szénatomos alkilcsoport redukáljuk.
- 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szomatotropin kis hurokját alkotó diszulfid-kötést ditiotreittel vagy 2-merkapto-etanollal redukáljuk,
- 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szomatotropin kis hurokjából származó merkaptocsoportokat jód-acetamiddal reagáltatjuk.
- 8. Eljárás stabil és biológiailag aktív gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, az 1. igénypont szerinti eljárással előállított szomatotropinszármazékot, mint hatóanyagot a gyógyszerkészítésben szokásosan alkalmazott hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverünk és gyógyászati készítménnyé alakítunk.
- 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hatóanyag és a gyógyászatilag elfogadható hordozóanyag keverékét liofilizáljuk.
- 10. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként sertés-szomatotropinból nyert származékot alkalmazunk.
- 11. A 8. igénypont eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként rekombináns szórnatotropinból nyert származékot alkalmazunk.
- 12. A 11. igényont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként rekombináns sertés-szomatotropinból nyert származékot alkalmazunk.
- 13. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a szomatotropin kis hurokjából származó merkaptocsoportok jód-acetamiddal való reagáltatásával nyert származékot alkalmazzuk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/242,542 US5079230A (en) | 1988-09-12 | 1988-09-12 | Stable bioactive somatotropins |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT56856A HUT56856A (en) | 1991-10-28 |
| HU206375B true HU206375B (en) | 1992-10-28 |
Family
ID=22915193
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU895729A HU206375B (en) | 1988-09-12 | 1989-09-07 | Process for producing biologically active, stable somatotropins and pharmaceutical compositions comprising same as active ingredient |
| HU91787A HU910787D0 (en) | 1988-09-12 | 1991-03-26 | Making brooms from systhetic fibres by means of soldering or welding methods |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU91787A HU910787D0 (en) | 1988-09-12 | 1991-03-26 | Making brooms from systhetic fibres by means of soldering or welding methods |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5079230A (hu) |
| EP (1) | EP0433395A1 (hu) |
| JP (1) | JPH04500519A (hu) |
| CN (1) | CN1037845C (hu) |
| AU (1) | AU4330889A (hu) |
| CA (1) | CA1339759C (hu) |
| DD (1) | DD289544A5 (hu) |
| ES (1) | ES2018397A6 (hu) |
| GR (1) | GR1002144B (hu) |
| HU (2) | HU206375B (hu) |
| NZ (1) | NZ230610A (hu) |
| PL (1) | PL162822B1 (hu) |
| RU (1) | RU2073686C1 (hu) |
| UA (1) | UA26853C2 (hu) |
| WO (1) | WO1990002758A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA896914B (hu) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE68929273T2 (de) * | 1988-08-24 | 2001-07-05 | American Cyanamid Co., Wayne | Stabilisierung von Somatotropinen durch Modifikation von Cystein-Resten durch orts-spezifische Mutagenese oder chemische Derivatisierung |
| US5849694A (en) * | 1990-07-16 | 1998-12-15 | Synenki; Richard M. | Stable and bioactive modified porcine somatotropin and pharmaceutical compositions thereof |
| US5169834A (en) * | 1990-11-30 | 1992-12-08 | American Cyanamid Company | Compositions and method for reducing vial breakage during lyophilization |
| US5567620A (en) * | 1993-01-26 | 1996-10-22 | Eli Lilly And Company | Non-denaturing potency assay for somatotropin |
| ZA94169B (en) * | 1993-01-26 | 1994-09-07 | Lilly Co Eli | Non-denaturing potency assay for bovine somatotropin |
| DE4303744A1 (de) * | 1993-02-09 | 1994-08-11 | Univ Autonoma De Nuevo Leon Mo | Hundewachstumshormon |
| DK44593D0 (da) * | 1993-04-20 | 1993-04-20 | Novo Nordisk As | Fremgangsmaade til fremstilling af et polypeptid |
| ZA9711731B (en) * | 1996-12-31 | 1998-07-01 | Monsanto Co | Aqueous glycerol formulations of somatotropin |
| WO1998051296A1 (en) * | 1997-05-15 | 1998-11-19 | Schmidt Geoffrey J | Method of reducing immunological tolerance to malignancy |
| DK1775346T3 (da) * | 1997-06-25 | 2009-09-28 | Merck Serono Sa | Disulfid-tværbundne glycoproteinhormonanaloger, deres fremstilling og anvendelse |
| AU2001273388B2 (en) * | 2000-09-08 | 2005-01-13 | Gryphon Therapeutics, Inc. | "Pseudo"-native chemical ligation |
| US6811777B2 (en) * | 2002-04-13 | 2004-11-02 | Allan Mishra | Compositions and minimally invasive methods for treating incomplete connective tissue repair |
| DE60332358D1 (de) * | 2002-09-09 | 2010-06-10 | Hanall Pharmaceutical Co Ltd | Protease-resistente modifizierte interferon alpha polypeptide |
| US7998930B2 (en) | 2004-11-04 | 2011-08-16 | Hanall Biopharma Co., Ltd. | Modified growth hormones |
| WO2006121569A2 (en) | 2005-04-08 | 2006-11-16 | Neose Technologies, Inc. | Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants |
| JP5875527B2 (ja) | 2010-01-22 | 2016-03-02 | ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー | ｉｎ−ｖｉｖｏにおける効力が延長された成長ホルモン |
| EP2446898A1 (en) | 2010-09-30 | 2012-05-02 | Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. | Use of growth hormone to enhance the immune response in immunosuppressed patients |
| JP6464145B2 (ja) | 2013-04-05 | 2019-02-06 | ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー | 成長ホルモン化合物製剤 |
| CN108828237B (zh) * | 2018-08-24 | 2021-04-02 | 浙江理工大学 | 一种分析羊毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3853832A (en) * | 1971-04-27 | 1974-12-10 | Harmone Res Foundation | Synthetic human pituitary growth hormone and method of producing it |
| US4342832A (en) * | 1979-07-05 | 1982-08-03 | Genentech, Inc. | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
| JPS5630925A (en) * | 1979-08-21 | 1981-03-28 | Sumitomo Chem Co Ltd | Purification of human growth hormone |
| CA1224432A (en) * | 1982-08-17 | 1987-07-21 | Gary N. Buell | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing bovine growth hormone-like polypeptides in high yield |
| CA1341012C (en) * | 1982-09-27 | 2000-06-06 | Biogen, Inc. | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing swine growth hormone-like polypeptides |
| FI82266C (fi) * | 1982-10-19 | 1991-02-11 | Cetus Corp | Foerfarande foer framstaellning av il-2 -mutein. |
| US4620948A (en) * | 1982-12-22 | 1986-11-04 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| WO1987000204A2 (en) * | 1985-06-26 | 1987-01-15 | The Upjohn Company | Purification of somatotropin from transformed microorganisms |
| US4766205A (en) * | 1985-11-13 | 1988-08-23 | Beatrice Companies, Inc. | Method for isolation of recombinant polypeptides in biologically active forms |
| US4816568A (en) * | 1986-05-16 | 1989-03-28 | International Minerals & Chemical Corp. | Stabilization of growth hormones |
| DE68929273T2 (de) * | 1988-08-24 | 2001-07-05 | American Cyanamid Co., Wayne | Stabilisierung von Somatotropinen durch Modifikation von Cystein-Resten durch orts-spezifische Mutagenese oder chemische Derivatisierung |
-
1988
- 1988-09-12 US US07/242,542 patent/US5079230A/en not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-08-09 CA CA000607863A patent/CA1339759C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-09-07 UA UA4895049A patent/UA26853C2/uk unknown
- 1989-09-07 JP JP1510357A patent/JPH04500519A/ja active Pending
- 1989-09-07 HU HU895729A patent/HU206375B/hu not_active IP Right Cessation
- 1989-09-07 EP EP89911168A patent/EP0433395A1/en not_active Withdrawn
- 1989-09-07 AU AU43308/89A patent/AU4330889A/en not_active Abandoned
- 1989-09-07 RU SU4895049/04A patent/RU2073686C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1989-09-07 WO PCT/US1989/003871 patent/WO1990002758A1/en not_active Application Discontinuation
- 1989-09-08 GR GR890100562A patent/GR1002144B/el not_active IP Right Cessation
- 1989-09-11 CN CN89107230A patent/CN1037845C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1989-09-11 NZ NZ230610A patent/NZ230610A/en unknown
- 1989-09-11 ZA ZA896914A patent/ZA896914B/xx unknown
- 1989-09-11 DD DD89332530A patent/DD289544A5/de unknown
- 1989-09-12 ES ES8903103A patent/ES2018397A6/es not_active Expired - Fee Related
- 1989-09-12 PL PL28138089A patent/PL162822B1/pl not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-03-26 HU HU91787A patent/HU910787D0/hu unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5079230A (en) | 1992-01-07 |
| PL162822B1 (pl) | 1994-01-31 |
| CA1339759C (en) | 1998-03-17 |
| AU4330889A (en) | 1990-04-02 |
| DD289544A5 (de) | 1991-05-02 |
| ES2018397A6 (es) | 1991-04-01 |
| EP0433395A1 (en) | 1991-06-26 |
| JPH04500519A (ja) | 1992-01-30 |
| GR890100562A (el) | 1990-10-31 |
| HUT56856A (en) | 1991-10-28 |
| HU910787D0 (en) | 1991-09-30 |
| NZ230610A (en) | 1991-12-23 |
| GR1002144B (en) | 1996-02-16 |
| ZA896914B (en) | 1990-10-31 |
| WO1990002758A1 (en) | 1990-03-22 |
| RU2073686C1 (ru) | 1997-02-20 |
| CN1037845C (zh) | 1998-03-25 |
| UA26853C2 (uk) | 1999-12-29 |
| CN1041160A (zh) | 1990-04-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6908897B2 (en) | Covalently bridged insulin dimers | |
| HU206375B (en) | Process for producing biologically active, stable somatotropins and pharmaceutical compositions comprising same as active ingredient | |
| RU2205836C2 (ru) | Усовершенствованный способ получения предшественника инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками | |
| US4608364A (en) | Pharmaceutical agent for the treatment of diabetes mellitus | |
| US5698669A (en) | Tri-arginine insulins | |
| DK172462B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af et insulinderivat | |
| JPH052654B2 (hu) | ||
| JP2005519041A (ja) | 長期作用を備えたインスリン分子 | |
| EP0251615A2 (en) | Method of chain combination | |
| NO179587B (no) | Analogifremgangsmåte for fremstilling av en terapeutisk aktiv insulinanalog og mellomprodukt | |
| JPH0720993B2 (ja) | 生長因子 | |
| HU191263B (en) | Process for producing factor for promoting letting out growth hormone of human pancreatic origine | |
| US4992417A (en) | Superactive human insulin analogues | |
| US20040192608A1 (en) | Treatment of obesity | |
| AU616131B2 (en) | Superactive human insulin analogues | |
| WO1988007084A1 (en) | Bovine growth hormone analogs | |
| US5466666A (en) | Amorphous monospheric forms of insulin derivatives | |
| HU207526B (en) | Process for renaturating false recombinants of insuline precursors | |
| Liberti | Isolation and somatomedin activity of bovine growth hormone fragment 87–124 | |
| EP0464549A1 (en) | Calcitonin analogues and use thereof | |
| CS121192A3 (en) | Super-active analog of a growth-hormone releasing factor, process forpreparing thereof and a pharmaceutical composition which contains said analog | |
| CA1338584C (en) | Superactive human insulin analogues | |
| HU201566B (en) | Process for producing new analoguse of activatin factor of human growth hormon and pharmaceutical and veterinair compositions containing them |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |