CN1457257A

CN1457257A - “拟”天然化学连接

Info

Publication number: CN1457257A
Application number: CN01815290A
Authority: CN
Inventors: S·B·H·肯特; P·博蒂; D·W·罗; J·A·布拉特博尼; C·L·亨特; S·－Y·陈; S·克雷斯曼; G·科亨德菲尔
Original assignee: Gryphon Therapeutics Inc
Current assignee: Gryphon Therapeutics Inc
Priority date: 2000-09-08
Filing date: 2001-07-12
Publication date: 2003-11-19
Also published as: PL365671A1; EE200300089A; CZ2003678A3; US20030208046A1; BG107590A; WO2002019963A3; RU2003109746A; WO2002019963A2; NO20031047L; CN1454097A; AU7890501A; NO20031047D0; NO20031048L; KR20030046411A; AU7338801A; CA2412277A1; AU2001278905B2; SK2772003A3; IL154118A0; EP1315513B1

Abstract

本发明涉及用于通过一个酰胺键把天然的化学连接技术扩展到更为广泛的肽、多肽、其它聚合物和其它分子的连接的方法和组合物(见图1)。本发明还提供这样的蛋白质和蛋白质衍生物的生产方法和用途。本发明特别适用于合成选择性地被聚合物改性的生物活性的合成蛋白质的合成。本发明还提供包含这样的蛋白质的药物组合物。

Description

“拟”天然化学连接

本发明的领域：

本发明涉及用于把天然的化学连接技术扩展到能通过酰胺键对更为广泛的肽、多肽、其它聚合物和其它分子进行连接的方法和组合物。本发明还提供这样的蛋白质和蛋白质衍生物的生产方法和用途。对相关申请的交叉引用

本申请是美国专利申请号60/231,330(2000年9月8日登记)和60/236,377(2000年9月29日登记)的部分接续申请，在此把它们全部引入供参考。

本发明的背景

在过去的30年中，医学的注意力日益转向探讨使用天然产生的蛋白质作为治疗疾病的治疗药物的可能性。

由于重组DNA技术可以在细菌和其它宿主细胞中大量地生产多肽和蛋白质，因此它已经成为商业上生产许多多肽和蛋白质的主要方法。重组蛋白质的生产涉及用给所要的外源蛋白质编码的DNA转染或转化宿主细胞，并且在有利于重组蛋白质表现度的条件下生长细胞。大肠杆菌和酵母是很有用的宿主细胞，因为可以以很高的效价使它们生产重组的蛋白质(参见US5,756,672(Builder等人))。

已经有多篇美国专利公开了关于重组DNA编码的蛋白质的普通细菌表现度(参见例如US4,565,785、US4,673,641、US4,738,921、US4,795,706、US4,710,473)。不幸的是，使用重组DNA技术还不是普遍成功的。在一些条件下，在宿主细菌中大量表现的某些异种的蛋白质以密集的聚集体形式沉积在细胞内，在相差显微镜下在细胞的内部呈现出可见的亮点。这些沉积的蛋白质的聚集体被称为“折射体”，它们可以在所有的细胞蛋白质中占有很大的比例(Brems等人，Biochemistry(1985)24：7662)。

从这些实体中回收蛋白质产生许多的问题，例如怎样把包埋在细胞中的蛋白质与细胞物质和保护它们的蛋白质分开，以及怎样以生物活性形式回收包埋体蛋白质。对于有关折射体的普通的综述性的文章，参见Marston，supra；Mitraki and King，Bio/Technology，7：690(1989)；Marston and Hartley，Methods in Enzymol.，182：264-276(1990)；Wetzel，“Protein Aggregation In Vivo：Bacterial Inclusion Bodies and Mammalian Amyloid，”inStability of Protein Phramaceutica s：In Vivo Pathways ofDegradation and Strategies for Protein Stabilization，Ahernand Manning(编辑)(Plenum Press，1991)；and Wetzel，“EnhancedFolding and Stabilization of Proteins by Suppression ofAggregation In Vitro and In Vivo，”in Protein Engineering--APractical Approach，Rees，A.R.等人(编辑)(IRL Press at OxfordUniversity Press，Oxford，1991)。因此，需要另一种生产生物活性的蛋白质的方法。

另一种生产重组蛋白质的方法涉及使用有机化学原理来合成蛋白质。现有的蛋白质的化学合成方法包括分步固相合成和溶液中或固相上片断缩合。经典的Merrifield分步固相合成涉及把与所要的肽链的羧基末端氨基酸相应的一种氨基酸共价键合到一种固体载体上，并通过一步步偶合含有活化的羧基的活性氨基酸衍生物而向着氨基末端扩展多肽。在充分保护的与固相连接的肽链的装配完成以后，通过合适的化学方法切开肽-固相的共价连接，并且除去保护基，得到多肽产物。

不幸的是，分步固相合成法有许多缺点，包括形成固相连接副产物，这会使每个循环中偶合和脱保护步骤中的反应不完全。肽链越长，要得到高纯度的精确的产物所要面对的挑战越大。通过这种途径来合成蛋白质和大的多肽既费时又费力。

设计固相片段缩合法(也称为片断缩合)需要克服在通过固相分步合成法得到长链多肽时所遇到的困难。片断缩合法涉及通过固相分步法制备几个肽片断，然后从固相上切下来，对这些经过最大限度保护的片断进行纯化，使这些受到保护的片断一个接一个地与连接在固相上的第一个片断缩合。但是，常常在固相片断缩合的许多步骤中遇到技术困难。参见E.Atherton等人，“Solid Phase FragmentCondensation-The Problems，”in Innovation and Perspectivesin Solid Phase Synthesis 11-25(R.Epton等人，1990)。例如，在片断上使用保护基来阻断不想要的连接反应往往会使被保护的片断只少量地可溶，干扰羧基的有效活化。被保护片断的有限的溶解度也会干扰被保护片断的纯化。参见K.Akaji等人，Chem.Pharm.Bull.(Tokyo)33：184-102(1985)。被保护的片断的纯度、共价结构难以表征，并且不易用高分辨率的ESMS(电喷雾质谱)进行分析(基于电荷)。每个活化的肽片断的C-末端残基的外消旋化也是一个问题，除非连接是在甘氨酸残基上进行的。而且，把完全装配好的与固相连接的多肽从固相上切割下来并且频繁地除去保护基可能需要严苛的化学操作方法和长的反应时间，这些都会导致完全装配好的多肽的降解。

片段缩合可以不在固相上而在溶液中进行。参见H.Muramatsu等人，Biochem.and Biophys.Res.Commn.203(2)：1131-1139(1994)。然而，在溶液中进行的片段缩合需要在连接前纯化片段并且针对一系列不同的侧链官能团使用保护基来预防许多不想要的副反应。而且，在溶液中进行的连接不像固相连接那样易于纯化和洗涤。此外，针对被保护的肽片段和被保护的肽中间反应产物的溶解度的限制也更为严重了。

为了克服最大限度被保护的肽所经常遇到的溶解性问题，已经开发了肽片段的化学连接法。化学连接涉及在第一种化学组分与第二种化学组分之间形成选择性的共价键。可以使用存在于第一种组分和第二种组分上的特异性的可相互反应的官能团来使连接反应具有化学选择性。例如，肽和多肽的化学连接涉及带有相容的特异性的可相互反应的C-末端和N-末端氨基酸残基的肽或多肽的化学选择性反应。已经利用了几种不同的化学方法来达到这种目的，其实例包括天然的化学连接(Dawson，等人，Science(1994)266：776-779；Kent，等人，WO96/34878；Kent，等人，WO98/28434)，形成肟的化学连接(Rose，等人，J.Amer.Chem.Soc.(1994)116：30-34)，形成硫代酸酯的连接(Schnlzer，等人，Science(1992)256：221-225)，形成硫醚的连接(Englebretsen，等人，Tet.Letts.(1995)36(48)：8871-8874)，形成腙的连接(Gaertner，等人，Bioconj.Chem.(1994)5(4)：333-338)和形成噻唑烷的连接以及形成噁唑烷的连接(Zhang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(1998)95(16)：9184-9189；Tam，等人，WO95/00846)US 5589356或其它方法(Yan，L.Z.and Dawson，P.E.，＂Synthesis of Peptides and Proteins without CysteineResidues by Native Chemical Ligation Combined withDesulfurization，＂J.Am.Chem.Soc.2001，123，526-533，在此引入供参考；Gieselnan et al.，Org.Lett.2001 3(9)：1331-1334；Saxon，E.等人，＂Traceless＂Staudinger Ligation for theChemoselective Synthesis of Amide Bonds.Org.Lett.2000，2，2141-2143)。

在这些方法中，只有天然化学连接方法能够得到在连接位点处含有天然的酰胺键(即肽键)的连接产物。已经证明，最初的天然化学连接方法(Dawson等人，supra；和WO96/34878)是一种在连接位点处产生天然酰胺键的强有力的方法。天然的化学连接涉及含有C-末端α-羧基硫代酸酯基团的第一种肽或多肽片断与含有N-末端半胱氨酸残基的第二种肽或多肽之间的化学选择性反应。硫醇交换反应产生了最初的硫代酸酯连接的中间体，该中间体自发地发生重排，在连接位点处产生天然的酰胺键，同时把半胱氨酸侧链的硫醇再生出来。最初的天然的化学连接法的主要缺陷是它需要一个N-末端半胱氨酸，即它只允许在连接位点处含有半胱氨酸的肽和多肽片断的连接。

尽管有这种缺陷，但是仍然有含有除半胱氨酸之外的N-末端氨基酸的肽的天然化学连接的报道(WO98/28434)。在该方法中，使用含有一个C-末端α-羧基硫代酸酯的第一种肽或多肽片断与含有一个N-末端的式HS-CH₂-CH₂-O-NH-[肽]所代表的N-{硫醇取代的辅助}基团的第一种肽或多肽片断来进行连接。连接后，通过断裂HS-CH₂-CH₂-O-辅助基团而除去N-{硫醇取代的辅助}基团，在连接位点处产生天然的酰胺键。该方法的一个局限是使用巯基乙氧基辅助基团只在甘氨酸残基处能够成功地形成酰胺键。这产生了一种连接产物，该连接产物在断裂反应后，在第二种肽或多肽片断的N-取代的氨基酸的位置处产生一个甘氨酸残基。由于这个原因，只有当你希望使反应的连接产物在该位置处含有一个甘氨酸残基时，实施该方法才是合适的，并且在任何情况下，就连接产率、母体的稳定性和除去O-连接的辅助基团的能力方面都是成问题的。然而可以使用其它辅助基团，例如HSCH₂CH₂NH-[肽]，而不会把反应限制在在甘氨酸残基处的连接上，这样的辅助基团不能从连接产物上除去。

因此，需要一种能够把天然的化学连接扩展到很多种不同的氨基酸残基、肽、多肽、聚合物和其它分子的广泛适用的和强有力的化学连接体系，该化学连接体系利用一种有效的容易除去的含有硫醇的辅助基团，而在连接位点处通过天然的酰胺键把这类分子连接起来。

附图的简要描述

图1表示拟天然化学连接的总体反应。

图2表示制备本发明的具有生物活性的合成蛋白质的总体方法。

图3描述一种优选的能激发红细胞生成的合成蛋白质的基本结构。

图4示出循环变更的不含有游离氨基或羧基末端的SEP类似物的一般结构。相对于SEP类似物，pPEG(本文所述“精确的PEG”)的连接点位置相同。通过在新的N-/C-末端位置例如P126C和A125X之间的肟键使SEP类似物循环。取决于给定的类似物修饰所用的pPEG，SEP类似物的总分子量将在50-80kDa的范围内，估计pPEG介导的流体动力学分子量大于大约100kDa。

图5示出具有生物活性的合成GCSF蛋白质的基本结构。图中，“J”代表一个含有一个疏水侧链的非天然编码的残基。

图6示出优选的合成RANTES类似物的结构。在图中，NNY＝壬酰基，X＝含有一个疏水侧链的非天然编码的氨基酸pPEG，而FA＝脂肪酸。

图7系统描述了带支链的pPEG聚合物的形成。

本发明的概述

本发明涉及用于通过一个酰胺键把天然的化学连接技术扩展到可连接更为广泛的肽、多肽、其它聚合物和其它分子的方法和组合物。本发明还提供这样的蛋白质和蛋白质衍生物的生产方法和用途。本发明特别适用于合成选择性地被聚合物改性的具有生物活性的合成蛋白质的合成。本发明还提供包含这样的蛋白质的药物组合物。

详细地，本发明提供一种含有一个侧链为式-S-R_aa的拟氨基酸残基的合成蛋白质(特别是含有一种分子量大于大约25kDa的单体的蛋白质)，其中R_aa是一种核糖体规定的氨基酸侧链的一个选择性取代的末端部分或一种核糖体规定的氨基酸侧链的末端部分的类似物。

本发明特别提供这样一种蛋白质的实施方式，其中蛋白质具有核糖体产生的生物活性蛋白质所具有的生物活性。

本发明还涉及其中蛋白质的多个氨基酸残基通过一个酰胺键与相邻的氨基酸残基相连的这种合成蛋白质以及其中多个氨基酸残基中的至少一个通过一个非酰胺键(例如硫酯键、硫醚键和肟键)与相邻的氨基酸残基相连的这种合成蛋白质。

本发明还涉及其中的拟氨基酸是一种D-构型的氨基酸残基或者是L-构型的氨基酸残基的合成蛋白质或者其中这样的合成蛋白质既包含D-构型的拟氨基酸残基也包含L-构型的拟氨基酸残基的合成蛋白质。

本发明还涉及其中拟氨基酸残基选自拟精氨酸、拟天冬酰胺、拟天冬氨酸、拟多巴胺、拟谷氨酸、拟谷胺酰胺、拟组氨酸、拟异亮氨酸、拟亮氨酸、拟赖氨酸、拟甲氨酸、拟苯丙氨酸、拟丝氨酸、拟苏氨酸、拟色氨酸、拟酪氨酸和拟缬氨酸的合成蛋白质。

本发明还涉及其中核糖体规定的生物活性蛋白质是哺乳动物蛋白质(例如人、猴、牛、鼠、猪、羊或马蛋白质)这样的合成蛋白质。

本发明还涉及其中蛋白质具有选自一种蛋白质受体或其片段、一种蛋白质受体配体或其片段或一种细胞素(特别是其中细胞素选自一种白介素、一种淋巴因子、一种RANTES蛋白质、一种激发红细胞生成的蛋白质、肿瘤坏死因子(TNF)、一种干扰素、一种生长素和一种单肽激素)的生物活性的合成蛋白质。

本发明还涉及合成蛋白质SEP-0、SEP-1和SEP-3。

本发明还涉及其中它们的一个或多个氨基酸残基被一种或多种聚合物加成物改性，特别是其中合成蛋白质包含一个或多个在对应于核糖体编码的生物活性蛋白质的至少一个糖基化位点的氨基酸残基处被一个或多个聚合物加成物改性的氨基酸残基的所有这类合成蛋白质。

本发明还提供一种在分子水平上均匀的包含一种合成蛋白质的药物组合物，其中蛋白质具有与具有生物活性的核糖体规定的哺乳动物蛋白质相关的生物活性相似的生物活性，其分子量大于大约25kDa，并且含有一个侧链为式-S-R_aa的拟氨基酸残基，其中R_aa是一种核糖体规定的氨基酸侧链的一个任选取代的末端部分或其类似物。

本发明还提供一种治疗人类疾病的方法，包括给需要治疗的个体服用治疗有效量的包含一种或多种在分子水平上均匀并且包含一种合成蛋白质的药物组分的药物组合物，其中合成蛋白质的分子量大于大约25kDa，并且含有一个侧链为式-S-R_aa的拟氨基酸残基，其中R_aa是一种核糖体规定的氨基酸侧链的一个选择性取代的末端部分或其类似物，合成蛋白质具有与具有生物活性的核糖体规定的人蛋白质受体或其片段、蛋白质受体配体或其片段或一种细胞素的生物活性相似的生物活性。

本发明还提供一种合成所要的多肽的方法以及通过这种方法合成的所要的多肽，其中所要的多肽具有下式：

a_{{NH}_{2}} - Q - {aa}_{x} - {aa}_{y} - W - {aa}_{COOH}

其中Q和W各自代表选择性存在的一种或多种其它的氨基酸残基，

代表多肽的N末端氨基酸残基，aa_x和aa_y分别代表具有侧链x和y的内部的相邻的氨基酸残基，而aa_COOH代表多肽的C-末端氨基酸残基；该方法包括：

(A)把一种式-Q-aa_x-COSR的第一种多肽(其中R是与硫代酸酯基团相容的任何基团，包括但是不限于芳基、苄基和烷基)与一种式Cys-W-aa_COOH的第二种多肽连接而形成多肽

{aa}_{{NH}_{2}} - Q - {aa}_{x} - Cys - W - {aa}_{COOH}

；和

(B)在一种试剂R_aa-X(其中R_aa是一个结构与氨基酸残基aa_y的侧链的末端部分相似的基团，而X是一个良好的离去基团，特别是卤素例如F、I或Br)的存在下培育多肽，培育条件要足以形成所要的多肽。

本发明还提供该方法和多肽的实施方式，其中氨基酸残基aa_y选自拟精氨酸、拟天冬酰胺、拟天冬氨酸、拟多巴胺、拟谷氨酸、拟谷胺酰胺、拟组氨酸、拟异亮氨酸、拟亮氨酸、拟赖氨酸、拟甲氨酸、拟苯丙氨酸、拟丝氨酸、拟苏氨酸、拟色氨酸、拟酪氨酸和拟缬氨酸。优选的实施方式的描述

本发明涉及用于通过一个酰胺键把天然的化学连接技术扩展到更为广泛的肽、多肽、其它聚合物和其它分子的连接的方法和组合物。本发明还提供这样的蛋白质和蛋白质衍生物的生产方法和用途。本发明特别适用于合成选择性地被聚合物改性的具有生物活性的合成蛋白质，优选单体分子量大于大约25kDa的合成蛋白质的合成。本发明还涉及包含这样的蛋白质的药物组合物。I.具有生物活性的肽和蛋白质的化学合成

典型地，具有生物活性的肽和蛋白质的合成采用于1960年代早期开发的“Merrifield”分步固相肽化学合成法，使用标准的自动肽合成器。这种合成方法可以采用固相或溶液相连接策略。尽管采用这种化学方法能容易地生产许多多肽，然而由于相关的产率损失、产生副产物和反应不完全，它不适于生产蛋白质或大的多肽。为了弥补这些局限，已经开发了能使你把预先形成的多肽片段连接起来而达到合成更大的多肽和蛋白质的化学连接技术。

化学连接涉及在第一种化学组分与第二种化学组分之间形成选择性的共价键。可以使用存在于第一种组分和第二种组分上的特异性的可相互反应的官能团使连接反应具有化学选择性。例如，肽和多肽的化学连接涉及带有相容的特异性的可相互反应的C-末端和N-末端氨基酸残基的肽或多肽的化学选择性反应。已经利用了几种不同的化学方法来达到这种目的，其实例包括天然的化学连接(Dawson，等人，Science(1994)266：776-779；Kent，等人，WO96/34878)；Kent，等人，WO98/28434)，形成肟的化学连接(Rose，等人，J.Amer.Chem.Soc.(1994)116：30-34)，形成硫代酸酯的连接(Schnlzer，等人，Science(1992)256：221-225)，形成硫醚的连接(Englebretsen，等人，Tet.Letts.(1995)36(48)：8871-8874)，形成腙的连接(Gaertner，等人，Bioconj.Chem.(1994)5(4)：333-338)和形成噻唑烷的连接以及形成噁唑烷的连接(Zhang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(1998)95(16)：9184-9189；Tam，等人，WO95/00846)或其它方法(Yan，L.Z.and Dawson，P.E.，＂Synthesis of Peptideand Proteins without Cysteine Residues by Native ChemicalLigation Combined with Desulfurization，＂J.Am.Chem.Soc.2001，123，526-533，在此引入供参考；Gieselnan et al.，Org.Lett.2001 3(9)：1331-1334；Saxon，E.等人，＂Traceless＂StaudingerLigation for the Chemoselective Synthesis of Amide Bonds.Org.Lett.2000，2，2141-2143)。

当连接涉及具有N-末端半胱氨酸残基的多肽的连接时，优选使用天然的化学连接法(Dawson等人，Science(1994)266：776-779；Kent等人，WO96/34878；Kent等人，WO98/28434；美国专利申请号09/097094，在此全部引入供参考)。天然的化学连接涉及含有一个C末端的α-羧基硫代酸酯基团的第一种肽或多肽片段与含有一个N-末端半胱氨酸残基的第二种肽或多肽之间的化学选择性反应。硫醇交换反应产生一种硫酯键合的初始中间体，该中间体自发性地发生重排而在连接位点处产生一个天然的酰胺键，同时把半胱氨酸侧链的硫醇再生出来。在很多情况下，天然的蛋白质序列将含有适当安置的半胱氨酸残基，使得可以合成含有N-末端半胱氨酸残基的多肽片段并且用于天然的化学连接反应中。

尽管已经证明这种方法是实用的、强有力的和可用于大的多肽和蛋白质的合成中，但是它要求在连接位点处含有一个半胱氨酸残基而限制了它的可应用性。半胱氨酸是最不常见的一种氨基酸。一个典型的蛋白质区域结构包含150-200个氨基酸，许多蛋白质在长度超过60个氨基酸的区域中不含有半胱氨酸残基。对于这个问题的一个解决办法包括设计一种非天然存在的蛋白质，其中蛋白质的一个或多个天然存在的氨基酸残基被半胱氨酸残基所代替，从而可以使用天然的化学连接法。该解决方法常常由于引入半胱氨酸残基可能会对蛋白质结构或功能产生不可预见的影响而变得错综复杂。这样的半胱氨酸残基可用于共价固定合成的蛋白质。

本发明提供另外两种解决这种问题的办法，这两种办法可以单独使用或者结合起来使用。第一种办法(在本文中称为“拟天然化学连接”)涉及把非天然存在的拟氨基酸残基用在蛋白质合成中所用的肽的预定位置。这样的拟氨基酸的结构既与半胱氨酸的结构也与在要合成的蛋白质的这种预定位置中自然存在的氨基酸的结构相似。第二种这样的办法(在本文中称为“扩展的天然化学连接”)被描述在美国专利申请号60/231,339(Kent等人，于2000年9月8日登记)中，在此引入供参考，涉及把含有一种羧基硫代酸酯，更优选一种α-羧基硫代酸酯的第一种组分与含有一种酸稳定的N-取代的，优选Nα-取代的C2或C3的链氨基烷基或芳基硫醇的第二种组分连接起来。下面对这些办法中的每一种进行详细讨论。A.拟天然化学连接

拟天然化学连接的目的是通过天然的化学连接把连接位点处产生的半胱氨酸侧链烷硫基化。一个优选的方面是半胱氨酸连接位点的烷硫基化，其中至少一个肽包含一个其硫醇侧链被合适的保护基团保护的天然的半胱氨酸。

在本发明的一种优选的实施方式中，把半胱氨酸残基的硫醇基团改造成所要的侧链，例如改造成核糖体规定的氨基酸的侧链，这样的氨基酸的类似物或者改造成一种非核糖体规定的氨基酸。这里所用的核糖体规定的氨基酸是一种在蛋白质的翻译过程中能够被核糖体识别并且可以掺入一种核糖体生产的蛋白质中的氨基酸。有相当多的公开文献描述了半胱氨酸侧链硫醇基团的化学改性(参见例如“CurrentProtocols in Protein Science，”John E.Coligan等人编辑，John Wiley & Sons，NY(2000))。Kaiser，E.T.已经描述了转变半胱氨酸残基侧链以模拟天然的氨基酸侧链的化学性能(参见例如Kaiser，E.T.等人，“Chemical Mutation of Enzyme Active Sites，”Science，1984 Nov 2；226(4674)：505-11)。另外，已经描述了使用半胱氨酸侧链把一种标记物引入一种肽或蛋白质中。S.S.Wong在Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking中综述了半胱氨酸侧链的改性(1991，CRC Press)；Chemical Modification ofProteins，Gary E：Means等人(1971，Holden-Day)；ChemicalModification of Proteins：Selected methods and analyticalprocedures，Glazer，A.N.等人(1975，Elsevier)；ChemicalReagents for Protein Modification，RL Lundblad(1991，CRCPress)。Tam等人(Biopolymers(1998)46：319-327)已经公开了使用高半胱氨酸(-CH₂-CH₂-SH)进行非半胱氨酸的天然化学连接，然后使用对硝基苯磺酸甲酯(甲基化试剂)进行烷硫基化，把高半胱氨酸侧链转变为一种天然的甲硫氨酸侧链(-CH₂-CH₂-S-CH₃)。还可以利用本发明把高半胱氨酸转变为拟氨基酸，即除甲硫氨酸之外的其它氨基酸。然而，就这里所述的半胱氨酸的转变来说，根据本发明，需要使用保护基来避免与包含至少一种不希望转变的天然的半胱氨酸肽的二硫键配对有关的天然半胱氨酸的破坏。合适的保护基如下所述。

虽然拟天然的化学连接方法不利于对某些核糖体规定的氨基酸的侧链(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸和脯氨酸的侧链)进行模拟(然而，可以通过一种脱硫反应来形成丙氨酸的侧链(Yan，L.Z.andDawson，P.E.，“Synthesis of Peptides and Proteins withoutCysteine Residues by Native Chemical Ligation Combined withDesulfurization，”J.Am.Chem.Soc.2001，123，526-533，在此引入供参考)，可以用它来形成模拟许多核糖体规定的或非编码的氨基酸的侧链。按照本发明的拟天然的化学连接方法生产的氨基酸将包含一个硫醚键，并且将不包含β-支链(其中它们都将在β-位包含一个甲基，即aa-βCH₂-S-)。因此，可以制备拟天然氨基酸形式的β-支链氨基酸，异亮氨酸和苏氨酸使其含有侧链结构而没有β-几何结构及其附带的限制。

重要的是，可以使用本发明的方法来形成长度等于、大于或小于核糖体规定的氨基酸长度的氨基酸侧链。可以利用这种侧链长度的改变来使三维构象稳定化(或去稳定化)而增大蛋白质的稳定性(或者增大蛋白质改变其构象从而能接受不同范围的底物、抑制剂、受体、配体等的能力，与天然蛋白质的接受能力相比)。例如，Cys-CH₂-SH+Br-CH₂-COOH得到Cys-CH₂-S-CH₂-COOH(这样的“拟谷氨酸”含有另外一个侧链原子即-S-基；另外，如果用于替换天冬氨酸，它将含有另外两个侧链原子即一个-CH₂-S-基团)。其它侧链含有同样数目的侧链原子，但是不同在于包含硫醚键(-S-)。例如，Cys-CH₂-SH+Br-CH₂-CH₂-NH-PG，然后除去PG，得到Cys-CH₂-S-CH₂-CH₂-NH₂。所得的结构中不含有其它的侧链原子，但是有一个-CH₂-基被-S-所替换。甲硫氨酸是这里的另一个实例，Cys-CH₂-SH+I-CH₂-CH₃，得到Cys-CH₂-S-CH₂-CH₃(与天然的甲硫氨酸的结构Met-CH₂-CH₂-S-CH₃相对)；这样硫醚就被重新定位了。精氨酸也是这样：Cys-CH₂-SH+Br-CH₂-NH-CH((NH₂)(＝NH₂ ⁺))，得到Cys-CH₂-S-CH₂-NH-CH((-NH₂)(＝NH₂ ⁺))。优选地，可以采用对反应性氨基进行保护(特别是在构建拟赖氨酸时)，以避免不想要的副反应。一旦进行完烷硫基化反应，就可以除去保护基。

一般来说，当想要尽可能逼真地模拟天然蛋白质时，最优选使用一种带有与通常存在于蛋白质中的同样位置的核糖体规定的氨基酸的侧链长度相同的侧链的拟氨基酸分子。较少优选使用带有比核糖体规定的氨基酸的侧链长度多一个原子的侧链的拟氨基酸分子，更较少优选使用带有比核糖体规定的氨基酸的侧链长度多两个原子的侧链的拟氨基酸分子。而且，优选把半胱氨酸的连接位点选择在这样的位置：在这样的位置，基因改变不太可能破坏功能或者相关蛋白质在该位点处的氨基酸被保存。这样的位点可以通过丙氨酸扫描、同源模型制作和其它方法鉴别出来。

在拟天然化学连接中，按照天然的化学连接方法把一个含有氨基末端的半胱氨酸残基的肽与一个含有羧基末端硫代酸酯的肽连接。然后使半胱氨酸的硫醇侧链与式R_aa-X的化合物反应，其中X是一个良好的离去基团，而R_aa是一个结构与一个核糖体规定的氨基酸或合成氨基酸的侧链的末端部分相似的基团。

重要的是，拟天然的化学连接反应能使用天然的L-构型或D-构型的半胱氨酸侧链进行。使用D-构型可以赋予在该连接位点以蛋白酶抗性，当需要增大对蛋白水解的稳定性时，这或许是需要的。然而，在使用D-半胱氨酸时，将会改变该侧的骨架结构。除了希望这种改变能产生对蛋白酶的抗性外，还可以希望它能改变生物活性。然而，为了尽可能地减小对生物活性的影响，优选把D-半胱氨酸定位于高灵活性的位点，例如无序区，如将要定位于所得的折叠分子表面、定位于分子的无序末端的无序环。最好是可以利用拟天然的化学连接反应来把大的带电荷的侧链(例如Lys、Arg、Asp或Glu的侧链)定位于合成分子的表面。

合适的良好的离去基团x的例子包括卤素，特别是碘和溴。R_aa基团的例子包括PO₄、COOH、COO、CONH₂、胍、胺、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、咪唑、烷基化的咪唑、吲哚和烷基化的吲哚基。

其中要用的R_aa基团的选择取决于希望在特定的位置上存在的氨基酸侧链。例如，想要的含有下列氨基酸序列的多肽或蛋白质：

{aa}_{{NH}_{2}} - Q - {aa}_{x} - {aa}_{y} - W - {aa}_{COOH}

其中Q和W各自代表选择性地存在或不存在的其它氨基酸残基，而aa_x和aa_y代表内部的相邻残基(分别含有侧链x和y)，而

和aa_COOH分别代表多肽或蛋白质的氨基(N-)末端残基和羧基(C-)末端残基，

它们可以通过制备下列两个肽片段而进行合成：

{aa}_{{NH}_{2}} - Q - {aa}_{x} - COSR

和Cys-W-aa_COOH其中cys表示用半胱氨酸替换aa_y，而R是与硫代酸酯基团相容的任何基团，它包括但是不限于芳基、苄基和烷基。R的例子包括3-羧基-4-硝基苯基硫代酸酯、苄基酯和巯基丙酸亮氨酸酯(参见例如Dawson等人，Science(1994)266：776-779；Canne等人，Tetrahodron Lett．(1995)36：1217-1220；Kent等人，WO96/34878；Kent等人，WO98/28434；Ingenito等人，JACS(1999)121(49)：11369-11374；和Hackeng等人，Proc．Natl．Acad．Sci．USA(1999)96：10068-10073)。其它例子包括二硫代苏糖醇或烷基或芳基硫代酸酯，它们可以通过intein-介导的生物技术来生产，这样的生物技术也是众所周知的(参见例如Chong等人，Gene(1997)192：277-281；Chong等人，Nucl．Acids Res．(1998)26：5109-5115；Evans等人，ProteinScience(1998)7：2256-2264；和Cotton等人，Chemi s try&Biology(1999)6(9)：247-256)；然后把这些片段连接在一起形成：

{aa}_{{NH}_{2}} - Q - {aa}_{x} - Cys - W - {aa}_{COOH}

然后使连接起来的片段与R_y-X反应，其中R_y是一个与y侧链的结构相似的侧基。反应在足以把半胱氨酸的硫醇基团转变为一种“拟-y”侧链的条件下进行。例如，如果选择的R_aa是CH₂-COOH或(CH₂)₂-COOH，则反应将会导致形成一种与天冬氨酸或谷氨酸的结构和功能相似的氨基酸残基(“拟-Asp”或“拟-Glu”)。你将会明白，根据上述说明，可以使用两个以上的肽片段进行更为复杂的合成。

本发明的涉及-拟氨基酸抑的天然化学连接显著地扩展了天然化学连接方法在蛋白质的化学合成中的可应用性。涉及“拟氨基酸”的天然化学连接使用与连接步骤中同样的化学方法，在Cys残基处与一个天然含有硫醇的侧链官能度形成一个肽键；在一种特异性的第二步中，通过化学选择性的反应转变连接位点处的天然的Cys的含硫醇的侧链而得到一种含有与基因编码的氨基酸同样的官能团，但是是一个非天然的侧链。

例如，可以使连接位点处的半胱氨酸与溴乙酸(或其它卤乙酸)在中性的pH下在水中反应；在这些条件下，只有连接位点处的未受保护的Cys的硫醇发生反应而得到一种在连接位点处含有一个S-羧甲基化的残基，即：

这种非天然的氨基酸的侧链上含有一个羧基部分，与谷氨酸或天冬氨酸残基的官能团相同。在这里，S-羧甲基化的Cys被称为“拟谷氨酸”(“拟谷氨酸盐”、“拟-Glu”)(其中存在一个额外的侧链原子，和是形成硫醚键的-S-基团)。对于许多蛋白质来说，在这种“拟氨基酸”中，甚至对带电荷的羧化物侧链进行简单的保护都将足以保留或赋予蛋白质以所要的性能。一个关键的差别是它能在没有合适的半胱氨酸的位置上作为天然的连接位点而发挥作用。

使用其它试剂来修饰连接位点处的Cys残基的侧链硫醇可以产生其它的“拟氨基酸”残基。例如，使硫醇与一种卤乙酰胺例如溴乙酰胺反应，将在连接位点处产生一种“拟谷胺酰胺”。

同样地，与一种N-保护的卤烷基胺例如下列化合物反应：

然后除去氨基保护基，将得到一种“拟赖氨酸”残基，即：

连接位点处的Cys残基与一种合适的卤代烷，例如下式的化合物反应

将产生一种“拟亮氨酸”氨基酸，即：

可以选择使用其它合适的含芳基的卤化物，例如其中R可以是H、OH、芳基等的下式的卤代物：

以同样的方式产生对应于Phe、Tyr或Trp残基的拟氨基酸，即：

这种方法的一个显著的特征是：在使片段反应的过程中你不希望改变的半胱氨酸残基的侧链被保护了，例如被保护成Cys(Acm)，以防止除连接位点处以外的Cys残基发生化学改性；或者在连接后，反应片段中的任何其它的Cys残基通过化学改性反应而被同时用于相同的“拟氨基酸”的形成中。你将会明白，同样的原理可用于在连接位点处使用高半胱氨酸。你还将会明白，通过硒代半胱氨酸介导的天然的化学连接，可以在连接位点处使用硒代的半胱氨酸，并且通过相似的烷基化反应进行转变而产生其中硒醚基团替换了硫醚基团的本发明的拟氨基酸。

这里所用的符号代表苄基，IM代表咪唑基，而IN代表吲哚基，PG代表保护基。以下是可用于合成含有本发明的拟氨基酸残基的肽的R_aa基团的概要(其中X是卤素(I、Br、Cl、F，对于大多数化合物，优选I和Br，对于连接，优选F)：碱性氨基酸：Lys(没有额外的原子)

-CH₂-SH+X-CH₂-CH₂-NH-PG，然后脱保护，得到-CH₂-S-CH₂-CH₂-NH₂Arg((没有额外的原子)

-CH₂-SH+X-CH₂-NH-C((NH₂)(＝NH₂+))，得到-CH₂-S-CH₂-NH-C((NH₂)(＝NH₂+))His(有2个额外的原子)

-CH₂-SH+X-CH₂-IM-PG，然后脱保护，得到-CH₂-S-CH₂-IM酸性氨基酸：Asp(有2个额外的原子)

-CH₂-SH+X-CH₂-COOH，得到-CH₂-S-CH₂-COOHGlu(有1个额外的原子)

-CH₂-SH+X-CH₂-COOH，得到-CH₂-S-CH₂-COOH不带电荷的极性氨基酸：Tyr(没有或有1个额外的原子)

-CH₂-SH+F--pOH，得到-CH₂-S--pOH(没有额外的原子，同样的几何结构)

-CH₂-SH+Br/I-CH₂--pOH，得到-CH₂-S-CH₂--pOH(有一个额外的原子)Gln(有1个额外的原子)

-CH₂-SH+X-CH₂-C(O)(NH₂)，得到-CH₂-S-CH₂-C(O)(NH₂)Asn((有2个额外的原子)

-CH₂-SH+X-CH₂-C(O)(NH₂)，得到-CH₂-S-CH₂-C(O)(NH₂)Ser(有2或3个额外的原子)

-CH₂-SH+X-CH₂-OH，得到-CH₂-S-CH₂OH(有2个额外的原子)

-CH₂-SH+X-CH₂-CH₂OH，得到-CH₂-S-CH₂-CH₂OH(有3个额外的原子)Thr(有2或3个额外的原子，缺乏β-支链)

-CH₂-SH+X-CH((CH₃)(O-PG))，然后除去PG，得到-CH₂-S-CH((CH₃)(OH))(2个额外的原子)

-CH₂-SH+X-CH₂-CH((CH₃)(O-PG))，然后除去PG，得到-CH₂-S-CH₂-CH((CH₃)(OH))(3个额外的原子)非极性氨基酸：Leu(有1或2个额外的原子)

-CH₂-SH+X-CH((CH₃)(CH₃))，得到-CH₂-S-CH((CH₃)(CH₃))(1个额外的原子)

-CH₂-SH+X-CH₂-CH((CH₃)(CH₃))，得到-CH₂-S-CH₂-CH((CH₃)(CH₃))(2个额外的原子)Ile(有2或3个额外的原子，缺乏β-支链)

-CH₂-SH+X-CH(CH₃)-CH₂-CH₃，得到-CH₂-S-CH(CH₃)-CH₂-CH₃(2个额外的原子)

-CH₂-SH+X-CH₂-CH(CH₃)-CH₂-CH₃，得到-CH₂-S-CH₂-CH(CH₃)-CH₂-CH₃(3个额外的原子)Phe(有1或2个额外的原子)

-CH₂-SH+F-，得到-CH₂-S-(有1个额外的原子)

-CH₂-SH+Br/I-CH₂-，得到-CH₂-S-CH₂-(有2个额外的原子)Met(没有额外的原子)

-CH₂-SH+I-CH₂-CH₃，得到-CH₂-S-CH₂-CH₃Trp(有1个额外的原子)

-CH₂-SH+F-IN，得到-CH₂-S-IN

一般的拟化学连接反应如图1中所示。可用于形成优选的拟氨基酸的优选的R_aa和X基团如表I中所示。所示的残基是不带电荷的，然而，应当明白，可以离子化的基团例如NH₂或COOH可以以其带电荷的形式或者以盐的形式提供。除了用于形成拟赖氨酸的反应之外的所有反应都在水溶液中在8-9的pH下进行，其中可以按照标准方法对反应的化学计量和优化条件进行调整。拟赖氨酸是在水溶液中在8-9的pH下进行反应，然后在哌啶/水(三氟乙酸(TFA))中反应而形成的。

在本发明的另一种实施方式中，可以把半胱氨酸残基的硫醇基氧化(-SH→-SO₃ ^-)，或者用O替换而形成丝氨酸(-SH→-OH)。这样的替换可以通过使半胱氨酸与甲苯磺酰氯(Tos-C1)反应从而把硫醇基-SH转变为-S-甲磺酰基而实现。在强碱的存在下，OH替换甲磺酰基取代基而形成所要的-OH基团。

另外，可以通过一个如下的Michael加成反应对半胱氨酸进行修饰：其中R是H、烷基、芳基、烷芳基、氨基或者是一个可以支化的或未支化的无规或嵌段聚合物分子。

本发明的另外一个方面指向多肽片段的用途，其中多肽片段的氨基末端半胱氨酸残基已经被修饰成包含一个烷基氨基(优选一个甲基氨基)基团：

通过保护烷基氨基的氨基，你可以把肽A与通式：肽B-αCOSR的第二种肽连接起来。在除去保护基后，可以把通式：肽C-αCOSR的其它肽与前面已经连接好的肽连接起来而形成一种下列的支化的肽配合物：

由于支化蛋白质依然包含半胱氨酸的硫醇基，它将与一种R_aa-X分子按照上述的方式反应，从而允许对侧链进行进一步的修饰。尤其是，通过使用一种烷基酰胺作为R取代基，可以把其它的氨基引入分子中，从而允许进一步的支化或进一步的连接反应：

在本发明的另一种实施方式中，可以利用对半胱氨酸侧链的修饰来引入多种标记物或结合分子中的任何一种。例如，可以使用能通过电子自旋共振、荧光(例如4-氯-7-磺基苯并呋咱(SBF)铵，PierceChemical Company生产)或磁成像检测的标记物。这样的标记可用于诊断疾病和状态以及对分子间相互作用进行分析(例如测定膜本体蛋白质间的距离)。本发明的方法就标记物和结合分子的使用而言具有几个显著的优点。可以以一种位点特异性的无规方式引入这样的取代基。另外，只需要标记物基团对后续的化学连接步骤(如果有的话)保持稳定。这样的反应一般在非常温和的的条件下(例如在天然化学连接中所用的条件；除去Acm或可以选择性地用来保护其它半胱氨酸残基的硫醇基团的其它保护基团(例如用Hg(CH₂COOH)₂除去)；使用反相HPLC进行纯化。对这些其它的硫醇基团进行保护能够防止含有Cys的肽的氧化聚合，从而方便了它们的纯化和处理。

B.扩展的天然化学连接

如上所述，当天然的蛋白质序列不含有合适的半胱氨酸残基，并且要对天然的蛋白质序列进行修饰以便在多肽的N-末端引入一个半胱氨酸残基要么是不方便的要么是不理想的时，可以使用“扩展的天然化学连接”来把已经将其N-末端改造成包含一个N-取代的，优选Nα-取代的C2或C3链氨基烷基或芳基硫醇从而允许利用天然化学连接的原理的多肽与缺乏半胱氨酸残基的多肽连接起来(参见美国专利申请号60/231,339，在此引入供参考)。

“扩展的天然化学连接”方法涉及把含有一种羧基硫代酸酯，更优选一种α-羧基硫代酸酯的第一种组分与含有一种酸稳定的N-取代的，优选Nα-取代的C2或C3链氨基烷基或芳基硫醇的第二种组分连接起来。第一种组分的羧基硫代酸酯与第二种组分的N-取代的C2或C3链烷基或芳基硫醇的硫醇之间的化学选择性反应通过一种硫酯键合的中间体进行，解析为一种初始连接产物。更具体地，发生在COSR硫代酸酯组分和氨基烷基硫醇组分之间的硫醇交换产生一种硫酯键合的中间体连接产物，该连接产物自发重排后，根据氨基烷基硫醇组分是式I还是式II，分别经过一个5元或6元环中间体而产生一种酰胺键合的第一连接产物：

J1-C(O)-N(C1(R1)-C2-SH)-J2 I或

J1-C(O)-N(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-J2 II其中J1是含有一个或多个选择性地被保护的氨基酸侧链的肽或多肽或这样的肽或多肽部分、聚合物、染料、合适的官能化的表面、连接体或可检测的标记物或与肽的化学合成或扩展的天然化学连接相容的其它化合物部分；R1、R2和R3独立地为H或一种与C1共轭的给电子基团：条件是至少R1、R2和R3中的一个包含一个与C1共轭的给电子基团；而J2是含有一个或多个选择性地被保护的氨基酸侧链的肽或多肽或这样的肽或多肽部分、聚合物、染料、合适的官能化的表面、连接子或可检测的标记物或与肽的化学合成或扩展的天然化学连接相容的其它化合物部分。

在连接位点处的N-取代C2或C3链烷基或芳基硫醇[HS-C2-C1(R1)-]或[HS-(C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]易于在与肽相容的条件下除去而不会对产物产生损害，产生一种在连接位点处含有一个天然酰胺键的下式III的最终的连接产物：

J1-C(O)-HN-J2 III其中J1、J2、R1、R2和R3如前面所定义。

选择R1、R2和R3基团要方便在与肽相容的断裂条件下断裂N-C1键。例如选择给电子基团，特别是当与C1共轭时，可以使用给电子基团在C1处形成便于断裂的共振稳定的阳离子。化学连接反应优选包含一种硫醇催化剂作为赋形剂并且在大约中性的pH条件下在水性或有机-水性的混合条件下进行。第一种和第二种组分的化学连接可以通过一种5元或6元环进行，后者自发地发生重排，得到一种N-取代的酰胺键合的连接产物。当第一种和第二种组分是肽或多肽时，N-取代的酰胺键合的连接产物的具有式IV或V：

J1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-HS)-CH(Z2)-C(O)-J2 IV

J1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-HS)-CH(Z2)-C(O)-J2 V其中J1、J2以及R1、R2、R3如前面所定义，Z2是一个氨基酸的侧链或这样的侧链的衍生物。

N取代的酰胺键合的连接产物的共轭的给电子基团R1、R2或R3有助于从N-取代的酰胺键合的连接产物中断裂N-C1键和除去C2或C3链烷基或芳基硫醇。在与肽相容的断裂条件下除去N的烷基或芳基硫醇链，产生一种在连接位点处含有天然的酰胺键的连接产物。当第一种和第二种组分是肽或多肽时，则连接产物将具有下式：

J1-CONαH-CH(Z2)-C(O)-J2 (X)

式I的R1取代基的实例列于表II中。

表II式II的R1、R2和R3取代基的实例列于表III中。

表III

如同N-取代的C2链化合物的情况一样，为了保持与C1碳的电子共轭以便于在连接后能有力地断裂Nα-C1键，把苄基和吡啶甲基的给电子取代基R1′、R3′和R5′定位在邻位或对位是必需的。然而，当R2和R3与C2和C3形成一个苄基时，至少R1′和R3′中的一个包含一个强给电子基团，其中R1′或R3′选自甲氧基(OCH₃)、硫醇(-SH)、羟基(-OH)和甲硫基(-SCH₃)。对于其中R2和R3都是H的N-取代的C3链硫醇，R1包含一个苄基或吡啶甲基，其中R1′、R3′和R5′包含强或中等的给电子基团或其组合。如同N-取代的C2链烷基或芳基硫醇的情况一样，强给电子基团能够增强C3链烷基或芳基硫醇在连接后发生断裂的敏感性。因此，可以相应地选择特定的给电子基团或其组合。

与N-取代的C2链化合物相似，当硫醇可以用来在令人感兴趣的结构中可用于取代时，本发明的N-取代的C3链化合物可以包括一种硫醇作为R1′和R5′位的R1的取代基。同样，给电子的硫醇基团与C1共轭，以及它在这些位置上的引入使化合物具有两条能形成6元环连接的路线。它还增大了用于与α-羧基硫代酸酯反应的可利用的硫醇的局部浓度，并且就结构限制来说.提供了其它构象，这可以促进连接。

本发明的N-末端的N-取代的C2或C3链烷基或芳基硫醇氨基酸的合成可以按照这里所述的方法进行，例如按照方案I和方案II，以及按照本领域中已知的标准有机化学技术进行，参见例如＂AdvancedOrganic Chemistry，reactions，Mechanisms，and Structure，＂4thEdition，J.March(Ed.)，John Wiley & Sons，New York，NY，1992；＂Comprehensive Organic Transformations，A Guide toFunctional Group preparations，＂R.Larock(Ed.)，VCHPublishers，New York，NY，1989。它们可以在溶液中、通过聚合物负载的合成方法或其组合进行合成。优选的方法使用Nα保护的N烷基化的S-保护的氨基烷基-或芳基-硫醇氨基酸母体。合成所用的试剂可以从多个商业渠道得到。而且，应当理解到，可以把原料组分和各种中间体，例如个别的氨基酸衍生物储存起来以备后用，以试剂盒等形式提供等。

在制备本发明的N-末端Nα-取代的C2或C3链烷基或芳基硫醇氨基酸时，采用保护基策略。在各种合成策略中所优选使用的保护基(PG)一般与固相肽合成(＂SPPS＂)相容的。在一些情况下，还有必要使用可以在不同的条件下被除去的正交保护基。已知有许多适用于这种目的的保护基(参见例如＂protecting Groups in Organic Synthesis＂，3rd Edition，T.W.Greehe and P.G.M.Wuts，Eds.，John Wiley& Sons，Inc.，1999；NovaBiochem Catalog 2000；＂SyntheticPeptides，A User′s Guide，＂G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman &Company，New York，NY，1992；＂Advanced Chemtech Handbook ofCombinatorial & Solid Phase Organic Chemistry，＂W.D.，Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，and H.H.Saneii，Eds.，Advanced Chemtech，1998；＂Principlesof Peptide Synthesis，2nd ed.，＂M.Bodanszky，Ed.，Springer-Verlag，1993；＂The Practice of Peptide Synthesis，2nd ed.，＂M.Bodanszky and A.Bodanszky，Eds.，Springer-Verlag，1994；and＂protecting Groups，＂P.J.Kocienski，Ed.，GeorgThieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994).实例包括苄氧基羰基(Z)、Boc、Bpoc、Trt、Nps、FmocCl-Z、Br-Z、NSC、MSC、Dde等。对于硫基团，合适的保护基的实例包括但是不限于苄基、4-甲基苄基、4-甲氧基苄基、三苯甲基、ACM、TACAM、呫吨基、二硫化物衍生物、吡啶甲基和苯乙酰基。

更具体地，Nα-取代的C2或C3链烷基或芳基硫醇可以按照方案I(Nα-取代的母体的固相制备)、方案II(Nα-取代的母体的溶液相制备)。在方案I中，使用标准的聚合物-负载的有机合成方法把Nα-取代的C2或C3链烷基或芳基硫醇直接装配在固相上，同时使用标准的偶合方法使方案II的Nα-保护的，N-烷基化的，S-保护的氨基烷基或芳基硫醇氨基酸母体与树脂偶合。当生产出外消旋体或非对映异构体产物时，有必要在用于扩展的天然化学连接之前，通过标准方法把这些化合物分离开来。

方案I

ECL助剂衍生的分子的固相合成

方案II

α-羧基硫代酸酯可以通过化学或生物学方法按照本领域中已知的标准技术生产，例如按照这里所述的方法，包括实施例中所述的方法生产。对于化学合成，可以在溶液中或者从生产硫代酸酯的树脂合成α-羧基硫代酸酯肽，这些技术是熟知的(参见例如Dawson等人，supra；Canne等人，supra；Hackeng等人，supra；Aimoto等人)。例如化学合成的硫代酸酯肽可以从相应的肽α-硫代酸制得，而后者又可以在一种硫代酸酯-树脂上或者在溶液中合成，但是优选树脂方法。可以把肽-α-硫代酸转变为相应的3-羧基-4硝基苯基硫代酸酯、相应的苄基酯或多种烷基硫代酸酯中的任何一种。所有这些硫代酸酯都能给连接反应提供令人满意的离去基团，其中3-羧基-4-硝基苯基硫代酸酯所表现的反应速率比相应的苄基硫代酸酯高一些，而苄基硫代酸酯的反应性又比烷基硫代酸酯高。作为另一个实例，可以使用能生产与三苯甲基缔合的巯基丙酸亮氨酸硫代酸酯的树脂来构建C-末端硫代酸酯(Hackeng等人，supra)。还可以使用一种3-羧酸丙磺酰胺安全捕集连接子，通过用重氮甲烷或碘代乙腈活化，然后用一种合适的硫醇替换来进行C-末端硫代酸酯的合成(Ingenito等人，supra；Bertozzi等人)。

把本发明的N-取代的C2或C3链烷基或芳基硫醇组分与第一种羧基硫代酸酯组分连接，产生一种在连接位点处含有N-取代的酰胺键的连接产物，如图1、2和3中所示。选择该反应的连接条件以保持硫代酸酯与N-取代的C2或C3链烷基或芳基硫醇部分选择性的反应性。在一种优选的实施方式中，连接反应在一种pH 6-8，优选的pH范围为6.5-7.5的缓冲溶液中进行。该缓冲溶液可以是水性溶液、有机溶液或其混合物。连接反应还可以包括一种或多种催化剂和/或一种或多种还原剂、脂质、去污剂、其它变性剂或增溶剂等。优选的催化剂的实例有硫醇和含磷部分，例如硫酚、苄基硫醇、TCEP和烷基膦。变性剂和/或增溶剂的实例包括胍、在水或有机溶剂例如TFE、HFIP、DMF、NMP中的脲、混有水或胍和脲的水溶液的乙腈。还可以利用温度来调节连接反应的速率，温度通常在5℃与55℃之间，优选温度介于15℃和40℃之间。作为一个实例，在一个含有2％硫酚的6M胍中，在6.8-7.8的pH下，连接反应进行得很好。

对于N-取代的C2链烷基或芳基硫醇来说，连接产生于发生在COSR硫代酸酯组分和氨基烷基硫醇组分之间的硫醇交换。交换产生一种硫代酸酯键合的中间体连接产物，其自发地发生重排后，通过一个5元环中间体而产生第一种在连接位点处含有可以被除去的N取代的C2链烷基或芳基硫醇[HS-C2-C1(R1)-]的式J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-SH)-CH(Z2)-J2的连接产物，其中取代基如前面所定义。在连接位点处的N取代的C2链烷基或芳基硫醇[HS-C2-C1(R1)-]易于在与肽相容的条件下除去而产生一种在连接位点处具有天然的酰胺键的式J1-HN-CH(Z1)-CO-NH-CH(Z2)-CO-J2的最终连接产物。

对于N-取代的C3链烷基或芳基硫醇来说，COSR硫代酸酯组分和氨基烷基硫醇组分之间的硫醇交换产生一种硫酯键合的中间体连接产物，后者自发地发生重排，通过一个6元环中间体而产生第一种在连接位点处含有可以被除去的N取代的C3链烷基或芳基硫醇[HS-C3(R3)-C2-C1(R1)-]的式J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Nα(C1-C2(R2)-C3(R3)-SH)-CH(Z2)-J2的连接产物。在连接位点处的N取代的C3链芳基硫醇[HS-C2-C1(Ri)-]易于在与肽相容的条件下断裂而产生一种在连接位点处具有天然的酰胺键的式J1-HN-CH(Z1)-CO-NH-CH(Z2)-CO-J2的最终连接产物。

N-取代的烷基或芳基硫醇基团的除去优选在酸性条件下通过方便地断裂N-C1键而进行，在连接位点处得到一种稳定的未取代的酰胺键。＂与肽相容的断裂条件＂是指适用于从连接产物中破开N-键合的烷基或芳基硫醇断裂的与肽相容的物理-化学条件。与肽相容的断裂条件一般根据所用的α-取代的化合物来进行选择，它可以容易地从合成路线和熟知的方法演绎出来(参见例如＂Protecting Groups in OrganicSynthesis＂，3rd Edition，T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Eds.，John Wiley & Sons，Inc.，1999；NovaBiochem Catalog 2000；＂Synthetic Peptides，A User′s Guide，＂G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman & Company，New York，NY，1992；＂Advanced ChemtechHandbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry，＂W.D.，Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，and H.H.Saneii，Eds.，Advanced Chemtech，1998；＂Principles of Peptide Synthesis，2nd ed.，＂M.Bodanszky，Ed.，Springer-Verlag，1993；＂The Practice of PeptideSynthesis，2nd ed.，＂M.Bodanszky and A.Bodanszky，Eds.，Springer-Verlag，1994；and＂Protecting Groups，＂P.J.Kocienski，Ed.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994)。

例如，当R1、R2或R3取代基包含甲氧基、羟基、硫醇或甲硫基、甲基等时，用于除去的更普遍的方法涉及用于肽合成化学中的典型的酸性断裂条件，这包括在强酸性条件下或水-酸条件下，在有或没有还原剂和/或清除剂体系(例如酸，例如无水的氟化氢(HF)、三氟乙酸(TFA)或三甲基磺酰基氟乙酸(TMSFA)等)的情况下断裂N-C1键。对于给定的结构，可以选择更具特异性的酸性断裂体系来优化Nα-C1键的断裂，除去芳基或烷基硫醇部分。这样的条件是熟知的并且是保持肽的完整性相容的。另一种消去方法涉及包含一种硫醇清除剂，其中色氨酸存在于肽或多肽序列中以避免色氨酸侧链与游离的芳基或烷基硫醇部分反应。硫醇清除剂的实例包括乙二醇、半胱氨酸、β-巯基乙醇和甲硫酚。

当吡啶甲基作为取代基时，其它具体的断裂条件包括光或还原性断裂条件。作为一个实例，当R1或R2和R3取代基包含一个吡啶甲基部分时，可以使用光解(例如紫外光)、锌/乙酸或电解还原按照标准方法进行断裂。当N-取代的C2链硫醇的R1在R1处含有一个甲硫基时，则可以使用汞或HF进行断裂。还可以使用该断裂体系同时从固体载体中断裂并且/或者当第一种和第二种连接组分包含其它保护基时，断裂体系可作为脱保护试剂。

在本发明的一种实施方式中，在肽的合成步骤中(特别是在肽的自动合成和正交的以及收敛的连接策略中)，使用Nα-取代的C2或C3链烷基或芳基硫醇来生产可用作生产生物活性的合成蛋白质的扩展的化学连接的底物的合适的N-末端衍生多肽。这些化合物包括一种式(PG1)S-C2-C1(R1)-Nα(PG2)-CH(Z2)-C(O)J2或(PG1)S-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-Nα(PG2)-CH(Z2)-C(O)-J2的完全受保护的、部分受保护的或完全未受保护的酸稳定的Nα-取代的C2或C3链氨基烷基或芳基硫醇，如下面表IV和表V中所示。尤其是，R1，R2和R3中的一个或多个含有与C1共轭的给电子基团，它在Nα-取代的氨基烷基或芳基硫醇转变为Nα-取代的酰胺烷基或芳基硫醇后，能够在C1处形成一种共振稳定的阳离子而便于在与肽相容的断裂条件下断裂Nα-C1键。PG1和PG2是单独或一起存在的保护基团，或者不存在，并且可以相同或不同，其中Z2是与肽的化学合成或扩展的天然的化学连接相容的任何化合物部分，并且其中J2是与肽的化学合成或扩展的天然的化学连接相容的任何化合物部分。PG1(或X1)是一种胺的保护基。PG2(或X2)是一种硫醇的保护基。许多这样的保护基是已知的并且适用于这种目的(参见例如＂Protecting Groups in OrganicSynthesis＂，3rd Edition，T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Eds.，John Wiley & Sons，Inc.，1999；NovaBiochem Catalog2000；＂Synthetic Peptides，A User′s Guide，＂G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman & Company，New York，NY，1992；＂Advanced ChemtechHandbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry，＂W.D.，Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，and H.H.Saneii，Eds.，Advanced Chemtech，1998；＂Principles of Peptide Synthesis，2nd ed.，＂M.Bodanszky，Ed.，Springer-Verlag，1993；＂The Practice of PeptideSynthesis，2nd ed.，＂M.Bodanszky and A.Bodanszky，Eds.，Springer-Verlag，1994；and＂Protecting Groups，＂P.J.Kocienski，Ed.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994)。

表IV

优选的PG1和X1保护基的实例包括但是不限于[Boc(叔丁基氨基甲酸酯)、Troc(2，2，2，-三氯乙基氨基甲酸酯)、Fmoc(9-芴基甲基氨基甲酸酯)、Br-Z或C1-Z(Br-或C1-苄基氨基甲酸酯)、Dde(4，4，-二甲基-2，6-二氧代环己-1-亚基)(ex1-ylidene)、MsZ(4-甲基亚磺酰基苄基氨基甲酸酯)、Msc(2-甲基磺基乙基氨基甲酸酯)、Nsc(4-硝基苯基乙基磺酰基-乙氧基羰基]。优选的PG1和X1保护基选自＂Protective Groups in Organic Synthesis，＂Green and Wuts，ThirdEdition，Wiley-Interscience，(1999)，其中最优选Fmoc和Nsc。优选的PG2保护基的实例包括但是不限于[Acm(乙酰氨基甲基)、MeOBzl或Mob(对-甲氧基苄基)、Meb(对-甲基苄基)、Trt(三苯甲基)、Xan(呫吨基)、tButhio(叔丁基硫基)、Mmt(对-甲氧基三苯甲基)、2或4-吡啶甲基(2或4-吡啶基))、Fm(9-芴基甲基)、tBu(叔丁基)、Tacam(三甲基乙酰氨基甲基)]。优选的PG2和X2保护基选自＂Protective Groups in Organic Synthesis，＂Green and Wuts，ThirdEdition，Wiley-Interscience，(1999)，其中最优选Acm、Mob、MeB、吡啶甲基。

表V

本发明的Nα-取代的C2或C3链烷基或芳基硫醇的受保护形式可以按照上述方案I和II中所述的方法制备。

本发明的化合物可以通过包括卤素介导的氨基烷基化、还原性氨基化在内的多种方法中的任何一种以及通过制备与固相氨基酸合成方法相容的Nα-保护的，N-烷基化的，S-受保护的氨基烷基-或芳基-硫醇氨基酸母体来生产。需要时，可以通过标准方法对生产的外消旋体或非对映异构体进行拆分而得到具有可以接受的手性纯度的化合物。II.本发明的生物活性肽和蛋白质A.生物活性的合成蛋白质

上述方法可以用来合成生物活性的合成肽和蛋白质。如果使用了非重组技术使一些，最优选全部其氨基酸残基聚合的话，则这里所用的生物活性蛋白质就被说成是“合成的”。术语“非重组技术”用来区分涉及有机化学和其它合成聚合方法的技术与涉及在体内或体外把RNA翻译为蛋白质的技术。更优选地，将利用有机化学原理，特别是这里所讨论的“天然化学连接”和“扩展的天然化学连接”方法在体外生产本发明的生物活性的合成蛋白质。这样的化学合成将优选使用一种汇集合成方法进行，其中可以合成多肽片段，然后一个一个地连接起来而形成生物活性的合成蛋白质。另外，本发明的生物活性的合成蛋白质可以在单一的非汇集合成中进行合成。

如上所述，本发明的生物活性的合成蛋白质具有相当大的分子量，优选分子量大于大约25kDa。为了本发明的目的，这种分子量的测定是通过变性SDS聚丙烯酰胺电泳进行的。术语“单体分子量”是指与可以具有多次复制的蛋白质或多肽的合成蛋白质不同的合成蛋白质单体的分子量。

这里所用的合成蛋白质如果具有依赖于合成蛋白质的结构或氨基酸序列的可看得清楚的生物活性，并且这种结构或序列的变化能够增大、改变或减小蛋白质的生物活性，则它被说成是具有“生物活性”。非限定性地，这种“生物活性”包括蛋白质介导催化反应、传导反应信号或诱导反应的能力。这里所用的蛋白质被说成是能“介导一种催化反应”，是通过把一种底物转变为一种产物而其本身不被消耗掉或发生永久性改变。如果一种蛋白质的存在能够引起一种生物或其组织或细胞启动、继续、增强、改变或减弱基因表达、细胞分化或细胞增殖，则该蛋白质被说成是能“介导信号的传递或诱导反应”。这种介导信号的传递或诱导反应的例子包括诱导细胞素的表达或对细胞素的表达作出反应，诱导红细胞生成，诱导或减弱炎症和/或炎症的过程、启动血管生成或血管形成、诱导凋亡、影响细胞周期等。

本发明的生物活性的合成蛋白质的生物活性包括蛋白质特异性地结合受体、配体或抗体的能力。这里所用的术语“特异性的”结合是指基于结构上的结合相互作用，例如存在于激素与其受体或抗体与抗原决定部位之间的特异性结合，区别于基于电荷、溶解性、疏水性等的“非特异性”结合。

本发明的生物活性的合成蛋白质优选通过氨基酸残基的缩合来进行合成。这样的氨基酸残基可以是核酸编码的核糖体装配的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在一种实施方式中，为了合成所要的生物活性的特定蛋白质所选择的氨基酸序列可以是天然的或者是天然的蛋白质序列。在另一种实施方式中，所选择的氨基酸序列可以全部从多肽片段构筑而成，其中多肽片段可以包含一个N-末端半胱氨酸残基，代替存在于天然的氨基酸序列或天然蛋白质序列中的氨基酸残基。多肽包含这样一个残基使得可以使用这里所述的天然的化学连接原理把它与另一个多肽(经过修饰而包含一个羧基硫代酸酯基)连接，有利于使用汇集合成方法来生产生物活性的合成蛋白质。

在另一种实施方式中，本发明的生物活性的合成蛋白质可以包含“不规则的”氨基酸残基。这里所用的术语“不规则的”氨基酸残基是指不被RNA编码的并且不被核糖体装配的氨基酸。就这方面来说，本发明允许在合成的生物活性的蛋白质的设计和/或建造中具有广泛的选择性和灵活性。可用于本发明的非核糖体装配的氨基酸的例子包括：D-氨基酸、β-氨基酸、拟-谷氨酸、γ-氨基丁酸、鸟氨酸、高半胱氨酸、N-取代的氨基酸(R.Simon等人，Pro.Natl.Acad，Sci.USA(1992)89：9367-71；WO91/19735(Bartlett等人)；US5,646,285(Baindur))，α-氨基亚甲基氧基乙酸(一种氨基酸-Gly二肽电子等排物)和α-氨基氧基羧酸等。可以使用含有硫代酰胺、插烯的酰胺、肼基、亚甲基氧基、亚甲基硫基、膦酰胺、羟基酰胺、羟基亚乙基、还原酰胺和取代的还原酰胺电子等排物以及β-磺酰胺的肽类似物。

尤其是，使用拟-谷氨酸是有利的，因为R链的修饰允许把聚合物加成物与合成蛋白质连接起来。同样地，可以使用N-末端Nα-取代的C2或C3链烷基或芳基硫醇氨基酸。有利的是，可以使用这样的残基(存在于末端或多肽)，按照这里所述的扩展的天然化学连接方法把该多肽与一种含有羧基硫代酸酯部分的多肽连接起来。

在一种实施方式中，可以通过一个肽键(即酰胺键)把生物活性的合成蛋白质的所有的氨基酸残基连接起来。另外，可以通过一种非酰胺键(例如一种硫酯键、一种肟键、一种硫醚键、一种定向的二硫键、一种臭硫烷键等)把两个氨基酸残基(或两个多肽的C-末端和N-末端残基)相互连接起来(Schnlzer，M.和Knet，S.B.H.，Science(1992)256：221-225；Rose，K.，J.Amer.Chem.Soc.(1994)116：30-33；Englebretsen，D.R.等人，Tetrahedron Lett.36：8871-8874；Baca，M等人，J.Amer.Chem.Soc.(1995)117：1881-1887；Liu，C.F.等人，J.Amer.Chem.Soc.(1994)116：4149-4153；Liu，C.F.等人，J.Amer.Chem.Soc.(1996)118：307-312；Dawson，P.E.等人，(1994)Science 266：776-779)。因此，本发明允许对肽键进行多种修饰、替代和电子等排替换以用于制备生物活性的蛋白质。

可以把本发明的生物活性的合成蛋白质设计成具有类似于哺乳动物(包括人、猿、牛、鼠、猪、羊、马等)、鸟或鱼的蛋白质那样的生物活性。如这里所用的第一种蛋白质与第二种蛋白质相比，其具有的生物活性改变了、增强了或减弱了，则该第一种蛋白质被说成是模拟第二种蛋白质。如果生物活性的存在直接或间接地依赖于蛋白质的氨基酸序列，则该生物活性被说成是与蛋白质“相关的”。

在另一种实施方式中，可以全部或部分地把本发明的生物活性的蛋白质工程化，与任何相应的生物活性的对应物无关。优选的本发明的生物活性的合成蛋白质包括受体、蛋白质受体配体。这样的蛋白质的例子包括肾上腺皮质激素受体及其生物活性的片段、血管紧张素受体、前房尿钠排泄受体、缓激肽受体、生长激素受体、趋化性受体、强啡肽受体、内啡肽受体、β-脂肪酸释放激素的受体及其生物活性的片段、脑啡肽受体、酶抑制剂受体、纤连蛋白的受体及其生物活性的片段、消化道和生长激素释放肽受体、释放黄体化激素肽的受体、激发黑素细胞的激素的受体、神经紧张素受体、片样肽受体、催产素受体、血管加压素受体、加压催产素受体、甲状旁腺激素受体及其片段、蛋白激酶受体、促生长素抑制素受体、底物P受体。

本发明的生物活性的合成蛋白质还包括酶和结构分子例如壳多糖或胶原等。

在另一种实施方式中，本发明的生物活性的合成蛋白质包括细胞素。细胞素是由细胞释放的能介导对细胞-细胞相互作用、信息和其它细胞的行为的特异性作用的小蛋白质或生物因子(在5-20kDa的范围内)。这里所用的术语“细胞素”的意思包括白介素(“IL”)(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14等)；淋巴因子和信号分子例如激发红细胞生成的蛋白质(例如红细胞生成素(EPO))、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素等、生长因子例如变形生长因子、神经生长因子、源于大脑的生长因子、神经营养因子-3、神经营养因子-4、肝细胞生长因子、T-细胞生长因子(TGF、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3等)、集落刺激因子(G-CSF、GM-CSF、M-CSF等)、表皮生长因子(EGF、LIF、KGF、OSM、PDGF、IGF-I等)、成纤维细胞生长因子(αFGF、βFGF等)和激素，特别是单一的肽激素例如生长激素)。

细胞素特别是趋化性细胞素还包括特别优选的可用于帮助本发明范围内的生物活性的合成蛋白质的设计的蛋白质的例子。细胞素通过直接或间接地介导白细胞增员或者作为白细胞活化(在微生物侵入的特异性位点上积累)中的重要信号物质而参与先天性和获得性免疫反应。促炎症的细胞素，白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)和介体反映了嗜中性细胞的增员和活化，包括可溶性的细胞间粘连分子白介素-8(IL-8)(Kotecha S.，European Journal of Pediatrics(1996)155Suppl 2：S14-17)。白介素-6是一种主要与极性期反应、B细胞分化和抗体生产有关的多官能的细胞素(Akira S.等人：Interleukin-6 inbiology and medicine.Adv Immunol(1993)54：1-78)。这种细胞素是由许多不同的细胞，包括单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、上皮细胞和成纤维细胞合成并且分泌的。IL-6常常是在许多紧急条件下由促炎症细胞素TNFα和IL-1诱发的，而循环的IL-6在急性期反应的诱发中起着重要的作用(Xing Z等人，J.Clin.Invest.(1998)101(2)：311-20)。直接或间接地影响白细胞的增员和活化的细胞素包括TNF-α、粒细胞菌落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-菌落刺激因子(GM-CSF)和化学素族的成员。主要调控白细胞的活化状态的细胞素包括干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-10(IL-10)和白介素-12(IL-12)。细胞素也可以通过诱导或调控其它效应分子的表达而影响微生物的清除，这可以发生在自分泌或旁分泌方式中。

菌落刺激因子是由多种生成红细胞的干细胞的增殖和成熟所需要的髓样细胞和基质细胞生产的细胞素。另外，研究显示这些因子增大了成熟的白细胞种群的效应细胞的活性。具体地，G-CSF在体外延长了嗜中性细胞的存活力，增大了嗜中性巨噬细胞的活性，增强了嗜中性细胞的呼吸释放(Standiford TJ等人，J.Invest.Med.(1997)45：335-345)。相比之下，GM-CSF能促进嗜中性细胞和巨噬细胞的增殖和成熟，这种细胞素的活化性能主要指向成熟的巨噬细胞种群(Chen GH等人，J.Immunol(1994)152：724-734)。

现在已经表征了被称为化学素的趋化性细胞素的6个密切相关的亚族。其中，至少有两个亚族的成员对肺部的抗菌性宿主防御有贡献(Mandujano J等人，Amer.J.Respir.Crit.Care Med.(1995)151：1233-1238)；Baggiolini M等人，Ann.Rev.Immunol.(1997)15：675-705)。包括IL-8、MIP(巨噬细胞炎症蛋白)-2、KC、ENA-78和NAP-2在内的C-X-c化学素族的成员具有卓越的嗜中性细胞的激发和趋化活性，其中包括MCP(单核细胞化学粘连蛋白质)-1、MCP-2、MCP-3、RANTES、MIP-1α和MIP-1β在内的C-C族针对巨噬细胞、淋巴细胞和嗜酸性细胞具有卓越的趋化性和/或活化作用(Huffnagle GB等人，TheRole of Chemokines In Pneumonia，在Koch A，Strieter R.所编的Chemokines in Desease，Texas：R.G.Landis Co.，1996：151-168)。

干扰素-γ是一种由T细胞(α、β-和γ、δ-T细胞二者)和NK细胞生产的细胞素，用于在对付广谱的肺病的细胞介导的免疫反应中作为工具。这种细胞素能够使好几种巨噬细胞效应细胞的功能活化，包括激发呼吸释放，能够提供抗原、引发源于巨噬细胞的TNF的释放，并且在体外增强巨噬细胞针对细菌、真菌和分支菌类生物的抗菌活性。

白介素-12是一种能促进Th1-型免疫反应同时能抑制Th2-型免疫反应的细胞素。具体地，IL-12能刺激Thl T细胞和NK细胞的发育，增强CD8+细胞和NK细胞的胞解活性。最重要的是，IL-12是来自T细胞和NK细胞的IFN-γ的主要诱导物。

与IL-12相比，IL-10能促进Th2-型免疫反应的发展，同时抑制细胞介导的(Th1-型)免疫(Howard M等人，J.Clin.Immunol.(1992)12：239-247)。这种细胞素显示了很强的消炎性能，部分地通过直接使嗜中性细胞和巨噬细胞失活和通过下调TNF、IFN-γ以及C-X-C和C-C化学素族成员的表达而发挥作用。IL-10在全身性免疫细胞活化的状态下，在减弱不需要的促炎症细胞素的生产中作为工具。

EPO是一种特别优选的其氨基酸序列可用于辅助设计具有激发红细胞生成的生物活性的合成蛋白质的例子。EPO是负责对稳态条件下和出血后红细胞物质的加速恢复的过程中的红细胞生产进行调控的主要因子(Jelkmann，W.(1992)Physiol.Reviews 72：449；Krantz，S.B.(1991)Blood 77：419；Porter，D.L.和M.A.Goldberg(1993)Exp.Hematol.21：399；Nissenson，A.R.(1994)Blood Purif.12：6)。循环形式的人EPO是一种分子量大约为30,000的165个氨基酸的糖蛋白(Sawyer，S.T.等人，(1994)Hematol.Oncol.Clinics NA 8：895；Jacobs，K.J.等人，Nature(1985)313：806；Lin，F-K，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82：7580)。虽然EPO的cDNA预报了一种含有166个氨基酸残基的分子，但是在翻译后的修饰中羧基末端被除去了(12)。有3个可能用于N-连接的糖基化的位点，把它们都填补上。还存在一个O-连接的糖部分(13)。糖基化的结果是复杂的。虽然没有糖基化的源于大肠杆菌的EPO在体外显示了完全的生物活性，然而糖基化显然是体内的完全活性所必需的。因此，大肠杆菌生产的和去糖基化的源于天然的EPO在动物研究中显示了很低的活性(Krants，S.B.(1991)Blood 77：419；Sasaki，H等人(1987)J.Biol.Chem.262：12059；Lowy，P.H.等人(1960)Nature 185：102；Wojchowski，D.M.等人，Biochem.Biophys.Acta 910：224；Dordal，M.S.等人(1985)Endocrinology 116：2293)。

与上述相一致的是，不同的糖基化模式显示了不同的结果。例如，去糖基化后的EPO在体外的活性增强了，而同时在活体内的活性降低了，这种作用归咎于半乳糖残基的暴露，被肝细胞识别、结合和清除(Spivak，J.L.和B.B.Hogans(1989)Blood 73v：90；Goldwasser，E.等人(1974)J.Biol.Chem.249：4202)。完全唾液酸化的EPO分支模式也给生物活性带来了差别。主要为四-触角分支的EPO显示了与“标准的”EPO同样的活性，而主要为双-触角分支的EPO在体外具有3倍多的活性，但是在体内却只有正常活性的15％(Takeuchi，M.等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：7819)。研究显示，只有N-连接的和O-连接的糖在EPO的功能中发挥着重要作用(Higuchi，M.等人(1992)J.Biol.Chem.267：770319)。

菌落刺激因子和RANTES还包括其氨基酸序列可用于辅助设计本发明范围的生物活性的合成蛋白质的特别优选的蛋白质的例子。B.聚合物改性的蛋白质和多肽

本发明的第二个属性涉及对蛋白质或多肽进行改性使其在预定的位置上包含一种或多种结构确定的聚合物加成物的能力。虽然以前已经描述了聚合物改性的蛋白质，然而本发明的可能的聚合物改性的性质和方式都与现有技术的成就显著不同。

由于本发明的生物活性的合成蛋白质全部或部分地是通过化学合成的，因此有可能以一定的方式合成出这样的蛋白质，它将允许通过共价键把聚合物(例如聚合物或糖、聚乙二醇、二元醇、透明质酸等)连接在多肽或蛋白质骨架中的一种或多种特定的用户选择的用户确定的位点上。而且，通过合成方法生产本发明的蛋白质允许在制备中确保这样的改性存在于用户选择的用户确定的每个分子的每个位点上。这种均匀性和对合成的控制使得本发明显著地不同于使用现有技术的方法所允许的随机改性。重要的是，本发明允许设计一种合成蛋白质，可以把其中的非关键残基衍生使其包含一种聚合物加成物。而且，对于每一个这样的用户选择的用户确定的位点来说，用户可以确定借以把这样的加成物与多肽或蛋白质骨架连接起来的明确的键(酰胺键、硫酯键、硫醚键、肟键等)。另外，可以对所要的存在于特定位点上的特定的聚合物加成物进行改变和控制，使得能够得到其中存在的每种蛋白质或多肽都在同样的精确的衍生位点上精确地包含同样的衍生加成物的制剂。因此，本发明能够形成聚合物改性的多肽和蛋白质的均匀制剂。

除了提供用于改变可以连接聚合物的连接点的位置和数目外，本发明还允许改变连接的聚合物的性质。可以掺入任何特定的用户选择的用户确定的位点的聚合物加成物可以具有任何确定的长度。同样地，与本发明的方法相一致，可以在不同的位点使用不同长度的聚合物。因此，在一种实施方式中，本发明的生物活性的合成蛋白质可以被一种聚合物加成物改性一次或多次。当把一种以上的聚合物加成物掺入特定的多肽或蛋白质中时，所用的聚合物可以是“单接种的”、“多接种的”、“均匀接种的”或“多种多样接种的”。这里所用的术语“单接种的”是指被单一的聚合物改性的多肽或蛋白质。相比之下，“多接种的”是指被一种以上的聚合物改性的多肽或蛋白质。如果在多肽或蛋白质的每个改性的位置上都存在同样的单一的聚合物，则这样的多接种的多肽或蛋白质被说成是“均匀接种的”。相比之下，如果多肽或蛋白质的改性位点被不同种类的聚合物改性，则多接种的多肽或蛋白质被说成是“多种多样接种的”。

还可以改变用户选择的用户确定的每个位点上的聚合物加成物的线性度或支化度。因此，聚合物加成物可以是线性的、支化的或均匀支化的。术语“均匀支化的”是指在特定位点上聚合物的所有支链都具有相同的结构和长度。就我们所知，本发明允许独立地改变任何单个支链的长度和存在于这样的支化点处的聚合物的结构。

总之，本发明允许你确定多肽或蛋白质骨架中用户选择的用户确定的聚合物改性的位点的(1)位置和(2)频数以及控制存在于每个这样的位点处的支链的(4)种类和(5)支化度。另外，对于被多次聚合物改性的多肽或蛋白质来说，本发明允许针对每个位点独立地确定上述5个变量中的每一个。而且，对于被支化的聚合物改性的多肽或蛋白质来说，本发明允许你针对每个支化点独立地确定上述5个变量中的每一个。因此，本发明提供了具有相当大灵活性的聚合物改性。C.蛋白质和多肽的输送

本发明的被聚合物选择性改性的生物活性的合成多肽和蛋白质可以用作治疗疾病和状态的药物。最优选地，当给需要治疗的病人或个体服用时，可使用一种药物输送体系来服用这样的生物活性的合成多肽和/或蛋白质。使用这样一种体系能保证药物以一种病人可以接受的方式提供给病人并且促使达到所要的生物活性效力。本发明的目的，优选药物输送体系包括能通过口、鼻腔或吸入方式或肌肉内给药、皮下给药、透皮给药、静脉内给药、耳内给药、眼内给药方式服用多肽或蛋白质的体系。

这样的药物输送体系可以包括能提供位点特异性释放或增强对肠粘膜的保护作用的制剂。合适的制剂包括：干燥的粉末制剂、通过病毒颗粒输送的胶囊、脂质体胶囊、透皮贴、电辅助的输送(电穿孔治疗)制剂和聚合物/重氮酮(niazone)共轭制剂。

在一种优选的实施方式中，这样的药物输送装置将会对生物环境的变化作出反应，并且根据这些变化而输送或者停止输送药物。已经使用了一系列物质来控制药物和其它活性试剂的释放：聚脲烷、聚硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯醇(为了亲水性和强度的目的)、聚乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚(甲基丙烯酸-2-羟基乙酯)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚(乙烯-乙酸乙烯基酯)、聚乙二醇、聚甲基丙烯酸等。在另一种优选的实施方式中，可使用可生物降解的聚合物来方便药物的输送。这样的聚合物包括聚交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(交酯-乙交酯)(PLGA)、聚酸酐和聚原酸酯。药物输送装置及其使用方法描述在下列美国专利中：6,072,041、6,041,253、6,018,678、6017,318、6,002,961、5,879,712、5,849,331、5,792,451、5,783,212、5,766,633、5,759,566、5,690,954、5,681,811、5,654,000、5,641,511、5,438,040、4,810,499和4,659,558。III.生物活性合成蛋白质的生产

可以构思包含下列步骤或组成部分的本发明的生物活性的合成蛋白质的生产方法：设计、合成、肽连接、蛋白质折叠、生物活性的评估、多肽骨架的聚合物改性(图2)。A.优选的生物活性合成蛋白质的设计

在一种特别优选的实施方式中，本发明的生物活性的合成蛋白质将是一种能激发红细胞生成的蛋白质。这里所用的能激发红细胞生成的蛋白质是一种能介导红细胞生成的蛋白质。蛋白质的能激发红细胞生成的生物活性可以通过多种手段进行测定，例如通过试验蛋白质介导依赖于EPO的细胞系的增殖能力，按照体内给药后红细胞的生成来进行测定。

优选的能激发红细胞生成的蛋白质是哺乳动物，最优选为人的EPO及其类似物。红细胞主要是由肾脏中的管状和管束状的毛细上皮细胞和间质细胞合成和分泌的。所产生的EPO的缺乏经常诱发贫血。因此，EPO在临床上的主要用途是治疗患有严重肾功能不全(血细胞比率低于0.3)的通常还接受输液的病人以及用于治疗化疗后的贫血病人。典型地，EPO是在临床上使用的仓鼠的卵细胞中通过重组方法合成的。EPO的成熟形式是一种热和pH稳定的酸性(pI＝4.5)的由165个氨基酸残基组成的蛋白质。EPO通过EPO-受体来传递它的活性。EPO分子量的大约40％来源于它的糖基化。糖基化是一种测定EPO在活体内的药物代谢动力学行为的重要因子。非糖基化的EPO具有极其短的生物半衰期。它依然与它的受体结合，并且甚至可以在体外具有更高的特异性活性。然而，近来的试验显示EPO PEG化显著地增大了它的生存期，但是在基于细胞的测定体系中却显著地降低了EPO的活性。

本发明的能激发红细胞生成的合成蛋白质(“SEPs”)优选为经过化学改性人尿EPO的合成类似物。在一种优选的实施方式中，它们含有一个或多个通过一个硫醚键、肟键、酰胺键或其它键与一个或多个肽残基相连的聚合物部分(最优选为pPEG部分)。在一种高度优选的实施方式中，这样的键将位于人尿EPO的天然糖基化的一个或多个位置(即位置24、38、83和126)。最优选地，SEP分子将在两个或多个这样的位置上含有pPEG部分。在另一种实施方式中，可以用聚合物对其它的蛋白质残基进行改性。本发明的生物活性的合成蛋白质的改性位置包括位于蛋白质的无序的环、区或域中的残基或位于可能的蛋白酶切位点处或附近的残基。例如，可以在EPO的9、69和/或125的一个或多个位置上进行聚合物改性。本发明的SEP分子的总分子量可以在大约125-大约150kDa的范围内变化，更优选在大约30-80kDa的范围内变化。通过增大或减小用于对给定的类似物进行改性的聚合物(例如pPEG)的数目和结构，可以控制分子量。对于更大的构建物来说，pPEG介导的流体动力学MW大于大约100kDa。在表达人EPO受体的细胞中进行的体外检定表明，本发明的SEPs的ED₅₀与通过重组方法生产的糖基化的EPO的ED₅₀相等。

肟键合的pPEG类似物优选是通过在一种带有一条侧链氨基氧基、酮或醛官能度的非天然编码的氨基酸处把一种氨基氧基、酮或醛官能化的pPEG连接到SEP蛋白质上而构建的。例如，含有拟谷氨酸(一种带有式-CHα-CH₂-S-COOH的侧链(与谷氨酸侧链-CHα-CH₂-CH₂-COOH相比)的非天然编码的氨基酸)的SEP-0和1的位点89和117。优选利用硫醚键来构建SEP类似物使其含有由半胱氨酸或含有带有硫醇的侧链的非天然氨基酸提供的硫醇官能度。图3描画了一种优选的能激发红细胞生成的蛋白质的基本结构。

在另一种实施方式中，本发明的SEP分子可以包含“循环变换的”EPO类似物，其中EPO的天然的氨基和羧基末端被重新配置了。最优选地，这种重新配置将把氨基和羧基末端移动到结构限制低的位置，例如无序环等。位点125和126附近的无序环就是这样的一个重新配置位点的例子。最优选地，这种SEPs的二硫键将是游离的，并且将可以通过化学改性使其在预定的残基上含有聚合物部分。

另外，可以把SEP分子的氨基和羧基末端重新配置到天然的糖基化位点或其它易于糖基化的位点例如位点126和125上。SEP分子还可以包括对氨基和羧基末端进行改性以消去或改变电荷(例如通过把羧基酰胺化等)。

在这种循环变换后的分子的一种优选实例中，新的N-和C-末端分别由位点126和125提供。优选通过不能形成二硫桥的非天然编码的氨基酸L-α-N-丁酸(Aba)在位点7、29、32和161处对天然的能形成二硫键的半胱氨酸进行重新配置。优选用丙氨酸对残基R166、E37和V82进行重新配置以改善产量。还优选相对于天然的EPO编号方案，把另一个半胱氨酸插入位点1和166之间，并在以下把它编号为‘0’。所得的分子含有4个半胱氨酸(在位点126、0、38和83(沿着从N-末端到C-末端的方向读取)，它们被周作(1)连接位点和(2)形成硫醚的pPEG的连接位点。选择性地，一个半胱氨酸可以替换A125而得到另一个pPEG连接位点。本发明的这种SEP分子的总分子量可以在大约25-150kDa，更优选在大约30-80kDa的范围内变化。通过增大或减小用于对给定的类似物进行改性的聚合物(例如pPEG)的数目和结构可以对分子量进行控制。pPEG介导的更大的构建物的流体动力学MW大于100kDa。选择性的pPBG连接位点位于位点125、9和24(沿着从N-末端到C-末端的方向读取)处。其它的SEP类似物在无序的环区含有其它N-末端和C-末端和/或把新的N-末端和/或C-末端截短后的残基。优选的循环变换后的分子的基本结构如图4中所示。

在另一种实施方式中，本发明的生物活性的合成蛋白质是哺乳动物，最优选人的C-GSF。G-CSF诱发嗜中性粒细胞的快速增殖并且释放到血流中，因而在与感染的斗争中能提供治疗效果。人GCSF蛋白质是的长度为174个氨基酸(专利EP459630，Camble R.等人)，已经分离出了它的序列的变体。该蛋白质含有4个半胱氨酸残基，并且在133位的苏氨酸处含有一个O-糖基化位点。

在这样一种合成的GCSF分子的一种实施方式中，将可以相对于天然的GCSF的序列而改变该分子的氨基酸序列，使其在位置1、2或3中的一个或多个位点处含有天然的或更优选含有非天然编码的疏水残基。选择性地，还可对这样的分子进行改性使其在GCSF的5-位和/或173-位和/或174-位处含有另外的天然的或更优选非天然编码的疏水残基。

在另外-种优选的实施方式中，合成的GCSF分子将在63-、64-和/或133-位中的一个或多个和/或1-和174-位中的一个或多个处被聚合物(优选pPEG)改性。pPEG聚合物可以是线性的或支化的、带电荷的、不带电荷的或其混合，并且其分子量在大约5-80kDa，更优选在大约40-70kDa的范围内。pPEG的总的分子量分布取决于改性所用的pPEGs的数目和结构。活体内的流体动力学半径显示了更大的有效分子量(例如，一种10kDa的支化的pPEG表现出大约55kDa的有效分子量)。估计的pPEG介导的流体动力学分子量大于100kDa。

对于利用肟键的类似物，优选把pPEG连接到带有一个侧链氨基氧基、酮或醛官能度的非天然编码的残基上。对于利用硫醚键的类似物，优选把pPEG连接到一个半胱氨酸或含有一个带有一个硫醇的侧链的非天然氨基酸上。对于利用酰胺键的类似物，把pPEG连接到带有一个反应性的侧链胺的天然或非天然氨基酸上。

生物活性的合成GCSF蛋白质的基本结构如图5中所示。图中，“J”代表含有一个疏水侧链的非天然编码的残基。

这种生物活性的合成GCSF蛋白质的生物活性可以通过常规手段进行测试，例如通过测试其介导因子依赖型人或鼠细胞系(例如NFS60细胞系)的增殖能力或者通过在有或没有半衰期/释放指标大于20天的输送体系的情况下，测定它在活体内对嗜中性细胞的激发、半衰期和致免疫性能来进行测试。

在另一种实施方式中，本发明的生物活性的合成蛋白质是一种哺乳动物，最优选人的化学素，RANTES。RANTES嵌段通过主要的受体CCR5进入M-托品酸HIV株以及下调炎症的途径与哮喘、移植排斥和伤口愈合有关(Kalinkovich A等人，Immunol Lett。(1999)68：281-287)。本发明的合成的RANTES分子优选在化学改性方面与RANTES化学素不同，使得：(1)在RANTES 1-68的1-位存在的N-末端丝氨酸被一个正壬酰基(“NNY”)所替换，和(2)3-位的酪氨酸被一个含有疏水侧链的非天然编码的氨基酸所替换。已经发现这样的化合物极其有效力，其ED₅₀在pM的范围内，相比之下，重组的“Met-RANTES 1-68”的ED₅₀在mM范围内。

已经创造了如上述一个或多个另外变化的(例如用一个带有疏水侧链的非天然编码的氨基酸替换2-位的脯氨酸以及把一种脂肪酸连接到分子的C-末端上)有效力的RANTES类似物。已经通过对与RANTES的12-20残基对应的N-环区进行了改性而改善了受体的特异性和能力。在另一种优选的实施方式中，给本发明的合成的RANTES分子的N-末端或C-末端掺入一种聚合物部分(例如pPEG或壬酰基(“NNY”)或Y₃X)以改善其在体内的半衰期。优选通过一个肟键把pPEG部分连接到一种在66、67、68-位或68-位的连接体处，优选67-位处引入的非天然编码的氨基酸上。优选通过一个肟键(优选通过一个连接子)把脂肪酸连接到残基68上，例如一个氨基氧基改性的氨基酸二或三肽连接体。还可以使用其它的化学连接方法。更大结构的这种合成RANTES类似物的分子量取决于pPEG连接的性质和结构，可以在大约25kDa-45kDa的范围内，对于更大的结构，其pPEG介导的流体动力学分子量大于60kDa。优选的合成RANTES类似物的结构如图6中所示。B.生物活性的合成蛋白质和肽的确定的和特异性的聚合物改性

本发明的另外一个方面涉及化合物部分和聚合物，特别是水溶性的聚合物及其在改性蛋白质以得到与没有改性的蛋白质相比具有改善的性能的蛋白质药物中的用途。可以预期的这种改性的有益效果包括但是不限于：(a)改善药效(b)由于增大了蛋白水解的稳定性并且降低了清除率，因而延长了蛋白质药物在循环中的生存期(c)减小致免疫性能和(d)与没有改性的分子相比，可能具有差示靶向。

如上所述，虽然已经使用聚乙二醇对蛋白质进行了改性(参见例如US6,027,720，Kuga等人，涉及对G-CSF的赖氨酸残基进行改性以允许通过一个反应性的氨基连接聚乙二醇分子)，然而这种改性与分子的不均匀性和分子的多样性相关。

这里所用的术语“分子的不均匀性”是指与蛋白质制剂的每个蛋白质连接的聚合物分子的数目的变化。术语“分子的多样性”是指(a)蛋白质被聚合物修饰的位点的变化，(b)一种蛋白质制剂的相同蛋白质的不同位点或不同蛋白质的相同位点的聚合物加成物的长度变化，或(c)一种蛋白质制剂的相同蛋白质的不同位点或不同蛋白质的相同位点的聚合物加成物的支化度和/或枝化性质的变化。这里所用的术语“分子均匀的”是指其中所有的蛋白质分子都含有该氨基酸序列并且在相同的位置被相同的聚合物改性的一种蛋白质制剂。在这里，两种或多种“分子均匀的”蛋白质制剂的混合物被称为“分子确定的”制剂。

根据本发明的这个方面，对前面鉴定的聚合物的不均匀性、多样性和不合适问题的解决办法涉及一类新的与生物相容的聚合物的生产，它把多肽的优点(精确的长度、方便的合成)和“pPEG”的优点((“精确的PEG”)，一种柔顺的两亲性的非致免疫的不易受蛋白酶影响的聚合物)结合起来，参见Rose，K等人，美国专利申请号09/379,297，在此引入供参考。这类新的与生物相容的聚合物具有下式：

-[CO-X-CO-NH-Y-NH]_n-其中n为整数，优选为1-100，更优选为2-100，X和Y是与生物相容的具有精确结构的被一个酰胺键连接起来的重复单元。优选地，X和Y是缺乏反应性官能团的二价有机基团或者是不存在，或者相同或不同，并且其各自的重复单元数(n)可以独立地变化。优选地，当n＝2时，至少X或Y中的一个选自取代的、未取代的、支化的和线性的脂肪烃基和芳香烃基。更优选地，至少X或Y二价有机基团中的一个选自苯基、C1-C10亚烷基、C1-C10烷基、含有杂原子的苯基、含有杂原子的C1-C10亚烷基、含有杂原子的C1-C10烷基及其组合。

特别优选的pPEG部分具有下式：

-{CO-(CH₂)₂-CO-NH-(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH}_n-其中n优选为1-100，更优选为2-100；或为：-{CO-(CH₂)₂-CO-NH-(CH₂)₆-NH-CO-(CH₂)₂-CO-NH-(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH-}_n-其中n优选为1-50，更优选为2-50。

这样的pPEG部分可以按照多种方法中的任何一种进行合成。然而，这样的部分优选是使用一种固相的单元分步链装配法而不是聚合法进行生产的。使用这样的一种装配法允许制备在长度、X和Y取代基的性质和(即使有的话)支链的位置方面都具有确定的和均匀结构的部分。

优选地，这样的部分将通过例如下述的步骤进行合成：

(a)用摩尔过量的一种式HOOC-X-COOH的二酸衍生物把一种式Z-Q-载体的化合物的氨基或羟基酰化，其中Z是H₂N-或HO-，Q是一个连接子或靶分子，而载体是固相、基质或表面；

(b)把步骤(a)的产物的游离羧基活化；

(c)用摩尔过量的式NH₂-Y-NH₂的一种二胺把步骤(b)的产物氨解；和

(d)选择性地使用HOOC-X-COOH和NH₂-Y-NH₂重复步骤(a)-(c)，其中所说的X和Y是二价的有机基团，或者不存在，并且可以相同或不同，并且可以独立地随每个所说的选择性的重复单元而变化，可以与前面的酰化和氨解步骤中所用的X和Y取代基相同或不同。

在优选的实施方式中，使用了上述重复单元的六聚体、十二聚体、十八聚体和三十二聚体。需要时，可以把重复单元与例如赖氨酸的氨基结合使用而形成支化的pPEG结构。可以通过多种化学方法包括形成硫醚键、肟键和酰胺键把pPEG连接到本发明的合成蛋白质上。

在一个实施方式中，固相的单元分步链装配法包括：

步骤1：把受保护的或未受保护的二酸偶合到树脂的氨基上，在连接位点处产生酰胺键(其中PG是一种取决于所用的二酸而存在或不存在的保护基)：

PG-OOC-X-COOH+NH₂-Y-NH-树脂

步骤2：除去树脂上的保护基(PG)(如果存在的话)

HOOC-X-CO-NH-Y-NH-树脂

步骤3：把受保护的或未受保护的二氨基偶合到树脂的羧基上，在连接位点处产生酰胺键(其中PG是一种取决于所用的二氨基而存在或不存在的保护基)：

PG-NH-Y-NH+HOOC-X-CONH-Y-NH-树脂

步骤4：除去树脂上的保护基(PG)(如果存在的话)

-NH-Y-NH-OC-X-CO-NH-Y-NH-树脂

步骤5：重复步骤1-4“n”次以加上“n”个单元，然后从树脂上切下来

-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-

如上所述，为了与本发明的生物活性的合成分子连接，线性的和支化的pPEG构成物优选为水溶性的聚合物。所用的pPEGs带有在生理条件下为带电荷的或中性的侧链基团，可以根据所用的pPEG的结构而改变pPEGs的化学连接方式、长度、支化度和溶解度。如上所述，本发明的优选的pPEGs包含一种含有重复单元-CO-X-CO-NH-Y-NH-的水溶性聚酰胺，其中X和Y中的一个或两个含有一个水溶性的重复单元，最优选含有一种基于‘PEG’的重复单元。虽然从原理上来说，使用简单的两步固相法可以得到低聚脲，如下对于氨基树脂NH₂-树脂和一种对称二胺所述：

使用羰基二咪唑活化，得到咪唑-CO-NH-树脂

使用二胺NH₂-Y-NH₂进行氨解，得到NH₂-Y-NH-CO-NH-树脂

其中可以把这两步重复多次而得到一种含有重复单元-NH-Y-NH-CO-的低聚脲，然而这种方法不是优选的方法。这是因为上述步骤的产率在室温下是非定量的，甚至使用非常大量过量的试剂在很长的反应时间下也是非定量的。因此，优选使用三步固相法(如下对于一种氨基树脂NH₂-树脂所述)来形成聚酰胺。为了避免异构体产物，试剂HO₂C-X-CO₂H和NH₂-Y-NH₂应当是对称的。

使用二酸HO₂C-X-CO₂H进行酰化，得到HO-CO-X-CO-NH-树脂

使用羰基二咪唑活化，得到咪唑-CO-OCO-X-CO-NH-树脂

使用二胺NH₂-Y-NH₂进行氨解，得到NH₂-Y-NH-CO-X-CO-NH-树脂

可以顺序地重复这三步多次以得到含有重复单元-NH-Y-NH-CO-X-CO-的聚酰胺。该聚合物含有精确数目的单体单元，在每个步骤中X和Y可以独立地变化，并且可以随心所欲地选择末端基团。例如，通过把丁二酸酐(“Succ”)用于酰化步骤中，把4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺(也称为“EDA”或“TTD”)用于氨解步骤中，形成了基于‘PEG’的聚酰胺，其中X是-CH₂CH₂-，Y是-NH-CH₂CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH-，重复单元是-NH-CH₂CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH-CO-CH₂CH₂CO-。虽然有该方法涉及不含有保护基的二价试剂这样一个事实，但是当使用标准的商用肽合成树脂时，除了下述的使用带支链的Lys核心来制备带支链的构建物的情况外，交联不是一个问题(Rose等人，美国专利申请号09/379,297；和Rose等人，J.Am.Chem.Soc.(1999)121：7034)。

例如，可以以与Rose等人(美国专利申请号09/379,297)和Rose，K.和Vizzavona，J(J.Am.Chem.Soc.(1999)121：7034)所述的“化学实体”构建物相似的方式制备支化的pPEG构建物。因此，可以制备支化的pPEG构建物使其含有一个支化的核心，例如一个支化的赖氨酸核心，通过肟键把赖氨酸核心偶合到一种优选的水溶性的聚酰胺例如-(CO-CH₂CH₂CO-NH-CH₂CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH)_n-上。例如，可以容易地在聚酰胺另一端的赖氨酸侧链上的氨氧基乙酰基与赖氨酸核心(例如四聚体核心(O＝CHCO)₄Lys₂Lys-)上的乙醛酰之间形成肟键。因此，可以把每个赖氨酸支化点处的肟连接子制备成结构-Lys(COCH₂ON＝CHCO-)酰胺-。一种替换的结构可以把肟键置于聚酰胺与聚酰胺的游离的侧基之间(优选使用一种单保护的二胺进行，并且在聚酰胺偶合之后进行脱保护)，产生一种下述的四价支化的构建物：

[O＝CHCO-(NH-CH₂CH₂CH₂-[OCH₂CH₂]₃-CH₂-NH-CO-CH₂CH₂CO-)_n]₄Lys₂Lys-

肟化学方法不仅可用于制备二聚和四聚的支化构建物，它也适用于装配八聚的支化构建物(Rose，K.J.Am.Chem.Soc.(1994)116：30；Rose，K.等人，Bioconj.Chem.(1996)7：552)。当然，当使用这样的pPEG聚酰胺时，可以使用其它化学方法来达到这种目的(参见例如图7)。而且，可以把聚酰胺的形成引入涉及Boc或Fmoc化学的用于多肽合成的合成方案中，但是当精心设计这样的方案时，必须牢记氨解步骤将会除去Fmoc基团，并且如果要使用Boc化学方法的话，它将会除去吲哚的甲酰基保护。

因此，可以制备这种pPEG使其含有各种通过一个选择的键(例如酰胺键、硫醚键、肟键等)与一种水溶性的线性聚酰胺(例如-(Succ-TTD)_n-等)连接的支化的核心(例如支化的赖氨酸核心)，其中可以用一种所要的侧基(例如羧酸酯、氨基、酰胺等)把每个水溶性的线性聚酰胺的每个游离端封盖起来，从而提供所要的电荷。还可以制备本发明的线性的和支化的pPEGs，使其包含一个特异性的用于与带有一个或多个特异性的可相互反应的官能团的合成蛋白质连接的官能团，并且pPEGs的侧基将优选是非抗原性的(参见例如图7)。

在本说明书中提到的所有文献和专利申请都已引入供参考，达到这样的程度：好像每个单独的文献或专利申请都具体地单独地显示是引入供参考的。在这里把对本发明的背景的讨论包括进来用于对本发明的内容进行解释。这不应当把它看成是承认任何被引用的材料都是本申请的任何一项权利要求的优先权日之时已经公开的、已知的或者是现有技术的一部分，或者是世界上任何地方的普通的一般知识。已经对本发明作了一般性的描述，通过参考下列实施例，将会更加容易地理解本发明，除非特别指明，提供这些实施例仅仅是为了详细说明，其目的不是限定本发明的保护范围。

实施例1

激发红细胞生成的合成蛋白质SEP-0的合成

合成了激发红细胞生成的合成蛋白质(SEP)，全部长度的合成蛋白质的序列(命名为“SEP-0(1-166)”)是：

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EHCSLNEKIT

VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL

LVKSSQPWΨP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKΨAIS

PPDAASAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA

CRTGDR(SEQ ID NO：1)其中Ψ代表由在巯基处被羧甲基化的半胱氨酸组成的非天然氨基酸残基。SEP-0蛋白质是在溶液中从下列4个多肽片段合成而得的：片段SEP-0：1(GRFN 1711，由SEQ ID NO.1的残基1-32构成)：

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-硫代酸酯片段SEP-0：2(GRFN 1712，由SEQ ID NO.1的残基33-88构成)：

CSLNEKITVP DTKVNFYAWK RMEVGQQAVE VWQGLALLSE

AVLRGQALLV KSSQPW-硫代酸酯(其中Cys³³被Acm保护)片段SEP-0：3(GRFN 1713，由SEQ ID NO.1的残基89-116构成)：

CPLQLHVDKA VSGLRSLTTL LRALGAQK-硫代酸酯(其中Cys⁸⁹被Acm保护)片段SEP-0：4(GRFN 1714，由SEQ ID NO.1的残基117-166构成)：

CAISPPDAAS AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLY

TGEACRTGDR-羧酸酯(其中C-末端半胱氨酸(Cys¹⁶¹)带有一个吡啶甲基(pico)保护基)

肽SEP-0：1和SEP-0：2以及SEP-0：3是在产生硫代酸酯的树脂上，通过用于Boc(叔丁氧基羰基)化学的原位中和法和分步固相肽合成法(SPPS)使用已知的SPPS、侧链保护和硫代酸酯树脂策略(Hackeng等人，PNAS(1999)96：10068-10073；和Schnolzer等人，Int.J.Pept.Prot.Res.，(1992)40：180-193))在一台ABI433A自动肽合成器上合成的或者是通过手工链装配合成的，或者是从商家定购而得的。例如，使用一套标准的Boc SPPS保护基，即Arg(Tos)、Asp(cHex)、Cys(4MeBzl)和Cys(Acm)、Glu(cHex)、His(DNP)、Lys(CIZ)、Ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Trp(甲酰基)、Tyr(BrZ)。Met、Asn、Gln是侧链未受保护的。以类似的方式在一种-OCH₂-Pam-树脂上合成片段SEP-0：4。使用HF/对甲基苯酚，按照标准的Boc化学方法把肽脱保护，同时从树脂载体上切下。然而，对于那些含有在HF/对甲基苯酚中没有除去的保护基的肽来说，保护基被保留下来了。通过制备性的C4反相高压液相色谱(HPLC)对肽进行纯化。使用ES-MS(电雾化电离质谱)鉴别含有纯肽的部分，合并和冷冻干燥用于后续的连接。

步骤1：连接#1以15mM的浓度把片段SEP-0：4和片段SEP-0：3溶于TFE中。加入含有6M氯化胍和1％硫酚的饱和磷酸盐缓冲剂(pH7.9)，得到一种澄清的肽片段的溶液。连接后，把连接混合物加入含有25％β-巯基乙醇的2ml TFE(三氟乙醇)、6ml 6M氯化胍、100mM磷酸盐的溶液中，培育20分钟。使用15mg/ml TCEP(三(2-羧基乙基)膦·HCl)的冰乙酸溶液酸化溶液，装载在一个制备性的C4反相HPLC柱(直径1英寸)上。然后通过制备性的反相梯度HPLC纯化肽。通过ES-MS鉴别含有所要的连接产物SEP-0：Acm+SEP-0：3+SEP-0：4的部分，合并。

步骤2：除去Acm#1为了除去Acm，使用1倍HPLC级的水稀释含有合并后的SEP-0：Acm+SEP-0：3+SEP-0：4部分的乙腈水溶液，加入固体脲使最终浓度为2摩尔。加入摩尔数过量3倍(相对于预期的总的半胱氨酸浓度)的30mg/ml的Hg(Ac)₂在3％乙酸水溶液中的溶液，把溶液搅拌1小时。然后把溶液制成20％的β-巯基乙醇溶液，装载到一个半制备性的反相HPLC柱上，使用逐步梯度进行纯化。通过ES-MS鉴别含有所要的产物SEP-0：3+SEP-0：4的部分，冷冻干燥过夜。

步骤3：连接#2以15mM的浓度把等量的SEP-0：3+SEP-0：4和SEP-0：2一起溶于纯粹的TFE中。加入250mM含有6M氯化胍和1％硫酚的磷酸盐缓冲剂(pH7.5)，得到一种肽片段的澄清溶液。连接1天后，把连接混合物加入10ml TFE、10ml β-巯基乙醇、10ml哌啶和20ml pH＝4的6M氯化胍的溶液中，并且培育20分钟以除去残留的保扩基。使用15mg/ml TCEP在20％乙酸水溶液中的溶液进行酸化，装载到制备性的反相HPLC柱上，使用线性的梯度进行纯化。通过ES-MS鉴别含有所要的连接产物SEP-0：Acm+SEP-0：2+SEP-0：3+SEP-0：4的部分，冷冻干燥过夜。

步骤4：羧甲基化以15mM的浓度把SEP-0：Acm+SEP-0：2+SEP-0：3+SEP-0：4溶于TFE中。加入2倍过量的(v/v)含有6M氯化胍的200mM磷酸盐缓冲剂(pH7.9)，得到一种肽片段的澄清溶液。加入25倍过量的溶于最少量的甲醇中的溴乙酸，让溶液反应2小时。使用15mg/ml TCEP在20％乙酸水溶液中的溶液酸化该溶液，装载到制备性的反相HPLC柱子上，使用逐步梯度进行纯化。通过ES-MS鉴别含有所要的羧甲基化产物SEP-0：Acm+SEP-0：2+SEP-0：3+SEP-0：4+Et的部分，合并。

步骤5：除去吡啶甲基在2M HCl中活化锌粉30分钟。以大约10mg/ml的浓度把肽SEP-0：Acm+SEP-0：2+SEP-0：3+SEP-0：4+Et溶于纯粹的TFE中。用4倍(v/v，相对于TFE)的含有(新加入的)35mg/ml L-甲硫氨酸和35mg/ml十二碳烷基肌氨酸(即N-十二碳烷酰基肌氨酸钠)的pH＝4的6M氯化胍、100mM乙酸稀释所得的溶液。把该溶液加入活化的锌粉中。以大约1小时的间隔监测反应，5小时后反应完全。反应完成后，除去上清液，用含有35mg/ml L-甲硫氨酸的pH＝4的6M氯化胍、100mM乙酸和含有20％TFE的35mg/ml十二碳烷基肌氨酸洗涤余下的锌粉两次共5分钟，用含有20％β-巯基乙醇的同样的溶液洗涤一次。使用15mg/ml TCEP在20％乙酸水溶液中的溶液酸化合并后的产物，装载到制备性的反相HPLC柱上，使用逐步梯度进行纯化。通过ES-MS鉴别含有所要的改性产物SEP-0：Acm+SEP-0：2+SEP-0：3+SEP-0：4+Et-Pico的部分，合并。

步骤6：除去Acm#2使用HPLC级的水把合并后的SEP-0：Acm+SEP-0：2+SEP-0：3+SEP-0：4+Et-Pico稀释3倍，加入固体脲使其最终浓度为2摩尔。加入摩尔数过量3倍(相对于预期的总的半胱氨酸浓度)的30mg/ml的Hg(Ac)₂在3％乙酸水溶液中的溶液，把溶液搅拌1小时。然后用β-巯基乙醇使溶液达到20％，装载到一个半制备性的反相HPLC柱上，使用逐步梯度进行纯化。通过ES-MS鉴别含有所要的产物SEP-0：2+SEP-0：3+SEP-0：4+Et-Pico的部分，用含有2倍(w/w，相对于肽的质量)DPC(十二碳烷基磷酰胆碱)的水稀释2倍，冷冻干燥过夜。

步骤7：连接#3以15mM的浓度把等量的SEP-0：2+SEP-0：3+SEP-0：4+Et-Pico和SEP-0：1一起溶于纯的TFE中，加入250mM含有6M氯化胍的磷酸盐缓冲剂(pH7.5)，向溶液中加入1％硫酚。连接1天后，把连接混合物加入10ml TFE、10ml β-巯基乙醇、10ml哌啶和20ml pH＝4的6M氯化胍的溶液中，并且培育20分钟以除去残留的保护基。使用15mg/ml TCEP在20％乙酸水溶液中的溶液酸化溶液，装载到制备性的反相HPLC柱上，使用线性的梯度进行纯化。通过电雾化质谱鉴别含有所要的连接产物SEP-0(1-166)：(SEQ ID NO：1)的部分，用含有2倍(w/w，相对于肽的质量)十二碳烷基肌氨酸的水稀释2倍，冷冻干燥。

步骤8：折叠把连接好的全长肽SEP-0(1-166)溶于200mM含有6M氯化胍和20％TFE的Tris缓冲剂(pH8.7)中，加入摩尔数过量10倍(相对于蛋白质中的Cys残基)的半胱氨酸。在室温下，用含有3M氯化胍的200mM Tris缓冲剂(pH8.7)对该溶液进行渗析过夜，然后在4℃下，用含有1M氯化胍的200mM Tris缓冲剂(pH8.7)把该溶液渗析4小时，最后在4℃下，用10mM磷酸盐缓冲剂(pH7.0)把该溶液渗析4小时，得到最终的折叠产物。折叠得到了电雾化ES-MS和CD(圆二色性)光谱的证实。

步骤9：纯化在一个圆锥形浓缩器瓶中，把折叠后的多肽浓缩5倍，装载到用10mM，pH7.0的磷酸盐平衡的Resource S阳离子交换柱上。使用最高达500mM NaCl的线性的盐梯度在10分钟之内把折叠好的蛋白质洗脱下来。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴别含有所要的折叠产物SEP-0(1-166)的部分，在-80℃下冷冻储藏。通过反相HPLC色谱和ES-MS谱以及CD光谱对折叠后的蛋白质产物进行分析，证实了折叠后的蛋白质的存在。

实施例2

激发红细胞生成的合成蛋白质SEP-1-L30的合成

合成了激发红细胞生成的第二种合成蛋白质(命名为SEP-1-L30)使其在SEP-0的24-位和126-位含有成肟基团。然后使用这些基团来形成SEP-1-L30，其中使线性的(EDA-Succ-)₁₈羧酸酯(EDA＝(4，7，10)-三氧杂十三碳烷-1，13-二胺，也称为TTD；Succ＝-CO-CH₂CH₂CO-)聚合物与蛋白质骨架相连。全长SEP-1(1-166)的序列为：

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK^oxITTGCA EHCSLNEKIT

VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL

LVKSSQPWΨP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKΨAIS

PPDAAK^oxAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA

CRTGDR(SEQ ID NO：2)其中Ψ代表一种非天然的氨基酸残基，由在巯基处被羧甲基化的一种半胱氨酸组成，其中K^ox代表一种在ε-氨基处被一个肟连接体基团化学改性的非天然的赖氨酸，该肟连接体基团与一种所称的水溶性聚合物通过一个肟键偶合在一起。A.使用GRFNP32对GRFN1776和GRFN1711进行肟化

为了把带有一个氨基氧基乙酰基的水溶性聚合物与带有酮式羰基的肽连接起来，进行了成肟作用。为了达到这个目的，合成了下列肽片段：片段SEP-1：4(GRFN 1776，由SEP IQ NO：2的残基117-166构成)：

CAISPPDAAK AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLY

TGEACRTGDR-羧酸酯(其中Lys¹²⁶在ε-氨基处被一个乙酰丙酸残基改性，其中Cys¹¹⁷被Acm保护)片段SEP-1：1(GRFN 1711，由SEQ ID NO：2的残基1-32构成)：

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-硫代酸酯(其中Lys²⁴被一个乙酰丙酸残基改性)

按照实施例1的方法，在一种产生硫代酸酯的树脂上合成片段SEP-1：1(GRFN 1711)，在一种-OCH₂-Pam树脂上合成片段SEP-1：4(GRFN 1776)。先用一个Fmoc基团在ε-氨基处对这两个片段的赖氨酸²⁴和赖氨酸¹²⁶进行最初的保护。在链装配完成后，按照标准的Fmoc脱保护方法把带有Fmoc的氨基脱保护，并且通过分别把乙酰丙酸连接到每个肽树脂上而进行改性。然后按照实施例1中所说的方法把肽脱保护，同时从树脂载体上切下来。通过制备性的C4反相HPLC纯化肽。使用ES-MS鉴别含有纯肽的部分，合并并且冷冻干燥，用于后续的连接。按照标准方法(Rose，K等人，美国专利申请号09/379,297；Rose等人，J.Am.Chem.Soc.(1999)121：7034)，在一种产生羧基的Sasrin树脂上装配GRFNP32[-(EDA-Succ)₁₈羧酸酯]。通过偶合过量5倍的活化的Boc-氨基氧基乙酸，把一个氨基氧基乙酰基(AoA)部分连接到聚合物的N-末端氨基上。使用经典的Fmoc化学方法把聚合物链从树脂载体上切下来。通过制备性的C4反相HPLC纯化聚合物链，使用ES-MS鉴别含有纯粹的聚合物的部分，合并并且冷冻干燥，用于后续的连接。

以等摩尔的比例把片段SEP-1：4和GRFNP32一起溶于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中，然后把溶液冷冻干燥。把干燥后的粉末溶解，通过制备性的梯度C4反相HPLC把聚合物改性的肽与没有改性的肽和没有反应的聚合物分离开来。通过ES-MS鉴别含有所要的肟化产物SEP-1：4+GP32的部分，合并并且冷冻干燥。

以等摩尔的比例把片段SEP-1：1和GRFNP32一起溶于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中，然后把溶液冷冻干燥。把干燥后的粉末溶解，通过制备性的梯度C4反相HPLC把聚合物改性的肽与没有反应的聚合物分离开来。通过ES-MS鉴别含有所要的肟化产物SEP-1：1+GP32的部分，合并并且冷冻干燥。B.激发红细胞生成的合成蛋白质SEP-1-L30的合成

在溶液中从下列四种多肽片段合成了SEP-1-L30：片段SEP-1：1+GP32(GRFN 1711+GRFNP32，对应于SEQ ID NO：2的残基1-32)：

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK^oxITTGCA EH-硫代酸酯(其中Lys²⁴在ε-氨基处被一个乙酰丙酸肟连接体基团改性，连接体基团通过一个乙酰丙酸氨基氧基乙酰基(Lev-AoA)肟键(用K^ox表示)与GRFNP32偶合片段SEP-1：2(GRFN1712，对应于SEQ ID NO：2的残基33-88)：

CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL

SEAVLRGQAL LVKSSQPW-硫代酸酯(其中Cys³³被Acm保护)

片段SEP-1：3(GRFN1713，对应于SEQ ID NO：2的残基89-116)：

CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-硫代酸酯(其中Cys⁸⁹被Acm保护)片段SEP-1：4+GP32(GRFN1776+GRFNP32，对应于SEQ ID NO：2的残基117-166)：

CAIS PPDAAK^oxAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR-羧酸酯(其中Lys¹²⁶在ε-氨基处被一个乙酰丙酸肟连接体基团改性，连接体基团通过一个乙酰丙酸氨基氧基乙酰基(Lev-AoA)肟键(用K^ox表示)与GRFNP32偶合，其中C-末端半胱氨酸带有一个吡啶甲基(pico)保护基)

按照实施例1中所述的方法进行其它肽的合成、连接反应、羧甲基化、脱保护基反应、折叠和纯化，得到了全长的折叠SEP-1-L30。通过反相HPLC色谱和ES-MS谱以及CD光谱对折叠后的蛋白质产物进行分析，证实了折叠后的蛋白质的存在。

实施例3

激发红细胞生成的合成蛋白质SEP-1-L26的合成

合成了激发红细胞生成的第三种合成蛋白质(命名为SEP-1-L26)使其在SEP-0的24-位和126-位含有成肟基团。然后使用这些基团来形成SEP-1-L26，其中使线性聚合物(EDA-Succ-)₁₈羧酸酯和(EDA-Succ)₆-酰胺分别通过24-位和126-位的肟键与蛋白质骨架相连。全长SEP-1(1-166)的序列为：

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK^oxITTGCA EHCSLNEKIT

VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL

LVKSSQPWΨP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKΨAIS

PPDAAK^oxAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA

CRTGDR(SEQ ID NO：2)其中Ψ代表一种非天然的氨基酸残基，由在巯基处被羧甲基化的一种半胱氨酸组成，其中K^ox代表一种在ε-氨基处被一个肟连接体基团化学改性的非天然的赖氨酸，该肟连接体基团与一种所称的水溶性聚合物通过一个肟键偶合在一起。

与SEP-1-L30相比，设计SEP-1-L26构建物使其带有一个连接在126-位的更小的不带电荷的水溶性聚合物。连接在24-位的聚合物与SEP-1-L30中的相同。全长产物的装配按照实施例2中所述的方法进行。A.使用GRFNP6对GRFN1776进行的肟化和使用GRFNP32对GRFN1711进行的肟化

为了把带有一个氨基氧基乙酰基的水溶性聚合物与带有一个酮式羰基的肽连接起来，进行了成肟作用。为了达到这个目的，合成了下列肽片段：片段SEP-1：4(GRFN 1776，由SEQ ID NO：2的残基117-166构成)：

CAISPPDAAK AAPLRTITAD TFRXLFRVYS NFLRGKLKLY

按照实施例1的方法，在一种产生硫代酸酯的树脂上合成片段SEP-1：1(GRFN 1711)，在一种-OCH₂-Pam树脂上合成片段SEP-1：4(GRFN 1776)。先用一个Fmoc基团在ε-氨基处对这两个片段的赖氨酸²⁴和赖氨酸¹²⁶进行最初的保护。在链装配完成后，按照标准的Fmoc脱保护方法把带有Fmoc的氨基脱保护，并且按照标准的偶合方法分别把乙酰丙酸连接到每个肽树脂上而进行改性。然后按照实施例1中所说的标准的Boc-化学方法把肽脱保护，同时从树脂载体上切下来。通过制备性的C4反相HPLC分别地纯化肽。对于每个肽，使用ES-MS鉴别含有纯肽的部分，合并并且冷冻干燥，用于后续的连接。

按照标准方法(Rose，K等人，美国专利申请号09/379,297；Rose等人，J.Am.Chem.Soc.(1999)121：7034)，在一种生产羧基的Sasrin树脂上装配水溶性的聚合物(EDA-Succ)₁₈羧酸酯(GRFNP32)。按照标准方法(Rose，K等人，美国专利申请号09/379,297；Rose等人，J.Am.Chem.Soc.(1999)121：7034)，在一种产生酰胺的Sieber树脂上装配水溶性的聚合物(EDA-Succ)₆-酰胺(GRFNP6)。通过偶合过量5倍的活化的Boc-氨基氧基乙酸，把一个氨基氧基乙酰基(AoA)部分连接到每种与树脂连接的聚合物的N-末端氨基上。使用经典的Fmoc化学方法分别把两种聚合物链从相应的树脂载体上切下来。通过制备性的反相HPLC纯化每种聚合物链。对于每种聚合物，使用ES-MS鉴别含有纯聚合物的部分，合并并且冷冻干燥，用于后续的连接。

以等摩尔的比例把片段SEP-1：4和GRFNP6一起溶于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中，然后把溶液冷冻干燥。把干燥后的粉末溶解，通过制备性的梯度C4反相HPLC把经过聚合物改性的肽与没有改性的肽和没有反应的聚合物分离开来。通过ES-MS鉴别含有所要的肟化产物SEP-1：4+GP6的部分，合并并且冷冻干燥。

以等摩尔的比例把片段SEP-1：1和GRFNP32一起溶于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中，然后把溶液冷冻干燥。把干燥后的粉末溶解，通过制备性的梯度C4反相HPLC把经过聚合物改性的肽与没有反应的聚合物分离开来。通过ES-MS鉴别含有所要的肟化产物SEP-1：1+GP32的部分，合并并且冷冻干燥。B.激发红细胞生成的合成蛋白质SEP-1-L26的合成

在溶液中从下列四种多肽片段合成了SEP-1-L26：片段SEP-1：1+GP32(GRFN 1711+GRFNP32，对应于SEQ ID NO：2的残基1-32)：

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK^oxITTGCA EH-硫代酸酯(其中Lys²⁴在ε-氨基处被一个乙酰丙酸肟连接体基团改性，该连接体基团通过一个乙酰丙酸氨基氧基乙酰基(Lev-AoA)肟键(用K^ox表示)与GRFNP32偶合片段SEP-1：2(GRFN1712，对应于SEQ ID NO：2的残基33-88)：

CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL

SEAVLRGQAL LVKSSQPW-硫代酸酯(其中Cys³³被Acm保护)片段SEP-1：3(GRFN1713，对应于SEQ ID NO：2的残基89-116)：

CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-硫代酸酯(其中Cys⁸⁹被Acm保护)片段SEP-1：4+GP6(GRFN1776+GRFNP6，对应于SEQ ID NO：2的残基117-166)：

CAIS PPDAAK^oxAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR-羧酸酯(其中Lys¹²⁶在ε-氨基处被一个乙酰丙酸肟连接体基团改性，该连接体基团通过一个乙酰丙酸氨基氧基乙酰基(Lev-AoA)肟键(用K^ox表示)与GRFNP6偶合，其中C-末端半胱氨酸[即Cys¹⁶¹]带有一个吡啶甲基(pico)保护基)

按照实施例1和2中所述的方法进行其它肽的合成、连接反应、羧甲基化、脱保护基反应、折叠和纯化，得到了全长的折叠SEP-1-L26。通过反相HPLC色谱和ES-MS谱以及CD光谱对折叠后的蛋白质产物进行分析，证实了折叠后的蛋白质的存在。

实施例4

激发红细胞生成的合成蛋白质SEP-1-B50的合成

合成了激发红细胞生成的第四种合成蛋白质(命名为SEP-1-B50)。全长SEP-1-B50的氨基酸序列与SEP-1-L30的相同：

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK^oxITTGCA EHCSLNEKIT

VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL

LVKSSQPWΨP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKΨAIS

PPDAAK^oxAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA

CRTGDR(SEQ ID NO：2)其中Ψ代表一种非天然的氨基酸残基，由在巯基处被羧甲基化的一种半胱氨酸组成，其中K^ox代表一种在ε-氨基处被一个肟连接子基团化学改性的非天然的赖氨酸，该肟连接子基团与一种所称的水溶性聚合物通过一个肟键偶合在一起。

然而，使用一种带有4个线性的(Succ-EDA)₁₂部分的支化的聚合物构造而不是使用SEP-1-L30的线性(Succ-EDA)₁₈聚合物来衍生蛋白质。衍生是通过一个肟键完成的。全长产物的装配按照实施例2中所述的方法进行。A.带有多个硫醇基的模板GRFNP17的合成

通过手工方式，以0.4mmol的规模，在一种产生酰胺的(4-甲基)二苯甲基胺(MBHA)-树脂上合成模板GRFNP17。使用标准的偶合方法(Schnlzer，M.，Int.J.Pept.Protein Res.(1992)40：180-93)偶合Fmoc-Lys(Boc)-OH。使用2.1mmol氨基酸、10％DIEA在3.8ml0.5M HBTU中的溶液；即使用过量5倍的氨基酸。除去Fmoc保护基后，使用标准的氨基酸偶合方法(2.1mmol氨基酸、10％DIEA在3.8ml 0.5MHBTU中的溶液；即使用过量5倍的氨基酸)偶合Fmoc-Lys(Fmoc)-OH。在第二次除去Fmoc的步骤之后，使用标准的氨基酸偶合方法(4.2mmol氨基酸、10％DIEA在7.6ml 0.5M HBTU中的溶液；即使用相对于游离胺过量5倍的氨基酸)偶合Fmoc-Lys(Fmoc)-OH。在最后一步脱除Fmoc的保护之后，把过量5倍(相对于游离胺)的S-乙酰基巯基乙酸五氟苯基酯(SAMA-oPfp)的DMF溶液偶合30分钟。通过用纯的TFA洗涤两次(每次1分钟)，然后用10％DIEA的DMF溶液洗涤中和树脂来除去C-末端赖氨酸残基的侧链的Boc保护基。把2mmol Boc-氨基氧基乙酸和2mmol N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶于3ml DMF中。加入2mmol DIC(二异丙基碳酰二亚胺)后，把酸活化30-60分钟。把溶液加入中和后的树脂中，偶合1小时。最后用20％哌啶的DMF溶液处理30分钟以除去与S-连接的乙酰基。使用HF/对甲基苯酚按照标准的Boc化学方法在作为游离醛的清除剂的半胱氨酸的存在下，把模板脱保护同时从树脂载体上切下来(Schnolzer，M.，Int.J.Pept.Protein Res.(1992)40：180-93)。把回收的聚酰胺在50％B[即含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液]中的溶液冷冻干燥。为了纯化，把模板粗产物溶于2ml 50％B中，加入100ml 100％A[即0.1％TFA的水溶液]稀释样品(不要加入氯化胍或乙酸盐，因为要保证加入醛)。把模板装载到在40℃下用3％B平衡的制备性的C4反相HPLC柱上。把盐等度地洗脱下来，以线性的梯度纯化所要的模板GRFNP17。通过ES-MS鉴别含有所要产物的部分，合并并且冷冻干燥。B.支化的水溶性聚合物GRFNP29的合成

通过对经过纯化的含硫醇的模板GRFNP17和-种线性的聚合物GRFNP31、Br-乙酰基-(EDA-Succ)₁₂羧酸酯进行产生硫醚的连接来合成GRFNP29-一种分子量为15kDa的支化(EDA-Succ)₁₂聚合物，其中GRFNP31是按照标准方法(Rose，K等人，美国专利申请号09/379,297；Rose等人，J.Am.Chem.Soc.(1999)121：7034)，在一种产生羧基的Sasrin树脂上合成的。

把1.3倍摩尔过量的(相对于总的硫醇)纯化的GRFNP31、Br-乙酰化的(EDA-Succ)₁₂和纯化的含有硫醇的模板GRFNP17一起溶于0.1MTris-HCl/6M，pH8.7的氯化胍中，使浓度达到大约10mM。溶解后，用0.1M Tris-HCl，pH8.7的缓冲剂把溶液稀释3倍(v/v)。在室温下搅拌连接混合物，通过反相HPLC和ES/MS监测反应。根据需要再次加入GRFNP31反应物，直到所要的反应产物是主要的产物为止。为了聚集，加入3倍(v/v，相对于连接混合物)0.1M乙酸盐/6M，pH4的氯化胍，把溶液装载到一个制备性的C4反相HPLC柱上，使用线性的梯度进行纯化。使用ES-MS鉴别含有纯的GRFNP29构建物的部分，合并并且冷冻干燥。C.使用GRFNP29对GRFN1776和GRFN1711进行肟化

按照实施例2中所述的方法合成片段SEP-1：4和片段SEP-1：1。以等摩尔的比例把片段SEP-1：4和GRFNP29一起溶于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中，把溶液冷冻干燥。把干燥后的粉末装载到一个制备性的反相HPLC柱(直径1英寸)上。通过制备性的梯度C4逆相HPLC把经过聚合物改性的肽与没有改性的肽和没有反应的聚合物分离开来。通过ES-MS鉴别含有所要的肟化产物SEP-1：4+GP29的部分，合并。

以等摩尔的比例把片段SEP-1：1和GRFNP29一起溶于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中，然后把溶液冷冻干燥。把干燥后的粉末溶于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中，装载到一个制备性的GPC(凝胶渗透色谱)柱(直径1英寸)上，通过等度洗脱把经过聚合物改性的肽与没有改性的肽和没有反应的聚合物分离开来。通过ES-MS鉴别含有所要的肟化产物SEP-1：1+GP29的部分，合并。D.激发红细胞生成的合成蛋白质SEP-1-B50的合成

在溶液中从下列四种多肽片段合成了SEP-1-B50(SEQ ID NO：2)：片段SEP-1：1+GP29(GRFN 1711+GRFNP29，对应于SEQ ID NO：2的残基1-32)：

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK^oxITTGCA EH-硫代酸酯(其中Lys²⁴在ε-氨基处被一个乙酰丙酸肟连接子基团改性，该连接子基团通过一个乙酰丙酸氨基氧基乙酰基(Lev-AoA)肟键(用K^ox表示)与GRFNP29偶合片段SEP-1：2(GRFN1712，对应于SEQ ID NO：2的残基33-88)：

CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL

CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-硫代酸酯(其中Cys⁸⁹被Acm保护)片段SEP-1：4+GP29(GRFN1776+GRFNP29，对应于SEQ ID NO：2的残基117-166)：

CAIS PPDAAK^oxAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR-羧酸酯(其中Lys¹²⁶在ε-氨基处被一个乙酰丙酸肟连接子基团改性，该连接子基团通过一个乙酰丙酸氨基氧基乙酰基(Lev-AoA)肟键(用K^ox表示)与GRFNP29偶合，其中C-末端半胱氨酸残基带有一个吡啶甲基(pico)保护基)

除了在Resource Q柱上进行纯化外，按照实施例1和2中所述的方法进行其它肽的合成、连接反应、羧甲基化、脱保护基反应、折叠和纯化，得到了全长的折叠SEP-1-B50(SEQ ID NO：2).通过C4反相HPLC色谱和ES-MS以及CD光谱对折叠后的蛋白质产物SEP-1-B50进行分析，证实了折叠后的蛋白质的存在。

实施例5

激发红细胞生成的合成蛋白质SEP-3-L42的合成

合成了激发红细胞生成的第五种合成蛋白质(命名为SEP-3-L42)。全部长度的SEP-3蛋白质的氨基酸序列是：

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAECITTGCA EHCSLNECIT

VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL

LACSSQPWEP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKEAIS

PPDAACAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA

CRTGDR(SEQ ID NO：3)

用马来酰亚胺官能化的(EDA-Succ)₁₈(GRFNP32)聚合物单元(通过一种Michael加成反应)对半胱氨酸残基的24、38、83和126位进行改性，形成SEP-3-L42。

详细地，在溶液中从下列四个多肽片段合成SEP-3：片段SEP-3：1(GRFN 1747，对应于SEQ ID NO：3的残基1-37)：

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAECITTGCA EHCSLNE-硫代酸酯(其中Cys⁷、Cys²⁹和Cys³³被Acm保护)片段SEP-3：2(GRFN 1774，对应于SEQ ID NO：3的残基38-82)：

CIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL

SEAVLRGQAL LV-硫代酸酯(其中Cys³⁸的侧链被Acm基团保护)片段SEP-3：3(GRFN 1749，对应于SEQ ID NO：3的残基83-125)：

CSSQPWEP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKEAIS

PPDAA-硫代酸酯(其中Cys⁸³的侧链被Acm基团保护)片段SEP-3：4(GRFN 1750，对应于SEQ ID NO：3的残基126-166)：

CAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA

CRTGDR-羧酸酯(其中Cys¹⁶¹被Pbo[即4-(CH3S(O)-)苄基-]保护)

肽的合成肽SEP-3：1和SEP-3：2以及SEP-3：3是在产生硫酯的树脂上，通过用于Boc化学的原位中和法和分步固相肽合成法(SPPS)使用已知的侧链保护策略(如实施例1中所述)合成的，同时改变了如上面指出的特定肽的保护基策略。以类似的方式在一种-OCH₂-Pam-树脂上合成片段SEP-3：4。把肽脱保护，同时从树脂载体上切下，如实施例1中所述。如上述得到的肽用制备性的RP-HPLC进行纯化。使用ES-MS鉴别含有纯肽的部分、合并和冷冻干燥，用于后续的连接。

步骤1：连接#1以15mM的浓度把片段SEP-3：4和片段SEP-3：3溶于TFE中。加入含有6M氯化胍和1％硫酚的饱和的磷酸盐缓冲剂(pH7.5)，得到一种澄清的肽片段的溶液。连接后，把连接混合物(规定为1个体积)加入2个体积的含有25％β-巯基乙醇的2ml TFE、6ml 6M氯化胍、100mM磷酸盐的溶液中，培育20分钟。使用15mg/ml TCEP的冰乙酸溶液酸化该溶液，装载在一个制备性的C4反相HPLC柱上，使用线性的梯度进行纯化。通过ES-MS鉴别含有所要的产物SEP-3：Acm+SEP-3：3+SEP-3：4的部分，合并。

步骤2：除去Acm#1 为了除去Acm，使用HPLC级的水把含有合并后的SEP-3：Acm+SEP-3：3+SEP-3：4部分的乙腈水溶液稀释1倍，加入固体脲使最终浓度为2摩尔。加入摩尔数过量3倍(相对于预期的总的半胱氨酸浓度)的30mg/ml的Hg(Ac)₂在3％乙酸水溶液中的溶液，把溶液搅拌1小时。然后把溶液制成20％的β-巯基乙醇溶液，装载到一个半制备性的C4反相HPLC柱上，使用逐步梯度进行纯化。通过ES-MS鉴别含有所要的产物SEP-3：3+SEP-3：4的部分，冷冻干燥过夜。

步骤3：连接#2以15mM的浓度把等量的SEP-3：3+SEP-3：4和SEP-3：2一起溶于纯的TFE(三氟乙醇)中。加入含有6M氯化胍和1％硫酚的250mM磷酸盐缓冲剂(pH7.5)，得到一种肽片段的澄清溶液。连接1天后，把连接混合物(规定为1个体积)加入2个体积的10ml TFE、10mlβ-巯基乙醇、10ml哌啶和20ml pH＝4的6M氯化胍的溶液中，并且培育20分钟以除去残留的保护基。使用15mg/ml TCEP在20％乙酸水溶液中的溶液酸化溶液，装载到制备性的C4反相HPLC柱上，使用线性的梯度进行纯化。通过ES-MS鉴别含有所要的连接产物SEP-3：Acm+SEP-3：2+SEP-3：3+SEP-3：4的部分，冷冻干燥过夜。

步骤4：除去Acm 为了除去Acm，使用HPLC级的水把含有合并后的SEP-3：Acm+SEP-3：2+SEP-3：3+SEP-3：4部分的乙腈水溶液稀释1倍，加入固体脲使其最终浓度为2摩尔。加入摩尔数过量3倍(相对于预期的总的半胱氨酸浓度)的30mg/ml的Hg(Ac)₂在3％乙酸水溶液中的溶液，把溶液搅拌1小时。然后把溶液制成20％的β-巯基乙醇溶液，装载到一个半制备性的C4反相HPLC柱上，使用逐步梯度进行纯化。通过ES-MS鉴别含有所要的产物SEP-3：2+SEP-3：3+SEP-3：4的部分，冷冻干燥过夜。

步骤5：连接#3以15mM的浓度把等量的SEP-3：2+SEP-3：3+SEP-3：4和SEP-3：1一起溶于纯粹的TFE中，加入含有6M氯化胍和1％硫酚的250mM磷酸盐缓冲剂(pH7.5)，得到一种肽片段的澄清溶液。连接1天后，把连接混合物(规定为1个体积)加入2个体积的10mlTFE、10ml β-巯基乙醇、10ml哌啶和20ml pH＝4的6M氯化胍的溶液中，并且培育20分钟以除去残留的保护基。使用15mg/ml TCEP在20％乙酸水溶液中的溶液酸化溶液，装载到制备性的C4反相HPLC柱上，使用线性的梯度进行纯化。通过ES-MS鉴别含有所要的连接产物SEP-3：1+SEP-3：2+SEP-3：3+SEP-3：4的部分，冷冻干燥过夜。

步骤6：连接聚合物GRFNP32通过使用BMPS(3-马来酰亚胺基丙酸NHS酯，Pierce，USA)按照形成马来酰亚胺官能化的(EDA-Succ)₁₈聚合物的生产方法把GRFNP32官能团化来制备被称为GRFNP32-马来酰亚胺的马来酰亚胺官能化的线性(EDA-Succ)₁₈聚合物[即马来酰亚胺-(EDA-Succ)₁₈]。把SEP-3：1+SEP-3：2+SEP-3：3+SEP-3：4溶于最少需要量的TFE中。把过量3倍的GRFNP32-马来酰亚胺溶于6M氯化胍、100mM，pH7.5的磷酸盐溶液中，加入TFE溶液中。通过分析用的反相HPLC跟踪Michael加成反应的进程。反应完成后，把溶液装载到制备性的C4反相HPLC柱上，使用线性的梯度进行纯化。通过ES-MS鉴别含有所要的聚合物改性的产物SEP-3：Acm+SEP-3：1+SEP-3：2+SEP-3：3+SEP-3：4+pPEG[即含有4备份与Cys²⁴、Cys³⁸、Cys⁸³和Cys¹²⁶的侧链硫醇连接的GRFNP32的连接好的166个残基的全长多肽链]的部分，冷冻干燥过夜。

步骤7：除去Pbo 为了还原Pbo，把冷冻干燥的SEP-3：Acm+SEP-3：1+SEP-3：2+SEP-3：3+SEP-3：4+GP32粉末溶于含有5％乙二硫醇的纯粹的TFA中。然后通过加入10％苯硫基甲烷和15％溴代三甲基硅烷处理30分钟来消去Pbo基团。在旋转蒸发器中干燥溶液，用含有0.1％TFA的乙腈水溶液浸取。把所得的溶液装载到一个半制备性的反相HPLC柱上，使用逐步梯度进行纯化。通过ES-MS鉴别含有所要的Cys¹⁶¹脱保护的SEP-3：Acm+SEP-3：1+SEP-3：2+SEP-3：3+SEP-3：4+GP32-Pbo的部分，冷冻干燥过夜。

步骤8：除去Acm 为了最终从Cys⁷、Cys²⁹和Cys³³的侧链上除去Acm，使用HPLC级的水把含有合并后的SEP-3：Acm+SEP-3：1+SEP-3：2+SEP-3：3+SEP-3：4+GP32-Pbo的部分的乙腈水溶液稀释1倍，加入固体脲使其最终浓度为2摩尔。加入摩尔数过量3倍(相对于预期的总的半胱氨酸浓度)的30mg/ml的Hg(Ac)₂在3％乙酸水溶液中的溶液，把溶液搅拌1小时。然后把溶液制成20％的β-巯基乙醇溶液，装载到一个半制备性的C4反相HPLC柱上，使用逐步梯度进行纯化。通过ES-MS鉴别含有所要的连接好的聚合物改性的产物SEP-3(1-166)的部分，冷冻干燥过夜。

步骤9：折叠把连接好的聚合物改性的全长肽SEP-3(1-166)溶于含有6M氯化胍和20％TFE以及摩尔数过量10倍(相对于SEP-3中的Cys残基)的半胱氨酸的200mM Tris缓冲剂(pH8.7)中。在室温下，用含有3M氯化胍的200mM Tris缓冲剂(pH8.7)对该溶液进行渗析过夜，然后在4℃下，用含有1M氯化胍的200mM Tris缓冲剂(pH8.7)把该溶液渗析4小时，最后在4℃下，用10mM磷酸盐缓冲剂(pH7.0)把该溶液渗析4小时，得到最终的折叠产物。折叠得到了电雾化ES-MS和CD(圆二色性)光谱的证实。

步骤10：纯化在一个圆锥形浓缩器瓶中，把折叠后的多肽浓缩5倍，装载到用10mM，pH7.0的磷酸盐平衡的Resource S阳离子交换柱上。使用最高达500mM NaCl的线性的盐梯度在10分钟之内把折叠好的蛋白质洗脱下来。通过SDS-PAGE鉴别含有所要的折叠产物SEP-3-L42的部分，在-80℃下冷冻储藏。

实施例6

激发红细胞生成的合成蛋白质的生物活性试验

以商业上得到的重组红细胞生成素作为对照的标准，使用UT/7和32D 103197细胞系，在因子依赖型细胞系的增殖试验中测定了折叠的能激发红细胞生成的合成蛋白质SEP-0、SEP-1-L26、SEP-1-L30、SEP-1-B50和SEP-3-L42的生物活性。UT-7是一种绝对依赖于白介素-3、粒细胞-巨噬细胞菌落刺激因子(GM-CSF)或用于生长和生存的红细胞生成素(EPO)的人的成巨核细胞白细胞系(Miura Y等人，ActaHaematol(1998)99：180-184)；Komatsu N等人，Cancer Res.(1991)51：341-8)。32D 103197是一种鼠造血细胞系(Metcalf，D.Int.J.Cell Cloning(1992)10：116-25)。

把SEP构建物的市售溶液配制在Iscove改进的Dulbecco介质(IMDM)、10％PBS(小牛血清)、谷胺酰胺和Penstrep中，把这些市售溶液的一系列2倍稀释液加入其中已经加入了浓度为5000个细胞/50μl的人UT/7 EPO的多孔板中。在37℃下，在5％CO₂的存在下培育多孔板，并且每日监测其生长情况。4天后，加入20μl 2.5mg/ml MTT(甲基噻唑四唑鎓)的PBS(磷酸盐缓冲的盐水)，培育多孔板4小时。加入150μlIPA，在562nm下读取每个孔的吸收值。确定SEP化合物的ED₅₀值(达到最大效果的50％的有效剂量)，与CHO(中国仓鼠卵巢)-细胞生产的rhEPO(重组的人红细胞生成素)的ED₅₀值进行比较。这些试验的结果证明，所有的激发红细胞生成的合成蛋白质都具有生物活性。SEP-0、SEP-1-L26、SEP-1-L30、SEP-1-B50的ED₅₀值的试验结果如表VI中所示。

表VI

激发红细胞生成的蛋白质	体外ED₅₀值(DM)
	体外ED₅₀值(DM)		UT-7(人)细胞	32D 103197(小鼠)细胞
	SEP-0	1,570	UT-7(人)细胞	32D 103197(小鼠)细胞	863
SEP-1-L26	SEP-0	1,570	46.5	100.8	863
SEP-1-L26	SEP-1-L30	71.5	46.5	100.8	182.5
SEP-1-B50	SEP-1-L30	71.5	182	6200	182.5
SEP-1-B50	rh EPO	32.5	182	6200	136.3

虽然结合具体的实施方式对本发明作了描述，但是应当明白，可以作进一步的改进，以及本申请的目的是包括那些在总体上遵守本发明的原理的情况下对本发明所作的任何变异、使用或适用，包括那些偏离了本发明的公开内容属于本领域的公知或常规操作的与本发明有关的以及适用于迄今已经提出的基本特征的内容。

序列表<110>格莱风科学公司<120>″拟″天然化学连接<130>03504.268<140><141><150>60/231,339<151>2000-09-08<150>60/236,377<151>2000-09-29<160>3<170>PatentIn Ver. 2.1<210>1<211>166<212>PRT<213>人类<400>1Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Lys Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His

20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Lys Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe

35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp

50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Lys Ser Ser Gln Pro Trp Cys Pro Leu Gln Leu His Val Asp

85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu

100 105 110Gly Ala Gln Lys Cys Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala

115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val

130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg

165<210>2<211>166<212>PRT<213>人类<400>2Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Lys Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His

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35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp

85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu

100 105 110Gly Ala Gln Lys Cys Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Lys Ala Ala

115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val

165<210>3<211>166<212>PRT<213>人类<400>3Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Cys Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His

20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Cys Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe

35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp

50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Ala Cys Ser Ser Gln Pro Trp Cys Pro Leu Gln Leu His Val Asp

85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu

100 105 110Gly Ala Gln Lys Cys Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Cys Ala Ala

115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val

165

Claims

1.一种含有一个侧链为式-S-R_aa的拟氨基酸残基的合成蛋白质，其中R_aa是一种核糖体规定的氨基酸侧链的一个选择性取代的末端部分或一种核糖体规定的氨基酸侧链的该末端部分的类似物。

2.权利要求1的合成蛋白质，其中所说的侧链-S-R_aa与所说的核糖体规定的氨基酸侧链的链长度相同。

3.权利要求1的合成蛋白质，其中所说的侧链-S-R_aa的长度大于所说的核糖体规定的氨基酸侧链的长度。

4.权利要求1的合成蛋白质，其中所说的蛋白质具有核糖体规定的生物活性蛋白质所具有的生物活性。

5.权利要求4的合成蛋白质，其中所说的拟氨基酸残基的侧链-S-R_aa模仿所说的生物活性的蛋白质的相应位置上的核糖体规定的氨基酸的结构或功能。

6.权利要求4的合成蛋白质，其中所说的拟氨基酸残基的侧链-S-R_aa改变了所说的生物活性的蛋白质的相应位置上的核糖体规定的氨基酸的结构或功能。

7.权利要求4的合成蛋白质，其中所说的合成蛋白质单体的分子量大于大约25kDa。

8.权利要求4的合成蛋白质，其中所说的核糖体产生的生物活性的蛋白质含有一个半胱氨酸残基。

9.权利要求8的合成蛋白质，其中所说的拟氨基酸残基位于与所说的核糖体产生的生物活性的蛋白质的所说的半胱氨酸残基的位置相应的位置之外的一个位置上。

10.权利要求1的合成蛋白质，其中所说的蛋白质的多个氨基酸残基与相邻的氨基酸残基通过一个酰胺键相连。

11.权利要求10的合成蛋白质，其中每个氨基酸残基与其相邻的氨基酸残基通过酰胺键相连。

12.权利要求1的合成蛋白质，其中所说的蛋白质由多个氨基酸残基组成，其中至少一种这样的氨基酸残基与一个相邻的氨基酸残基通过一个非酰胺键连接。

13.权利要求12的合成蛋白质，其中所说的非酰胺键选自硫酯键、硫醚键和肟键。

14.权利要求1的合成蛋白质，其中所说的拟氨基酸残基是一种D-构型氨基酸残基。

15.权利要求1的合成蛋白质，其中所说的拟氨基酸残基是一种L-构型氨基酸残基。

16.权利要求1的合成蛋白质，其中所说的拟氨基酸残基选自拟精氨酸、拟天冬酰胺、拟天冬氨酸、拟多巴胺、拟谷氨酸、拟谷胺酰胺、拟组氨酸、拟异亮氨酸、拟亮氨酸、拟赖氨酸、拟甲氨酸、拟苯丙氨酸、拟丝氨酸、拟苏氨酸、拟色氨酸、拟酪氨酸和拟缬氨酸。

17.权利要求16的合成蛋白质，其中所说的拟氨基酸残基是拟谷氨酸。

18.权利要求4的合成蛋白质，其中所说的核糖体产生的生物活性的蛋白质是哺乳动物蛋白质。

19.权利要求18的合成蛋白质，其中所说的哺乳动物蛋白质选自人、猴、牛、鼠、猪、羊和马蛋白质。

20.权利要求18的合成蛋白质，其中所说的哺乳动物蛋白质是人蛋白质。

21.权利要求19-20任意一项的合成蛋白质，其中所说的蛋白质具有选自一种蛋白质受体或其片段、一种蛋白质受体配体或其片段或一种细胞素的生物活性。

22.权利要求21的合成蛋白质，其中所说的生物活性的合成蛋白质具有一种细胞素的活性。

23.权利要求22的合成蛋白质，其中所说的细胞素选自一种白介素、一种淋巴因子、一种RANTES蛋白质、一种激发红细胞生成的蛋白质、肿瘤坏死因子(TNF)、一种干扰素、一种生长因子和一种单肽激素。

24.权利要求23的合成蛋白质，其中所说的细胞素是一种激发红细胞生成的蛋白质。

25.权利要求24的合成蛋白质，其中所说的激发红细胞生成的的蛋白质是红细胞生成素。

26.权利要求25的合成蛋白质，其中所说的生物活性的合成蛋白质选自SEP-0、SEP-1和SEP-3。

27.权利要求22的合成蛋白质，其中所说的细胞素是一种RANTES蛋白质。

28.权利要求22的合成蛋白质，其中所说的细胞素是一种生长因子。

29.权利要求28的合成蛋白质，其中所说的生长因子是G-CSF。

30.权利要求1的合成蛋白质，其中所说的合成蛋白质包含一个或多个被一个或多个聚合物加成物改性的氨基酸残基。

31.权利要求4的合成蛋白质，其中所说的核糖体产生的生物活性的蛋白质在一个或多个糖基化位点处被糖基化。

32.权利要求31的合成蛋白质，其中所说的合成蛋白质包含一个或多个在对应于核糖体产生的生物活性蛋白质的至少一个上述糖基化位点的氨基酸残基处被一个或多个聚合物加成物产生的氨基酸残基。

33.一种在分子水平上均匀的包含一种合成蛋白质的药物组合物，其中该蛋白质具有与具有生物活性的核糖体规定的哺乳动物蛋白质相关的生物活性相似的生物活性，其分子量大于大约25kDa，并且含有一个侧链为式-S-R_aa的拟氨基酸残基，其中R_aa是选自一种核糖体规定的氨基酸侧链的一个选择性取代的末端部分或其类似物。

34.权利要求33的药物组合物，其中所说的组合物包括至少两种所说的在分子水平上均匀的药物组合物的混合物。

35.权利要求33的药物组合物，其中所说的核糖体规定的生物活性的哺乳动物蛋白质选自人、猴、牛、鼠、猪、羊和马的蛋白质。

36.权利要求33的药物组合物，其中所说的核糖体规定的生物活性的哺乳动物蛋白质是人的蛋白质。

37.权利要求36的药物组合物，其中所说的合成蛋白质具有一种蛋白质受体或其片段、一种蛋白质受体配体或其片段或一种细胞素的生物活性。

38.权利要求37的药物组合物，其中所说的合成蛋白质具有一种细胞素的生物活性。

39.权利要求38的药物组合物，其中所说的细胞素选自一种白介素、一种淋巴因子、一种RANTES蛋白质、一种激发红细胞生成的蛋白质、肿瘤坏死因子(TNF)、一种干扰素、一种生长因子和一种单肽激素。

40.权利要求39的药物组合物，其中所说的细胞素是一种激发红细胞生成的蛋白质。

41.权利要求40的药物组合物，其中所说的激发红细胞生成的蛋白质是红细胞生成素。

42.权利要求41的药物组合物，其中所说的合成蛋白质选自SEP-0、SEP-1和SEP-3。

43.权利要求38的药物组合物，其中所说的细胞素是一种RANTES蛋白质。

44.权利要求39的药物组合物，其中所说的细胞素是一种生长因子。

45.权利要求44的药物组合物，其中所说的生长因子是G-CSF。

46.一种治疗人疾病或状态的方法，包括给需要这种治疗的个体服用治疗有效量的包含一种或多种在分子水平上均匀并且包含一种合成蛋白质的药物组合物，其中合成蛋白质的分子量大于大约25kDa，并且含有一个侧链为式-S-R_aa的拟氨基酸残基，其中R_aa是一种选自核糖体规定的氨基酸侧链的一个选择性取代的末端部分或其类似物；该合成蛋白质具有与生物活性的核糖体规定的人蛋白质受体或其片段、蛋白质受体配体或其片段或一种细胞素的生物活性相似的生物活性。

47.权利要求46的方法，其中所说的合成蛋白质具有一种细胞素的生物活性。

48.权利要求47的方法，其中所说的细胞素选自一种白介素、一种淋巴因子、一种RANTES蛋白质、一种激发红细胞生成的蛋白质、肿瘤坏死因子(TNF)、一种干扰素、一种生长因子和一种单肽激素。

49.权利要求48的方法，其中所说的细胞素是一种激发红细胞生成的蛋白质。

50.权利要求49的方法，其中所说的激发红细胞生成的蛋白质是红细胞生成素。

51.权利要求50的方法，其中所说的合成蛋白质选自SEP-0、SEP-1和SEP-3。

52.权利要求48的方法，其中所说的细胞素是一种RANTES蛋白质。

53.权利要求48的方法，其中所说的细胞素是一种生长因子。

54.权利要求44的方法，其中所说的生长因子是G-CSF。

55.一种合成下式的所要的多肽的方法：

{aa}_{{NH}_{2}} - Q - {aa}_{x} - {aa}_{y} - W - {aa}_{COOH}

代表多肽的N0末端氨基酸残基，aa_x，和aa_y，分别代表具有侧链x和y的内部的相邻的氨基酸残基，而aa_COOH代表多肽的C-末端氨基酸残基，该方法包括：(A)把一种式

{aa}_{{NH}_{2}} - Q - {aa}_{x} - COSR

的第一种多肽(其中R是与硫代酸酯基团相容的任何基团，包括但是不限于芳基、苄基和烷基)与一种式Cys-W-aa_COOH。的第二种多肽连接而形成多肽

{aa}_{{NH}_{2}} - Q - {aa}_{x} - Cys - W - {aa}_{COOH}

；和

(B)在一种试剂R_aa-X(其中R_aa是一个结构与氨基酸残基aa_y的侧链的末端部分相似的基团，而X是一个艮好的离去基团)的存在下培育该多肽，该培育条件足以形成所说的所要的多肽。

56.权利要求55的方法，其中X是一个卤素原子。

57.权利要求56的方法，其中所说的卤素原子是F、I或Br。

58．权利要求55的方法，其中所说的氨基酸残基aa_y选自拟精氨酸、拟天冬酰胺、拟天冬氨酸、拟多巴胺、拟谷氨酸、拟谷胺酰胺、拟组氨酸、拟异亮氨酸、拟亮氨酸、拟赖氨酸、拟甲氨酸、拟苯丙氨酸、拟丝氨酸、拟苏氨酸、拟色氨酸、拟酪氨酸和拟缬氨酸。

59.一种下式的多肽：

{aa}_{{NH}_{2}} - Q - {aa}_{x} - {aa}_{y} - W - {aa}_{COOH}

代表多肽的N0末端氨基酸残基，aa_x和aa_y分别代表具有侧链x和y的内部的相邻的氨基酸残基，而aa_COOH代表多肽的C-末端氨基酸残基；其中所说的多肽是通过一种包括下列步骤的方法生产的：(A)把一种式

{aa}_{{NH}_{2}} - Q - {aa}_{x} - COSR

的第一种多肽(其中R是与硫代酸酯基团相容的任何基团，包括但是不限于芳基、苄基和烷基)与一种式Cys-W-aa_COOH的第二种多肽连接而形成多肽

{aa}_{{NH}_{2}} - Q - {aa}_{x} - Cys - W - {aa}_{COOH}

；和

(B)在一种试剂R_aa-X(其中R_aa是一个结构与氨基酸残基aa_y的侧链的末端部分相似的基团，而x是一个良好的离去基团)的存在下培育该多肽，该培育条件足以形成所说的所要的多肽。

60.权利要求59的多肽，其中X是一个卤素原子。

61.权利要求60的多肽，其中所说的卤素原子是F、I或Br。

62.权利要求59的多肽，其中所说的氨基酸残基aa_y选自拟精氨酸、拟天冬酰胺、拟天冬氨酸、拟多巴胺、拟谷氨酸、拟谷胺酰胺、拟组氨酸、拟异亮氨酸、拟亮氨酸、拟赖氨酸、拟甲氨酸、拟苯丙氨酸、拟丝氨酸、拟苏氨酸、拟色氨酸、拟酪氨酸和拟缬氨酸。