CN1460023A - 聚合物修饰的生物活性合成趋化因子及其生产方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及聚合物修饰的生物活性合成趋化因子，并且涉及所述趋化因子的生产方法和用途。本发明的生物活性合成趋化因子包括一种聚合物修饰的多肽趋化因子主链。本发明的化合物和方法可用于治疗与天然存在的趋化因子相关的疾病，如用于治疗HIV和AIDS相关的疾病，以及用于治疗哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、粉瘤/动脉粥样硬化、器官移植排斥、和类风湿关节炎。

Description

聚合物修饰的生物活性合成趋化因子及其生产方法和用途
技术领域：
本发明涉及聚合物修饰的生物活性合成趋化因子，特别是趋化因子拮抗剂和激动剂，及其生产方法和用途。
对相关申请的交叉引用：
本申请是被收作本文参考的美国专利申请流水号60/217683(申请日为2000年7月12日)的部分后续申请。
发明背景：
趋化因子是参与白细胞运输和各种其他生物学过程的小蛋白(Murphy等，Pharmacological Rev.，2000，51，1：145-176，Rollins，BJ.，Blood，1997，90，3：909-928和Wells等，InflammationRes.，1999，48：353-362)。大多数趋化因子存在于炎症位点，并且通过诱导趋化性和通常存在于炎症位点的各种不同类型炎性细胞的细胞激活加重炎症。某些趋化因子具有除了趋化性以外的其他特性，如诱导杀伤细胞的增殖和激活，调节造血祖细胞生长，将造血祖细胞运入和运出处于发炎状态的骨髓，血管生成和肿瘤生长(例如，参见Baggiolini.等，Ann.Rev.Immunology，1997，15：675-705；Zlotnik等，Critical Rev.Immunology，1999，19，1：1-4；Wang等，J.Immunological Methods，1998，220，1-2：1-17；和Moser等，Intl.Rev.Immunology，1998，16，3-4：323-344)。
有很多趋化因子的氨基酸序列、结构和功能是已知的。趋化因子的分子量大约为8-10kDa，并且在蛋白水平上表现出彼此之间具有大约20-50％的序列同源性。所述蛋白还具有共同的三级结构。所有趋化因子都具有多个参与分子内二硫键形成的保守的半胱氨酸残基，利用这些残基鉴定趋化因子并对趋化因子进行分类，例如，具有前两个半胱氨酸残基被一个氨基酸隔开的趋化因子被称为“C-X-C”趋化因子(又被称为α趋化因子)。前两个半胱氨酸相邻的趋化因子被称为“CC”趋化因子(又被称为β趋化因子)。“C”趋化因子与其他趋化因子的差别在于缺乏半胱氨酸残基(又被称为γ趋化因子)。C趋化因子与CC趋化因子的某些成员具有相似性，但是它丧失了CC和CXC趋化因子所特有的第一个和第三个半胱氨酸残基。前两个半胱氨酸残基被三个氨基酸隔开的趋化因子小组的成员，被称为“CXXXC”趋化因子(又被称为“CX3C”或δ趋化因子)。还存在趋化因子的亚型，例如，包括两个额外的保守半胱氨酸残基的CC趋化因子是已知的，并且有时候用术语“C6β”趋化因子表示该亚型。到目前为止所鉴定的大部分趋化因子是CC和CXC趋化因子类型的成员。
趋化因子与重要的疾病途径有关，如哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、癌症、病毒性疾病、粉瘤/动脉粥样硬化、类风湿关节炎和器官移植排斥。不过，很多趋化因子所存在的普遍问题及其作为治疗剂的潜在用途，涉及它们所固有的促进或加剧白细胞炎症反应和感染的特性。为此，业已对趋化因子进行了多种修饰，以期制备相应的野生型趋化因子的拮抗剂。Proudfoot(J.Biol.Chem.，1996，271，5：2599-2603)；Simmons等(Science276：276-279)；Gong等(J.Biol.Chem.，1996，271：10521-10527)；Baggiolini等(J.Exp.Med.，1997，186，8：1189-1191)；Polo等(Eur.J.Immunol.，2000，30：3190-3198)；Nibbs等(J.Immunol.，2000，164：1488-1497)和Townson等(J.Biol.Chem.，2000，176，50：39254-39261)报导了各种N-末端修饰的趋化因子。
一种典型的代表性例子是RANTES。在某些场合下，野生型RANTES能增强炎症和HIV感染(Gordon等，J.Virol.，1999，73：684-694；Czaplewski等，J.Biol.Chem.，1999，274：16077-16084)。相反，对RANTES多肽链的26号位置(E26A)和66号位置(E66S)进行取代，可以将该分子转化成其非炎症形式，并且提高其与它的受体竞争结合HIV的能力(Appay等，J.Biol.Chem.，1999，274：39：27505-27512；还可参见US6214540，该专利披露了能抑制HIV感染的趋化因子以及基于该趋化因子的方法)。不过，对RANTES的N-末端进行的修饰产生了能抑制HIV-1干扰的拮抗剂，包括N-末端截短[RANTES 9-68]，添加甲硫氨酸(Met-RANTES)，氨基氧戊烷(AOP-RANTES)或壬酰基(NNY-RANTES)(Arenzana-Seisdedos等，Nature，1996，383：400；Mack，等，J.Exp.Med.，1998，187：1215-1224；Proudfoot等，J.Biol.Chem.，1996，271：2599-2603；Wells等，WO96/17935；Simmons等，Science，1997，276：276-279；Offord等，WO99/11666；和Mosier等，J.Virology，1999，73，5：3544-3550)。US6168784披露了趋化因子类似物NNY-RANTES，并且建议用PEG链对该类似物的C-末端进行修饰。Wilkin等(Curr.Opinion Biotech.1999，9：412-426)对蛋白的化学合成进行了综述。
趋化因子的生物学活性是由受体介导的(Murphy等，Pharmacological Rev.，2000，51，1：145-176，Rollins，BJ.，Blood，1997，90，3：909-928和Wells等，Inflammation Res.，1999，48：353-362)。其中包括趋化因子特异性受体和具有重叠的配体特异性，能结合属于CC趋化因子或CXC趋化因子的几种不同趋化因子的受体。例如，CC趋化因子SDF-1α对CXCR4受体特异，而CXC趋化因子RANTES能结合CCR1、CCR3和CCR5受体。另一种例子是趋化因子Eotaxin，它是CCR3(又被称为CKR3)受体的配体(例如，参见Cyster，J.G.，Science，1999，286：2098-2102；Ponath等，J.Experimental Medicine，1996，183，6：2437-2448；Ponath等，J.Clinical Investigation，1996，97，3：604-12；和Yamada等，Biochem.Biophys.Res.Communications，1997，231，2：365-368)。
趋化因子激活其关联受体的能力，在很大程度上受对该趋化因子的N-末端区的修饰的影响。所述改变可以是由于蛋白水解加工、诱变或化学修饰所造成的(例如，参见Proudfoot，A.E.等，J.Biol.Chem.，1996，271：2599；Grzegorzewski等，Cytokine，2001，13，4：209-219；Clark-Lewis等，J.Biol.Chem.，1991，266，34：23128-23134；Moser等，J.Biol.Chem.，1993，268：7125-7128；Harrisson，J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95：10896；Mack等，J.Exp.Med.，1998，187：1215；Gong等，J.Biol.Chem.，1996，271：10521；Struyf等，Eur.J.Immunol.，1998，28：1262；Weber等，J.Exp.Med.，1996，183：631；Proot等，1998，J.Immunol.，160：4034；Yang等，J.Virol.1999，73，6：4582-4589；Rusconi等，Antivir Ther.，2000，5，3：199-204；Wyuts等，J.Immunol.，1999，163，11：6155-6613；Detheux等，J.Exp.Med.，2000，192：1501-1508；Nibbs等，J.Immunol.，2000，164：1488-1497；McCole等，J.Immunol.，1999，163，5：2829-2835；Nufer等，Biochemistry，1999，38，2：636-642；和Wyuts等，Eur.J.Biochem.，1999，260，2：421-429)。
上述很多修饰过的蛋白能在体外拮抗趋化因子受体介导的作用，能在若干动物模型中抑制病毒感染并明显减轻炎症。在某些场合下，它们保留了激活其受体的能力，并且在原代细胞中这种活性反映了受体表达的水平。对N-末端区的某些修饰还对趋化因子受体的运输有重大影响。因此，尽管所述修饰过的趋化因子能拮抗其受体和相应的野生型趋化因子，但是作为拮抗剂、激动剂或其变异的分类可能不同。
尽管业已提出将趋化因子用作治疗剂，潜在的主要缺陷之一是它在体内的循环半衰期较差，通常只有几分钟。为了提高循环半衰期，已知可以将诸如PEG(聚乙二醇)等水溶性聚合物连接在蛋白上，但是所获得的混乱的结果使得以受控制的方式和用户所规定的精确度连接它们是困难的(Zalipsky，S.Bioconjugate Chemistry，1995，6：150-165；Mehvar，R.，J.Pharm.Pharmaceut.Sci.，2000，3，1：125-136；和Monfardini等，Bioconjugate Chemistry，1998，9：418-450)。
在这一方面，开发了一种用于将PEG链以位点特异性形式连接到蛋白的N-末端残基上的技术，并且在生长因子粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和趋化因子IL-8上得到了证实(Gaertner等，BioconjugateChemistry，1996，7，1：38-44)。这两种因子都被报导保留了其大部分活性。不过，对于被用作拮抗剂的药物来说，效力是特别重要的，如用作病毒感染的基于受体的抑制剂。因此，将PEG或其他水溶性聚合物连接到除了IL-8以外的趋化因子的N-末端残基上，特别是趋化因子拮抗剂上，可能不适合提供N-末端残基的敏感性及其对活性和效力的作用。公开的专利申请WO00/53223是大量趋化因子文献的大部分的代表，该文献报导了新型趋化因子，并且报导了可以制备拮抗剂，以及可以连接PEG或其它水溶性聚合物，但是缺乏连接在何处或连接何种类型的链的特异性，也没有与之相关的活性。
用野生型趋化因子作为治疗剂的另一个潜在缺陷是，它具有在高浓度下聚集的倾向，并且混杂结合并有差异地激活趋化因子受体(Murphy等，Pharmacological Rev.，2000，51，1：145-176，Rollins，BJ.，Blood，1997，90，3：909-928和Wells等，InflammationRes.，1999，48：353-362)。聚集会对制备造成问题，并且在某些场合下会加重病理学(Czaplewski等，J.Biol.Chem.，1999，274，23：16077-16084；Czaplewski等，“hMIP-1α的工程、生物学和临床开发”，1999，参见：Chemokinesin Disease：Biology and ClinicalResearch，Ed.C.A.Herbert，Humana Press Inc.，Totwa，NJ.；Trkola等，J.Virol.，1999，73，8：6370-6379；Appay等，J.Virol.，1999，274，39：27505-27512；Hunter等，Blood，1995，86，12：4400-4408；Lord等，Blood，1995，85，12：3412-3415；Lord等，Brit.J.Cancer.，1996，74：1017-1022)。混杂结合是趋化因子的一种特征，并且在某些治疗设计中可能是不理想的。不过，趋化因子很有可能用作治疗剂(Murphy等，Pharmacological Rev.，2000，51，1：145-176，Rollins，BJ.，Blood，1997，90，3：909-928和Wells等，Inflammation Res.，1999，48：353-362)。
尽管所述方法在某些场合下具有改善了的与拮抗剂相关的效力，在制备趋化因子拮抗剂时所遇到的一个挑战是要提高效力同时又要改善诸如药代动力学的其他药物特性。另外，需要发现用于制备强效趋化因子抑制剂的策略和方法，以及相应的趋化因子抑制剂化合物，及其在制备用于预防和/或治疗疾病的药品方面的用途。
因此，需要具有包括改善了的循环半衰期和希望的活性和效力在内的改善了的治疗特性的新型趋化因子和修饰过的趋化因子，特别是需要能发挥抑制或拮抗天然存在的趋化因子的活性的新型趋化因子和修饰过的趋化因子。还需要提供具有改善了的循环半衰期和改变了的受体活性和效力的趋化因子和修饰过的趋化因子。本发明满足了上述要求以及其他要求。
发明概述
本发明涉及聚合物修饰的生物活性合成趋化因子，特别是涉及N-和/或C-末端修饰的趋化因子，并且涉及用于生产所述趋化因子的方法和用途。本发明的N-末端修饰的生物活性合成趋化因子包括在其N-末端用脂族链和一个或多个氨基酸衍生物进行修饰的趋化因子多肽链。本发明的C-末端修饰的生物活性合成趋化因子包括在其C-末端用脂族链或多环修饰的趋化因子多肽链。本发明的N-和C-末端修饰的生物活性合成趋化因子还可以包括在N-和C-末端进行组合修饰。还提供了生产和使用本发明的生物活性趋化因子的方法。本发明的价值在于它提供了一种用于制备作为相应的天然存在的野生型趋化因子或其受体的强效拮抗剂的化合物的通用方法。
附图简述
图1A-1E表示用于制备本发明的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白的方法的示意图。
图2A-2C表示用于制备本发明的合成的生物活性蛋白的方法的示意图。
图3A-3B表示多片段连接方法的示意图，该方法包括三个或三个以上非重叠肽片段的化学连接，即至少有一个片段是相当于最终的全长连接产物的中间片段。
图4A-4C表示所得到的侧链硫醇的天然化学连接和化学修饰。
图5A-5B表示用于制备本发明的水溶性聚合物U-B-Polymer-J*的分支核心(B)和特殊的化学选择功能官能团(U)的固相方法。
图6A-6D表示用于制备本发明的优选的基本为非抗原性的水溶性聚酰胺-Polymer J*成分的固相方法，该成分用于随后与U-B核心连接。
图7表示用于偶联U-B成分和Polymer-J*成分以便制备结构式为U-B-Polymer-J*的本发明的优选合成聚合物结构的方法。
图8表示精确连接水溶性聚合物和一种肽片段，用于连接并生产本发明的生物活性合成蛋白的另一种方法。
图9是表示通过保守的半胱氨酸形式确定的四种类型天然存在的趋化因子及其相应的N-末端、N-环和C-末端区的通用结构的示意图，其中，“C”是半胱氨酸的单字母代码，而“X”表示除了半胱氨酸之外的任何氨基酸。
图10A-10D表示各种趋化因子多肽链的天然存在的氨基酸序列的例子，包括所述趋化因子的相应的N-末端、N-环和C-末端区。使用了20种遗传编码氨基酸的标准单字母氨基酸代码。
图11表示被命名为Rantes G1755-01的合成趋化因子，它是Rantes的聚合物修饰的类似物。
图12表示被命名为Rantes G1755的合成趋化因子，它是Rantes的聚合物修饰的类似物。
图13表示被命名为Rantes G1805的合成趋化因子，它是Rantes的聚合物修饰的类似物。
图14表示被命名为Rantes G1806的合成趋化因子，它是Rantes的聚合物修饰的类似物。
图15表示在还原性(R)和非还原性条件(N)下比较野生型Rantes和合成的趋化因子类似物Rantes G1806的相对分子量的代表性SDS-PAGE凝胶。相对分子量在每一块凝胶的左侧示出，它相当于在同一块凝胶上电泳的分子量标准。
图16表示比较以每毫升特定Rantes类似物的皮克重量为单位(pg/ml)的血浆浓度与以分钟为单位的时间的代表性药代动力学曲线。在该图中所示出的化合物是AOP-Rantes和Rantes G1755、G1806和G1805。
优选实施方案的说明：
本发明涉及生物活性合成趋化因子，特别是N-和/或C-末端修饰的趋化因子分子。本发明的新型生物分子合成趋化因子优选能抑制天然存在的趋化因子的活性，这种作用是通过合适的趋化因子生物测定确定的。所述分子可以通过拮抗与它结合的趋化因子受体的一种或多种特征(例如，抑制病毒感染、导致受体下调、导致受体内化)并因此“拮抗”受体返回到细胞表面的正常循环而发挥作用。对于其他生物学反应来说，所述分子可以起着受体拮抗剂的作用，例如，诱导钙流通，启动趋化性等。因此，本发明的生物活性合成趋化因子可以起着拮抗剂的作用(包括部分拮抗)，不过还可以起着激动剂的作用(包括部分激动)或这两种作用的混合。优选具有至少一种拮抗特性的分子，即拮抗与它结合的趋化因子受体的一种或多种生物学特性的能力(例如，阻断或部分阻断(1)病毒感染，(2)趋化性，(3)受体循环等)。所述分子可以通过结合(或涉及)而不激活趋化因子受体的方式起作用，或者可以通过其他方式起作用。
A.本发明的N-和C-末端修饰的生物活性合成趋化因子
本发明特别涉及能抑制相应的天然存在的趋化因子活性的生物活性合成趋化因子。所述分子优选具有N-和/或C-末端修饰。本发明的N-末端修饰的生物活性合成趋化因子包括在其N-末端用脂族链和一个或多个氨基酸衍生物修饰过的趋化因子多肽链。从N-末端到C-末端方向，本发明的N-末端修饰的生物活性合成趋化因子具有以下结构式：J1-X1-Z1-CHEMOKINE，其中：J1是脂族链；X1是包括该趋化因子多肽链的N-末端氨基酸序列的0个或多个氨基酸的间隔区；Z1是氨基酸衍生物；CHEMOKINE是所述趋化因子多肽链的其余的氨基酸序列；而连线“-”表示共价键。将所述化合物设计成兼顾到所述多肽链的N-末端区的全长。因此，根据疏水性脂族链的长度和所述氨基酸衍生物的位置，相对天然存在的趋化因子多肽链而言，所述N-末端拮抗剂可以在其N-末端包括一个或多个取代、插入或缺失。
本发明C-末端修饰的生物活性合成趋化因子包括在其C-末端用脂族链或多环修饰的趋化因子多肽链。从N-末端到C-末端方向，该化合物具有以下结构式：CHEMOKINE-X2-J2，其中：X2是包括该趋化因子多肽链的C-末端氨基酸序列的0个或多个氨基酸的间隔区；J2是脂族链或多环；CHEMOKINE是所述趋化因子多肽链的其余的氨基酸序列；而连线“-”表示共价键。可以对趋化因子的C-末端区进行实质性修饰，包括插入、缺失或添加一个或多个氨基酸或其他化学成分，以便与相应的野生型分子相比延长该多肽链的C-末端，以及添加荧光标记和生物相容的聚合物，并且与诸如小的有机分子、肽、和蛋白之类的其他化合物结合。
本发明的N-和C-末端修饰的生物活性合成趋化因子可以包括同时在N-和C-末端区进行的修饰，在具体提到这些修饰时，可将其命名为N-和C-末端修饰的生物活性合成趋化因子。这种化合物具有以下结构式：J1-X1-Z1-CHEMOKINE-X2-J2，其中，J1、X1、Z1、CHEMOKINE、X2、J2和“-”的定义如上文所述。根据特定的最终用途，所述化合物以协同方式组合了N-和C-末端修饰的优点。
“趋化因子多肽链”表示与天然存在的野生型趋化因子的多肽链基本上同源的多肽链。“N-末端氨基酸序列”表示所述趋化因子多肽链的靠近天然存在的趋化因子多肽链的第一个二硫键形成半胱氨酸并且位于其N-端的氨基酸序列。“C-末端氨基酸序列”表示所述趋化因子多肽链的靠近天然存在的趋化因子多肽链的最后一个二硫键形成半胱氨酸，并且位于其C-端的氨基酸序列。所述趋化因子多肽链、N-末端氨基酸序列、C-末端氨基酸序列和第一个和最后一个二硫键形成半胱氨酸，构成了本发明的生物活性合成趋化因子基础，并可以根据相应的天然存在的趋化因子的氨基酸序列，以及通过与同一种类的其他趋化因子进行同源性模拟，如比较被称为C、CC、CXC和CXXXC趋化因子的氨基酸序列而方便地推测。
例如，下面是已知的天然存在的趋化因子的例子，其中的很多业已用不同的名称披露过，并因此出现了若干次：6Ckine，9E3，ATAC，ABCD-1，ACT-2，ALP，AMAC-1，AMCF-1，AMCF-2，AIF，ANAP，Angie，β-R1，β-血小板球蛋白，BCA-1，BLC，blr-1配体，BRAK，C10，CCF18，Ck-β-6，Ck-β-8，Ck-β-8-1，Ck-β-10，Ck-β-11，cCAF，CFF-4，CINC，C7，CKA-3，CRG-2，CRG-10，CTAP-3，DC-CK1，ELC，Eotaxin，Eotaxin-2，Exodus-1，Exodus-2，ECIP-1，ENA-78，EDNAP，ENAP，FIC，FDNCF，FINAP，Fractalkine，G26，GDCF，GOS-19-1，GOS-19-2，GOS-19-3，GCF，GCP-2，类GCP-2，GRO1，GRO2，GRO3，GROα，GROβ，GROγ，H400，HC-11，HC-14，HC-21，HCC-1，HCC-2，HCC-3，HCC-4，H174，肝素中和蛋白，Humig，I-309，ILINCK，I-TAC，Ifi10，IL8，IP-9，IP-10，IRH，JE，KC，Lymphotactin，L2G25B，LAG-1，LARC，LCC-1，LD78α，LD78β，LD78γ，LDCF，LEC，Lkn-1，LMC，LAI，LCF，LA-PF4，LDGF，LDNAP，LIF，LIX，LUCT，Lungkine，LYNAP，Manchester抑制剂，MARC，MCAF，MCP-1，MCP-2，MCP-3，MCP-4，MCP-5，MDC，MIP-1α，MIP-1β，MIP-1δ，MIP-1γ，MIP-3，MIP-3α，MIP-3β，MIP-4，MIP-5，Monotactin-1，MPIF-1，MPIF-2，MRP-1，MRP-2，M119，MDNAP，MDNCF，巨核细胞刺激因子，MGSA，Mig，MIP-2，mob-1，MOC，MONAP，NC28，NCC-1，NCC-2，NCC-3，NCC-4N51，NAF，NAP-1，NAP-2，NAP-3，NAP-4，NAPS，NCF，NCP，Neurotactin，制癌蛋白A，P16，P500，PARC，pAT464，pAT744，PBP，类PBP，PBSF，PF4，类PF4，PF4-ALT，PF4V1，PLF，PPBP，RANTES，SCM-1α，SCI，SCY A26，SLC，SMC-CF，ST38，STCP-1，SDF-1α，SDF-1β，TARC，TCA-3，TCA-4，TDCF，TECK，TSG-8，TY5，TCF，TLSFα，TLSFβ，TPAR-1，TSG-1。
通过说明，而不是通过限定的方式，在图10A-10D中示出了上述某些野生型趋化因子多肽链及其相应的A-末端、N-环和C-末端氨基酸序列的例子。可以理解的是，其他的趋化因子多肽链是已知的，并且可以从很多不同的来源获得，包括公众可以进入的数据库，如基因组数据库(约翰霍普金斯大学，马里兰州，美国)，蛋白数据库(Brookhaven国家实验室&Rutgers大学，新泽西，美国)，Entrez(国家健康研究所，马里兰)，NRL3D(匹茨堡超级计算中心，卡耐基梅隆大学，宾夕法尼亚州，美国)，CATH(University College London，London，UK)，NIH Gopher Server(NIH，马里兰州，美国)，ProLink(波士顿大学，马萨诸塞州，美国)，核酸数据库(Rutgers大学，新泽西州，美国)，GenBank(国家医学图书馆，马里兰州，美国)，Expasy(瑞士生物信息研究所，日内瓦，瑞士)等。另外，通过本领域公知的标准技术进行同源性和模式比较，可以鉴定新的趋化因子，如由各种基因和蛋白测序程序产生的趋化因子，包括用于实现该目的的数据库和相关的工具。
在本发明的一种实施方案中，可以用诸如噬菌体展示或模块混排的定向进化技术制备具有较高的受体特异性的趋化因子。业已披露了在治疗和预防HIV中利用噬菌体展示测定趋化因子衍生物或类似物结合趋化因子受体的能力(US6214540；DeVico等)。业已将噬菌体展示用于检测或鉴定CXC趋化因子受体3(CXCR3)的受体蛋白配体、抑制剂或启动子(US6140064，Loetscher等)，其特征是能选择性结合一种或多种具有诱导细胞应答能力的趋化因子(US6184358，Loetscher等)。业已披露了噬菌体展示在标记和筛选分子(US6180336，Osbourn等)，标记并且随后纯化特异抗原的结合分子(例如，参见WO92/01047)，以及在确定用于预防和治疗HIV感染和免疫疾病的肽组合物(US6090388，Wang)方面的用途。
业已披露了与G蛋白偶联的受体相关的噬菌体展示方法(例如，参见Doorbar，J.等，“通过噬菌体展示分离拮抗凝血酶受体的肽”，J.Mol.Biol.244：361-9，1994)，具有用于在N-环区进行定向进化的优选区域(Konigs，C，“对噬菌体展示随机肽文库进行双单克隆抗体筛选发现了趋化因子受体CCR5的模拟表位：与所述受体的三级结构以及HIV-1gp120的N-末端结合位点相关”，Eur.J.Immunol.，2000，Apr；30，4：1162-71；Sidhu，S.S.等，“大型蛋白在用于功能性选择筛选的噬菌体上的高拷贝展示”，J.Mol.Biol.2000，Feb，18；296，2；487-95；Fielding，A.K.等，“超融合长臂猿白血病外被糖蛋白：通过配体展示对细胞毒性基因进行定向”，Hum Gene Ther，2000，Apr，10；11，6：817-26)，位于N-环和C-末端之间的部分，以及C-末端(Cain，S.A.等，“从完整分子随机突变的C5a文库中筛选新型配体”，Protein Eng，2001，Mar；14，3：189-93；Heller，T.等，“从噬菌体文库中筛选能减轻免疫复合疾病和缺血性/在灌注损伤的炎症反应的C5a受体拮抗剂”，J.Immunol.1999，Jul，15；163，2：985-94；Chang，C.等，“用组合的肽文库剖析LXXLL核受体共激活物相互作用：雌激素受体α和β的肽拮抗剂的发现”，Mol Cell Biol1999，Dec；19，2：8226-39)。
J1和J2的合适的疏水性脂族链包括，但不限于长度为5(C5)-22(C22)个碳原子的疏水性脂族链。所述链可以是不饱和的和/或不分支的，或者可以具有不同程度的饱和和/或分支。所述疏水性脂族链的通式为Cn(Rm)-，其中，Cn是碳原子的数量，而Rm是选自氢、烷基、酰基、芳族基团或其组合的取代基的数量，n和m可以相同或不同。J1和J2基团可以通过任何合适的共价键与X1、X2连接或与所述趋化因子多肽链连接。合适共价键的例子包括，但不限于：酰胺、酮、醛、酯、醚、硫醚、硫酯、噻唑烷(thiozolidine)，肟、噁唑烷(oxizolidine)，席夫碱和席夫碱类键(例如，酰肼)。所述键可以包括但不限于：
-C(O)-NH-(CH2)-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)-NH-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)x-NH-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；
-NH-(CH2)-C(O)-；-NH-(CH2)x-C(O)-；-NH-(CH2)-NH-C(O)-；-NH-(CH2)x-NH-C(O)-；-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-NH-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-NH-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-NH-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-NH-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-NH-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；
-ONH-C(O)-；-ONH-(CH2)-C(O)-；-ONH-(CH2)x-C(O)-；-ONH-(CH2)-NH-C(O)-；-ONH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-ONH-(CH2)x-NH-C(O)-；-ONH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-ONH-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-ONH-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-ONH-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-ONH-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-ONH-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；
-OCH2-C(O)-；-OCH2-(CH2)-C(O)-；-OCH2-(CH2)x-C(O)-；-OCH2-(CH2)-NH-C(O)-；-OCH2-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-OCH2-(CH2)x-NH-C(O)-；-OCH2-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-OCH2-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-OCH2-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-OCH2-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-OCH2-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-OCH2-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-OCH2-NH-C(O)-；-OCH2-NH-(CH2)-C(O)-；-OCH2-NH-(CH2)x-C(O)-；-OCH2-NH-(CH2)-NH-C(O)-；-OCH2-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-OCH2-NH-(CH2)x-NH-C(O)-；-OCH2-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-OCH2-NH-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-OCH2-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-OCH2-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-OCH2-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-OCH2-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；
-O-C(O)-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)x-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-NH-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)x-NH-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-O-C(O)-NH-C(O)-；-O-C(O)-NH-(CH2)-C(O)-；-O-C(O)-NH-(CH2)x-C(O)-；-O-C(O)-NH-(CH2)-NH-C(O)-；-O-C(O)-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-O-C(O)-NH-(CH2)x-NH-C(O)-；-O-C-(O)-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-O-C(O)-NH-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；
-CH＝CH-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)x-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-NH-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)x-NH-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；
-SCH2-N(CH3)-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-
-S-C(O)-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)x-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-NH-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)x-NH-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-S-C(O)-NH-C(O)-；-S-C(O)-NH-(CH2)-C(O)-；-S-C(O)-NH-(CH2)x-C(O)-；-S-C(O)-NH-(CH2)-NH-C(O)-；-S-C(O)-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-S-C(O)-NH-(CH2)x-NH-C(O)-；-S-C(O)-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-S-C(O)-NH-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-C3H6SN-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)x-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)x-NH-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-C3H6SN-NH-C(O)-；-C3H6SN-NH-(CH2)-C(O)-；-C3H6SN-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6SN-NH-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6SN-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6SN-NH-(CH2)x-NH-C(O)-；-C3H6SN-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-C3H6SN-NH-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；
-C3H6ON-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)x-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)x-NH-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-C3H6ON-NH-C(O)-；-C3H6ON-NH-(CH2)-C(O)-；-C3H6ON-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6ON-NH-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6ON-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6ON-NH-(CH2)x-NH-C(O)-；-C3H6ON-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-C3H6ON-NH-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-O-C(O)-；-C(O)-，或共价键，其中，x和y是2、3、4或更大，并且可以相同或不同。
适合键体系的化学方法是众所周知的，并可用于本发明(例如，参见“蛋白结合和交联的化学方法”，S.S.Wong，Ed.，CRC Press，Inc.，1993；Perspectives in Bioconjugate Chemistry，ClaudeF.Modres，Ed.，ACS，1993)。
除了将J1和J2连接到X1、X2或趋化因子多肽链上之外，还可选择所采用的键体系，以便调节靶分子的物理-化学和/或生物学特性，其前提是所得到的分子保留其拮抗剂特性。例如，这一目的可以通过以下方式实现：掺入在一种类型的条件下比另一种条件下更稳定(或更不稳定)的键体系调节半衰期等，或掺入具有不同长度、刚性、电荷和/或手性的键体系调节效力、特异性等。将烃链与趋化因子多肽链连接在一起的键单位可以有很大不同，其前提是J1和/或J2之间的总体长度和空间填充最优选近似于天然存在的趋化因子。
在一种优选实施方案中，所述疏水性脂族链J1是长度为5个(C5)-10个(C10)碳原子的烃链，而所述疏水性脂族链J2是长度为12个(C12)-20个(C20)碳原子的脂类。J1 C5-C10烃链的例子包括，但不限于：-C5H11，-C5H9，-C5H7，-C5H5，-C5H3，-C6H13，-C6H11，-C6H9，-C6H7，-C6H5，-C6H3，-C7H15，-C7H13，-C7H11，-C7H9，-C7H7，-C7H5，-C7H3，-C8H17，-C8H15，-C8H13，-C8H11，-C8H9，-C8H7，-C8H5，-C8H3，-C9H19，-C9H17，-C9H15，-C9H13，-C9H11，-C9H9，-C9H7，-C9H5，-C9H3，-C10H21，-C10H19，-C10H17，-C10H15，-C10H13，-C10H11，-C10H9，-C10H7，-C10H5，和-C10H3。
合适的J2脂类包括，但不限于脂肪酸衍生的脂类和多环甾族化合物衍生的脂类。脂肪酸包括，但不限于饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸。饱和脂肪酸的例子有月桂酸(C12)，豆蔻酸(C14)，棕榈酸(C16)，硬脂酸(C18)和花生酸(C20)。不饱和脂肪酸的例子包括油酸(C18)，亚油酸(C18)、亚麻酸(C18)、桐油酸(C18)、和花生四烯酸(C20)。多环类包括，但不限于：醛甾酮、胆甾烷醇、胆甾醇、胆酸、粪甾醇、皮质甾醇、可的松、脱氢胆甾醇、去氢胆固醇、毛地黄毒苷配基、麦角甾醇、雌二醇、羟基皮质甾醇、lathosterol，强的松、孕烯诺龙、黄体酮、睾酮、酵母甾醇等。所述脂肪酸通常是通过酸成分与所述趋化因子多肽链连接，因此产生了酰基连接的部分，不过也可以采用其他键。将烃链连接在趋化因子多肽链上的键单位可以有很大不同，其前提是填充所述N-末端区的总体长度和空间填充近似于天然存在的趋化因子。在这一方面，业已发现C-末端区更灵活一些，因此，与N-末端区相比总体长度和空间填充可以有更大程度的波动。
在另一种优选实施方案中，包括在本发明的生物活性合成趋化因子中的J1和J2成分包括C5-C20饱和的或不饱和的酰基链，如壬酰基、壬烯酰基、氨基氧戊烷、十二酰基、豆蔻酰基、棕榈酸、月桂基、棕榈酰基、二十酰基、油酰基、或胆酰基。例如，所述J1取代基可以是壬酰基或氨基氧戊烷，而J2取代基可以是饱和的或不饱和的脂肪酸，优选C12-C20脂肪酸，或诸如胆甾醇的多环甾族脂类。
根据所述疏水性脂族链的性质和长度，本发明的生物活性合成趋化因子可以包括添加在所述多肽链上的，特别是添加在C-末端上的额外的氨基酸或其他成分，以便提供用于疏水性脂族成分的间隔基团和/或各自的连接位点。
“氨基酸衍生物”表示除了20种遗传编码的天然存在的氨基酸以外的氨基酸或氨基酸样化学。具体地讲，氨基酸衍生物Z1是除了20种遗传编码的天然存在的氨基酸以外的氨基酸，并且具有结构式-(N-CnR-CO)-，其中，Cn是1-22个碳，R是氢、烷基或芳族基团，其中N和Cn，N和R，或Cn和R可以形成环状结构。另外，N、Cn和R根据所述氨基酸衍生物在其还原形式下可以各自具有一个或多个氢。所述烷基部分可以是取代的或未取代的，它可以是线性的、支化的、或环状的，并且可以包括一个或多个杂原子。所述芳族基团可以是取代的或未取代的，并且包括一个或多个杂原子。所述氨基酸衍生物可以是从头制备的，或者从商业来源获得(例如，参见Calbiochem-Novabiochem AG，Switzerland；Advanced Chemtech，Louisville，KY，USA；Lancaster Synthesis，Inc.，Windham，NH，USA；BachemCalifornia，Inc.，Torrance，CA，USA；Genzyme Corp.，Cambridge，MA，USA)。氨基酸衍生物的例子包括，但不限于氨基异丁酸(Aib)，羟基脯氨酸(Hyp)，1，2，3，4-四氢异喹啉-3-COOH(Tic)，二氢吲哚-2-羧酸(indol)，4-二氟脯氨酸(P(4，4DiF))，L-噻唑烷-4-羧酸(Thz)，L-高脯氨酸(HoP)，3，4-脱氢脯氨酸(ΔPro)，3，4-二羟基苯丙氨酸(F(3，4-DiOH))，pBz1-3，4-二羟基苯丙氨酸(F(3，4-DiOH)，pBzl)，二苯酮(p-Bz)，环己基丙氨酸(Cha)，3-(2-萘基)-丙氨酸(βNal)，环己基甘氨酸(Chg)，和苯基甘氨酸(Phg)。
就X1，CHEMOKINE和X2而言，所述成分的氨基酸序列与相应的天然存在的野生型分子基本同源。本文所使用的术语“基本同源”包括与特定序列具有至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的序列同源性的氨基酸序列(优选95-99％)。该术语可以包括，但不限于相对特定序列而言具有1-20，1-10或1-5个单一氨基酸缺失、插入或取代的氨基酸序列，只要所得到的多肽能起着相应的天然存在的趋化因子拮抗剂的作用就行。
例如，本领域众所周知的是，某些氨基酸可以用其他氨基酸所取代，而又不会导致多肽特征的明显改变，包括但不限于氨基酸的保守性取代。所述可能性属于本发明的范围。还应当指出的是，还可以进行不会明显改变多肽特征的氨基酸缺失或插入。本发明包括这样的缺失或插入(例如，缺失或插入的部分最多可达相应天然存在的趋化因子的特异拮抗剂序列长度的10、20或50％)。另外，还可以对趋化因子进行实质性修饰，包括混合和匹配不同的趋化因子多肽片段，以便产生额外的多样性，如在WO99/11655中所披露的模块‘交换’合成方法，该文献被以全文形式收作本文参考。
除了N-和/或C-末端的改变之外，本发明的生物活性合成趋化因子还可以包括出现在该多肽链上其他位点的一个或多个氨基酸取代、插入或缺失，即在上述结构式中用CHEMOLINE表示的多肽链。在一种优选实施方案中，对所述趋化因子的N-环进行改变，以便提高其对靶受体的特异性/选择性。这样，本发明的生物活性合成趋化因子的N-环能抑制一种特定受体，同时降低对其他可能的共同受体的拮抗作用。“N-环”表示相邻于构成一种特定趋化因子多肽链的N-末端区的第一个保守半胱氨酸模式并在其C-端的20-26个氨基酸序列区(参见图9和10A-10D)。例如，从该趋化因子多肽链的N-末端到C-末端方向，CC趋化因子的N-环相邻于第一个和第二个保守的半胱氨酸并在其C-端，并且相邻于/第三个保守的半胱氨酸并在其N-末端，并且位于这两者之间的氨基酸序列区。
在另一种实施方案中，所述取代和插入可以包括天然氨基酸以及氨基酸衍生物或用一种聚合物修饰过的氨基酸。聚合物结合的优选位置位于趋化因子的C-末端部分。对于具有天然糖基化位点的趋化因子来说，聚合物可以连接在为了糖基化而编码的一个或多个氨基酸上，例如，N-连接的糖基化位点的精氨酸。所述聚合物可以连接在天然存在的氨基酸、取代天然存在的氨基酸的氨基酸衍生物的侧链上，或连接在与靶糖基化位点上的氨基酸侧链连接的碳水化合物或其他成分上。适合上述目的的聚合物是生物相容性的，就是说它们对生物学系统来说是无毒的，并且其中很多种这样的聚合物是已知的。所述聚合物在性质上可以是疏水性的或亲水性的，可生物降解的，不可生物降解的，或其组合。所述聚合物包括，但不限于天然聚合物，如胶原、明胶、纤维素、透明质酸、多糖、和聚氨基酸，以及合成的聚合物，如聚酯、聚原酸酯、和聚酐等。疏水性不可生物降解的聚合物的例子包括聚二甲基硅氧烷，聚氨基甲酸酯，聚四氟乙烯，聚乙烯，聚氯乙烯，和聚异丁烯酸甲酯。亲水性不可生物降解的聚合物的例子包括聚(2-异丁烯酸羟基乙酯)，聚乙烯醇，聚(N-乙烯吡咯烷酮)，聚亚烷基，聚丙烯酰胺，及其共聚物。优选的聚合物包括具有以下结构式的环氧乙烷的系列重复单位：-(CH2-CH2-O-)n-，其中，n＝环氧乙烷单位的数量，优选的含有环氧乙烷的聚合物的例子有聚乙二醇(PEG)，和聚酰胺环氧乙烷，如在下文和WO00/12587中所分别披露的。
例如，基于PEG的链是两亲性的，非免疫原性的，并且不易被蛋白水解酶裂解。由PEG或基于PEG的链修饰过的材料制剂具有较低的免疫原性和抗原性。例如，参见Abuchowski等，J.Biol.Chem.，1977，252，11：3578-3581；Tsutsumi等，Jpn.J.Cancer Res.，1994，85：9-12；聚乙二醇化学和生物学应用，ACS Symposium Series680，J.M.Harris和S.Zalipsky，Eds.，American Chemical Society，1997；和聚乙二醇化学、生物技术和生物医学应用，Topics in AppliedChemstry，J.M.Harris，Ed.，Plenum Press，New York，NY，1992)。PEG还可起到增加与它连接的材料的分子大小的作用，从而延长其生物学半衰期。PEG修饰过的材料的这种有利特征使得它非常适用于多种治疗用途。因此，本发明还涉及改善本发明多肽的药代动力学，包括在有可能使得该蛋白保留其内在的生物学活性的位点上对所述多肽进行修饰或“聚乙二醇化”。所述位点包括，但不限于所述多肽的C-末端。将PEG链或以PEG为基础的链接枝到蛋白上的技术是已知的。例如，参见Zalipsky，US5122614，该专利披露了被转化成它的N-琥珀酰亚胺碳酸酯衍生物的PEG。还已知用活性基团对PEG链进行修饰，以便有利于接枝到蛋白上。例如，参见Harris，US5739208，该专利披露了用一种砜成分激活的PEG衍生物，它用于选择性地连接到分子和表面上的硫醇部分上，以及Harris等US5672662，该专利披露了具有单一的丙酸或丁酸部分的PEG酸的活性酯。Zalipsky对这方面作了广泛的综述，见Bioconjugate Chemistry，1995，6：150-165。除了使用PEG之外，Wright在EP0605963A2中披露了含有水溶性聚合物的连接试剂，它能与蛋白上的醛基形成腙键。上面所述、提到的所有参考文献都被收作本文参考。
B.本发明生物活性合成趋化因子的聚合物修饰
本发明还涉及业已通过聚合物加合物修饰过的生物活性合成趋化因子，并且涉及其生产方法和用途。本发明特别涉及在其N-末端区具有一个或多个残基改变的这样的合成趋化因子。具有这样的改变的修饰过的趋化因子通常是其相应受体的强效拮抗剂。一般，迄今为止所发现的最有效的改变是疏水性质的，例如，对每一种主要类型的趋化因子N-末端的甲硫氨酸(Met-)、氨基氧戊烷(AOP-)和壬酰基(NNY-)修饰；效力的进一步提高可以通过用氨基酸或疏水衍生物(例如，CC趋化因子，如Rantes，MCP，和MIP和CXC趋化因子，如SDF1和IL-8)取代N-末端区的野生型氨基酸进一步提高效力(参见美国专利申请流水号60/217683，该专利以全文形式收作本文参考)。另外，向趋化因子的C-末端区导入疏水性修饰，能进一步提高效力，这进一步支持了N-和C-末端区的疏水性影响效力的观点(参见美国专利申请流水号60/217683)。因此，连接水溶性聚合物预计一般能显著降低甚至是破坏所述趋化因子的理想的拮抗活性，特别是下调所述聚合物修饰的趋化因子所结合的相应受体，其前提是，所述下调可以通过增强特定趋化因子的N-和C-末端的疏水性而增强。Zalipsdy，S.(BioconjugateChemistry，1995，6：150-165)，Mehvar，R.(J.Pharm.Pharmaceut.Sci.，2000，3，1：125-136)和Monfardini等(Bioconjugate Chem.，1998，9：418-450)对各种水溶性聚合物，其与肽和蛋白的连接以及生物学作用进行了综述。
本发明的一个方面基于以下发现：水溶性聚合物与生物活性合成趋化因子的连接不会像上述一般理论所预测的那样影响其效力，相反，其效力和受体特异性可以根据结合位点、所连接的聚合物的性质以及要定向进行聚合物修饰的前体趋化因子而进行控制。本发明还基于以下发现：通过系统地改善所希望的拮抗特性和循环半衰期之间的平衡，可以提高生物活性合成趋化因子的效力。这种优化涉及三成分过程，当这些成分被成功地组合在一起时能产生具有进一步提高了的效力和循环半衰期的合成趋化因子。该方法通常适用于所有趋化因子，每一种成分同样具有用于制备生物活性合成趋化因子的通用性，并且具有体外下调与合成趋化因子结合的相应趋化因子受体的生物活性。在本文中，“下调趋化因子受体”表示导致一种趋化因子受体的正常基本活性的减弱，其特征是在它与趋化因子或趋化因子类似物结合之后会表现出钙信号传递、白血细胞趋化性和病毒感染中的一种或多种；可以包括从细胞表面清除受体的延长或增强。
第一种成分涉及用一种感兴趣的水溶性聚合物对前体生物活性合成趋化因子的一个或多个位点进行精确修饰，这种修饰保留了所述前体生物活性合成趋化因子的体外生物学活性。体外生物学活性是用于评估个各趋化因子功能的良好标准和标准测定，对于这种目的来说是众所周知的(例如，参见Cytokine Reference，Vol.1，Ligands，Acompendium of cytokines and other mediators of host defenseEds.J.J.Oppendheim and M.Feldmann，Acedemic Press，2001；和Cytokine Reference，Vol.2，Receptors，A compendium of cytokinesand other mediators of host defense Eds.J.J.Oppendheim andM.Feldmann，Acedemic Press，2001)。优选的连接位点选自相当于C-末端位点，聚集位点、糖基化位点、和糖胺聚糖(GAG)结合位点的前体趋化因子的残基。Kuschert等(Biochem.，1999，38：12959-12968)、Koppman等(J.Immunol.，1999，163：2120-2127)和Proudfoot等(J.Biol.Chem.，2001，276，14：10620-10626)报导了GAG结合和趋化因子。
第二种成分涉及被连接的聚合物的性质，它优选具有结构式U-B-Polymer-J，其中，U是连接在蛋白上的官能团，B是具有三个或三个以上臂，并且可以存在或缺乏的支化核心，Polymer是基本上无抗原性的水溶性聚合物，其分子量等于或大于1000Da，而J是侧基，它在生理学条件下具有选自负的、中性的或正的理想净电荷。
针对本发明聚合物修饰的生物活性合成趋化因子的一种意外发现是，小到大约1000-1500Da的水溶性聚合物结构就足于将所述前体趋化因子的血清循环半衰期提高大约10倍。另一个意外发现是，小的线性聚合物结构和更大的支化聚合物结构在连接到相同位点上时，可能对效力和受体下调具有相似的作用。另一个发现是，所述聚合物结构上的侧基J的性质和数量，可能影响所述具有生物活性的合成的聚合物修饰的趋化因子的下调和受体特异性。
例如，使用具有多个可离子化侧基J的支化聚合物结构，能通过设计改变GAG和受体结合。举例来说，类似于RANTES的合成趋化因子其中的支化聚合物具有带负电荷的基团(在生理学条件下)，偏向结合CCR5，CCR5具有呈中性的净电表面，与CCR1相反，后者具有负的净电表面。因此，具有包括多个带负电荷的侧基J的水溶性聚合物的聚合物修饰过的生物活性合成Rantes可以与具有净的中性或净的正电表面的受体优先相互作用。类似地，由于GAGs通常具有净的负电荷，可以对与它的相互作用进行处理。当然，如上文所述，可以利用所述聚合物的连接位点根据感兴趣的生物活性合成聚合物修饰的趋化因子的特定最终用途微调受体元件和GAG结合。
第三种成分涉及制备具有最佳体外生物活性的聚合物修饰过的生物活性合成趋化因子，其特征是下调与它结合的趋化因子受体。其中包括选择前体趋化因子(即选择用于在它上面连接水溶性聚合物的天然或修饰过的趋化因子)，该前体趋化因子的效力比聚合物修饰的生物活性合成趋化因子的理想效力范围高大约1-5倍，优选大约5-10倍或更高(通过在基于体外细胞的相关测定中测定)。业已发现所述前体趋化因子的选择，能产生表现出效力和体内血清循环半衰期之间的理想平衡的聚合物修饰过的生物活性合成趋化因子。术语“EC50”表示能引起位于剂量反应(或浓度反应)曲线上的本底和最大反应之间的一半的化合物浓度。例如，EC50可以作为效力指标，其中，所测定的特定反应的较小的EC50表示与具有较高EC50的化合物相比更有效的化合物。EC50通常又被称作ED50或IC50，对于病毒感染来说，它是能抑制病毒产量的50％，病毒感染性的50％，或病毒诱导的细胞病变效应的50％的有效浓度。
可以理解的是，提供了合成趋化因子，它可以来源于所述每一种成分(即聚合物结合位点、聚合物的性质、和用于聚合物修饰的前体趋化因子的选择)本身或组合。所述聚合物连接位点还可以重叠或者是相同，例如，聚集位点和GAG位点是相邻的，或者位于相同的位点。另外，提供了在它上面结合了两种或两种以上聚合物的合成趋化因子。例如，本发明还包括生物活性合成趋化因子，它包括一个趋化因子多肽链，和连接在选自GAG位点的第一位点和选自聚合位点和C-末端位点的第二位点上的水溶性聚合物。本发明的这一方面使得人们特别是能够提高分子量和水溶性(因此改善由水溶性聚合物所提供的循环半衰期和其他的特征)，同时消除了不理想的特征，如在聚合物连接位点上的聚集和特定类型的GAG结合。
1.聚合物连接位点
本发明的优选生物活性合成趋化因子可以通过用一种感兴趣的水溶性聚合物在选自C-末端位点、聚集位点、糖基化位点和GAG结合位点的一个或多个位点的残基上对本发明的生物活性合成趋化因子蛋白进行精确修饰制备而成。这些位点上的残基可用于连接，只要它们具有适合聚合物连接的侧链就行(即具有一种官能团的氨基酸侧链，例如，赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、脯氨酸等)。另外，上述位点上的残基可以用具有适合聚合物连接的侧链的不同氨基酸取代。另外，可以对所述遗传编码氨基酸的侧链进行化学修饰，以便用于聚合物连接，或者可以使用具有合适侧链官能团的非天然氨基酸。连接的优选方法采用肽合成和化学连接的组合。
本发明的所述生物活性合成趋化因子优选是通过氨基酸残基的缩合而合成的。所述氨基酸残基可以是核酸编码的，核糖体安装的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在一种实施方案中，为本发明生物活性合成趋化因子的特定位点选择的氨基酸序列可以是天然的，或者出现在所述蛋白序列的所述位置上的天然存在的氨基酸。在另一种实施方案中，所述选择的氨基酸序列可以由这样的多肽片段组成或由这样的多肽片段构建：它可以含有一个代替位于存在于所述蛋白的天然序列上的氨基酸残基的N-末端半胱氨酸残基。由于包括所述残基，使得能够利用天然化学连接、肽合成和/或汇集合成的原理和方法，将所述多肽连接到另一种多肽上(修饰成含有一种羧基硫酯基团)(参见美国专利申请流水号60/231339，60/236377和09/097094，以上所有文献被收作本文参考)，以上原理优选被用于合成本发明的生物活性合成趋化因子。
在另一种实施方案中，本发明的合成生物活性蛋白可以包括“不规则的”氨基酸残基。在本文中，术语“不规则的氨基酸残基”表示不是由RNA编码的，并且不是由核糖体安装的氨基酸。就此而言，本发明在设计和/或构建合成的生物活性蛋白方面具有广泛的可选择性和灵活性。可用于本发明中的非核糖体安装的氨基酸的例子包括D-氨基酸、β-氨基酸、假谷氨酸、γ-氨基丁酸、鸟氨酸、高半胱氨酸、N-取代的氨基酸(R.Simon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1992，89：9367-71；WO91/19735(Bartlett等)，US5646285(Baindur))，α-氨基亚甲基氧乙酸(氨基酸-Gly二肽等排物)，和α-氨基氧酸等。可以使用含有硫酰胺、插烯酰胺、肼基、亚甲基氧、硫代亚甲基、亚磷酰胺、羟基酰胺、羟基亚乙基、还原的酰胺和取代的还原酰胺等排物和β-氨磺酰的肽类似物。
具体地讲，使用假天然化学连接是有利的，因为R链修饰可以将聚合物加合物连接到合成的蛋白上。同样，可以使用N-末端Nα-取代的2或3碳链烷基或芳基硫醇氨基酸。根据本文所披露的延伸的天然化学连接的方法，可将所述残基(其中存在于多肽的末端)优选用于将所述多肽连接到具有羧基硫酯部分的多肽上。
肽合成优选是基于在二十世纪六十年代早期开发的“Merrifield”-化学逐步固相肽合成方法，用标准自动化肽合成仪进行的。肽连接步骤可以采用固相或液相连接方法。化学连接涉及到在第一种化学成分和第二种化学成分之间形成选择性的共价键。可以利用所述第一种和第二种成分上的独特的、相互作用的官能团使得所述连接反应具有化学选择性。例如，肽和多肽的化学连接包括相容的独特的、相互作用的、C-末端和N-末端氨基酸残基的肽或多肽片段的化学选择反应。
在一种实施方案中，所述合成生物活性蛋白的所有氨基酸残基可以通过肽键(即酰胺键)连接在一起，或者通过非酰胺键(如硫酯键、肟键、硫醚键、定向二硫键、噻唑烷键、成腙连接、成噁唑烷连接等)。将两个氨基酸残基(或两个肽的C-末端和N-末端)彼此连接在一起(Schnolzer，M.and Kent，S.B.H.，Science，1992，256：221-225；Rose，K.J.Amer.Chem Soc.，1994，116：30-33；Englebretsen，D.R.等，Tetrahedron Lett.36：8871-8874；Baca，M.等，J.Amer.Chem.Soc.，1995，117：1881-1887；Liu，C.F.等，J.Amer.Chem.Soc.1994，116：4149-4153；Liu，C.F.等，J.Amer.Chem.Soc.1996，118：307-312；Dawson，P.E.等，1994，Science 266：766-779；Gaertner等，Bioconj.Chem.1994，5，4：333-338；Zhang等，Proc.Natl.Acad.Sci.1998，95，16：9184-9189；Tam等，WO95/00846；US5589356)或采用其他方法(Yan，L.Z.和Dawson，P.E.，“通过天然化学连接与脱硫化组合合成没有半胱氨酸残基的肽和蛋白”，J.Amer.Chem.Soc.2001，123：526-533，被收作本文参考；Gieselnan等，Org.Lett.2001，3，9：1331-1334；Saxon，E.等，“Traceless”Staudinger Ligation for theChemoselective Synthesis of Amide Bonds.Org.Lett.，2000，2，2141-2143)，因此，本发明可以对多种肽键修饰、取代和等排性替换，以便用于制备生物活性蛋白。
当所述连接涉及到连接具有N-末端半胱氨酸残基的多肽时，优选使用天然化学连接方法(Dawson等，Science，1994，266：776-779；Kent等，WO96/34878；Kent等，WO98/28434)。业已证实该方法是用于在连接位点产生天然酰胺键的可靠方法。天然化学连接涉及到具有C-末端α羧基硫酯部分的第一种肽或多肽片段和具有N-末端半胱氨酸残基的第二种肽或多肽之间的化学选择性反应。硫醇交换反应产生了一种最初的硫酯连接的中间产物，这种产物能自动重排，以便在连接位点形成天然酰胺键，同时重新产生半胱氨酸侧链硫醇。在很多场合下，所述天然蛋白的序列包括适当定位的半胱氨酸残基，这样就可以合成具有N-末端半胱氨酸残基的多肽片段，并用于天然化学连接反应。在其他场合下，可以进行肽合成，以便为了上述目的而将半胱氨酸残基导入一种多肽。
不过，当为了在一种多肽的N-末端导入半胱氨酸残基而对天然蛋白序列进行修饰不方便或不理想时，可以用其N-末端业已被修饰成含有N-取代的，并且优选N α-取代的2或3碳链氨基烷基或芳基硫醇的多肽对天然化学连接方法进行延伸。所述“延伸的天然化学连接”披露于被收作本文参考的美国专利申请流水号60/231339和60/236377。
简单地讲，所述方法包括连接含有羧基硫酯，更优选α-羧基硫酯的第一种成分和含有酸稳定性N-取代的(优选Nα-取代的2或3碳链氨基烷基或芳基硫醇)的第二种成分。第一种成分的羧基硫酯和第二种成分的N-取代的2或3碳链氨基烷基或芳基硫醇的硫醇之间的化学选择性反应通过一种硫酯连接的中间产物进行，并且分解成最初的连接产物。更具体地讲，发生在COSR硫酯成分和氨基烷基硫醇成分之间的硫醇交换产生了一种硫酯连接的中间连接产物，该产物随后自动重排，根据氨基烷基硫醇成分是具有结构式I或II通过五员环或六员环中间产物产生酰胺连接的第一种连接产物：
J1-C(O)-N(C1(R1)-C2-SH)-J2                  I
J1-C(O)-N(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-J2       II其中，J1是具有一个或多个任选被保护的氨基酸侧链的肽或多肽，或这种肽或多肽的部分，聚合物，染料，适当官能化的表面，接头或可检测的标记，或与化学肽合成或延伸的天然化学连接相容的任何其他化学成分；R1、R2和R3分别表示与C1连接的H或电子供给基团；前提是，R1、R2和R3中的至少一种包括与C1连接的电子供给基团；和J2是具有一个或多个选任被保护的氨基酸侧链的肽或多肽，或诸如肽或多肽的部分，聚合物，染料，适当功能化的表面，接头或可检测的标记，或与化学肽合成或延伸的天然化学连接相容的任何其他化学成分。
可以在肽相容条件下将连接位点上的N-取代的2或3碳链烷基或芳基硫醇[HS-C2-C1(R1)-]或[HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]除去，而不破坏该产物，以便产生在连接位点具有天然酰胺键的具有结构式III的最终连接产物：
J1-C(O)-HN-J2                        III其中，J1、J2、R1、R2和R3的定义如上文所述。
选择R1、R2和R3基团，以便有利于在肽相容裂解条件下裂解N-C1键。例如，电子供给基团，特别是如果与C1连接时，可用于在C1上形成有利于裂解的共振稳定化阳离子。所述化学连接反应优选包括作为赋形剂的硫醇催化剂，并且是在中性pH条件下在水或混合的有机-水条件下进行的。第一种和第二种成分的化学连接可以通过五员环或六员环进行，它能自动进行重排，以便产生N-取代的酰胺连接的连接产物。其中，所述第一种和第二种成分是肽或多肽，N-取代的酰胺连接的连接产物具有结构式IV或V：
J1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-HS)-CH(Z2)-C(O)-J2               IV
J1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-HS)-CH(Z2)-C(O)-J2    V其中，J1、J2和R1、R2、R3的定义如上文所述，而Z2是氨基酸侧链或所述侧链的衍生物。
N-取代的酰胺键连接产物的结合的电子供给基团R1、R2或R3有利于裂解N-Cl键和从N-取代的酰胺连接的连接产物上除去2或3碳链烷基或芳基硫醇。在肽相容裂解条件下除去所述烷基或芳基硫醇链，产生在连接位点具有天然酰胺键的连接产物。当所述第一种和第二种成分是肽或多肽时，连接产物具有以下结构式：
J1-CONαH-CH(Z2)-C(O)-J2             VI
与C-末端位点连接的优点是，它能降低与大部分趋化因子的已知功能区的最大间隔而导致的活性的潜在损失。连接具有一个或多个聚集位点的趋化因子的优点是，所述水溶性聚合物能破坏聚集，同时又减少活性的潜在损失，并且改善处理/制剂化和体内效力。连接糖基化位点具有模拟正常存在于所述位点的糖链的正面影响的优点，同时通过在天然聚合物连接位点连接合成聚合物降低了活性的潜在损失。在糖基化位点进行聚合物修饰的另一个优点是，可以使用包括一种可裂解的接头的聚合物，以便以药物前体形式提供合成的趋化因子，特别是当糖基化位点位于或靠近N-末端药效团区时更是如此。与GAG结合位点连接的一个优点是，可以利用所述聚合物破坏该位点的GAG结合，并且在一些场合下破坏聚集，当所述位点重叠时，同时又降低了活性的潜在损失，通过减弱与具有GAG部分的不希望的表面结合提高循环半衰期，以及改善处理/制剂化和体内效力。另外，根据用于连接的水溶性，可以增强GAG结合，或增强特定类型的GAG的结合。当然，根据用于修饰的靶趋化物，用于聚合物连接的位点可能比其他位点更优选，例如，当所有趋化因子都具有C-末端区和一个或多个GAG结合位点时，并非所有的趋化因子都具有聚集位点和糖基化位点。
水溶性聚合物的连接是通过一种可生物降解的接头进行的，特别是位于蛋白的N-末端部分。所述修饰起着以前体(或药物前体)形式提供蛋白的作用，这种前体在接头降解之后，释放出没有聚合物修饰的蛋白。通过使用诸如酯键等可生物降解的键连接是众所周知的，并且在下文作更详细地说明。
a.C-末端位点
本发明的优选生物活性合成趋化因子具有连接在C-末端位点上的水溶性聚合物。“C-末端位点”表示趋化因子多肽链的一个残基，它在趋化因子的C-末端α螺旋的C-端。它包括具有游离的α-羧酸的C-末端侧基，以及与它相邻的残基。所有趋化因子的突出的二级结构特征是三链反平行β折叠，由它形成放置疏水性C-末端α螺旋的折叠平面。因此，C-末端α螺旋是趋化因子的便于识别的一致特征，识别方法为，例如，通过同源性模拟和比较识别，例如，通过比较已知趋化因子的一级序列和/或三维结构，或通过分子取代和能量最低化程序推测的结构(例如，参见Cytokine Reference，Vol.1，Ligands，Acompendium of cytokines and other mediators of host defenseEds.J.J.Oppendheim and M.Feldmann，Acedemic Press，2001)。
优选的C-末端位点是靠近聚合物修饰所针对的前体趋化因子的C-末端侧基的位点。例如用于Rantes类似物的位点。野生型Rantes的C-末端残基(1-68)是68号位置上的丝氨酸(即Ser68或S68)。水溶性聚合物与靠近诸如NNY-Rantes(2-68)的前体趋化因子的C-末端侧基的残基的连接包括67号位置上的甲硫氨酸(M67)，以及连接在相当于M67和/或S68的残基上的接头部分。例如，添加用于将水溶性聚合物偶合在感兴趣的趋化因子的C-末端的具有功能性侧链的接头或间隔成分，降低了对位于或靠近该位点的原始C-末端基团功能的潜在影响。例如，在Rantes的S68号位置上添加接头，如二肽接头Lys69-Leu70得到了Rantes((1-68)(K69-L70))，并且提供了用于将聚合物连接在接头部分Lys69的侧链上的ε氮上的功能性偶合基团，以及在新产生的C-末端的具有游离的α羧酸的氨基酸。还可以在相当于67号位置的残基上添加间隔基团或接头(例如，用Lys67取代Met67，并且将接头连接在ε侧链氨基上)。业已发现这两种趋化因子都保留了生物活性，并且这种设计似乎普遍适用于其他趋化因子。例如，SDF-1α或SDF-1β的类似地修饰可以产生保留了所需生物活性的聚合物修饰过的SDF-1类似物。在另一种例子中，当所述合成趋化因子是MCP-1或Eotaxin的类似物时，并且当水溶性聚合物连接在邻近C-末端的残基上时，所述聚合物连接位点包括分别相当于MCP-1的D68或Eotaxin的D66的氨基酸。在这里，位于C-末端位点的邻近所述位点的残基可用于聚合物连接，如MCP-1的K69或Eotaxin的K68。另外，添加接头或间隔成分，能够获得在C-末端或靠近C-末端添加其他成分的更大的灵活性，如诸如脂类或多环之类的疏水性成分。因此，本发明的其他优选的聚合物修饰的生物活性合成趋化因子包括通过接头或间隔部分的侧链连接在C-末端位点的水溶性聚合物。
b.聚集位点
特别感兴趣的是具有连接在一个或多个聚集位点上的水溶性聚合物的合成趋化因子。“聚集位点”表示会导致蛋白单体自我缔合的残基。大多数趋化因子具有形成同二聚体的潜力，其中很多能够形成四聚体，并且某些形成甚至更大的多聚体(Cytokine Reference，Vol.1，Ligands，A compendium of cytokines and other mediators of hostdefense Eds.J.J.Oppendheim and M.Feldmann，Acedemic Press，2001)。趋化因子聚集位点通常存在于能够在高浓度下形成二聚体和多聚体复合物的趋化因子上(Cytokine Reference，Vol.1，Ligands，A compendium of cytokines and other mediators of host defense，Eds.J.J.Oppendheim and M.Feldmann，Acedemic Press，2001)。例如，诸如Rantes和MIP1β的趋化因子在高浓度下通过单体的自我缔合能形成聚集体，而诸如IL-8，SDF1α和vMIP的趋化因子不具有任何显著程度的这种倾向。聚集位点可以通过多种已知方法鉴定，如同源性模拟，丙氨酸扫描，和在溶液中在不断增加的浓度下比较活性化合物，用本领域公知的各种技术监测聚集、自我缔合(例如，参见Czaplewski等，J.Biol.Chem.，1999，274，23：16077-16084；Czaplewski等，“hMIP-1α的工程、生物学和临床开发”，1999，参见：Chemokines in Disease：Biology and Clinical Research，Ed.C.A.Herbert，Humana Press Inc.，Totwa，NJ.；Trkola等，J.Virol.，1999，73，8：6370-6379；Appay等，J.Virol.，1999，274，39：27505-25512；Hunter等，Blood，1995，86，12：4400-4408；Lord等，Blood，1995，85，12：3412-3415；Lord等，Brit.J.Cancer.，1996，74：1017-1022)。正如上文所指出的，很多趋化因子的聚集位点是已知的，并且用于鉴定推测的聚集位点的技术是众所周知的(同样可以参见Cytokine Reference，Vol.1，Ligands，A compendium of cytokines and other mediators of hostdefense Eds.J.J.Oppendheim and M.Feldmann，Acedemic Press，2001)。因此，可以通过公开的信息、同源性模拟、通过筛选、或每一种技术的组合鉴定趋化因子的聚集位点。因此，本文所提供的例子是用于说明本发明的，而不是用于限定本发明的。
举例来说，业已通过各种技术鉴定了多种趋化因子中的聚集位点，如上文所披露的技术。例如，野生型Rantes具有至少两个参与聚集的残基：位于26号和66号位置上的谷氨酸残基(即Glu26和Glu66；或E26和E66)。因此，当合成的趋化因子是Rantes的类似物时，并且当水溶性聚合物连接在聚集位点上时，所述聚集位点可以包括相当于Rantes的选自E26和E66的残基的氨基酸。例如，我们业已连接了邻近Rantes的E66的水溶性聚合物，即位于相当于甲硫氨酸67的位置上(即Met67或M67)。这种聚合物修饰破坏了聚集，并且改善了总体上的处理特性，这可能是因为由破坏相邻的谷氨酸残基的聚集特性的聚合物造成的大的疏水外壳。因此，对于本发明来说，Rantes上的聚集位点不仅相当于E26和E66，而且相当于邻近它的氨基酸。因此，Rantes上的聚集位点包括相当于Rantes的选自E26和E66的残基的氨基酸，包括M67。
作为另一个例子，当合成趋化因子是MIP1α的类似物，并且水溶性聚合物是连接在它的聚集位点时，所述聚集位点包括相当于MIP1α的选自D26和E66的残基的氨基酸。类似地，当合成趋化因子是MIP1β的类似物，并且水溶性聚合物是连接在它的聚集位点时，所述聚集位点包括相当于MIP1β的选自D27和E67的残基的氨基酸。在另一种例子中，当合成趋化因子是MCP1或Eoxtaxin的类似物，并且水溶性聚合物是连接在它的聚集位点时，所述聚集位点包括分别相当于MCP-1的残基P8和D68或Eoxtaxin的D66的氨基酸。在这里，邻近所述位点的残基同样可用于聚合物连接，以便破坏聚集，如MCP-1的K69或Eoxtaxin的K68，因此，体现在本发明的生物活性合成趋化因子上的是在其聚集位点连接有水溶性聚合物，可以理解的是，聚集位点可以方便地识别，并且是聚合物修饰的优选位点，并且可选择用于通过筛选所需生物活性的方法进行优先连接。
在一种更优选的实施方案中，将水溶性聚合物连接在位于感兴趣的趋化因子的C-末端区的聚集位点。聚合物连接的一个更优选的聚合位点在趋化因子的C-末端α螺旋的C端，如Rantes的E66和M67，MIP1α的E66，MIP1β的E67，MCP-1的D68或Eotaxin的D66。因此，本发明的优选生物活性合成趋化因子包括具有连接在C-末端聚集位点的水溶性聚合物的趋化因子，所述聚集位点在该趋化因子的C-末端α螺旋的C端。本发明这一方面的最优选的生物活性合成趋化因子是具有连接在C-末端聚集位点的水溶性聚合物的趋化因子，所述聚集位点在它的C-末端α螺旋的C端，并且该位点邻近前体趋化因子的C-末端侧基。
c.糖基化位点
在另一种优选实施方案中，提供了具有连接在糖基化位点上的水溶性聚合物的本发明的生物活性合成趋化因子。“糖基化位点”表示编码碳水化合物(寡聚糖)链的酶促连接的残基，如N-连接的和O-连接的糖基化位点。更优选的糖基化位点是出现在趋化因子的C-末端区的糖基化位点。最优选N-连接的糖基化位点。所述糖基化位点可以是天然位点或者是通过工程方法导入靶蛋白的位点。可以通过对糖及其连接位点存在的分析检测、同源性比较，或者通过扫描基因和蛋白数据库中的共有序列和/或结构可以确定野生型分子上的糖基化位点。通过工程方法在靶蛋白上制造一个糖基化位点的优点是，可以鉴定用于聚合物连接的其他优选位点，只要所述工程产生的位点不破坏感兴趣的生物活性就行。
具体地讲，通过粗面内质网的核糖体合成的大部分蛋白含有碳水化合物(寡糖)的短链，并且被称为糖蛋白(例如，参见Vanden Steen等，Critical Rev.Biochem.Mol.Biol.，1998，33，3：151-208)。并且已知很多趋化因子是糖基化的，或者含有N-连接和/或O-连接的糖基化共有位点。实际上，很多天然产生的趋化因子是高度糖基化的。这使得趋化因子的糖基化位点对于聚合物修饰具有特别的作用。例如，糖蛋白决定蛋白的很多重要特征(例如，pI，分子大小，溶解度，稳定性，结构和静电表面电荷)和真核细胞表面的很多重要特征(例如，细胞-细胞识别和粘附，抗“磨损和撕裂”的细胞表面电荷保护，血型特异性抗原，病毒，细菌和原生动物受体，移植(组织相容性)抗原，离子通道和很多其他特征)。水溶性聚合物在所述位点的连接可用于模拟有利的特征(例如，pI，大小，溶解度，稳定性，减弱的抗原性，延长了的循环半衰期)，同时消除了其他特征(例如，异质性，糖介导的清除和不希望的粘附)，以便产生具有改善了的特性的药物化合物。
另外，将水溶性聚合物连接在一个或多个糖基化位点上，通常能减弱对生物活性的影响，并有可能提高其生物活性，因为选择了用于连接大的水溶性聚合物的所述位点的性质。将糖蛋白的碳水化合物部分(通常占总重量的50％或更高)共价连接在多肽上，因为寡糖侧链通常含有4-15个糖。在同一个多肽上可能存在若干个侧链，并且这些侧链可以是支化的。并且，我们业已发现，糖基化位点是适合聚合物连接的位点的良好指标，特别适合连接具有较高分子量的支化水溶性聚合物，这种聚合物具有能模拟通过糖基化连接的寡糖链的净电荷作用的带电侧基。
在鉴定糖基化位点时，糖蛋白的寡糖有两种主要类型：O-连接的和N-连接的。O-连接的寡糖通常通过与丝氨酸和苏氨酸侧链的羟基之间的O-糖苷键连接于蛋白。N-连接的寡糖通常通过与天冬酰胺侧链的氨基之间的O-糖苷键连接于蛋白，其中在天冬酰胺存在的序列中X是除脯氨酸和天冬氨酸以外的任何氨基酸。
如上文所述，N-糖基化碳水化合物链结合在多肽上的Asn-X-Ser/Thr序列的Asn残基上(X是除了Pro以外的任何氨基酸)。不过，很多蛋白都含有未糖基化Asn-X-Ser/Thr序列，并且该序列的存在并非总是导致在它上面添加碳水化合物链。不过，可以方便地检测N-糖基化的存在或缺乏(Biller，M.等，J.Virol.Methods，1998，Dec；76，1-2：87-100；Taverna，M.等，J.Biotechnol.，1999，Feb，5；68，1：37-48；Friedman，Y.等，Anal Biochem，1995，Jul1；228，2：221-5)。另一方面，将O-糖基化碳水化合物链连接在多肽上的Ser或Thr残基上，但是与N-糖基化不同，对于糖基化所要求的氨基酸序列没有限制。不过，已知当Pro出现在附近，例如，出现在序列Pro-Thr/Ser、Thr/Ser-Pro和Thr/Ser-X1-3-Pro上时，糖基化的倾向增强(X是任何氨基酸)(Takahashi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1984，84：2021)。在这里，同样可以方便地检测O-连接的糖基化。
已知很多趋化因子是糖基化的，或者含有推测的糖基化位点(例如，参见Cytokine Reference，Vol.1，Ligands，A compendium ofcytokines and other mediators of host defense Eds.J.J.Oppendheim and M.Feldmann，Acedemic Press，2001)。因此趋化因子的糖基化位点可以从公开的信息中确定。对于推测的位点来说，证实N-和/或O-连接的糖基化位点的优选方法是通过同源性比较(例如，使用适合这一目的的数据库和模式匹配系统，例如，参见Xiang，Y.等，Virology，1999，Mayl0；257，2：297-302；Hoops，T.C.等，J.Biol.Chem.，1991，Mar5；266，7：4257-63；Apweiler，R.等，Biochim Biophys Acta1999，Dec6；1473，1：4-8)，然后在酵母或哺乳动物细胞表达系统中检测前体趋化因子，并且进行分析测定，以便鉴定糖的含量和连接位点。另外，通过同源性比较鉴定的推测位点，可以用感兴趣的水溶性聚合物修饰，然后通过适合这一目的的标准方法在相关的体外生物测定中简单地筛选感兴趣的生物活性(例如，钙流量，趋化性和/或对病毒入侵的抑制作用)。
举例来说，同源性模拟鉴定了位于Rantes上的5号丝氨酸位置(即Ser5或S5)的推测的O-连接的糖基化位点，这一结论得到了其他研究的支持(Kameyoshi等，J.Exp.Med.1992，176，2：587-592)，这些文献证实糖基化形式具有2-10nM的趋化活性。对于作为拮抗剂的诸如NNY-Rantes类似物的Rantes类似物来说，将Rantes的5号位置上的丝氨酸换成诸如Glu或Lys的带电荷的、可溶性基团部分会减弱其效力，而导入诸如t-丁基丙氨酸(tBuA)的氨基酸部分能保留效力，所述效力是在病毒感染/融合的基于细胞的测定中测定的。因此，对于Rantes拮抗剂来说，将水溶性聚合物连接在相当于野生型Rantes的S5号位置上的位点上，优选是通过可生物降解的接头完成，例如，连接在丝氨酸或类似基团的侧链羟基上的酯键，它能提供基本上为药物前体形式的Rantes拮抗剂化合物。在体内系统中降解并且从水溶性聚合物中释放出Rantes类似物，然后产生活性形式。通过诸如酯链的可生物降解的键进行的连接是众所周知的，并且在下文作更详细说明。
业已在诸如MIP-1α和MIP-1β的其他趋化因子上发现了类似情形，这两种趋化因子具有一个或两个潜在的O-连接的糖基化位点。例如，MIP-1α具有推测的糖基化位点，该位点包括相当于T7残基的氨基酸，而对于MIP-1β来说，推测的糖基化位点包括相当于S5残基的氨基酸。这两种例子与Rantes的类似之处在于，O-连接的糖基化位点是推测的，因此，对于MIP的拮抗剂类似物来说，优选的连接是通过可生物降解的键实现的，以便能在体内释放出聚合物之后形成活性形式。
很多其他的趋化因子具有糖基化位点，并且可以是合成的，以及用本发明的一种或多种水溶性聚合物修饰。因此，本文所提供的例子是用于说明本发明的，不应当被认为是对本发明的限定。例如，lyphotactin是包括8个O-连接的糖基化位点的由93个残基的趋化因子。该化合物是使用标准Fmoc-化学方法通过天然化学连接合成的，在每一个糖基化位点上掺入一个GalNAc残基(Marcaurelle等，Chemistry，2001，7，5：1129-1132)。在诸如MCP-1的其他趋化因子中，糖基化位点包括相当于MCP-1的T71残基的氨基酸。尽管规范的N-糖基化序列出现在MCP-1的N14号位置上，但没有可检测的N-连接的糖。相反，将少量的唾液酸化的O-连接的碳水化合物添加到所述蛋白的C-末端(Zhang等，J.Biol.Chem.，1994，269“15918-15924)，推测的位点是T71。业已报导该糖基化形式在体外单细胞趋化性测定中的效力只比非糖基化的MCP-1低2-3倍(Proost等，J.Immunology，1998，160：4034-4041)。另一种糖基化的趋化因子是HCC-1，它是迄今为止已知的唯一能以纳摩尔的浓度在人体血浆中循环的CC-趋化因子(Richter等，Biochemistry，2000，39，35：10799-10805)。HCC-1能以各种加工过的形式存在，74个氨基酸的全长形式具有位于7号位置(Ser7)上的O-糖基化，两个N-乙酰神经氨酸和二糖N-乙酰半乳糖胺半乳糖。
在一种更优选的实施方案中，将水溶性聚合物连接在位于感兴趣的趋化因子的C-末端区的糖基化位点上。用于聚合物连接的最优选的糖基化位点是在趋化因子的C-末端α螺旋的C端的位点。例如，当合成趋化因子是MCP-1时，优选将水溶性聚合物连接在相当于野生型MCP-1的T71残基位置上的糖基化位点上。因此本发明的优选生物活性合成趋化因子包括具有结合在C-末端糖基化位点上的水溶性聚合物的趋化因子，所述糖基化位点是在趋化因子的C-末端α螺旋的C端的位点。
d.GAG结合位点
在本发明的另一种优选实施方案中，提供了具有连接在GAG结合位点上的水溶性聚合物的生物活性合成趋化因子。“GAG结合位点”表示GAG结合的残基；通常是具有伯胺或仲胺的残基，如赖氨酸和精氨酸，并且有时候是组氨酸，它们能在蛋白表面形成正电荷团。已知能结合GAGs的趋化因子包括肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素，这些物质天然存在于内皮细胞表面上和胞外基质中(例如，参见Wells等，Inflamm.Res.，1999，48：3353-3362，Lalani等，J.Virol.，1997，71：4356-4363；Rot，A.，Eur J Immunol.，1993，23：303-306；Witt等，Curr Biol，1994，4：394-400；Hoogewerf等，Biochem，1997，36：13570-13578；Marquezini等，Cardiology，1995，86：143-146；Wasty等，Diabetologia，1993，36：316-322)。Kuschert等(Biochem.，1999，38：12959-12968)，Koppman等(J.Immunol.，1999，163：2120-2127)和Proudfoot等(J.Biol.Chem.，2001，276，14：10620-10626)报导了GAG结合和趋化因子。
趋化因子的GAG结合能力尽管不是功能所必需的，但是业已报导这种结合能调节受体相互作用和具有受体的细胞在基质蛋白和细胞表面上的haptotactic迁移(例如，参见Rot，A.，Eur J Immunol.，1993，23：303-306；Witt等，Curr Biol，1994，4：394-400；Hoogewerf等，Biochem，1997，36：13570-13578；Marquezini等，Cardiology，1995，86：143-146；Wasty等，Diabetologia，1993，36：316-322；Kuschert等，Methods Enzymol.，1997，287：369-387；Kuschert等，Biochem.，1998，37：11193-11201；Kuschert等，Biochem.，1999，38：12959-12968)。在大多数场合下，趋化因子与可溶性GAGs的结合抑制了趋化因子与其受体的结合(Kuschert等，Biochem.，1999，38：12959-12968)。不过，业已报导了在少数情况下趋化因子与GAGs的相互作用能加强活性(Wbb等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993，90：7158-7162；和Wagner等，Arteriosclerosis，1989，9：21-32)。因此，在其GAG结合位点上连接了水溶性聚合物的合成趋化因子可用于调节生物学功能。可以根据被选择用于连接的位点及其预期的最终用途通过减弱GAG结合或偏向某些GAGs的结合而实现。因此，本发明的一种优选实施方案涉及在GAG结合位点上连接了水溶性聚合物，并且具有下调与它结合的趋化因子受体的体外生物学活性的生物活性合成趋化因子。
如上文所述，所有已知的趋化因子都能结合肝素，不过具有不同的亲和力，因此所有趋化因子都具有GAG结合位点。在选择用于聚合物修饰的GAG位点时，有多种不同的技术适用于这一目的。例如，BBXB和BBBXXB基序，其中，B表示碱性残基，业已证实它们是包括若干种趋化因子在内的若干种蛋白的共同的肝素结合基序(例如，参见Cardin等，Arteriosclerosis，1989，9：21-32；Hileman等，Bioessays，1998，20，2：156-167；和Proudfoot等，J.Biol.Chem.，2001，176，14：10620-10626)。不过，GAG结合位点不局限于BBXB或BBBXXB基序。例如，Rantes(44RKNR47和55KKWVR59)、SDF-1(24KHLK27)、MIP-1α(45KRSR48)、和MIP-1β(45KRSK48)上的GAG结合位点具有BBXB基序，而IL-8(Lys20、Lys64和Arg68)和MIP-1(Lys59和Arg66)上的主要GAG结合残基在空间上是分离的，但是在蛋白表面上形成了碱性电荷团。因此，所述配体的碱性电荷导致了其肝素结合特性。
还可以通过碱性残基(例如，Lys，His和Arg)的丙氨酸扫描鉴定GAG位点，NMR和GAG/肝素结合测定中的活性化合物比较，以及NMR研究适用于这一目的(Proudfoot等，J.Biol.Chem.，2001，176，14：10620-10626；Trkola等，J.Virol.，1999，73，8：6370-6379；Appay等，J.Biol.Chem.，1999，274，39：27505-27512；Hunter等，Blood，1995，86，12：4400-4408；Lord等，Blood，1995，85，12：3412-3415；Lord等，Brit.J.Cancer，1996，74：1017-1022)。正如上文所指出过的，很多趋化因子的GAG结合位点是已知的，并且鉴定推测的GAG位点的技术也是众所周知的(还可参见Cytokine Reference，Vol.1，Ligands，A compendium of cytokines and other mediators of hostdefense Eds.J.J.Oppendheim and M.Feldmann，Acedemic Press，2001)。因此，可以通过公开的信息、同源性模拟、通过筛选或上述各种方法的组合鉴定趋化因子的GAG结合位点。另外，由于参与GAG结合的残基的至少一个侧链位于分子的表面上，并且远离N-末端药效团部分，所述位点通常适合连接水溶性聚合物。
举例来说，野生型Rantes具有至少两个主要GAG结合位点，它包括相当于Rantes的选自Lys44、Lys45、Arg47、Lys55、Lys56和Arg59(即K44、K45、R47、K55、K56和R59)的残基的氨基酸。因此，当所述合成趋化因子是Rantes的类似物，并且水溶性聚合物连接在它的GAG结合位点上时，所述GAG结合位点包括相当于Rantes的选自K44、K45、R47、K55、K56和R59的残基的氨基酸。在一种优选实施方案中，水溶性聚合物连接在相当于Rantes的选自K44、K45、R47的残基的位点，以K45号位点为更优选。在本实施方案中，连接在45号位置上的聚合物具有减弱所述合成的Rantes趋化因子类似物与CCR1受体结合的优点，同时基本上保留了与CCR5的结合。
作为另一个例子，当合成的趋化因子是MIP1α的类似物，并且水溶性聚合物连接在它的GAG结合位点上时，所述GAG结合位点包括相当于MIP1α的选自R17、R45和R47的残基的氨基酸。类似地，当合成的趋化因子是MIP1β的类似物，并且水溶性聚合物连接在它的GAG结合位点上时，所述结合位点可以包括相当于MIP1β的选自R18、R45和R46号位置的残基的氨基酸。在这两种例子中，聚合物连接的优选位点是MIP1α的R45和MIP1β的R46。对Rantes来说，将上述修饰设计成使所述趋化因子类似物的结合偏向CCR5。
在另一种例子中，当合成趋化因子是SDF1α的类似物，并且水溶性聚合物连接在GAG结合位点上时，所述GAG结合位点包括相当于SDF1α的残基K24、H25和K27的氨基酸。在这里，靠近所述位点的残基同样可用于聚合物连接，以便获得基本上相同的结果，如N22或N30或N33，特别是N33，并因此体现在GAG结合位点上连接有水溶性聚合物的本发明的生物活性合成趋化因子上。
在另一种例子中，当所述合成趋化因子是IL-8的类似物，并且水溶性聚合物连接在GAG结合位点上时，所述GAG结合位点包括相当于IL-8的选自K20、R60、K64、K67和R68的残基的氨基酸。IL-8的合成类似物的优选的聚合物连接位点相当于它的K64位置。另一个例子是MCP-1，因此当所述合成趋化因子是MCP-1的类似物，并且水溶性聚合物连接在它的GAG位点上时，所述GAG位点包括相当于MCP-1的选自K58和H66的残基的氨基酸，优选K58。
可以理解的是，GAG结合位点是便于识别的并且是聚合物修饰的优选位点，并且可以通过常规筛选需要的生物活性选择优势的连接。适用于这一目的的生物测定方法是众所周知，并且在文献中有大量报导(Cytokine Reference，Vol.1，Ligands，A compendium of cytokinesand other mediators of host defense Eds.J.J.Oppendheim andM.Feldmann，Acedemic Press，2001)。
2.水溶性聚合物
将要连接在本发明的生物活性合成趋化因子上的本发明的聚合物修饰优选是水溶性聚合物。在本文中，术语“水溶性聚合物”表示可溶于水的基本上无抗原性的聚合物结构。生物学溶性聚合物的例子包括，但不限于(a)葡聚糖，硫酸葡聚糖，羧甲基糊精；(b)糖胺聚糖，如肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素；(c)透明质素和透明质酸；(d)聚交酯和寡聚丙烯酸乳酰酯；(e)纤维素、甲基纤维素和羧甲基纤维素；(f)胶原；(g)明胶；(f)藻酸；和(i)淀粉。
本发明的水溶性聚合物可以是直链的、支化的或星形的，或所述构形的混合形式，并且可以具有很大范围的分子量，和聚合物亚基。所述亚基可以包括生物学聚合物、合成聚合物或其组合。
所述生物学水溶性聚合物的很多衍生物是已知的，并且可用于本发明中。合成水溶性聚合物的例子包括，但不限于(a)含有聚环氧烷、聚环氧乙烷、亚乙基/马来酐共聚物及其衍生物的聚合物，包括它的均聚物和共聚物，如聚乙二醇，一甲氧基聚乙二醇，聚丙二醇均聚物，乙二醇与丙二醇的共聚物及其衍生物，其中，所述均聚物或共聚物是未取代的，或者在一端用烷基基团取代；(b)聚乙烯醇和聚乙烯乙醚；(c)聚乙烯吡咯烷酮；(d)聚氧乙烯化多元醇，包括pluronic多元醇；(e)聚酯，如聚(乙醇酸)；聚(L-乳酸)；聚(D-乳酸)；聚(DL-乳酸)；交酯/乙交酯共聚物；聚-1，3，6-三噁烷；聚-1，3-二噁烷；聚(对二噁烷)和共聚物；聚己内酯；PEG-聚酯共聚物；聚(磷酸酯)；(f)聚(原酸酯)；(g)聚酐；(h)假-聚(氨基酸)(均聚物或无规共聚物)；(i)聚甘油；(j)葡聚糖，和羧甲基纤维素等。
上述水溶性聚合物是众所周知的，并且业已用于多种连接化学、键体系和结构，如用于连接肽、多肽和其他化合物的生物稳定的，可生物降解的以及药物前体结构(例如，参见国际专利申请：
WO90/13540，WO92/00748，WO92/16555，WO94/04193，WO94/14758，WO94/17039，WO94/18247，WO94/28937，WO95/11924，WO96/00080，WO96/23794，WO98/07713，WO98/41562，WO98/48837，WO99/30727，WO99/32134，WO99/33483，WO99/53951，WO01/26692，WO95/13312，WO96/21469，WO97/03106，WO99/45964，和美国专利Nos.4,179,337；5；075,046；5,089,261；5,100,992；5,134,192；5,166,309；5,171,264；5,213,891；5,219,564；5,275,838；5,281,698；5,298,643；5,312,808；5,321,095；5,324,844；5,349,001；5,352,756；5,405,877；5,455027；5,446,090；5,470,829；5,478,805；5,567,422；5,605,976；5,612,460；5,614549；5,618,528；5,672,662；5,637,749；5,643,575；5,650,388；5,681,567；5,686,110；5,730,990；5,739,208；5,756,593；5,808,096；5,824,778；5,824,784；5,840,900；5,874,500；5,880,131；5,900,461；5,902,588；5,919,442；5,919,455；5,932,462；5,965,119；5,965,566；5,985,263；5,990,237；6,011,042；6,013,283；6,077,939；6,113,906；6,127355；6,177,087；6,180,095；6,194,580；6,214,966).有关合适的聚合物的其他信息披露于以下文献中：
Turnbull，W.B.et al.(Calbiochem(2000)，Towardthe Synthesis of Large Oligosaccharide-Based Dendrimers，”1：70-74)，vanDuijvenbode，R.C.et al.(Macromolecules(2000)“Synthesis and ProtonationBehavior of Carboxylate-Functionalized Poly(propyleneimine)Dendrimers，”33：46-52)，Marcaurelle，L.A.(“Recent Advances in the Synthesis of Mucin-TypeGlycoproteins，” http：//www.chem.unt.edu/acs/pdf/marcaur.pdf)，Domenek，S.(“TheHuman Genome Project：Challenge for Society and Chemistry，”http：//www.orgc.tugraz.at/orgc/hoegroup/chem ges/domenek.PDF)，Imperiali，B.etal.(“Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure，”Current Opinion in Chemical Biology 1999，3：643-649)，Rudd，P.M.et al.(“Glycosylation and the Immune System，”Science(2000)291：2370-2376)，Van denSteen，P.et al.(“Concepts and Principles of O-Linked Glycosylation，”CriticalReviews in Biochemistry and Molecular Biology，33(3)：151-208(1998))，Knischka，R.et al.(“Star-Shaped Polymers Based On Polyglycerol Cores：Synthesis，Characterization And Crosslinking，” http：//www-ics.u- strasbg.fr/～equipe3/Poster4.pdf)，Rudd，P.M.et al.(“Roles for Glycosylation of CellSurface Receptors Involved in Cellular Immune Recognition，J.Mol.Biol.(1999)293，351-366)，and Davis，B.G.(“Recent developments in glycoconjugates，”J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1 1999，(22)，3215-3237).
本发明的水溶性聚合物优选具有超过10000Da的有效流体动力学分子量，更优选大约20000-500000Da，最优选大约40000-300000Da。“有效流体动力学分子量”表示通过水基大小排阻层析(SEC)测定的聚合物链的有效水溶剂化大小。当所述水溶性聚合物包括具有环氧乙烷重复单元的聚合物链时，优选每一个链具有大约200-大约80000Da的原子分子量，优选大约1500-大约42000Da，最优选2000-大约20000Da。除非专门说明，分子量表示原子分子量。
所述水溶性聚合物可以包括生物稳定的或可生物降解的聚合物链。例如，具有重复键的聚合物，这些聚合物在生理学条件下根据键的不稳定性具有不同程度的稳定性。具有所述键的聚合物可以根据低分子量类似物的已知水解速度通过在生物学条件下的相对水解速度进行分类，例如，从较不稳定到较稳定的排列顺序为：聚碳酸酯(-O-C(O)-O-)＞聚酯(-C(O)-O-)＞聚氨基甲酸酯(-NH-C(O)-O-)＞聚原酸酯(O-C((OR)(R’))-O-)＞聚酰胺(-C(O)-NH-)。类似地，将水溶性聚合物连接在靶分子上的键体系可以是生物稳定的或可生物降解的，例如，从较不稳定到较稳定的顺序为：碳酸酯(-O-C(O)-O-)＞酯(-C(O)-O-)＞氨基甲酸酯(-NH-C(O)-O-)＞原酸酯(-O-C((OR)(R’))-O-)＞酰胺(-C(O)-NH-)。所述键是以举例形式提供的，而不是要限定可用于本发明水溶性聚合物的聚合物链或键体系中的键的类型。如上文所述，可以通过改变与它连接的水溶性聚合物的性质修饰本发明合成蛋白的生物活性。
用于这一目的的优选水溶性聚合物具有以下结构式：
                    U-B-Polymer-J其中，U是能够被靶分子连接或连接在靶分子上的官能团的残基，B是具有三个或三个以上臂的分支核心，并且可以存在或缺乏。Polymer是分子量等于或大于1000Da的基本上无抗原性的水溶性聚合物，而J是在生理学条件下具有选自负的、中性或正的净电荷的侧基。所述聚合物包括披露于被以全文形式收作本文参考的美国专利申请流水号60/236377中的聚合物。
可以用一个或多个间隔或接头部分将成分U、B、Polymer和J与水溶性聚合物的其他基团隔开，因此，水溶性聚合物U-B-Polymer-J可以用以下结构式表示：
               U-s1-B-s2-Polymer-s3-J其中，S1、S2和S3是间隔部分或接头部分，它们可以相同或不同，并且可以单独存在或者是缺乏。优选的间隔基或接头包括直链或支化部分，包括用于水溶性聚合物中的一个或多个重复单元，二氨基和或二酸单元，天然或非天然氨基酸或其衍生物，以及脂族部分，包括烷基、芳基、杂烷基，杂芳基，和烷氧基等，它们优选含有多达18个碳原子或者甚至包括额外的聚合物链。
如上文所述，成分U是一个官能团的残基，它能够被靶分子连接或者与诸如肽或多肽的靶分子连接。当U是用于与靶分子结合的官能团的残基时，U包括一个亲核基团或亲电子基团，而所述靶分子分别包括相互起反应的亲电子基团或亲核基团。
上述聚合物可用于生产包括以下结构式的水溶性聚合物修饰的蛋白：蛋白-W，其中，W是具有以下结构式的水溶性聚合物基团：-s0-U-s1-B-s2-Polymer-s3-J；其中，U是与蛋白直接连接或通过s0连接的官能团的残基，而B是具有三个或三个以上臂的支化核，并且可以存在或缺乏，Polymer是分子量等于或大于1000Da的基本上无抗原性的水溶性聚合物，J是在生理学条件下具有选自负的、中性的或正的净电荷的侧基，而s0、s1、s2和s3是间隔或接头部分，它们可以相同或不同，并且可以单独存在或缺乏。
上述很多相互起反应的官能团是已知的，并且可以连接在肽和多肽所共有的侧链官能团上，或衍生的侧链官能团上(Zalipsky等，Bioconjugate Chemistry，1995，6：150-165；“Perspectives inBioconjugate Chemistry”，C.F.，Meares，Ed.，ACS，1993；“Chemistryof protein conjugation and cross-linking”，S.S.Wong，Ed.，CRC Press，Inc.，1993)。官能团的例子包括能够与氨基起反应的基团，如(a)碳酸酯，如对硝基苯基，或琥珀酰亚胺基；(b)羰基咪唑；(c)二氢唑酮；(d)环酰亚胺硫酮；和(e)异氰酸酯或异硫氰酸酯。能够与羧酸基团和活性羰基基团起反应的官能团的例子包括(a)伯胺；或(b)肼和酰肼官能团，如乙酰肼、肼基甲酸酯，氨基甲酸酯，硫代肼基甲酸酯，氨基氧等。能够与巯基或硫氢基起反应的官能团包括苯基乙二醛，马来酰亚胺和卤基。能够与诸如羧酸的羟基基团起反应的官能团或能够与亲电子的中心起反应的其他亲核基团的例子包括羟基、氨基、羧基、硫醇基、和活性亚甲基等。
例如，可以制备水溶性聚合物，该聚合物具有作为用于结合靶分子的官能团的成分U，其中，所述官能团是丙烯酸酯、醛、酮、氨基氧基、胺、羧酸、酯、硫酯、卤、硫醇、氰基乙酸酯，二棕榈酰磷酯酰乙醇胺，二硬脂酰磷酯酰乙醇胺，环氧化物，酰肼，叠氮，异氰酸酯，马来酰亚胺，甲基丙烯酸酯，硝基苯基碳酸酯，原吡啶基二硫化物，硅烷，硫氢基，乙烯基砜，琥珀酰亚胺基戊二酸酯，琥珀酰琥珀酸酯，琥珀酸，和tresylate等。U还能够以可激活的形式提供，例如，能够转化成它的活性酯的羧酸，它能够与诸如胺的亲核基团起反应。
在一种优选实施方案中，U是一种特殊官能团的残基，它能与靶分子上的独特官能团选择性地起反应。本发明的这一方面体现了肽合成(保护基团方法)和化学连接(部分或无保护基团方法)的原理。对于保护基团方法来说，除了U及其相互反应的官能团之外，存在于所述靶分子上的所有潜在反应性官能团都被合适的保护基团封闭。有很多保护基团是已知的，并且适用于这一目的(例如，参见“Protectinggroups in organic synthesis”，3rd edition，T.W.Greene andP.G.M.Wuts，Eds.，John Wiley&Sons，Inc.，1999；NovaBiochemCatalog2000；“Synthetic peptides，a user’s guide”，G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman&Company，New York，NY，1992；“Advanced chemtechhandbook of combinatorial&solid phase organic chemistry”，W.D.Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，and H.H.SaneII，Eds.，Advanced chemtech，1998；“principles of peptide synthesis，2nd ed.”，M.Bodanszky，Eds.，Springer-Verlag，1993；“the practice of peptidesynthesis，2nd ed.”，M.Bodanszky和A.Bodanszky，Eds.，Springer-Verlag，1994；and“Protecting groups”，P.J.Kocienski，Ed.Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994)。
因此，U可以表示多种官能团的残基，如上文所披露的官能团。对于部分或不保护基团方法来说，存在于靶分子上的U及其相互反应的官能团采用了一种化学选择性反应对，其中，其他官能团可存在于该反应系统中，但不起反应。其中包括适用于胺捕获方法(例如，通过半氨基形成，通过亚胺形成和通过Michael加合)，硫醇捕获方法(例如，通过硫醇盐形成、或二硫化物交换)，天然化学连接方法(例如，通过涉及到含有半胱氨酸或硫醇的侧链氨基酸衍生物的硫酯交换)，和正交连接偶合方法(例如，通过噻唑烷形成、硫酯交换、硫酯形成、二硫化物交换以及通过酰胺形成)的U基团(例如，参见Coltart，DM.，Tetrahedron，2000，56：3449-3491)。
优选的U包括用于水相容性连接化学方法中的独特官能团的残基，如天然化学连接(Dawson等，Scienee，1994，266：776-779；Kent等，WO96/34878)，延伸的一般化学连接(Kent等，WO98/28434)，成肟化学连接(Rose等，J.Amer.Chem.Soc.，1994，116：30-33)，成硫酯连接(Schnolzer等，Science，1996，256：221-225)，成硫醚连接(Englebretsen等，Tet.Letts.，1995，36，48：8871-8874)，成腙连接(Gaertner等，Bioconj.Chem.，1994，5，4：333-338)，和成噻唑烷连接和成噁唑烷连接(Zhang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，16：9184-9189；Tam等，WO95/00846)或通过其他方法(Yan，L.Z.和Dawson，P.E.，“Synthesisof peptides and proteins without cysteine residues by nativechemical ligation combined with desulfurization”，J.Amer.Chem.Soc.，2001，123，526-533，被收作本文参考；Gieselnan等，Org.Lett.2001，3，9：1331-1334；Saxon，E.等，“Traceless”Staudinger Ligation for the Chemoselective Synthesis of AmideBonds.Org.Lett.，2000，2，2141-243)。
对于上述各种连接化学方法来说，显而易见的是，当U是与靶分子结合的官能团的残基时，U可以包括选自碳酸酯、酯、氨基甲酸乙酯、原酸酯、酰胺、胺、肟、二酰亚胺、脲、硫脲、硫醚、硫氨基甲酸乙酯、硫酯、醚、噻唑烷、腙、和噁唑烷等的键的残基。优选的键是肟和酰胺键。
如上文所述，B是具有三个或三个以上臂的支化核心部分，并且可以存在或不存在。当存在B时，有一个臂与U或者与U连接的间隔基或接头连接，并且每一个其他的臂与聚合物或者与聚合物连接的间隔基或接头连接。支化核心B的例子包括，但不限于氨基、酰胺、羧酸及其组合。其中包括赖氨酸和/或精氨酸的寡聚酰胺或其组合，或由链烷二胺和丙烯酸制备的寡聚体(聚酰胺型胺类)，后者提供了支化核心上的净正电荷(例如，参见Zeng等，J.Pept.Sci.，1996，2：66-72；Rose等，Bioconjugate Chem.，1996，7，5：552-556；NovoBichemcatalog and peptide synthesis handbook，Laufelfingen，2001，Wells等，Biopolymers，1998，47：381-396；Mahajan等，1999，40：4909-49-12；Judson等，1998，39：1299-1302；Swali等，1997，62：4902-4903；US9532462，5919455，5643575，5681507)。由很多其他不同的支化核心可以使用，并且适用于这一目的，包括取代的二胺、取代的二酸，烷基酸，如甘油和其他具有三个或三个以上官能团或可激活的基团的其他部分，包括多价烷基、芳基、杂烷基、杂芳基和烷氧基部分等，以及寡糖(例如，Nierengarten等，TetrahedronLett.，1999，40：5681-5684；Matthews等，Prog.Polym.Sci.，1998，1-56；Suner等，Macromolecules，2000，33：253；Fischer等，Angew.Chem.Iht.Ed.，1999，38：884；Sunder等，Adv.Mater.，2000，12：235；Mulders等，Tetrahedron Lett.，1997，38：631-634；Mulders等，Tetrahedron Lett.，1997，38：30-3088；和Turnbull等，Chembiocehm，2000，1，1：70-74。
优选的支化核心是氨基、羧基，和混合的氨基酸和羧酸。另外，优选的支化聚合物结构是这样的聚合物结构，其中的分支来自单一的支化核心，如寡聚酰胺或聚酰胺核心。不过，可以采用其他类型的支化结构，如蠕虫样结构，其中，所述分支来自沿着聚合物主链分布的多个支化核心的序列(Schluter等，Chem.Int.Ed.，2000，39：864)。根据聚合物主链的化学组成和/或体积以及重复单位，可以将所得到的蠕虫样结构设计成水溶性的或容易诱导液晶组构(Quali等，Macromolecules，2000，33：6185)，它又有利于输送用途，作用的稳定性和持久性。对于本发明的其他支化聚合物结构来说，将所述蠕虫样结构制备成含有一个包括U的功能侧基。
结构式U-B-Ploymer-J的水溶性聚合物的Ploymer包括上文所披露的水溶性聚合物，优选的聚合物成分选自(a)含有聚环氧烷、聚环氧乙烷、亚乙基/马来酐共聚物及其衍生物的聚合物，包括它的均聚物和共聚物，如聚乙二醇，一甲氧基聚乙二醇，聚丙二醇均聚物，乙二醇与丙二醇的共聚物及其衍生物，其中，所述均聚物或共聚物是未取代过的，或者在一端用烷基基团取代；(b)聚乙烯醇和聚乙烯乙醚；(c)聚乙烯吡咯烷酮；(d)聚氧乙烯化多元醇，包括pluronic多元醇；(e)聚酯，如聚(乙醇酸)；聚(L-乳酸)；聚(D-乳酸)；聚(DL-乳酸)；交酯/乙交酯共聚物；聚-1，3，6-三噁烷；聚-1，3-二噁烷；聚(对二噁烷)和共聚物；聚己内酯；PEG-聚酯共聚物；聚(磷酸酯)；(f)聚(原酸酯)；(g)聚酐；(h)假-聚(氨基酸)(均聚物或无规共聚物)；和(i)聚甘油。其中优选的聚合物包括聚环氧烷，特别是包括结构式为(-CH2-CH2-O-)n或(O-CH2-CH2-)n的聚环氧乙烷的聚合物及其衍生物，其中，n是2或更大，包括它的均聚物或共聚物(例如，参见“聚(乙二醇)化学：生物技术和生物医学应用”J.M.Harris Ed.，Plenum Press，New York，NY，1992；和“聚乙二醇化学和生物学应用”，J.M.Harris和S.Zalipsky，Eds.，ACS，1997)。
更优选的聚合物成分是这样的聚合物，其中的水溶性聚合物U-B-Ploymer-J是通过逐步合成一起生产的。这意味着所述聚合物具有精确的分子量和确定的结构，相反，正常的聚合物合成是一种聚合过程，会产生具有不同长度的链的混合物，并因此存在分子量和分子大小的分布，如果不能分离的话，这种分布是困难的。控制分子纯度的能力是有利的，其优点在于可以构建在它上面结合有水溶性聚合物的合成蛋白，并且该蛋白是单一分布的。由此所产生的一个显著优点是，可以避免杂合的混合物所产生的可变特征，并且能够制备并比较容易地分离具有最优选的特征的化合物。
最优选的聚合物成分包括披露于WO00/12587中的结构式为-[C(O)-X-C(O)-NH-Y-NH]n-或-[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-的聚酰胺，其中，n是从1-100的正的整数，更优选2-100，并且，其中的X和Y是具有通过诸如酰胺键的方式连接的精确结构的生物相容性重复元件。X和Y可以是二价基团等。X和Y可以相同或不同，并且可以是支化的或直链的。在高度优选的例子中，X和Y中的至少一个包括水溶性聚合物重复单位。
X，Y的优选水溶性重复单位包括聚环氧烷、聚环氧乙烷及其衍生物，包括它的均聚物和共聚物，其中，所述均聚物和共聚物可以是未取代的或取代的，直链的或支化的，并且可以包括烷基、芳基、芳烷基等在内的侧基，聚氧乙烯化的多元醇，包括pluronic多元醇，和C1-C18脂族侧基。可以理解的是，微小的改变包括结构式为-[C(O)-X-NHC(O)-Y-NH]n-或-[NH-Y-C(O)-NH-X-C(O)]n的聚酰胺。X’和Y’是X和Y的亚实施方案，其中，X＝X’-NH或NH-X’，而Y＝Y’-NH或NH-Y’。X’、Y’的更优选的水溶性重复单位包括聚环氧乙烷结构(CH2-CH-O)n或(O-CH2-CH2-)n，其中，n是2-50，3-25，3-10，更优选3-5。
正如上文所指出的，成分J可以是在生理学条件下具有选自中性、正的或负的净电荷的任何基团。其中包括烷基、芳基、芳烷基、酰基、和羰基基团。这些基团是取代的或未取代的，及其盐。所述基团可以是氨基酸、核酸、脂肪酸、碳水化合物及其衍生物的一种成分，以及诸如壳多糖、脱乙酰壳多糖、肝素、磷酸乙酰肝素、软骨素、硫酸软骨素、皮肤素和硫酸皮肤素、环糊精、葡聚糖、透明质酸、磷脂、和唾液酸等。J优选包括可离子化的部分，选自羧基、氨基、硫醇、羟基、磷酰基、胍基、咪唑及其盐。最优选的J包括可离子化的羧化物部分，并且在生理学条件下具有净的负电荷。
根据本发明，解决聚合物不均匀性、多样性和不适用性的优选方案包括生产新型生物相容性聚合物，该聚合物综合了多肽(精确的长度、便于合成)和糖基化模拟基团(糖模拟基团，一种不容易受蛋白酶影响的柔性的、两性的、非免疫原性的聚合物)的优点，Rose，K.等(美国专利申请流水号09/379297，被收作本文参考)。
在优选聚合物-[C(O)-X-NHC-(O)-Y-NH]n-或-[NH-Y-C(O)-NH-X-C(O)]n的优选实施方案中，X和Y可以是缺乏活性官能团的二价有机基团，或者不存在，并且可以相同或不同，可以根据每一个重复单元(n)独立改变。当n＝2时，X或Y中的至少一个优选选自取代的、未取代的、支化的或直链脂族基团和芳族基团。更优选的是，所述二价有机基团可以选自苯基、C1-C10亚烷基部分，C1-C10烷基基团，含有杂原子的苯基、含有杂原子的C1-C10亚烷基部分，含有杂原子的C1-C10烷基基团及其组合。
特别优选的糖模拟部分可以用以下结构式表示
    -{CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH}n-其中，n优选为1-100，更优选为2-100；或者
-{CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH}n-其中，n优选为1-50，更优选为2-50。一种特别优选的糖模拟基团的n＝12，X是-(CH2)2-，而Y是：
              -(CH2)3O(CH2)2O(CH2)2O(CH2)3-。
本发明的糖模拟部分可以用多种方法中的任一种合成。不过，所述部分优选通过各单元的逐步固相链组装生产，而不是通过聚合方法生产。所述组装方法的应用使得一种制剂的组成部分具有确定的和均匀的结构，如其长度，其X和Y取代基的性质，分支点的位置(如果有的话)，以及长度，X和Y取代基，任何分支的位置。所述部分优选是通过以下步骤合成的：
(a)用摩尔过量的结构式为HOOC-X-COOH的二酸的衍生物对结构式为Z-Q-支持物的化合物的氨基或羧基进行酰化，其中Z是H2N-或HO-；Q是接头或靶分子；而所述支持物是固相基质或表面；
(b)激活步骤(a)产物的游离羧基；
(c)用摩尔过量的具有结构式NH2-Y-NH2的二胺对步骤(b)的产物进行氨基分解；和
(d)任选用HOOC-X-COOH和NH2-Y-NH2重复步骤(a)-(c)，其中，X和Y是二价有机基团或者不存在，并且是相同的或不同的，并且可以根据所述任选的重复单元而独立改变，并且与用于前面的酰化和氨基分解步骤中的X和Y取代基相同或不同。
在优选实施方案中，采用了上述重复单元的6聚体、12聚体、18聚体和32聚体。如果需要的话，所述重复单元可以与赖氨酸的氨基基团组合使用，以便形成分支的糖模拟结构。所述糖模拟基团可以通过多种化学方法连接在本发明的合成蛋白上，包括硫醚、肟和酰胺键形成。
在一种实施方案中，各单元的逐步固相链组装包括：
步骤1：将保护的或未保护的二酸连接在树脂上的氨基上，以便在连接位点产生酰胺键(其中，PG是保护基团，它根据所采用的二酸而存在或不存在)：
           PG-OOC-X-COOH+NH2-Y-NH-树脂
步骤2：除去树脂上的保护基团(PG，如果存在的话)
               HOOC-X-CO-NH-Y-NH-树脂
步骤3：将保护的或未保护的二氨基连接在树脂上的羧基上，以便在连接位点上产生酰胺键(其中，PG根据使用的二氨基而存在或不存在)：
       PG-NH-Y-NH+HOOC-X-CO-NH-Y-NH树脂
步骤4：除去树脂上的保护基团(PG，如果存在的话)
           -NH-Y-NH-OC-X-CO-NH-Y-NH-树脂
步骤5：重复步骤1-4‘n’次，以便添加‘n’个单元，然后从树脂上裂解-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-
3.本发明的水溶性聚合物的合成
本发明的水溶性聚合物可以通过多种方法中的任一种合成。图1A-1E表示连接方法，包括在连接之前或之后或其组合将水溶性聚合物(U-B-Ploymer-J*，如本文所定义的)连接到部分或完全未保护的肽片段(
Figure A0181524700541
)上。在图1A-1D中，Yaa表示位于第一种肽片段上的C-末端氨基酸，它具有独特的化学选择部分(例如，具有α羧基硫酯的氨基酸)，用于与第二种肽片段连接，第二种肽片段具有独特的和相互反应的N-末端氨基酸Xaa(例如，氨基末端半胱氨酸)部分，该部分能够与Yaa发生化学选择性化学连接。Xaa和Yaa之间的化学选择性反应在它们之间产生了共价键(例如，酰胺键)。因此，Yaa和Xaa形成了化学选择性连接的配对。在所述附图中，Un-表示第二种独特的化学选择性部分，该部分业已掺入所述氨基酸侧链上的确切用户限定位点上，并且能选择性地与水溶性聚合物U-B-Polymer-J*的基团U-相互起反应。例如，当Un是业已被修饰成具有酮基的侧链时，水溶性聚合物U-Polymer-J*的U-是与酮起反应的化学选择性基团，例如，能在它们之间产生肟键的氨基氧基团。Un中的角标n是氨基酸的数量，其侧链被设计成具有化学选择基团U，例如，当两个特定的和用户限定的位点要进行聚合物修饰时，n＝2，它还可以表示成U2或Un＝2。在所有场合下，n是通过设计精确控制的正整数。因此Un和U表示第二种化学选择连接配对，它们是相容的，并且不会与Xaa和Yaa的化学选择基团起反应。图1A和1B表示两种不同的潜在反应。在所示出的第一种反应中，将具有Un官能性的多肽链连接到第二种多肽上，然后与U-B-Polymer-J*部分起反应，以便获得聚合物修饰的多肽。在所示出的第二种反应中，让具有Un官能性的多肽与U-B-Polymer-J*部分起反应，以便获得聚合物修饰的多肽，然后连接到第二种多肽上，以便获得较大的聚合物修饰的多肽。以上附图的差别在于，在图1A中，具有Xaa残基的多肽用于接受聚合物修饰，而在图1B中，具有Yaa残基的多肽用于接受聚合物修饰。图1A表示本发明修饰多种多肽链的能力，这种修饰是在连接之前或之后进行，以便形成更大的多肽。在图1D中，PG和PG’表示保护基团，其中PG’表示正交的保护基团，即PG和PG’可以在不同的条件下去掉，并且可用于通过相同的化学作用将不同的水溶性聚合物连接到Un基团上，或者可用于当Un表示不希望用聚合物进行修饰的侧链官能团(例如，具有反应性-NH2或-SH的侧链，其中，水溶性聚合物的U基团被设计成只能与伯胺基或侧链硫醇起反应)的情况下。图1D表示可以利用保护基团，以便保护按照本发明方法连接的多肽的需要的侧链。
图1E表示用于按照图1A-1D的方法进行连接和聚合物修饰的多肽片段上的可以存在或不存在的基团的多样性。
图2A-2C表示用于制备本发明的合成生物活性蛋白的其他方法的示意图。具体地讲，图2A-2B表示连接示意图，包括将水溶性聚合物U-B-Polymer-J*连接到氨基末端基团Xaa侧链的连接位点上(例如，半胱氨酸的侧链硫醇)。图2C表示在图2A-2B中的连接和聚合物修饰中使用的肽片段上的可以存在或不存在的基团的多样性。
图3A-3B表示用于实现多片段连接的其他方法的示意图，该方法包括三个或三个以上非重叠肽片段的化学连接，即，至少有一个片段是相当于最终的全长连接产物的中间片段。用这种方法制备的肽可用于制备参与另一种连接反应的肽片段，例如，在图1A-1E、图2A-2C和图4A-4C中所示出的。一般，对多片段连接来说，中间片段具有受保护的Xaa基团或受保护的Yaa基团，以便避免所述肽根据所采用的连接化学作用产生环化或多联体。为了进行顺序或系列连接，对中间片段的Xaa基团进行保护(例如，Cys(Acm))，而Yaa基团不进行保护(例如，Yaa-COSR，其中，-COSR是α-羧基硫酯)。在这里，Yaa基团是游离的，能够与具有未保护的Xaa基团的第二种肽起反应，其中，第二种肽缺乏游离的Yaa基团。在连接之后，将保护基团除去，以便再生Xaa基团，用于随后的连接反应。该过程可以根据需要持续进行，因此产生了延长的多肽链。Yaa基团的保护对于汇集化学连接来说是特别有用的，这种连接涉及到由四种或四种以上片段组成的最终连接产物的产生。例如，对于由四个片段连接产生的蛋白目的物来说(即三次连接反应)，相当于所述蛋白的一个末端的两个片段和相当于所述蛋白的另一末端的两个片段可以平行连接，这一点与顺序连接相反，并且在最终的连接反应中连接两个末端。在美国专利申请流水号60/231339中披露了将所述汇集化学连接方法用于硫酯介导的化学连接反应(例如，天然的和延伸的天然化学连接)，该专利被收作本文参考。在这里，在图1E、2C和4C中同样示出了可以在所述肽片段上存在或缺乏的基团的多样性。
图4A-4C表示如何按照本发明的原理完成所得到的侧链硫醇的天然化学连接和化学修饰，具体地讲，图4A-4B表示利用在所得到的半胱氨酸侧链硫醇的连接位点上进行天然化学连接和化学修饰以便通过硫代烷基化形成“假氨基酸”(用
Figure A0181524700561
Xaa表示)，并产生包括硫醚键的化学修饰的侧链(用
Figure A0181524700562
表示)。在没有示出的另一种实施方案中，可以通过脱硫化反应将所述侧链硫醇转化成丙氨酸(Liang等，J.Amer.Chem.Soc.，2001，123，4：526-533)。这两种反应的一个重要方面是，用合适的保护基团(PG)对不希望转化或修饰的任何其他侧链硫醇进行保护，或进行多片段连接以及正交保护基团(PG’)，其中，具有羧基末端Yaa基团的片段包括一个受保护的氨基末端Xaa基团，即PG-Xaa肽，在图4B中以举例形式提供。图4C表示在图4A-4B、以及图1A-1E、图2A-2C、和图3A-3B的连接和聚合物修饰中使用的肽片段上的可以存在或不存在的基团的多样性。
图5A-5B表示用于制备本发明的水溶性聚合物U-B-Polymer-J*的支化核心(B)和独特的化学选择性官能团(U)的固相方法。该方法可以在溶液中进行，不过业已证实固相方法是优选的。具体地讲，图5A表示具有反应性基团(
Figure A0181524700563
)的正交保护的U-B前体部分，而所述结构的基本几何结构用点表示，所述点通过键( )连接；这种基本几何结构并不是要限定所采用的化学键或基团的类型，而仅仅是说明用于构建结构的相对几何点，以及适用于产生本发明的U-B部分的化学修饰点。将正交保护的U-B前体偶合到含有合适的可裂解接头和共同活性基团(
Figure A0181524700565
)的聚合物支持物/树脂上，在激活之后，它能够与U-B前体共价连接：
该系统采用了聚合物支持的有机化学原理。在偶合之后，按所示方法对支化核心进行修饰(仅仅示出了第一个分支点，不过可能存在或不存在其他的分化点)，以便产生适用于随后连接需要的聚合物成分的支化核心，所述聚合物成分如基本上无抗原性的、水溶性直链聚合物。还示出了U基团，它可以作为正交保护的U-B前体的一部分在合成开始时提供，或者在修饰支化核心B期间或之后修饰。尽管聚合物成分的连接可以在树脂上完成，即在裂解之前进行，一种优选方法是从聚合物支持物/树脂上裂解U-B部分，以便产生能够纯化的U-B核心，该核心随后连接所述聚合物成分。正如所说明的，构建核心基团B的侧面分支点，以便包括一个官能团(Func)，它们可以是相同的或不同的，并且可以进行可恢复的保护(PG，PG’或PG”)或不进行保护。在每一种情况下，连接聚合物成分的最终步骤都包括在侧面分支点上产生官能团(Func)，并且产生基团U(参见图7)。图5B表示另一种方法，其中，将被保护的U-B前体用于与具有一个接头的聚合物支持物结合，它能在裂解之后产生需要的保护的或未保护的U-基团。图5B还表示组装前的分支核心B与聚合物支持物的连接，以及利用U-基团产生树脂制备U-B部分，用于随后连接聚合物成分。
图6A-6D表示用于制备本发明的优选的基本上无抗原性的水溶性聚酰胺聚合物-J*成分的固相方法，该成分随后用于结合U-B核心。尽管示出了作为优选方法的固相方法，液相方法也可用于获得相同的最终结果。在图6A-6B中，利用固相有机化学原理偶合二酸和二氨基单位。可以任选掺入被保护的氨基-X’-酸和/或氨基-Y’-酸单位，以便在具有结构式-[NH-Y-NHCO-X-CO]-的聚酰胺结构的最终裂解产物上产生基团X和Y的额外的多样性。图6A表示沿N-至C-末端方向进行的合成，而图6B表示沿C-至N-末端方向进行的合成。在图6C和6D中，用固相有机化学原理连接受保护的氨基X’-酸和/或氨基Y’-酸单位。图6C表示沿N-至C-末端方向进行的合成，而图6D表示沿C-至N-末端方向进行的合成。从图6A-6D中可以看出，可以精确控制最终聚酰胺产物的性质，这取决于为了合成而进行的循环的次数。另外，可以将侧基J*构建成基本任何用户确定的性质。当采用单分散性单元X、Y、X’和Y’时，可以精确地控制最终的聚酰胺产物的确切分子结构。
在图7中示出了用于将U-B成分连接到聚合物-J*成分上，以便产生本发明的具有结构式U-B-Ploymer-J*的优选合成聚合物结构的优选方法。正如所说明的，可以提供各种保护基团，并且选择性地取决于特定结构的预期最终用途。还示出了生产需要的U-B-Ploymer-J*结构的不同途径，包括固相方法和液相方法。
图8表示将水溶性聚合物精确连接在可用于连接并生产本发明的生物活性合成蛋白的肽片段上的另一种方法。第一个步骤采用了固相肽合成(SPPS)(例如，Fmoc或Boc SPPS)，其中，用正交保护基团保护用于聚合物连接的氨基酸侧链(例如，如果使用Fmoc SPPS，可以用Boc基团保护聚合物连接位点，或者如果使用Boc SPPS，可以使用Fmoc基团作为正交保护基团)。在肽合成之后，选择性地除去正交保护基团，而所述肽的其余部分仍然受到保护。由此提供了用于下一个步骤的单一连接位点-固相聚合物合成。一旦除去了正交保护基团，就可以作为前体连接聚合物链。更优选的是，采用图6A-6D所示的方法通过连续轮次的聚合物合成构建所述聚合物链。尽管示出了单一的聚合物连接位点，但可以提供一个以上的连接位点。
4.前体趋化因子
与制备聚合物修饰的生物活性合成趋化因子相关的第三种成分具有最佳体外生物活性，其特征是能下调与它结合的趋化因子受体。其中包括前体趋化因子的选择(即选择用于在它上面连接水溶性聚合物的靶趋化因子)，该趋化因子的效力比所需要的聚合物修饰的生物活性合成趋化因子的理想效力范围高大约1-5倍，优选大约5-10倍或更高(其中，效力是通过相对基于体外细胞测定的EC50测定的)。
举例来说，在鉴定包括具有用于抑制病毒感染的理想的ED50的聚合物修饰的Rantes的合成趋化因子时，合成了一组非聚合物修饰的前体类似物，并且通过细胞融合测定筛选HIV感染。将聚合物修饰形式的靶抗融合效力设定为10nM或比野生型Rantes更低，野生型Rantes大约为20nM或更高。在制备需要的前体Rantes趋化因子时，对以下部分进行一系列修饰：(1)N-末端残基；(2)N-末端区内部；和(3)C-末端区。发现了特别有效的前体类似物，其中，相当于野生型Rantes的1号位置上的丝氨酸被n-壬酰基部分所取代，相当于野生型Rantes的3号位置上的酪氨酸被L-环己基甘氨酸所取代，并且通过二肽(Lys69-Leu70)接头部分将脂肪酸部分连接在所述C-末端残基上；还发现了一种更有效的类似物，它同时包括上述改变和用L-硫代脯氨酸取代野生型Rantes的2号位置上的脯氨酸。业已发现，当将直链或支化水溶性聚合物连接在含有一种或多种上述变化的所述Rantes类似物的C-末端位点上时，就可以获得聚合物修饰形式的理想的靶抗融合效力。即获得了包括Rantes类似物的一系列合成趋化因子，这些趋化因子抑制病毒感染的ED50在10nM范围内或更低。具体地讲，将直链和支化水溶性聚合物结构连接在C-末端位点上(67号位置，相当于野生型Rantes的67号位置上的甲硫氨酸)，该位点邻近野生型Rantes的聚集位点(66号位置，相当于野生型Rantes的66号位置上的谷氨酸)。在所述位点上添加水溶性聚合物不仅会破坏不希望的聚合，聚合物修饰的形式具有在10nM和更低目标范围内的效力范围。这一观察与以下发现吻合，即用于聚合物修饰的前体趋化因子的起始效力优选比聚合物修饰的合成趋化因子的理想效力高大约1-5倍，优选大约5-10倍或更高(其中，效力是相对基于体外细胞的测定通过EC50测定的)。另外，业已发现，Rantes的每一种聚合物修饰的类似物具有在诸如大鼠或小鼠的相关动物模型中测定的明显改善了的循环半衰期。这种掺入能提高前体趋化因子效力的改变的系统方法普遍适用于其他趋化因子。因此，所述前体趋化因子的选择可用于产生表现出效力和体内血清循环半衰期之间的优选平衡的聚合物修饰的生物活性合成趋化因子。
C.对本发明趋化因子进行可检测标记
本发明的生物活性合成趋化因子还可以包括可检测标记，如荧光团和导入特定的选择位点的其他取代基团，所述标记将分子转化成与趋化因子作用、病毒抑制等相关的膜和细胞生物学事件的探针，以及用于监测药代动力学等。优选将可检测的标记连接在本发明生物活性合成趋化因子的C-末端区上。可检测标记可以在所述趋化因子多肽链的合成期间或合成之后掺入。例如，可以在链组装期间将可检测的标记掺入预连接的肽片段上。例如，可以在除去其他保护基团并从树脂上释放出标记过的肽之前，将荧光团方便地结合在树脂结合的肽上面的未保护的反应性基团上。含有可检测标记的氨基酸衍生物和用于将其掺入肽或多肽序列上的化学合成技术是众所周知的，并且可用于这一目的。这样，就可以将所得到的趋化因子多肽链连接产物设计成在选择的预先规定的位置上含有一个或多个可检测的标记。另外，可以将可检测标记添加在反应性基团上，优选存在于肽片段连接之前或者甚至是在连接之后的肽片段的特定氨基酸上的能够进行位点特异性连接的化学选择性反应性基团，如酮或醛基团。
适合这一目的的可检测标记包括光活性基团，以及生色团，包括荧光团和其他染料，或诸如生物素的半抗原。所述标记物被从很多不同的商业渠道获得(例如，参见Molecular Probes，Oregon USA；Sigmaand affiliates，St.Louis MO，USA；等)。为了在树脂上进行标记，荧光素、伊红、Oregon绿、罗丹明绿、Rhodol绿、四甲基罗丹明、罗丹明红、德克萨斯红、香豆素和NBD荧光团、dabcyl生色团和生物素都对氟化氢(HF)，以及大多数的其他酸稳定并因此适合通过固相合成掺入(Peled等，Biochemistry，1994，33：7211；Ben-Efraim等，Biochemistry，1994，33；6966)。除了香豆素之外，所述荧光团对于用来对使用Fmoc化学方法合成的肽进行脱保护的试剂来说是稳定的(Strahilevitz等，Biochemistry，1994，33：10951)。还可利用ε-dabcyl-L-赖氨酸的t-Boc和α-Fmoc衍生物将dabcyl生色团掺入多肽片段的特定位点。Dabcyl生色团具有宽的可见光吸收范围，并可用作淬灭基团。还可利用dabcyl琥珀酰亚胺基酯将Dabcyl基团掺入N-末端(Maggiora等，J.Med.Chem.，1992，35：3727)。EDANS是用于在FRET实验中与Dabcyl淬灭基团配对的常用荧光团。该荧光团可以在肽的自动合成期间利用5-((2-(t-Boc)-γ-谷氨酰氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸方便地导入(Maggiora等，J.Med.Chem.，1992，35：3727)。在化学合成期间，可以利用α-(t-Boc)-ε-丹酰-L-赖氨酸将α-(t-Boc)-ε-丹酰荧光团掺入多肽(Gauthier等，Arch.Biochem.Biophys.，1993，306：304)。与EDANS一样，该荧光团的荧光与Dabcyl的吸收重叠。肽的位点特异性生物素化可以利用t-Boc-保护的生物胞素的衍生物(Gealhen等，Anal.Biochem.，1992，202：68)或诸如NHS生物素的其他公知生物素化衍生物等实现。在进行t-Boc或Fmoc保护之后还将消旋二苯酮苯丙氨酸类似物掺入肽(Jiang等，Intl.J.Peptide Prot.Res.，1995，45：106)。还可以在对产物进行HPLC纯化期间完成非对映体的分辨，还可以通过本领域的标准技术分辩未保护的二苯酮。可用于进行树脂标记的氨基酸的其他例子包括用于肟连接的具有酮的氨基酸，叠氮/羟基色氨酸，biotyl赖氨酸和D-氨基酸。可以理解的是，可以按照本领域的标准技术通过常规合成制备用于自动化肽合成的其他受保护氨基酸。在另一种实施方案中，本发明的生物活性合成趋化因子可以包括结合在它上面的药物(例如，参见WO00/04926)。
D.合成本发明的趋化因子并且连接水溶性聚合物
还提供了生产本发明的生物活性合成趋化因子的方法，该方法包括(i)合成天然存在的趋化因子的类似物，它包括氨基酸序列基本上与天然存在的趋化因子同源的多肽链，其中，用选自脂族链和氨基酸衍生物的成分对所述多肽链上的N-末端、N-环和C-末端中的一个或多个进行修饰；和(ii)筛选与相应的天然存在的趋化因子相比具有拮抗剂活性的趋化因子类似物。
具体地讲，用于生产本发明的N-末端修饰的生物活性合成趋化因子的方法包括：(i)合成天然存在的趋化因子的类似物，它包括氨基酸序列基本上与天然存在的趋化因子同源的多肽链，其中，用脂族链和一种或多种氨基酸衍生物对所述多肽链的N-末端进行修饰；和(ii)筛选与相应的天然存在的趋化因子相比具有拮抗剂活性的趋化因子类似物。用于生产本发明的C-末端修饰的生物活性合成趋化因子的方法包括：(i)合成天然存在的趋化因子的类似物，它包括氨基酸序列基本上与天然存在的趋化因子同源的多肽链，其中，用脂族链或多环对所述多肽链的C-末端进行修饰；和(ii)筛选与相应的天然存在的趋化因子相比具有拮抗剂活性的趋化因子类似物。用于生产本发明的N-/C-末端修饰的生物活性合成趋化因子的方法包括：(i)合成天然存在的趋化因子的类似物，它包括氨基酸序列基本上与天然存在的趋化因子同源的多肽链，其中，用脂族链和一种或多种氨基酸衍生物对所述多肽链的N-末端进行修饰，并且用脂族链或多环对所述多肽链的C-末端进行修饰；和(ii)筛选与相应的天然存在的趋化因子相比具有拮抗剂活性的趋化因子类似物。
本发明生物活性合成趋化因子的合成是通过化学合成(即无核糖体的合成)，或生物学合成(即核糖体合成)和化学合成的组合完成的。对于化学合成来说，本发明的生物活性合成趋化因子可以通过逐步链组装或片段缩合技术完整地制备，如利用Fmoc和tBoc方法进行的固相或液相肽合成，或通过化学连接完全由链组装或链组装和生物学生产的组合制备的肽片段。所述逐步链组装或片段缩合以及连接技术为本领域所熟知(例如，参见
Kent，S.B.H.，Ann.Rev.Biochem.(1988)57：9557-989；Dawson et al.，Methods Enzymol.(1997)287：34-45；Muir et al.，Methods Enzymol.(1997)289：266-298；Wilken et al.，Current Opinion In Biotechnology(1998)9：412-426；Ingenito et al.，J.Amer.Chem.Soc.(1999)121(49)：11369-11374；and Muir et al.，Chemistry&Biology(1999)6：R247-R256)
对于化学连接来说，将具有N-末端官能团的第一种肽片段连接到具有C-末端官能团的第二种肽片段上，C-末端官能团能与N-末端官能团起反应，在它们之间形成共价链。根据所选择的官能团，所述连接反应产生了在连接位点上具有天然酰胺键或非天然共价键的产物。用于化学连接的第一种或第二种肽片段通常是通过逐步链组装或片段缩合制备的。具体地讲，当本发明的生物活性合成趋化因子是通过连接肽片段制备的时，所述片段被制备成包括适应于将要用于连接的化学选择性反应化学方法的化学选择性活性侧基。所述化学方法包括，但不限于天然化学连接(Dawson等，Science，1994，266：776-779；Kent等，WO96/34878)，延伸的一般化学连接(Kent等，WO98/28434)，成肟化学连接(Rose等，J.Amer.Chem.Soc.，1994，116：30-33)，成硫酯连接(Schnolzer等，Science，1992，256：221-225)，成硫醚连接(Englebretsen等，Tet.Letts.，1995，36，48：8871-8874)，成腙连接(Gaertner等，Bioconj.Chem.，1994，5，4：333-338)，和成噻唑烷连接和成噁唑烷连接(Zhang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，16：9184-9189；Tam等，WO95/00846)。
选择特定连接化学方法的反应条件，以便保持连接成分的理想的相互作用。例如，pH和温度，所述肽和成分的水溶解度，肽的比例，含水量和每一种肽的组成可以改变，以便优化连接。还可以通过添加或排除试剂将所述肽溶解到不同的程度，以便控制所需连接反应的特异性和速度。还可以通过与一种或多种内部和/或外部对照比较，分析所需要的化学选择性反应产物，以便方便地确定反应条件。
Kent等在WO96/34878中披露了采用天然化学连接的化学合成的优选方法，Offord在WO99/11666中披露了制备在N-和/或C-末端化学修饰的蛋白的方法，以上专利的内容被收作本文的内容。一般，让含有C-末端硫酯的第一种肽与具有未氧化的巯基侧链的N-末端半胱氨酸的第二种肽起反应。在存在催化数量的硫醇，优选苄基硫醇，硫代苯酚，2-硝基硫代苯酚，2-硫代苯甲酸，2-硫代吡啶等的条件下所述N-末端半胱氨酸的未氧化的巯基侧链与C-末端的硫酯缩合。通过利用β-氨基硫酯键连接所述第一种和第二种肽产生了中间肽，中间肽重排产生包括通过酰胺键连接的所述第一种和第二种肽的肽产物。
对于化学和生物学生产的组合来说，一种肽片段是通过化学合成制备的，而另一种肽片段是利用重组方法制备的，然后通过化学连接连接所述片段，以便产生全长的产物。例如，可以利用intein表达系统通过intein蛋白剪接元件的诱导型自我裂解活性产生C-末端硫酯肽片段。具体地讲，intein在存在诸如DTT、b-巯基乙醇或半胱氨酸的条件下能发生特异性自我裂解，由此产生了具有C-末端硫酯的肽片段(例如，参见Muir等，Chemistry&Biology，1999，6：R247-R256；Chong，Gene，1997，192：277-281；Chong等，Nucl.Acids Res.，1998，26：5109-5115；Evans等，Protein Science，1998，7：2256-2264；和Cotton等，Chemistry&Biology，1999，6，9：247-256)。然后可以利用这种具有C-末端硫酯的肽连接具有N-末端硫酯反应性官能性的第二种肽，如具有用于天然化学连接的N-末端半胱氨酸的肽片段。
可以在链组装期间、链组装之后或通过其组合时掺入疏水性脂族链和氨基酸衍生物。对于在链组装期间进行的掺入来说，通过逐步或片段缩合和/或连接链组装方法掺入氨基酸衍生物和/或在它上面连接有脂族链的氨基酸。所述氨基酸可以通过逐步方式在肽合成期间添加到生长中的肽链上，以便组装用于连接的肽片段，或者在某些场合下通过从聚合物支持物上裂解提供侧面N-或C-末端修饰，以便由裂解产物产生需要的疏水性脂族链。对于链组装后来说，在链组装期间掺入具有反应性官能团的氨基酸或其衍生物(保护形式的或非保护形式的)，然后以它的非保护反应性形式用于所需疏水性部分的连接，即肽合成后的连接反应。链组装后连接可以在变性的线性肽链上进行，或在多肽链折叠后进行。在一种优选实施方案中，氨基酸衍生物是在肽合成期间添加到感兴趣的氨基酸位点上的，而N-、C-和/或N-/C-末端疏水性脂族链是在肽合成之后通过结合反应添加的。根据所需要的共价连接，可以采用多种结合化学方法中的任一种(例如，参见Plaue，S.等，Biologicals.，1990，18，3：147-57；Wade J.D.等，Australas Biotechnol.1993，3，6：332-6；Doscher，M.S.等，MethodsEnzymol.，1977，47：578-617；Hancock，D.C.等，Mol.Biotechnol.，1995，4，1：73-86；Albericio，F.等，Methods Enzymol.，1997，289：313-36)以及连接化学方法。可以按照本领域的标准技术实现本发明生物活性合成趋化因子的折叠，例如，参见WO99/11655；WO99/11666，Dawson等，Methods Enzymol.，1997，287：34-45)。
为了筛选合成趋化因子化合物的拮抗剂活性，通过基于体内或体外的测定方法检验所述化合物，其特征是将趋化因子配体直接或间接连接到其相应的受体上。趋化因子受体及其相应的野生型趋化因子的例子包括CXXXCR1(Fractalkine)；XCR1(SCM-1)；CXCR2(GRO，LIX，MIP-2)；CXCR3(MIG，IP-10)；CXCR4(SDF-1)；CXCR5(BLC)；CCR1(MIP-1α，RANTES，MCP-3)；CCR2(MCP-1，MCP-3，MCP-5)；CCR3(Eotexin，RANTES，MIP-1α)；CCR4(MDC，TARC)；CCR5(RANTES，MIP-1α，MIP-1β)；CCR6(MIP-3α)；CCR7(SLC，MIP-3β)；CCR8(TCA-3)和CCR9(TECK)。所述系统的体内和体外测定是众所周知的，并且可以方便地获得从头制备。例如，参见US5652133；US5834419；WO97/44054；WO00/04926；和WO900/0492。例如，通常将能表达一种或多种趋化因子的受体的天然的、转化的和/或转基因细胞系用于监测趋化因子诱导的趋化性或在接触本发明的生物活性合成趋化因子时对该事件的抑制作用。例如，还可以用动物模型监测与本发明的生物活性合成趋化因子治疗组合时的反应特征，或对所述化合物的药代动力学和药物动态学特征进行特征分析。为了作为病毒感染抑制剂分析本发明的化合物，可以采用利用靶细胞系和被膜细胞系的被膜介导的细胞融合测定方法筛选本发明生物活性合成趋化因子的抑制HIV感染的能力。当然，还可将无细胞病毒感染分析方法用于这一目的。
例如，为了评估趋化性的总体拮抗性，可以采用外周血白细胞，如按照业已完善的分离单核细胞的方法从正常供体中分离的T淋巴细胞和嗜中性粒细胞。可以构建一组C，CC，CCXXXC和CXC趋化因子受体表达测试细胞，并在接触本发明的单一化合物的一系列稀释液之后进行评估。可以用天然趋化因子作对照，例如，用编码各种趋化因子受体的各种表达盒转染的一组细胞适用于这一目的。例如，可以利用表达CXCR4/融合体/SESTR，CCR3，CCR5，CXC4的转化体筛选诸如RANTES，SDF-1α、SDF-1β和MIP的趋化因子的拮抗剂(所述细胞可以从各种商业和/或学术来源获得，或者按照标准方法制备，例如，参见Risau等，Nature，387：671-674，1997；Angiololo等，AnnalsNY Acad.Sci.，1996，795：158-167；Friedlander等，Science，1995，870：1500-1502)。所述结果能够以趋化性指数(CI)形式表示，该指数表示与对照培养基相比由刺激诱导的细胞迁移增加的倍数，以及测定的统计学显著性。
还可以进行受体结合测定，例如，评估竞争抑制作用与受体循环作用(参见，Signoret，N.et al.，
Signoret，N.et al.，“Endocytosis and recycling of the HIV coreceptor CCR5，”J Cell Biol.2000151(6)：1281-94；Signoret，N.et al.，“Analysis of chemokine receptor endocytosisand recycling，”Methods Mol Biol.2000；138：197-207；Pelchen-Matthews，A.et al.，“Chemokine receptor trafficking and viral replication，”Immunol Rev.1999Apr；168：33-49；Daugherty，B.L.et al.，“Radiolabeled chemokine binding assays，”Methods Mol Biol.2000；138：129-34；Mack，M.et al.“Downmodulation andrecycling of chemokine receptors，”Methods Mol Biol.2000；138：191-5；所有文献被收作本文参考)。该方法是众所周知的，并且通常按照标准方法在存在浓度不断增加的未标记过的天然趋化因子的条件下使用标记过的本发明的生物活性合成趋化因子。当然，可以对任一种配体或两种配体进行标记，在这种类型的测定中，可以对结合数据进行分析，例如，采用诸如LIGAND的计算机程序(P.Munson，Division ofcomputer researchs and technology，NIH，Bethesda，MD)，并且用“单一位点”和“双位点”模型进行Scatcsard曲线分析，与天然白细胞或能表达靶趋化因子受体的受体转染的细胞组进行比较。然后通过以下公式计算未标记过的配体竞争结合的速度：％抑制＝1-(在存在未标记过的趋化因子的条件下的结合/在仅存在培养基的情况下的结合)×100。
为了筛选所述化合物抑制或缓解病毒感染和疾病的能力，可以用一组能稳定表达合适受体的接触各种病毒菌株和对照的细胞筛选所述化合物。例如，可以将能表达CCR3、CCR5、CXC4或CXCR4受体的U87/CD4细胞用于筛选M-向性、T-向性和双向性HIV菌株的感染。病毒感染的抑制作用可以通过相对趋化因子浓度和对照浓度的感染百分比表示。例如，参见McKnight等，Virology，1994，201：8-18；和Mosier等，Science，1993，260：689-692；Simmons等，Science，1997，276：276-279；Wu等，J.Exp.Med.，1997，185：168-169；和Trkola等，Nature，1996，384：184-186。钙转移测定是用于筛选受体结合拮抗剂的另一种例子，例如，用于鉴定天然趋化因子的拮抗剂，这种拮抗剂对嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞具有趋化性(Jose等，J.Exp.Med.，179：881-887，1994)。作为另一种例子，本发明化合物的拮抗剂活性可以通过鸡绒毛尿囊膜(CAM)测定评估(Oikawa等，Cancer Lett.，1991，59：57-66)。
本发明的生物活性合成趋化因子具有很多用途，包括用作研究工具，诊断剂和治疗剂。具体地讲，业已发现本发明的生物活性合成趋化因子具有有价值的药理学特征，并且业已证实能有效抑制与相关的野生型分子相关的炎性作用-所述野生型分子与各种疾病相关，包括哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、粉瘤/动脉粥样硬化、器官移植排斥、和类风湿关节炎。因此，可将其用于治疗哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、粉瘤/动脉粥样硬化、器官移植排斥、和类风湿关节炎。例如，业已证实诸如RANTES和SDF-1α和SDF-1β拮抗剂的本发明的若干种生物活性合成趋化因子能抑制HIV-1感染，并且可将拮抗剂(例如，vMIP-II类似物)用于同一种目的。因此，本发明的RANTES或SDF-1α或SDF-1β拮抗剂和vVIP-II类似物可用于在哺乳动物抑制HIV-1。所述化合物用于抗HIV-1的潜在用途是通过披露于以下实施例中的方法确定的。所述化合物用于抗炎性作用的潜在用途是通过本领域技术人员所公知的方法确定的。另外，可以理解的是，本发明的生物活性合成趋化因子可以单独使用，或者彼此组合使用，以及与其他能协同治疗特定疾病的非趋化因子药物组合使用。
举例来说，而不是要进行限定，以下是野生型趋化因子分子及其相关的生物学特性的某些具体例子，用于说明制备本发明的生物活性合成趋化因子的一般用途。例如，SCM-1是在脾脏中表达的C-趋化因子。它与CC和CXC-趋化因子显著相关，主要的差别是，它仅具有在这种蛋白中保守的四个半胱氨酸中的第二个和第四个(Yoshida等，FEBLetters，1995，360，2：105-159；Yoshida等，J.Biol.Chem.，1998，273，26：16551-16554)。在人体中，存在两种高度同源的SCM-1蛋白，SCM-1α和SCM-1β，这两种蛋白的差别在于两个氨基酸的取代，发现SCM-1与lymphotactin-鼠类淋巴细胞特异性趋化因子具有大约60％的相同性。因此，SCM-1和lymphotactin可以代表C-趋化因子或γ-趋化因子的人类或鼠类原型。在通过工程改造能表达孤独受体GPR5的鼠L1.2细胞中，两种SCM-1分子能特异性地诱导迁移，所述孤独受体主要在胎盘中表达，并且能在各种人类组织的脾脏和胸腺中弱表达。因此，SCM-1的拮抗剂可用于抑制GPR4的正常功能。
作为另一种例子，Fractalkine的可溶形式，即一种76个氨基酸的CXXXC趋化因子是T细胞和单核细胞的有效趋化引诱物，但不是嗜中性粒细胞的趋化引诱物。在用TNF或IL-1刺激之后Fractalkine显著增加。Fractalkine的人类受体被命名为CX3CR1。该受体能介导Fractalkine的粘性和迁移性功能。所述人类受体能够在嗜中性粒细胞、单核细胞、T淋巴细胞和包括大脑在内的若干实体器官中表达。业已证实所述受体能与CD4一起作为来自HIV-1的一级分离物的被膜蛋白的共同受体。细胞-细胞融合测定证实，Fractalkine能有效地并且特异性地抑制融合(例如，参见Bazan等，Nature，1997，385，6617：640-644；Combadiere等，J.Biol.Chem.，1998，273，37：23799-23804；Rossi等，Genomics，1998，47，2：163-170；和Faure等，Science，2000，287：2274-2277)。因此，很显然，Fractalkine的拮抗剂可用于治疗与TNF或IL1途径相关的各种关节疾病，如关节炎，以及用作HIV感染的阻断剂。
Eotaxin是另一种例子，该蛋白的长度为74个氨基酸，并且由于其特有的半胱氨酸形式被归入CC-趋化因子类型。业已在被用作过敏性炎症模型的豚鼠的支气管肺泡洗液中发现了这种蛋白，并且和与哮喘相关的疾病相关。在1-2pM的剂量下，Eotaxin能在皮肤内诱导嗜酸性粒细胞的显著积累，而不会到嗜中性粒细胞的积累产生显著影响。在体外，Eotaxin是豚鼠和人类嗜酸性粒细胞的有效刺激物。所述因子似乎在豚鼠嗜酸性粒细胞上拥有与RANTES相同的结合位点。Eotaxin能在正常人嗜酸性粒细胞中诱导钙流量反应，但不能在嗜中性粒细胞或单核细胞中诱导这种反应。用其他CC-趋化因子对嗜酸性粒细胞进行预处理不能对所述反应脱敏化。在嗜碱性粒细胞中，Eotaxin能诱导比RANTES高的趋化反应，但是它对组氨酸的释放或白三烯C4产生仅有微弱的影响。它还在B细胞淋巴瘤细胞的趋化性中发挥作用。Eotaxin的主要受体是CCR3(例如，参见Bartels等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1996，225，3：1045-51；Jose等，J.Exp.Med.，1994，179：881-887；Ponath等，J.Clin.Investigation，1996，97，3：604-612；Ponath等，J.Exp.Med.，1996，183，6：2437-2448；Yamada等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1997，231，2：365-368)。因此，可以将Eotaxi的拮抗剂用作哮喘和其他与嗜酸性粒细胞相关的过敏性疾病的有效调节剂。
RANTES是靶趋化因子的另一个例子，对它的拮抗剂是特别感兴趣的。它是一种参与从炎症、器官排斥到HIV感染的很多疾病的CC-趋化因子。RANTES的合成是由TNFα和IL1α诱导的，而不是由TGFβ、INFγ和IL-6诱导的。RANTES是由培养物中的循环T-细胞和T-细胞克隆生产的，而不是由至今为止任何测试的T细胞系产生的。在刺激T淋巴细胞之后抑制了RANTES的表达。RANTES对T细胞、人类嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞有趋化性，并且在将白细胞寡集到炎症部位方面发挥积极作用。RANTES还能激活嗜酸性粒细胞，以便释放，例如，嗜酸性阳离子型蛋白，它能改变嗜酸性粒细胞的密度，并且使得它们密度降低，这被认为体现了普遍化的细胞激活状态，并且经常与诸如哮喘和过敏性鼻炎的疾病相关。RANTES还是氧化代谢的有效的嗜酸性粒细胞特异性激活物。RANTES能提高单核细胞与内皮细胞的粘附性。它能选择性地支持能表达细胞表面标记CD4和UCHL1的单核细胞和T淋巴细胞迁移。以上细胞被认为能预刺激具有记忆T细胞功能的辅助T细胞。RANTES能激活来自某些特定嗜碱性粒细胞供体的人类嗜碱性粒细胞，并且导致组胺的释放。另一方面，RANTES还能抑制由包括最有效的组胺诱导物之一MCAF的若干种细胞因子诱导的嗜碱性粒细胞的组胺释放。
最近业已证实RANTES具有除了趋化性以外的生物学活性。它能够诱导被称作CHAK(CC-趋化因子激活的杀伤细胞)的杀伤细胞的增殖和激活，所述细胞类似于由IL2激活的细胞。RANTES是由人滑膜成纤维细胞表达的，并且可能参与类风湿关节炎中的持续性发炎过程相关。业已在人单核细胞白血病细胞系PHT-1中鉴定了RANTES的高亲和力受体(大约700个结合位点/细胞；Kd＝700pM)，在趋化性和钙迁移测定中，所述细胞系对RANTES有反应。通过用MCAF(单核细胞趋化性和激活因子)或MIP-1-α(巨噬细胞炎性蛋白)预培养，能明显抑制THP-1细胞对RANTES的趋化反应。MCAF和MIP-1-α能与RANTES竞争结合单核细胞。RANTES的受体是CCR1、CCR3和CCR5。RANTES的拮抗剂的临床用途和价值是多方面的。例如，天然RANTES的抗体能显著抑制与实验性系膜增殖性肾炎相关的细胞浸润。另外，天然RANTES似乎在经历与肾脏移植排斥相关的细胞排斥的人肾脏异体移植物中高度表达(Pattison等，Lancet，1994，343，8891：209-11，1994)。业已证实RANTES的化学修饰形式(氨基氧戊烷-RANTES或AOP-RANTES；和n-壬酰基-RANTES或NNY-RANTES)起着趋化因子的CCR-5受体的拮抗剂的作用，并且具有抑制HIV-1感染的能力。因此，本发明的拮抗剂N-、C-和N-/C-末端修饰的RANTES类似物可用作治疗诸如哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、粉瘤/动脉粥样硬化、器官移植排斥、和类风湿关节炎的疾病的抗炎制剂。
趋化因子SDF-1α和β的拮抗剂是其他的例子，它们属于趋化因子的CXC类。SDF-1β的不同在于在C-末端具有四个额外的氨基酸。这些趋化因子与其非人对应体的相同性超过92％。SDF-1在除了血细胞之外的其他细胞是普遍表达的。SDF-1作用于淋巴细胞和单核细胞，但在体外不能作用于嗜中性粒细胞，并且在体内是单核细胞的高效趋化剂。它还能在淋巴细胞内诱导细胞内肌动蛋白聚合。SDF-1在体外和体内都起着人造血祖细胞的趋化剂作用，产生混合类型的祖细胞和更原始的类型。SDF-1似乎还参与心室隔膜的形成。CD34+细胞的趋化性会针对SDF-1和IL-3的组合作用而增强。业已证实SDF还能诱导上述细胞中细胞质钙的瞬时提高。SDF-1的主要受体是CXCR4，它还起着HIV-1的主要T淋巴细胞共同受体的作用，例如，参见Aiuti等，J.Exp.Med.，1997，185，1：111-120，1997；Bleul等，J.Exp.Med.，1996，184，3：1101-1109，1996；Bleul等，Nature，1996，382，6594：829-833；D’Apuzzo等，European J.Immunol.，1997，27，7：1788-1793；Nagsawa等，Nature，1996，382：635-638；Oberlin等，Nature，1996，382，6594：833-835。因此，举例来说，本发明的SDF-1α或SDF-1β拮抗剂可用作治疗诸如哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、粉瘤/动脉粥样硬化、器官移植排斥、和类风湿关节炎的疾病的抗炎制剂。另外，本发明的SDF-1α或SDF-1β拮抗剂可以单独使用或者与诸如本发明的RANTES拮抗剂类似物的其他化合物组合使用用于阻断哺乳动物中针对促炎细胞的寡集和/或激活的SDF-1、RANTES、MIP-1α和/或MIP-1β的作用，或治疗或抑制HIV-1感染。
因此，本发明的另一方面涉及治疗需要治疗的哺乳动物的药物组合物和方法，包括给予治疗有效量的含有本发明的一种或多种趋化因子或其可以药用的盐的化合物。“可以药用的盐”表示这样的盐，它保留了本发明多肽的生物学作用和特性，并且它在生物学方面或其他方面不是不理想的。所述盐可以源于酸或碱。酸加成盐来自无机酸，如氢氯酸、氢溴酸、硫酸(产生硫酸盐和亚硫酸盐)、硝酸、和磷酸等，以及有机酸，如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、水杨酸、和p-对甲苯磺酸等。碱加成盐可源于无机碱，包括钠、钾、锂、铵、钙、和锰盐等。源于有机碱的盐包括由伯胺、仲胺和叔胺、取代的胺形成的盐，包括天然存在的取代胺、和环化胺，包括异丙基胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、氨丁三醇、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、hydrabamine、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、N-烷基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、和N-乙基哌啶等。优选的有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、哌啶、可可碱、和胆碱。
本文所使用的术语“治疗”包括对哺乳动物特别是人的疾病的任何治疗，并且包括：(i)防止有患病的倾向但尚未诊断出患病的对象发病；(ii)抑制所述疾病，即阻止其发展；或(iii)缓解所述疾病，即导致所述疾病的恢复。
在本文中，术语“通过用本发明的生物活性合成趋化因子的治疗而预防或缓解的哺乳动物疾病状态”意在包括本领域普遍公知的所有疾病状态，一般，这些疾病状态可以用本发明的生物活性合成趋化因子治疗，以及可以通过用本发明的特殊化合物治疗而预防或缓解的疾病状态。例如，所述疾病状态包括，但不限于哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、粉瘤/动脉粥样硬化、类风湿关节炎和器官移植排斥。
在本文中，术语“治疗有效量”表示在给予有需要的哺乳动物本发明的生物活性合成趋化因子时足以实施治疗(如上文所定义的)的用量，例如，作为抗炎剂，抗哮喘制剂，免疫抑制剂，或抗自身免疫病制剂抑制哺乳动物的病毒感染。构成“治疗有效量”的用量会根据趋化因子衍生物、疾病状态和严重程度、以及接受治疗的哺乳动物，其体重、年龄等而变化，不过，本领域普通技术人员可以根据现有的知识和本说明书通过常规方法确定治疗有效量。在本文中，术语“q.s.”表示添加足以实现所声称的功能的用量，例如，将溶液调整到所需要的体积(例如，100毫升)。
本发明的趋化因子及其可以药用的盐，即活性成分是以治疗有效剂量给药的，即在给予有需要的哺乳动物时，这一用量足以实现上文所述的治疗。本发明所披露的生物活性合成趋化因子的给药可以通过起着类似作用的制剂的任何可接受的给药方式进行。在本文中，“本发明的生物活性合成趋化因子”、“本发明多肽的可以药用的盐”和“活性成分”可以交换使用。
本发明的生物活性合成趋化因子在一种制剂中的含量可以在本领域技术人员所采用的整个范围内，例如，以总的制剂为基础本发明的生物活性合成趋化因子的含量为大约0.01％至大约99.99％w，并且含有大约0.01％至大约99.99％w的赋形剂。更常见的是，本发明的生物活性合成趋化因子的用量为大约0.5％-大约80％w。
尽管本发明生物活性合成趋化因子的人类剂量水平尚有待优化，一般，每天的剂量为大约0.05-25毫克/千克体重/天，最优选大约0.01-10毫克/千克体重/天。因此，在对70千克体重的人给药时，剂量范围为大约0.07毫克-3.5克/天，优选3.5毫克-1.75克/天，最优选大约0.7毫克-0.7克/天。当然，拮抗剂的给药量取决于接受治疗的对象和要预防或缓解的疾病状态，疾病的性质或严重程度，给药的方式和方案，以及处方医生的判断。这种用量的优化属于本领域普通技术人员的知识范围。
给药可以通过任何可以接受的全身或局部途径进行，例如，通过肠胃外、口服(特别适合婴儿制剂)、静脉内、鼻腔、气管吸入(即气溶胶制剂)、经皮或局部途径，呈固体形式、半固体或液体或气溶胶剂型，例如，片剂、丸剂、胶囊、粉剂、液体、溶液、乳液、可注射液体、悬浮液、栓剂、或气溶胶等。本发明的生物活性合成趋化因子还可以以持续的或受控制的释放剂型给药，包括储存注射液、渗透压泵、丸剂、和经皮(包括电转移)贴剂等，以便以预定的速度长时间给予所述多肽，优选以适合一次给予精确剂量的单位剂型给药。所述组合物可以包含常规药用载体或赋形剂以及本发明的生物活性合成趋化因子，此外，还可以包含其他医用制剂、药用制剂、载体、佐剂等。载体可以选自各种油类，包括石油、动物、植物、或合成来源的油类，例如，花生油、大豆油、矿物油、和芝麻油等。水、盐水、葡萄糖水溶液、甘油是优选的液体载体，特别适用于可注射的溶液。合适的药用载体包括淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅凝胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、硬脂酸单甘油酯、氯化钠、干燥的脱脂奶、甘油、丙二醇、水和乙醇等。其他合适的药用载体及其制剂由E.W.Martin披露于“Remington’sPharmaceutical Sciences”中。
如果需要，所给予的药用组合物还可以含有少量的无毒的辅助性物质，如润湿剂或乳化剂，以及pH缓冲剂等，例如，乙酸钠、一月桂酸山梨聚糖、油酸三乙醇胺等。
尽管可能需要更多的活性成分，可以通过口服递送本发明的生物活性合成趋化因子，使用常规的每日剂量方案，该剂量方案可以根据所需要的预防程度或疾病的缓解而调整。对于所述口服方案来说，可以通过掺入任何常用的赋形剂制备无毒组合物，例如，药用级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、聚维酮、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、交联羧甲纤维素钠、葡萄糖、明胶、蔗糖、和碳酸镁等。所述制剂可采用溶液、悬浮液、可分散的片剂、丸剂、胶囊、粉末、和缓释制剂等形式。口服制剂特别适用于治疗胃肠道疾病。通过采用能改善全身循环吸收的赋形剂可以调整为了一般全身目的的口服生物利用度，如含有乙酰化氨基酸的制剂。例如，参见US5935601和US5629020。
所述组合物可以采用胶囊、丸剂或片剂形式，因此，该组合物除了活性成分之外可以包括稀释剂，如乳糖、蔗糖、和磷酸氢钙等；分散剂，如交联羧甲纤维素钠、淀粉或其衍生物；诸如硬脂酸镁之类的润滑剂；以及粘接剂，如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、金合欢胶、明胶、纤维素及其衍生物等。
例如，可以通过将本发明的生物活性合成趋化因子(大约0.5％-大约20％)和任选性的药用佐剂溶解或分散在诸如水、盐水、葡萄糖水溶液、甘油、乙二醇、乙醇和防腐剂之类的载体中，以便形成液体或悬浮液，从而制备可以药用的液体组合物。如果需要，被服用的药用组合物还可以含有少量的无毒辅助物质，如润湿剂、悬浮剂、乳化剂或增溶剂、和pH缓冲剂等。例如，乙酸钠、柠檬酸钠、环糊精衍生物、聚环氧乙烷、山梨聚糖一月桂酸酯或硬脂酸酯等。制备所述剂量形式的实际方法是公知的或者对本领域技术人员来说是显而易见的；例如，参见Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack PublishingCompany，Easton，Pennsylvain。在任何情况下，所给予的组合物或制剂都含有一定量的活性成分，其用量能有效防止或缓解接受治疗的对象的症状。为了给婴儿服用，优选液体制剂(如糖浆或悬浮液)。
对于含有液体的固体剂型来说，优选将包含在诸如丙二醇碳酸酯、植物油或甘油三酯中的溶液或悬浮液胶囊化于明胶胶囊中。对于液体剂型来说，可以用足够数量的诸如水的可以药用的液体载体稀释用诸如聚乙二醇制备的溶液，以便定量给药。
另外，可以通过将活性成分溶解和分散在植物油、乙二醇、甘油三酯、聚丙二醇酯(例如丙二醇碳酸酯)等中制备液体或半固体形式的口服制剂，并且将所述溶液或悬浮液胶囊化于硬的或柔软的明胶胶囊外壳中。
在将本发明的生物活性合成趋化因子用于治疗上述症状时，本文所披露的活性成分的给药优选是通过肠胃外途径给药的。通常，肠胃外给药的特征是注射，包括皮下注射、肌内注射或静脉内注射，并且可以包括皮内或腹膜内注射以及胸骨内注射或输液技术。注射液可以用常规方式制备，可以制成液体溶液或悬浮液形式，适合在注射之前在液体中溶解成溶液或悬浮液的固体形式，乳液或生物相容性聚合物基的微球(例如，脂质体、聚乙二醇衍生物、聚(D，C)丙交酯等)。合适的赋形剂有，例如水、盐水、葡萄糖、甘油、或乙醇等。另外，如果需要，所给予的药用组合物还可以含有少量的无毒辅佐物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、增溶剂、和蛋白载体等，例如，乙酸钠、聚环氧乙烷、山梨聚糖单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、环糊精、血清白蛋白等。
本发明的生物活性合成趋化因子可以通过肠胃外途径服用，例如，将所述分子溶解在合适的溶剂(如水或盐水)中，或者掺入脂质体制剂中，然后分散到可接受的输液流体中。本发明多肽的典型的每日剂量可以通过一次输液给药，或者通过间隔一定时间的一系列输液给药。对于肠胃外给药来说，具有可水溶形式的特别适合的活性成分的水溶液，例如，水溶性盐形式，或含有增粘物质的含水注射悬浮液，例如，羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖，并且如果需要的话含有稳定剂。所述活性成分以及任选包括的赋形剂还可以是冷冻干燥物的形式，并且在肠胃外服用之前通过添加合适的溶剂制成溶液。
最近设计的肠胃外给药的方法采用了植入缓释或持续释放系统，以便保持稳定水平的剂量。例如，参见US3710795，US5714166和US5041292，以上文献被收作本文参考。
所述肠胃外组合物中所含的活性成分的百分比在很大程度上取决于它的特定性质，以及所述多肽的活性和受治对象的需要。不过，活性成分在溶液中0.01％-10％的百分比是可以采用的，并且，如果该组合物是固体的话百分比可以更高。然后再将它稀释到上述百分比。所述组合物在溶液中优选含有0.02-8％的活性成分。
给予本发明生物活性合成趋化因子的另一种方法采用了药团注射或连续输液方法。当治疗性处理是为了预防HIV-1感染时，这是特别优选的方法。
气溶胶给药是将本发明的生物活性合成趋化因子直接输送到呼吸道中的一种有效方法。这种方法的某些优点是：1)它避免了酶促降解作用，肠胃道的不良吸收，或由于肝脏首次通过效应而导致的治疗剂的损失；2)它可以给予那些通过其他方式给药不能达到呼吸道的靶位点的活性成分，这是由于这种活性成分的分子大小、电荷或与肺以外的部位的亲和力而造成的；3)它可以通过肺的肺泡将活性成分快速吸收到体内；和4)它避免了让其他器官系统接触所述活性成分，当这种接触会导致不理想的副作用时是特别重要的。由于以上原因，气溶胶给药特别有利于治疗哮喘、肺的局部感染、和肺和呼吸道的其他疾病或疾病状态。
有三种类型的药物吸入装置，喷雾吸入器、定量吸入器和干粉吸入器。喷雾装置能产生高速空气流，它能导致趋化因子衍生物(业已制成液体形式)以雾状形式喷射，它被携带到患者呼吸道中。定量吸入器通常具有由压缩气体包装的制剂，在驱动时，通过压缩气体排除一定量的多肽，因此提供了一种服用定量制剂的可靠方法。干粉吸入器以自由流动的粉末形式服用所述多肽，在呼吸期间可以通过该装置将粉末分散在患者吸入的空气流中。为了获得自由流动的粉末，用诸如乳糖的赋形剂配制趋化因子衍生物。将一定量的趋化因子衍生物储存在胶囊形式中，并且通过每一次动作分散给患者。上述所有方法都可用于服用本发明的趋化因子。
基于脂质体的药用制剂也适用于本发明的趋化因子。例如，参见US5631018、US5723147和US5766627。据信，脂质体的优点是与组织分布和药代动力学参数的有利变化相关，这种有利变化是由于脂质体对药物的捕获而导致的，并且本领域技术人员可将其用于本发明的多肽。还可以使用用于注射或口服的控制释放脂质体液体药用制剂。
对于通过栓剂全身给药来说，传统的粘接剂和载体包括，例如聚乙二醇或甘油三酯，例如PEG1000(96％)和PEG4000(4％)。所述栓剂可以用含有活性成分的混合物制成，活性成分的含量为大约0.5％至大约10％(w/w)；优选大约1％至大约2％(w/w)。
如上文所述，以及如下面的特定实施例中所进一步说明的，本发明的生物活性合成趋化因子可用作天然存在的趋化因子的拮抗剂。具体地讲，本发明的生物活性合成趋化因子作为拮抗剂具有增强了的效力，可用于各种疾病状态的分析和治疗，如哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、病毒性疾病、粉瘤/动脉粥样硬化、类风湿关节炎和器官移植排斥。还可将本发明的生物活性合成趋化因子用于设计并筛选其关联受体的小分子拮抗剂，例如，通过工程方法产生的本发明化合物的结构多样性位于更合理的设计、筛选、和微调更好的小分子化合物，以便用作治疗与趋化因子受体的天然活性相关的疾病的药物。实施例
提供下面的制剂和例子是为了使得本领域技术人员能够更清楚地理解并且实施本发明，不应当将这些例子视为对本发明范围的限定，而仅仅是作为对本发明的说明和代表。
                         缩略语DIEA                      二异丙基乙胺DMF                       N，N-二甲基甲酰胺DNP                       2，4-二硝基苯基GuHCl                     盐酸胍HBTU                      O-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-
                      四甲基-uronium六氟代磷酸盐HF                        氟化氢TFA                       三氟乙酸Aib                       氨基异丁酸Hyp                       羟基脯氨酸Tic                       1，2，3，4-四氢异喹啉-3-COOHIndol                     二氢吲哚-2-羧酸P(4，4DiF)                4-二氟脯氨酸Thz                       L-噻唑烷-4-羧酸Hop                       L-高脯氨酸ΔPro                     3，4-脱氢脯氨酸F(3，4-DiOH)              3，4二羟基苯丙氨酸F(3，4-DiOH，pBz1)        pBc1，-3，4二羟基苯丙氨酸p-Bz                      二苯酮Cha                       环己基丙氨酸βNal                     3-(2-萘基)丙氨酸Chg                       环己基甘氨酸Phg                       苯基甘氨酸HoF                       高苯丙氨酸F(F)5                     五氟苯丙氨酸tBuA                         叔丁基丙氨酸F(4-Me)                      4-甲基苯丙氨酸tL                           叔亮氨酸CycP                         1-氨基-1-环戊烷羧酸CycH                         1-氨基-1-环己烷羧酸Nle                          正亮氨酸氨基氧戊烷-RANTES(2-68)      AOP-RANTESn-壬酰基-RANTES(2-68)        NNY-RANTES实施例1：本发明趋化因子的通用合成方法
本发明的生物活性合成趋化因子的肽是通过固相肽合成制备的。固相肽合成是在购自Applied Biosystems的专门改进的430A肽合成仪上进行的，采用原位中和/2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3，-四甲基uronium六氟代磷酸盐激活方法，实现逐步Boc化学链延伸(Schnolzer等，Int.J.Peptide Protein Res.，1992，40：180-192)。N-末端肽片段是在硫酯产生树脂上合成的。在研究位点之前的残基连接之后(从C到N-末端延伸)裂解所述树脂，并且所述肽是以0.03mM的规模人工延伸的。每一个合成循环包括用纯的TFA处理1-2分钟除去Nα-Boc，用DMF冲洗1分钟，在存在过量DIEA的条件下用1.0mM的预先激活的Boc-氨基酸偶合10-20分钟，并用DMF进行第二次冲洗。在存在过量DIEA(3mM)的条件下用1mM HBTU(0.5M，溶解在DMF中)将Nα-Boc-氨基酸(1.1mM)预先激活3分钟。在每一个人工偶合步骤之后，通过茚三酮测定评估残余的游离胺(Satin等，Anal.Biochem.，1981，117：147-157)。在标准-O-CH2-苯乙酰胺甲基树脂上合成包括氨基酸的C-末端。在链组装完成之后，通过用5％对甲酚作清除剂用无水氟化氢在0℃下处理1小时对所述肽进行脱保护并且从树脂上裂解下来。在所有场合下，咪唑侧链TNP保护基团都保留在His残基上，因为DNP-去除方法与C-末端硫酯基团不相容。不过，在连接反应中，DNP逐渐被硫醇消除，产生了未保护的His。在裂解之后，用冰镇的二乙醚沉淀这两种肽，溶解在乙腈水溶液中，并且冷冻干燥。通过RP-HPLC，使用Waters公司的C18-柱，采用线性梯度的用缓冲液A(水/0.1％三氟乙酸)配置的缓冲液B(乙腈/10％水/0.1％三氟乙酸)纯化所述肽，并且在214nm的波长下进行UV检测。用PlatformII仪器(Micromass，Manchester，England)通过电子喷射质谱法分析样品。将肽用于连接，通过天然化学连接制备全长的趋化因子多肽链(Dawson等，Science，1994，266：776-779；Wilken等，Chem.Biol.，1999，6：43-51；和Camarero等，Current Protocolsin Protein Science，1999，18.4.1-18.4.21)。多肽链的折叠是在存在Cys-SH/(Cys-S)2的条件下通过标准技术完成的(Wilken等，Chem.Biol.，1999，6：43-51)。实施例2：合成NNY-RANTES、AOP-RANTES和SDF-1的N-、C-和N-/C-末端类似物
按照实施例1所述方法制备RANTES类似物(1-68)和SDF-1β类似物(1-72)，并且在本文中用于说明制备本发明的CC和CXC趋化因子的一般方法。具体地讲，N-、C-和N-/C-末端修饰的RANTES类似物是基于对趋化因子化合物CH3-(CH2)7-CHO-RANTES(2-68)(又被称为n-壬酰-RANTES(2-68)或“NNY-RANTES”)进行修饰，以及对趋化因子化合物CH3-(CH2)4-O-N＝CH-CO-RANTES(2-68)(又被称为氨基氧戊烷RANTES或“AOP-RANTES”)进行的修饰。在WO99/11666中披露用于这一目的的NNY-RANTES、AOP-RANTES和其他RANTES衍生分子，该文献被收作本文参考。使用为了RANTES类似物而设计的相同的基本设计方法制备SDF-1的N-、C-和N-/C-末端类似物。
为了进行对靶趋化因子进行N-末端修饰，如对RANTES进行的NNY和AOP修饰，按上述方法以及在WO99/11666和Wilken等，Chem.Biol.，1999，6：43-51中所披露的方法制备化学变体，在树脂上对N-末端肽片段进行修饰，以便用于连接产生侧面N-末端修饰(例如NNY或AOP)，然后进行裂解/脱保护，纯化，并且在天然化学连接中使用未保护的N-末端修饰的肽α-硫酯，将其连接到C-末端肽片段上形成完整的产物。合成肽，在实施例1所述的肽合成期间掺入氨基酸取代，包括氨基酸衍生物。利用实施例1披露的天然化学连接制备线性产物，对于RANTES类似物来说，连接是在Lys31-Cys32位点上进行的，而对于SDF-1类似物来说，连接是在Asn33-Cys34位点上进行的。将等摩尔量的肽片段(2-2.5mM)溶解在6M GuHCl，100mM磷酸，pH7.5，1％苄基巯基乙醇和3％硫代苯酚中。所述反应通常进行一夜。按上述肽片段的纯化和分析方法纯化和分析所得到的多肽产物。为了制备折叠的蛋白，将NNY-RANTES的纯化多肽链(大约0.5-1毫克/毫升)溶解在含有8mM半胱氨酸，1mM胱氨酸和10mM甲硫氨酸的2MGuHCl，100mM Tris，pH8.0中。在轻柔搅拌过夜之后，按上述方法通过RP-HPLC纯化蛋白溶液。对于SDF-1类似物来说，采用其他折叠条件：在室温下，在存在空气的条件下，在1M GuHCl，0.1M Tris，pH8.5中以0.5毫克/毫升的浓度氧化SDF-1和Met0-SDF-1。在搅拌过夜之后完成折叠。在相同的缓冲液中氧化AOP-、己酰基-和NNY-SDF-1，不过是在存在2M M GuHCl的条件下进行的。
为了将脂肪酸化学结合在特定的折叠蛋白上，采用两个基本步骤。首先，通过氨基氧基将脂肪酸官能化。其次，将活性羰基基团特异性导入该蛋白的羧基末端结构域，该部位被认为对于趋化因子的活性不重要。为此，通过C-末端Lys(Ser)Gly序列延伸合成了用于C-末端脂肪酸修饰的趋化因子类似物。因此，举例来说，合成了NNY-RANTES(2-68)，以便在C-末端包括Lys(Ser)Gly序列延伸。通过用NaIO4处理重新折叠的蛋白产生活性羰基基团，从而使得脂肪酸部分能够通过稳定的肟键进行位点特异性连接。
对于脂肪酸官能化来说，在0.5毫升DMF/DCM混合物(1∶1，v∶v)中用等摩尔数量的DCC和HOAt激活0.2mM的脂肪酸(棕榈酸、油酸、花生酸、胆酸)，并且添加到0.25mM Boc-AoA-NH-(CH2)2-NH2的0.5毫升DMF溶液中，并且用N-乙基吗啉将表观pH调整到pH8.0。在培养过夜之后在真空条件下除去挥发性物质，通过快速层析或通过在C4柱上进行制备HPLC分离产物。通过TFA处理除去Boc基团，并且通过ESI-MS证实产物。
为了进行蛋白氧化，将靶蛋白(2毫克/毫升)溶解在含有6M盐酸胍的0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.5)中，并且添加甲硫氨酸使清除剂的摩尔数超过蛋白100倍。然后添加10倍过量的高碘酸钠，并且在黑暗中将该溶液培养10分钟。通过添加摩尔数超过高碘酸钠1000倍的乙二醇终止该反应，并且在室温下将该溶液再培养15分钟。然后用0.1％的乙酸透析该溶液，并最后进行冷冻干燥。例如，C-末端侧链丝氨酸的氧化被证实几乎都是通过ESI-MS定量的，对于AOP-RANTES-K(S)G，获得了8141.1±0.7Da的质量，相当于损失了31Da，以便形成乙醛酰衍生物，并且没有观察到相当于原料的质量的峰值。
脂肪酸与所述趋化因子的结合是在存在0.1％十二烷基肌氨酸钠，20mM甲硫氨酸和超过蛋白20倍的功能化脂肪酸的条件下在0.1M乙酸钠缓冲液，pH5.3中进行的。在37℃下搅拌6-20小时之后，通过在脂肪酸的氨基-氧基团和趋化因子醛之间形成的肟键产生的结合物用反向HPLC纯化，并且通过ESI-MS鉴定该产物。对于所有类似物来说，氨基氧官能化脂肪酸与氧化蛋白的结合几乎都是通过分析HPLC定量的。实施例3：NNY和AOP-RANTES的N-末端类似物
对于N-末端RANTES衍生物来说，对相当于NNY-RANTES(2-68)或AOP-RANTES(2-68)的前8个氨基酸残基的一个或多个氨基酸的N-末端区进行修饰，所述前8个氨基酸残基的序列为-PYSSDTTP-。该序列相当于图10A-10D中所示出的野生型RANTES多肽链(即RANTES(1-68))的68个氨基酸残基中的2-9号氨基酸残基，因为天然存在的RANTES(1-68)的第一个残基(Ser)被NNY-RANTES(2-68)中的n-壬酰取代基和AOP-RANTES(2-68)中的氨基氧戊烷所取代。因此，举例来说，在NNY-RANTES(2-68)上的2号氨基酸位置上的取代可以用下面的通用化合物结构式表示“NNY-P2X-RANTES(3-68)”，其中，NNY是n-壬酰基，X是用于取代NNY-RANTES(2-68)的2号位置上的脯氨酸(P)的氨基酸，而RANTES(3-68)表示NNY-RANTES(2-68)的其余66个氨基酸，阅读方向为从N-末端到C-末端。作为另一种例子，对NNY-RANTES(2-68)上的3号位置的氨基酸的取代可以用以下通用化合物结构式表示“NNY-P-Y3X-RANTES(4-68)”，其中，NNY是n-壬酰基，X是用于取代NNY-RANTES(2-68)的3号位置上的酪氨酸(Y)的氨基酸，而RANTES(4-68)表示NNY-RANTES(2-68)的其余65个氨基酸，阅读方向为从N-末端到C-末端。对于多次取代的NNY-RANTES类似物来说，下面的在NNY-RANTES(2-68)的2、3和9号氨基酸位置上进行的3次取代的化合物结构式可以通过以下通用化合物结构式表示：NNY-P2X-Y3X-SSDTT-P9X-RANTES(10-68)；其中，NNY是n-壬酰基，X是取代NNY-RANTES(2-68)上的2号位置上的脯氨酸(P)，3号位置上的酪氨酸(Y)和9号位置上的脯氨酸(P)的相同或不同的氨基酸，SSDTT相当于NNY-RANTES(2-68)的4-8号氨基酸，而RANTES(10-68)表示NNY-RANTES(2-68)的其余59个氨基酸，阅读方向为从N-末端到C-末端。
下面是所制备的NNY-P2X-RANTES(3-68)类似物的例子。
              化合物                           编号
        NNY-P2Aib-RANTES(3-68)                   1
        NNY-P2Hyp-RANTES(3-68)                   2
        NNY-P2Tic-RANTES(3-68)                   3
        NNY-P2Indol-RANTES(3-68)                 4
        NNY-P2P(4，4DiF)-RANTES(3-68)            5
        NNY-P2Thz-RANTES(3-68)                   6
        NNY-P2HoP-RANTES(3-68)                   7
        NNY-P2ΔPro-RANTES(3-68)                 8
        NNY-P2A-RANTES(3-68)                     9
下面是制备的NNY-P-Y3X-RANTES(4-68)类似物的例子。
              化合物                           编号
        NNY-P-Y3P-RANTES(4-68)                   10
        NNY-P-Y3A-RANTES(4-68)                   11
        NNY-P-Y3L-RANTES(4-68)                   12
        NNY-P-Y3V-RANTES(4-68)                   13
        NNY-P-Y3F(3，4-DiOH)-RANTES(4-68)        14
        NNY-P-Y3F(3，4-DiOH，pBz1)-RANTES(4-68)  15
        NNY-P-Y3pBz-RANTES(4-68)                 16
        NNY-P-Y3Cha-RANTES(4-68)                 17
        NNY-P-Y3βNal-RANTES(4-68)               18
        NNY-P-Y3Chg-RANTES(4-68)                 19
        NNY-P-Y3Phg-RANTES(4-68)                 20
        NNY-P-Y3Hof-RANTES(4-68)           21
        NNY-P-Y3F(F)5-RANTES(4-68)         22
        NNY-P-Y3tbuA-RANTES(4-68)          23
        NNY-P-Y3F(4-Me)-RANTES(4-68)       24
        NNY-P-Y3tL-RANTES(4-68)            25
        NNY-P-Y3CycP-RANTES(4-68)          26
        NNY-P-Y3CycH-RANTES(4-68)          27
        NNY-P-Y3Nle-RANTES(4-68)           28
下面是制备的NNY-PY-S4X-RANTES(5-68)类似物的例子。
                化合物
        NNY-PY-S4A-RANTES(5-68)            29
        NNY-PY-S4tbuA-RANTES(5-68)         30
下面是制备的NNY-PYS-S5X-RANTES(6-68)类似物的例子。
                化合物                   编号
        NNY-PYS-S5tbuA-RANTES(6-68)        31
下面是制备的NNY-PYSS-D6X-RANTES(7-68)类似物的例子。
               化合物                    编号
        NNY-PYSS-D6tbuA-RANTES(7-68)       32
下面是制备的NNY-PYSSD-T7X-RANTES(8-68)类似物的例子。
                化合物                   编号
        NNY-PYSSD-T7tbuA-RANTES(8-68)      33
下面是制备的NNY-PYSSDT-T8X-RANTES(9-68)类似物的例子。
                化合物                        编号
        NNY-PYSSDT-T8tBuA-RANTES(9-68)          34
下面是制备的NNY-PYSSDTT-P9X-RANTES类似物的例子。
            化合物                            编号
      NNY-PYSSDTT-P9Hyp-RANTES(10-68)           35
      NNY-PYSSDTT-P9Aib-RANTES(10-68)           36
      NNY-PYSSDTT-P9ΔPro-RANTES(10-68)         37
      NNY-PYSSDTT-P9Thz-RANTES(10-68)           38
以下化合物是所制备的双取代的类似物NNY-P2X-Y3X-RANTES(4-68)和三取代的类似物NNY-P2X-Y3X-SSDTT-P9X-RANTES(10-68)的例子
             化合物                           编号
      NNY-P2Hyp-Y3tButA-RANTES(4-68)            39
      NNY-P2Thz-Y3tButA-RANTES(4-68)            40
      NNY-P2Hyp-Y3Chg-RANTES(4-68)              41
      NNY-P2Thz-Y3Chg-RANTES(4-68)              42
      NNY-P2Thz-Y3Chg-SSDTT-P9Aib-RANTES(10-68) 43实施例4：NNY-RANTES的N-末端、N-环类似物
下面是用于说明其他NNY-取代的RANTES类似物的，其中，对N-环(RANTES的12-20号残基)进行修饰，以便增强针对CCY5的效力，而不影响通过CCY1和CCY3进行的信号转导。
对于N-末端、N-环RANTES类似物来说，对NNY-RANTES(2-68)的N-环进行修饰，其中，所述N-环相当于12-20号氨基酸。RANTES的N-环的氨基酸序列为-FAYIARPLP-(SEQ ID NO：29)，因此，举例来说，对NNY-RANTES(2-68)的12号位置上的氨基酸的取代具有以下通用化合物结构式“NNY-PYSSDTTPCC-F12pBz-RANTES(13-68)”，其中，NNY是n-壬酰基，PYSSDTTPCC相当于RANTES(1-68)的2-11号氨基酸，F12pBz表示用于取代RANTES(1-68)的12号位置上的苯丙氨酸(F)的氨基酸衍生物pBz，而RANTES(13-68)表示RANTES(1-68)的其余13-68号氨基酸残基，阅读方向为从N-末端到C-末端。
            化合物                               编号
    NNY-PYSSDTTPCC-F12pBz-RANTES(13-68)            44
    NNY-PYSSDTTPCC-F12Y-RNTES(13-68)               45
    NNY-PYSSDTTPCC-F12F(4-Me)-RANTES(13-68)        46
    NNY-PYSSDTTPCC-F12(4-F)-RANTES(13-68)          47
    NNY-PYSSDTTPCCF-A13R-RANTES(14-68)             48
    NNY-PYSSDTTPCCF-A13S-RANTES(14-68)             49
    NNY-PYSSDTTPCCFA-Y14F-RANTES(15-68)            50
    NNY-PYSSDTTPCCFA-Y14Cha-RANTES(15-68)          51
    NNY-PYSSDTTPCCFAY-I15tBuA-RANTES(16-68)        52
    NNY-PYSSDTTPCCFAY-Il5S-RANTES(16-68)           53
    NNY-PYSSDTTPCCFAYI-A16S-RANTES(17-68)          54
    NNY-PYSSDTTPCCFAYA-R17A-RANTES(18-68)          55
    NNY-PYSSDTTPCCFAYA-R17H-RANTES(18-68)          56
    NNY-PYSSDTTPCCFAYAR-P18Thz-RANTES(19-68)       57
    NNY-PYSSDTTPCCFAYARP-L19I-RANTES(20-68)        58
    NNY-PYSSDTTPCCFAYARP-L19Cha-RANTES(20-68)      59
    NNY-PYSSDTTPCCFAYARPL-P20Thz-RANTES(21-68)     60实施例5：NNY-RANTES的N-末端RANTES类似物
以下化合物是用于说明其他NNY-取代的-RANTES类似物的，其中，不同的疏水性脂族链被用于代替NNY取代基。
             化合物                                编号
    CH2＝CH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-RANTES(2-68)  61
    Nle-Met-RANTES(1-68)                             62
           化合物                      编号
  Dodecanoyl-RANTES(3-68)                63
  月桂酰-Hyp-RANTES(3-68)                64
           化合物                      编号
  肉豆蔻酰-RANTES(4-68)                  65
  十二烷酰-Hyp-RANTES(4-68)              66实施例6：NNY-和AOP-RANTES的C-末端和N/C-末端类似物
制备了具有Lys-Gly C-末端延伸部分的AOP-和NNY-RANTES，Lys的ε氨基被丝氨酸残基酰化。在对丝氨酸延伸部分进行高碘酸盐氧化之后，将衍生物与氨基氧乙酰基官能化的化合物结合，包括荧光团(FITC、NBD、Ncy-5和BODIPY-F1)或脂类。这种C-末端标记过的趋化因子保留了它的生物学特性，并且引入了诸如CH3-(CH2)14-CONH-(CH2)2-NHCO-CH2-O-NH2的脂族部分，业已证实该部分能提高该趋化因子的效力。为了寻找最有效的化合物，通过与Boc-AoA-NH-(CH2)2-NH2，随后是除去了Boc的月桂酸、棕榈酸、油酸、花生酸、胆酸和胆甾醇氯甲酸酯偶合，用氨基氧基团对不同的脂肪酸和脂类进行官能化。将所述一种或多种衍生物与氧化的NNY-RANTES-K(S)G或AOP-RANTES-K(S)G结合，其中，AOP类似物的例子如下：
   化合物                           编号
AOP-PANTES-K(月桂酰)-G                67
其中“(月桂酰)”是缩略语，表示乙醛酰＝AOA-乙二胺，月桂酸酯等
AOP-PANTES-K(棕榈酰)-G                68
AOP-PANTES-K(花生酰)-G                69
AOP-PANTES-K(油酰)-G                  70
AOP-PANTES-K(胆酰)-G                  71
AOP-PANTES-K(阻甾烯基)-G              72
还可以通过另一种方法制备所述脂类部分的化学变体。所述化合物是通过在树脂上对C-末端片段进行修饰合成的，包括在裂解之前将脂肪酸连接在Fmoc脱保护的Boc-肽-Lys-Gly-树脂上，纯化并用于化学连接，以便形成全长的多肽。
在设计所述化合物时，采用脂类偶合有两个主要原因。首先，现在有越来越多的证据表明RANTES化合物的抗HIV-1抑制活性与下调受体的能力相关。这意味着一旦将配体-受体复合物内化，正常情况下它在早期内体中发生解离，受体的再循环还可以与质膜或某些细胞质脂肪酸结合蛋白相互作用。因此，对受体进行的脂类修饰可以简单地通过疏水性相互作用将所述复合物重新导向到特定细胞内亚结构域，并因此推迟所述受体的再循环。有一些涉及到细胞内蛋白运输的最新的文章支持这样的观点，即酰化是增强蛋白对洗涤剂抗性膜的亲和力的共同机制，并且可能是不跨膜的蛋白的主要导向机制(例如参见Melkonian等，J.Biol.Chem.，1999，274：3910-3917；Zlatkine等，J.Cell Sci.，1997，110：673-679；Zhan等，CancerImmunol.Immunother.1998，46：55-60)。其次，还可以进行修饰，以便改变所述化合物的药代动力学特性。有一些最新的论文支持这一观点(例如，参见Honeycutt等，Pharm.Res.，1996，13：1373-1377；Kurtzhals等，J.Pharm.Sci.，1997，86：1365-1368；Markussen等，Diabetologia，1996，39：281-288)。
正如在下面的例子中所证实的，活性的增强是另人吃惊的和出乎预料的，因为所述修饰的目的是为了改变药代动力学。希望的结果是减弱所述活性，但是所希望的药代动力学的改善可能带来可以接受的折衷。实施例7：SDF-1β的N-末端类似物SDF-1α
制备下面的N-末端SDF-1β(1-72)衍生物，以便说明制备本发明的XCX趋化因子的通用方法。举例来说，对SDF-1β的N-末端进行修饰，以便产生在N-末端具有疏水性脂族链的化合物。按上述方法制备RANTES化合物的还包括位于N-末端区的氨基酸衍生物和/或位于C-末端区的脂族链的化合物。例如，具体地讲，制备并测定的合适的N-末端取代基包括，但不限于Lys、Met-Lys、己酰-Lys、CH3(CH2)7C(O)和CH3(CH2)4-O-NH-乙醛酰。下面的化合物是所制备的某些SDF-1α和SDF-1β类似物的例子。
                化合物                   编号
           Lys-SDF-1(2-72)                 73
           Met-Lys-SDF-1(2-72)             74
           己酰-Lys-SDF-1(2-72)            75
           NNY-SDF-1(2-72)                 76
           AOP-己醛酰-SDF-1(2-72)          77实施例8：筛选测定
通过基于HIV的测定方法筛选在实施例3-7中所制备的若干种RANTES和SDF类似物及其他类似物的拮抗剂活性，以便鉴定对使用RANTES和SDF-1的特定场合的抑制功能。一般，对所述化合物进行初步筛选，筛选其抑制HIV被膜介导的细胞融合能力。随后检测所述化合物中最有希望的化合物抑制无细胞病毒感染靶细胞系的能力。选择这种测定方法是因为业已证实细胞融合测定方法和体外无细胞病毒感染测定方法可用作体内效力的指示方法，这一点是在SCID小鼠模型上确定的(Mosier等，J.Virol.，1999，73：3544-3550)。另外，由于业已证实相对AOP-RANTES而言NNY-RANTES的抗病毒效力的增强是由于除了提高对CCR5的亲和力以外的因素，对所述化合物在细胞融合测定中的活性进行评估，而不是评估其对CCR5的亲和力。实施例9：被膜介导的细胞融合测定
利用通过工程方法改造成与具有CD4和CCR5并且含有一种受体系统的细胞发生病毒被膜蛋白融合的细胞测定实施例3-7中特定化合物组抑制CCR5依赖性细胞融合的能力。使用细胞系HeLa-P5L和HeLa-Env-ADA，基本上按Simmons等所披露的方法(Science，1997，276：276-279)实施CCR5-向性病毒被膜介导的细胞融合测定，以上两种细胞系都是由M.Alizon实验室(巴黎)提供的。简单地讲，将HeLa-P5L细胞接种在96孔平板上(每孔104细胞，体积为100微升)。24小时之后，除去培养基，并且向每个孔中添加含有104HeLa-Env-ADA细胞的培养基和趋化因子(最终体积为200微升)。再培养24小时之后，用PBS洗涤细胞一次，并且在室温下用50微升PBS/0.5％NP-40裂解15分钟。添加50微升2×CPRG底物(10mM氯酚红-β-D-半乳糖吡喃糖苷；120mM磷酸氢钠，85mM磷酸二氢钠，20mM氯化钾，20mM硫酸镁，和10mM β-巯基乙醇)，并且在室温下遮光培养1-2小时，测定裂解物的β-半乳糖苷酶活性。然后在Labsystems微量平板读数器上读出575纳米波长下的吸收值。通过以上值计算在每一种抑制剂浓度下的抑制百分比[100×(OD(测试)-OD(阴性对照))/(OD(阳性对照)-OD(阴性对照))]。通过融合抑制百分比与抑制剂浓度的曲线可以计算出每一种化合物的IC50值。
很显然，相对野生型RANTES而言，测定的大部分化合物具有较大的效力。在下面的表1中示出了特定RANTES拮抗剂类似物的结果。
                   表1：细胞-融合筛选
                    N末端修饰的NNY-RANTES
           化合物编号            平均相对效力
           19                     7
           23                     7
           40                     4
           42                     2
           NNY-RANTES(对照)       18-25
                N-环修饰的NNY-RANTES
           化合物编号            平均相对效力
           54                     15
           57                     15
           58                     13
           59                     14
           NNY-RANTES(对照)       18-25
                    C末端修饰的AOP-RANTES
           化合物编号            平均相对效力
           68                     45
           AOP-RANTES(对照)       100
在表1中，对于平均相对效力来说，在融合测定中IC50的绝对值在不同日子中进行的实验中有所波动，不过活性的等级级别保持稳定。为了标准化有关结果，在每一个实验中都用AOP-RANTES作对照。因此，在每一个实验中的IC50是相对AOP-RANTES表达的，后者给出的是100的任意值。尽管相对野生型RANTES而言，所测定过的所有化合物的大部分都表现出较强的效力，不过诸如编号为19、23、40和42的化合物的某些化合物的效力是这样的，即使是在系列稀释的最低稀释比例下也获得了超过50％的抑制作用。实施例10：无细胞病毒感染测定
按照与被膜介导的细胞融合测定相同的方法进行无细胞病毒感染测定，所不同的是，在这里，被膜细胞系被活的R5向性病毒所取代。将HEK293-CCR5细胞(由T.Schwartz馈赠，哥本哈根)接种到24孔平板上(1.2×105细胞/孔)。在培养过夜之后，在4℃下使用12皮摩尔的[125I]MIP-1α(Amersham)和可变量的未标记过的配体在0.5毫升的‘结合缓冲液’(50mM HEPES，pH7.4，添加了1mM氯化钙，5mM氯化镁，和0.5％(w/v)牛血清白蛋白)中在完整细胞上进行竞争结合3小时。在培养之后，用冰冷的补充了0.5M氯化钠的结合缓冲液快速洗涤细胞4次。在1毫升3M乙酸、8M尿素和2％NP-40中裂解细胞，用Beckmanγ4000闪烁记数器对裂解的材料进行1分钟的记数。重复进行测定，并且IC50值是使用Prism软件通过单相浓度抑制曲线获得的。表2表示通过编号为19和13的化合物在初步筛选中证实的相对NNY-RANTES的效力的增强。
          表2：来自无细胞病毒感染测定的
          选定化合物的体外感染性数据
    AOP-RANTES     NNY-RANTES     化合物23     化合物19
  实验IC50感染性结果     140     32     17     15
    47     8     3.8     34
    260     26     28     9.9
    135     30     14     12
  平均感染性IC50 145pM 24pM 14pM 12pM
  用于比较的细胞融合结果 480pM 97pM 38pM 26pM
实施例11：用抗CCR5和抗CXCR4化合物进行联合治疗
以下例子说明了联合使用抗CCR5(例如NNY-RANTES)和抗CXCR4(例如SDF-1拮抗剂或AMD3100)对阻断HIV感染和阻断HIV的R5菌株向X4菌株潜在转化的保护作用。将SCID小鼠模型用于这一目的。具体地讲，用SCID小鼠测定了NNY-RANTES和AMD3100(一种小的有机分子抗X4制剂)的保护作用，按照披露于以下文献中的方法繁殖人外周血白细胞并且用HIV-1刺激：Mosier，Adv.Immunol.，1996，63：79-125；Picchio等，J.Virol.，1997，71：7124-7127；Picchio等，J.Virol.，1998，72：2002-2009；和Offord等，WO99/11666。按照表X所示给予NNY-RANTES，并且以200毫克/毫升溶液形式使用AMD3100。除了AMD3100组之外，用R5HIV病毒进行刺激。在联合治疗中没有观察到逃脱的突变，并且所有适当处理的小鼠在整个实验过程中都保留无病毒状态。这表明本发明的N-、C-和N-/C-RANTES衍生物可以与诸如AMD3100或SDF-1拮抗剂的抗X4菌株化合物联合使用，用于抑制HIV对哺乳动物的感染，如本文所披露的。实施例12：制备RANTES类似物G1755-01
按以下方法合成在图11中示出的RANTES类似物G1755-01。
1.制备AOP-[RANTES(2-33)]-硫酯
序列：
氨基氧戊烷-咪唑基-PYSSDTTPCC
FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GK-硫酯(SEQ ID NO：30)
将RANTES(2-33)序列组装在硫酯产生树脂上(Hackeng等，PNAS，1999，96：10068-10073)，然后按照标准方法通过将氨基氧戊烷-咪唑基肟部分[即CH3(CH2)4-O-N＝CHCOOH]直接偶合在所述树脂上，对N-末端进行修饰(Wilken等，Chemistry&Biology，1999Z6，1：43-51)，合成含有N-末端氨基氧戊烷-咪唑基肟部分(AOP)的N-末端肽片段AOP-[RANTES(2-33)]-α硫酯(硫酯又被表示为-C(O)SR)。用氢氟酸裂解所述肽树脂，并且通过反向HPLC纯化，以便产生α-羧基硫酯肽AOP-RANTES(2-33)-硫酯。观察到的质量＝4179.64Da；计算的质量＝4178.57Da(平均同位素组成)。
2.制备[RANTES(34-68)]-Lys69(GP6)-Leu70
序列：
CSNPAVVFVT RKNRQVCANP EKKWVREYIN
SLEMSK(GP6)L(SEQ ID NO.：31)
其中，GP6结合在Lys69的εN上：
a.固相肽和在{肽树脂}上的水溶性聚合物合成
通过传统固相肽合成在Boc-Leu-OCH2-Pam-树脂上合成C-末端肽片段[RANTES(34-68)]-Lys69(Fmoc)-Leu70，对于Boc化学固相肽合成来说，使用Schnolzer等，Int.J.Pep.Protein Res.40：180-193所披露的原位中和/HBTU激活方法。
在链组装完成之后，在DMF处理中用20％的哌啶将Lys69的εN上的Fmoc基团从受保护的肽树脂上除去。然后在含有DIEA的DMF制备的HOBT(羟基苯并三唑)溶液中将琥珀酸酐(Succ)偶合到Lys69的εN上。在洗涤之后，通过添加溶解在DMF中的羰基二咪唑激活树脂结合的琥珀酸上的游离羧基。在经过另一轮洗涤之后，添加溶解在DMF中的0.5M HOBT中的50％(4，7，10)-三噁三癸烷-1，13二胺(TTD)。在洗涤之后，树脂结合的聚合物就可用于下一轮琥珀酸酐偶合/CDI激活/TTD偶合。在6次循环之后，将琥珀酸酐偶合在HOBT/DMF＝DIEA溶液中的最后的TTD胺上，以便产生Lys69修饰过的化合物，该化合物具有酰胺连接的-(Succ-TTD)6-Succ-OH聚合物。
用氢氟酸将肽/线性水溶性聚合物树脂从所述树脂上裂解下来，并且通过反向制备HPLC纯化产物，以便产生[RANTES(34-68)]-Lys69(GP6)-Leu70。观察到的质量＝6253Da，计算的质量＝6252Da(平均同位素组成)。
3.制备G1755-01
序列：
氨基氧戊烷-咪唑基-PYSSDTTPCC
FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GKCSNPAVVF VTRKNRQVCA
NPEKKWVREY INSLEMSK(GP6)L(SEQ ID NO.：32)
通过Dawson等所披露的天然化学连接方法将上述N-末端和C-末端完全未保护的肽片段连接在一起(Science，266：776-779，1994)。通过反向HPLC，使用线性梯度的乙腈与含有0.1％的三氟乙酸的水纯化还原形式的全长的多肽产物。观察到的质量＝10060Da。
在含有半胱氨酸-胱氨酸氧化还原对的含水缓冲液中折叠与GP6连接的全长的多肽，同时形成了2个二硫键，并且按照标准方法通过反向HPLC纯化(Wilken等，Chemistry&Biology，1999，6，1：43-51)。折叠的产物在HPLC上是均匀的。观察到的质量＝10056Da；计算的质量＝10058Da(平均同位素组成)。实施例13：制备RANTES类似物G1755
按以下方法合成在图12中示出的G1755化合物。
1.制备n-壬酰-RANTES(2-33)
序列：
n-壬酰-PYSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS
GK-硫酯(SEQ ID NO.：33)
按上述方法在硫酯产生树脂上合成n-壬酰-RANTES(2-33)，然后通过将n-壬酸直接偶合在所述树脂上对其N-末端进行修饰。用氢氟酸裂解所述肽树脂，并且通过反向HPLC纯化以便产生n-壬酰-RANTES(2-33)。观察到的质量＝4177Da；计算的质量＝4177.62Da(平均同位素组成)。
2.制备RANTES(34-68)Lys69(GP6)-Leu70
序列：
CSNPAVVFVT RKNRQVCANP EKKWVREYIN
SLEMSK(GP6)L(SEQ ID NO.：34)
a.固相肽和在{肽树脂}上进行的水溶性聚合物合成
使用上文所述Boc化学固相肽合成的原位中和/HBTU激活方法通过常规固相肽合成在Boc-Leu-OCH2-Pam-树脂上合成RANTES(34-68)-Lys69(Fmoc)-Leu70。
在链组装完成之后，除去保护的肽树脂上的Lys69的εN上的Fmoc基团，并且按上述方法在肽树脂上合成GP6结构。用氢氟酸裂解肽/线性水溶性聚合物树脂，并且通过反向制备HPLC纯化产物，以便得到[RANTES(34-68)]-Lys69(GP6)-Leu70。观察到的质量＝6252.87Da，计算的质量＝6252.24Da(平均同位素组成)。
3.制备G1755
序列：
壬酰-PYSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS
GKCSNPAVVF VTRKNRQVCA NPEKKWVREY
INSLEMSK(GP6)L(SEQ ID NO.：35)
a.通过天然化学连接组装全长的多肽
通过在实施例8中所披露的天然化学连接将N-末端和C-末端完全未保护的肽片段连接在一起。用线性梯度的乙腈和含有0.1％的三氟乙酸的水通过反向HPLC纯化还原形式的全长的多肽。观察到的质量＝10060.74Da；计算的质量＝10058.67Da(平均同位素组成)。
b.用水溶性聚合物修饰过的多肽的折叠和纯化
在含有半胱氨酸-胱氨酸氧化还原对的含水缓冲液中折叠通过GP6连接的全长的多肽，同时形成了2个二硫键。折叠的产物在HPLC上是均匀的。观察到的质量＝15057.43Da；计算的质量＝10054.67Da(平均同位素组成)。实施例14：制备RANTES类似物G1805
按以下方法制备图13中示出的G1805化合物。
1.制备n-壬酰-RANTES(2-33)(Tyr3Chg)-硫酯
序列：
壬酰-PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS
GK-硫酯(SEQ ID NO.：36)
其中X＝L-环己基甘氨酸(Chg)
按上述方法在硫酯产生树脂上合成n-壬酰-RANTES(2-33)(Tyr3Chg)，然后通过将n-壬酸直接偶合在所述树脂上对其N-末端进行修饰。用氢氟酸裂解所述肽树脂，并且通过反向HPLC纯化，以便产生n-壬酰-RANTES(2-33)(Tyr3Chg)。观察到的质量＝4151.98Da；计算的质量＝4152.6Da(平均同位素组成)。
2.制备RANTES(34-68)(Met67Lys(Lev))-Lys69-Leu70
序列：
CSNPAVVFVT RKNRQVCANP EKKWVREYIN
SLEK(Lev)SKL(SEQ ID NO.：37)
使用上文所述Boc化学固相肽合成的原位中和/HBTU激活方法通过常规固相肽合成在Boc-Leu-OCH2-Pam-树脂上合成RANTES(34-68)-(Met67Lys)-Lys69(Fmoc)-Leu70。
在肽链组装完成之后，用溶解在DMF中的20％的哌啶处理，将Lys67的εN上的Fmoc基团从保护的肽树脂上除去。用1，3-二异丙基碳二亚胺激活乙酰丙酸作为对称的酸酐，并且与Lys67的εN偶合。用氢氟酸裂解肽-树脂，并且通过反向制备HPLC纯化产物，以便得到[RANTES(34-68)(Met67Lys(Lev))-Lys69-Leu70。观察到的质量＝4433.22Da；计算的质量＝4434.19Da(平均同位素组成)。
3.制备G1805
序列：
壬酰-PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS
GKCSNPAVVF VTRKNRQVCA NPEKKWVREY
INSLEK(Lev-GP29)SKL(SEQ ID NO.：38)
其中，X＝L-环己基甘氨酸(Chg)，而GP29＝在图13和14中所
示出的支化肟连接的水溶性聚合物结构。
a.通过天然化学连接组装全长的多肽
通过上述天然化学连接将N-末端和C-末端完全未保护的肽片段连接在一起。用线性梯度的乙腈和含有0.1％的三氟乙酸的水通过反向HPLC纯化还原形式的全长的多肽。观察到的质量＝8213.62Da；计算的质量＝8216.64Da(平均同位素组成)。
b.合成水溶性聚合物GP29
i.合成具有多个硫醇基团的模板GRFNP17
在酰胺产生(4-甲基)二苯甲基胺(MBHA)-树脂上以0.4mM的规模人工合成支化核心模板GRFNP17。用标准连接方法连接Fmoc-Lys(Fmoc)-OH-(Schonlzer，M.Int J.Pept.Protein Res.，1992，40：180-93)。将2.1mM的氨基酸，10％DIEA溶解在3.8毫升的0.5M HBTU中；即5倍过量的氨基酸。在除去Fmoc保护基团之后，用标准氨基酸连接方法连接Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(将2.1mM的氨基酸，10％DIEA溶解在3.8毫升的0.5M HBTU中；即5倍过量的氨基酸)。在第二次除去Fmoc的步骤之后，用标准氨基酸连接方法连接Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(将4.2mM的氨基酸，10％DIEA溶解在7.6毫升的0.5M HBTU中；即与游离胺相比氨基酸5倍过量)。在最后的Fmoc脱保护步骤之后，用溶解在DMS中的S-乙酰硫代乙醇酸五氟苯基酯(SAMA-oPfp)连接30分钟。通过纯的TFA进行两次批量洗涤除去C-末端赖氨酰残基的t-Boc保护基团，每次洗涤1分钟。然后通过用DMF制备的10％的TIEV洗涤中和所述树脂。将2mM Boc-氨基氧乙酸和2mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解在3毫升DMF中。在添加2mM DIC(二异丙基碳二亚胺)之后，将所述酸激活30-60分钟，将该溶液添加到所述中和树脂中，并且连接1小时。最后，用溶解在DMF中的20％的哌啶用30分钟时间除去S-连接的乙酰基团。按照标准Boc-化学方法，在存在作为游离醛的清除剂的半胱氨酸的条件下用HF/p-甲酚对模板进行脱保护并同时从树脂支持物上裂解下来(Schnolzer，M.Int J.Pept.Protein Res.，1992，40：180-93)。冷冻回收到50％B[即含有0.1％TFA的50％的乙腈水溶液](不含醛)的聚酰胺，并且冷冻干燥。为了进行纯化，将模板粗制产品溶解在2毫升50％B中，并且添加100毫升100％A[即用水配制的0.1％TFA]，以便稀释样品(避免添加盐酸胍或乙酸胍，因为要添加醛)。将所述模板加样到在T＝40℃下用3％B平衡的C4制备反向HPLC柱上。等度洗脱盐类，并且通过线性梯度纯化需要的模板GRFNP17。通过ES-MS确定含有所需产品的级份，合并并且冷冻干燥。
ii.合成支化的水溶性聚合物GRFNP29
通过对纯化的含有硫醇的模板GRFNP17和线性聚合物GRFNP31、Br-乙酰-(TTD-Succ)12-羧酸酯进行硫酯产生连接而合成GRFNP29，即一种分子量为15kD的支化(TTD-Succ)12聚合物，其中，GRFNP31是按照标准方法在Sasrin羧基产生树脂上合成的(Rose，K.等，美国专利申请流水号09/379297；Rose，等，J.AM.Chem.Soc.，1999，121：7034)，溴乙酰化并进行纯化。
将多出1.3倍摩尔数的(超出总硫醇的数量)纯化的GRFNP31、Br-乙酰-(TTD-Succ)12和纯化的含有硫醇的模板GRFNP17同时溶解在0.1M Tris/6M盐酸胍，pH8.7中，浓度大约为10mM。在溶解之后，用0.1Mtris-HCl，pH8.7缓冲液将该溶液稀释3倍(v/v)。在室温下搅拌该连接混合物，并且通过反向HPLC和ES/MS监测反应。根据需要添加额外GRFNP31反应剂，直到需要的反应产物是主要产物为止。为了进行制备，添加3倍(v/v连接混合物)0.1M乙酸/6M盐酸胍，pH4，并将该溶液加样到C4反向制备HPLC柱上，并且用线性梯度纯化。通过ES-MS确定含有纯的GRFNP29结构的级份，合并并且冷冻干燥。
c.将GP29结合到连接的全长的多肽上
将冷冻干燥的全长的多肽溶解在含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中，并且与等摩尔数量的含有氨基氧乙酰基(AOA)的支化水溶性聚合物结构GP29同时冷冻干燥。溶解干燥的粉末，并且通过反向HPLC纯化，以便产生具有GP29的全长的多肽，GP29是通过肟键共价连接在67号位置上的赖氨酸的修饰过的侧链上的酮官能团上。通过制备梯度C4反向HPLC分离聚合物修饰过的肽和未修饰过的肽与未反应的聚合物。通过ES-MS确定含有所需聚合物修饰过的产物的级份，并且合并。观察到的质量＝23835.92Da，计算的质量＝23844.64Da(平均同位素组成)。另外，在折叠所述多肽之后共价连接GP29，不过，发现这样做能得到较低的产量。
d.折叠并纯化含有肟连接的GP29的多肽
在含有半胱氨酸-胱氨酸氧化还原对的含水缓冲液中折叠连接有GP29的全长的多肽，同时形成了2个二硫键，并且按照反向HPLC方法纯化。折叠的产物在HPLC上是均匀的，观察到的质量＝23832Da，计算的质量＝23840Da(平均同位素组成)。实施例15：制备RANTES类似物G1806
按以下方法合成在图14中示出的RANTES类似物G1806。
1.制备n-壬酰-RANTES(2-33)(Tyr3Chg)-硫酯
序列：
壬酰-PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS
GK-硫酯(SEQ ID NO.：39)
其中，X＝L-环己基甘氨酸(Chg)
按上述方法在硫酯产生树脂上合成肽片段n-壬酰-RANTES(2-33)(Tyr3Chg)-硫酯(硫酯还被表示成-COSR，其中，R是烷基)。并且通过将n-壬酸直接偶合在所述树脂上对其N-末端进行修饰。用氢氟酸裂解所述肽树脂，并且通过反向HPLC纯化，以便产生n-壬酰-RANTES(2-33)Tyr3Chg。观察到的质量＝4151.98Da；计算的质量＝4152.6Da(平均同位素组成)。
2.制备RANTES(34-68)(Met67Lys(Lev))-Lys69(Palm)-Leu70
序列：
CSNPAVVFVT RKNRQVCANP EKKWVREYIN
SLEK(Lev)SK(Palm)L(SEQ ID NO.：40)
其中，K(lev)是野生型RANTES的Met67Lys改变的Lys67的乙酰丙酸修饰的εN。K(Palm)是通过氨基辛酸部分连接的棕榈酸修饰的Lys69εN，具有以下结构：
[ε氮Lys69]-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-(CH2)14-CH3
其中，使用上述用于Boc化学固相肽合成的原位中和/HBTU激活方法通过常规固相肽合成在Boc-Leu-OCH2-Pam-树脂上合成RANTES(34-68)(Met67Lys)-Lys69(Palm)-Leu70。在将Boc-Lys(Fmoc)-OH偶合到69号位置上之后，用溶解在DMF中的20％的哌啶除去Fmoc基团。用HBTU/DIEA激活Fmoc-8-氨基辛酸，并且与Lys69的εN偶合。在除去Fmoc基团之后，用1-羟基-7-叠氮苯并三唑(HATU)和1，3-二异丙基碳二亚胺激活棕榈酸，并且与所述树脂偶合。然后按照上文所述的标准Boc化学SPPS方法进行链组装。在链组装之后用溶解在DMF中的20％的哌啶处理，除去Lys67的εN上的Fmoc基团。用1，3-二异丙基碳二亚胺激活乙酰丙酸作为对称的酸酐，并且与Lys67的εN连接。用氢氟酸裂解肽-树脂，并且通过反向制备HPLC纯化，以便得到RANTES(34-68)(Met67Lys(Lev))-Lys69(棕榈酸)-Leu70。观察到的质量＝4813.72Da；计算的质量＝4813.81Da(平均同位素组成)。
3.制备G1806
序列：
壬酰-PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS
GKCSNPAVVF VTRKNRQVCA NPEKKWVREY INSLEK(Lev-
GP29)SK(Palm)L(SEQ ID NO.：41)
其中，X＝L-环己基甘氨酸(Chg)，而棕榈酸(Palm)脂肪酸
连接是通过一个氨基辛酸部分实现的。
[ε氮Lys69]-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-(CH2)14-CH3
a.通过天然化学连接组装脂肪酸修饰的全长的多肽
通过上述天然化学连接将N-末端和C-末端完全未保护的肽片段连接在一起。用线性梯度的乙腈和含有0.1％三氟乙酸的水通过反向HPLC纯化还原形式的全长的多肽。观察到的质量＝8598.21Da；计算的质量＝8596.27Da(平均同位素组成)。
b.将水溶性聚合物GP结合在连接的脂肪酸修饰过的全长的多肽上
溶解冷冻干燥的全长的多肽并且与等摩尔数量的含有AOA的聚合物GP29同时冷冻干燥。溶解干燥的粉末，并且通过反向HPLC纯化，以便产生具有GP29的全长的多肽，GP29是通过肟键共价连接在67号位置上的赖氨酸的修饰过的侧链上的酮官能团上。观察到的质量＝24217Da；计算的质量＝24224Da(平均同位素组成)。另外，还可以在折叠所述多肽之后共价连接GP29，不过，发现这样做得到较低的产量。
c.折叠并纯化含有肟连接的GP29和脂肪酸的多肽
在含有半胱氨酸-胱氨酸氧化还原对的含水缓冲液中折叠连接有GP29的全长的多肽，同时形成了2个二硫键，并且通过上述反向HPLC方法纯化。折叠的产物在HPLC上是均匀的。观察到的质量＝24210.10Da；计算的质量＝24220.17Da(平均同位素组成)。
图15表示代表最终折叠的、纯化的合成RANTES类似物的分析数据。具体地讲，在图15中示出了在还原性(R)和非还原性条件(N)下比较野生型(Wt)RANTES与合成趋化因子类似物RANTES G1806的相对分子量的代表性SDS-PAGE凝胶。相对分子量在每一块凝胶的左侧示出，它相应于在同一块凝胶上电泳的分子量标准(未示出)。还示出了折叠的、纯化的G1806产物的代表性RP-HPLC层析图谱。图中说明了与野生型天然RANTES相比精确聚合物修饰的结构的纯度和较大的相对分子量。实施例16：G1755-01、G1755、G1805和G1806的细胞融合测定
进行细胞融合测定，以便检验各种聚合物修饰的RANTES类似物抗HIV活性。采用在实施例9中所披露的方法。在下面的表3中示出了代表性结果。
                           表3
            HeLa-P4-CCR5/HeLa-Env-ADA细胞融合数据
            化合物                   EC50
            AOP-RANTES(2-68)         1.81×10-9M
            NNY-RANTES(2-68)         3.23×10-10M
            RANTES G1755-01          11.00×10-9M
            RANTES G1755             1.87×10-9M
            RANTES G1805             1.40×10-9M
            RANTES G1806             2.98×10-10M
以上结果表明，在用线性或支化水溶性聚合物结构进行位点特异性修饰之后基本上保留了抗融合活性。这一结果所提供的惊人发现是当诸如脂肪酸的疏水性部分连接在C-末端上时能增强各种RANTES类似物的活性，这一结果支持了以下假说，即提高RANTES类似物的疏水性质一般会增强抗融合活性。相反，将水溶性聚合物，特别是支化水溶性聚合物(具有相当高的亲水性的并且带有负电荷)用于修饰，只会出现活性的很小的减弱，减弱以下的活性仍然在体内活性所要求的目标效力范围内。更出人意料的是，与较小的线性水溶性聚合物结构相比，用大的带负电荷的支化水溶性聚合物结构进行修饰在相当程度上保留了RANTES类似物的活性，而小的线性和大的支化聚合物修饰的类似物对活性具有大体上相同的影响。相信后一种发现在一种程度上是由于设计成的当水溶性聚合物修饰发生在野生型RANTES的C-末端侧基的聚集部位内部时的抗聚集特性的和/或水溶性聚合物局部的抗融合特性。
其他的效力增强变化弥补了相对AOP-RANTES和NNY-RANTES而言由于连接水溶性聚合物而导致的活性的小的损失。所述变化包括将一个或多个疏水性氨基酸导入C-末端，以及在C-末端添加疏水性脂肪酸部分。以上结果表明，额外的变化与单分散聚酰胺亚乙基聚合物(或其他水溶性聚合物)的组合能提高NNY和NOP型修饰的趋化因子分子的总体效力，如在N-末端进行了组合的Pro2Thz和Tyr3Chg改变和/或在C-末端添加了脂类部分的AOP-或NNY-RANTES。实施例17：G1755、G1805和G1806的药代动力学研究
按以下方法用雄性Sprague-Dawley大鼠对聚合物修饰的RANTES聚合物进行药代动力学研究。通过在即将注射之前用将冷冻干燥的蛋白原料溶解在pH7.0磷酸缓冲盐溶液中将按上述方法制备的RANTES类似物G1755、G1805和G1806(同时用AOP-RANTES作对照)配制成静脉(IV)注射液。制备所述制剂，以便给每一只实验动物提供等摩尔剂量的RANTES类似物[400微克/千克(AOP-RANTES)；510微克/千克(G1755)；1210微克/千克(G1805)和1225微克/千克(G1806)(微克类似物/千克动物)]。在必要时调整最终浓度，以便为每一只动物提供1毫克/千克的总的重量体积(即剂量体积保持稳定)。在实验的第一天通过大鼠尾部静脉给予每一种制备的类似物，并且每只动物只接受一个剂量。
在注射之后，在实验过程中在每一个样品采集时间点从尾部静脉/动脉中采集大约0.25毫升的血液，并且按照标准方法和国家健康动物研究所管理指南和推荐的检测方法用EDTA作为抗凝剂制备血浆或血清样品。根据所述采集的数据调整样品采集时间，避免在3周内从每一只动物上采集超过14份0.25毫升的样品(根据国家卫生动物管理指南确定)。每隔1周采集其他的样品，其中，可检测的血液含量保持超过所述原始样品。按照生产商的说明用Quantikine_Elisa，人类RANTES免疫测定(R&D Systems产品目录#DRN00)测定每一个时间点上的每一种RANTES类似物的血浆浓度。在实验过程中监测所述动物的总体健康状况，包括体重、进食习性、排泄、外观等，并且没有观察到明显的副作用。在图16中示出了代表性结果。
以上结果表明，通过将水溶性聚合物连接在各种前体RANTES类似物上明显提高了循环半衰期，半衰期的表观提高顺序为G1805＞G1806＞G1755＞AOP-RANTES。相对AOP-RANTES而言，G1805提高了大约40倍，G1806提高20倍，G1755提高10倍。总之，预计水溶性聚合物修饰过的RANTES的保留的高效力和明显提高的循环半衰期之间的平衡能提高这种化合物在体内使用时的治疗效力，并且减少治疗所需要的剂量次数和数量。
在本说明书中所提到的所有文献和专利申请都以相同的程度收作本文参考，就如同每一份文献或专利申请被专门和单独指明被收作参考一样。
现在业已对本发明进行了充分说明，对本领域普通技术人员来说显而易见的是，在不超出所附权利要求书的精神或范围的前提下可以对本发明作出多种改变和改进。
                  序列表<110>格莱风科学公司<120>聚合物修饰的生物活性合成趋化因子及其生产方法和用途<130>03504.270<140><141><150>60/217,683<151>2000-07-12<160>41<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>92<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Gly Ser Glu Val Ser Asp Lys Arg Thr Cys Val Ser Leu Thr Thr Gln1               5                  10                  15Arg Leu Pro Val Ser Arg Ile Lys Thr Tyr Thr Ile Thr Glu Gly Ser
         20                  25                  30Leu Arg Ala Val Ile Phe Ile Thr Lys Arg Gly Leu Lys Val Cys Ala
     35                  40                  45Asp Pro Gln Ala Thr Trp Val Arg Asp Val Val Arg Ser Met Asp Arg
 50                  55                  60Lys Ser Asn Thr Arg Asn Asn Met Ile Gln Thr Lys Pro Thr Gly Thr65                  70                  75                  80Gln Gln Ser Thr Asn Thr Ala Val Thr Leu Thr Gly
             85                  90<210>2<211>68<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala1               5                  10                  15Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly
         20                  25                  30Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln
     35                  40                  45Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser
 50                  55                  60Leu Glu Met Ser65<210>3<211>74<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>3Gly Pro Ala Ser Val Pro Thr Thr Cys Cys Phe Asn Leu Ala Asn Arg1               5                  10                  15Lys Ile Pro Leu Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Gly
         20                  25                  30Lys Cys Pro Gln Lys Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Ala Lys Asp
     35                  40                  45Ile Cys Ala Asp Pro Lys Lys Lys Trp Val Gln Asp Ser Met Lys Tyr
 50                  55                  60Leu Asp Gln Lys Ser Pro Thr Pro Lys Pro65                  70<210>4<211>73<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>4Lys Ser Met Gln Val Pro Phe Ser Arg Cys Cys Phe Ser Phe Ala Glu1               5                  10                  15Gln Glu Ile Pro Leu Arg Ala Ile Leu Cys Tyr Arg Asn Thr Ser Ser
         20                  25                  30Ile Cys Ser Asn Glu Gly Leu Ile Phe Lys Leu Lys Arg Gly Lys Glu
     35                  40                  45Ala Cys Ala Leu Asp Thr Val Gly Trp Val Gln Arg His Arg Lys Met
 50                  55                  60Leu Arg His Cys Pro Ser Lys Arg Lys65                  70<210>5<211>76<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>5Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr1               5                  10                  15Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr
         20                  25                  30Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala
     35                  40                  45Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser Met
 50                  55                  60Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr65                  70                  75<210>6<211>76<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>6Gln Pro Val Gly Ile Asn Thr Ser Thr Thr Cys Cys Tyr Arg Phe Ile1               5                  10                  15Asn Lys Lys Ile Pro Lys Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Thr Thr
         20                  25                  30Ser Ser His Cys Pro Arg Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Asp
     35                  40                  45Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Thr Gln Lys Trp Val Gln Asp Phe Met
 50                  55                  60Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gln Thr Pro Lys Leu65                  70                  75<210>7<211>82<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>7Gly Pro Asp Ala Val Ser Thr Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Val Val1               5                  10                  15Lys Gln Lys Ile His Val Arg Lys Leu Lys Ser Tyr Arg Arg Ile Thr
         20                  25                  30Ser Ser Gln Cys Pro Arg Glu Ala Val Ile Phe Arg Thr Ile Leu Asp
     35                  40                  45Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Glu Lys Trp Val Lys Asn Ser Ile
 50                  55                  60Asn His Leu Asp Lys Thr Ser Gln Thr Phe Ile Leu Glu Pro Ser Cys65                  70                  75                  80Leu Gly<210>8<211>70<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>8Ala Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr1               5                  10                  15Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser
         20                  25                  30Ser Gln Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg Ser Arg
     35                  40                  45Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser
 50                  55                  60Asp Leu Glu Leu Ser Ala65                  70<210>9<211>69<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>9Ala Pro Met Gly Ser Asp Pro Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr1               5                  10                  15Ala Arg Lys Leu Pro Arg Asn Phe Val Val Asp Tyr Tyr Glu Thr Ser
         20                  25                  30Ser Leu Cys Ser Gln Pro Ala Val Val Phe Gln Thr Lys Arg Ser Lys
     35                  40                  45Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Ser Trp Val Gln Glu Tyr Val Tyr
 50                  55                  60Asp Leu Glu Leu Asn65<210>10<211>70<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>10Ala Ser Asn Phe Asp Cys Cys Leu Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Leu His1               5                  10                  15Pro Lys Phe Ile Val Gly Phe Thr Arg Gln Leu Ala Asn Glu Gly Cys
         20                  25                  30Asp Ile Asn Ala Ile Ile Phe His Thr Lys Lys Lys Leu Ser Val Cys
     35                  40                  45Ala Asn Pro Lys Gln Thr Trp Val Lys Tyr Ile Val Arg Leu Leu Ser
 50                  55                  60Lys Lys Val Lys Asn Met65                  70<210>11<211>77<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>11Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Lys Pro1               5                  10                  15Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr Leu Leu Ile Lys Asp
         20                  25                  30Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Arg Gln
     35                  40                  45Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu Arg Ile Ile Gln Arg
 50                  55                  60Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg Ser Ser65                  70                  75<210>12<211>74<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>12Gly Asp Thr Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Cys Leu1               5                  10                  15Gly Tyr Gln Lys Arg Pro Leu Pro Gln Val Leu Leu Ser Ser Trp Tyr
         20                  25                  30Pro Thr Ser Gln Leu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys
     35                  40                  45Arg Gly Arg Gln Val Cys Ala Asp Lys Ser Lys Asp Trp Val Lys Lys
 50                  55                  60Leu Met Gln Gln Leu Pro Val Thr Ala Arg65                  70<210>13<211>99<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>13Arg Val Thr Lys Asp Ala Glu Thr Glu Phe Met Met Ser Lys Leu Pro1               5                  10                  15Leu Glu Asn Pro Val Leu Leu Asp Arg Phe His Ala Thr Ser Ala Asp
         20                  25                  30Cys Cys Ile Ser Tyr Thr Pro Arg Ser Ile Pro Cys Ser Leu Leu Glu
     35                  40                  45Ser Tyr Phe Glu Thr Asn Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe
 50                  55                  60Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys Gln65                  70                  75                  80Val Gln Val Cys Met Arg Met Leu Lys Leu Asp Thr Arg Ile Lys Thr
             85                  90                  95Arg Lys Asn<210>14<211>97<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>14Gln Pro Lys Val Pro Glu Trp Val Asn Thr Pro Ser Thr Cys Cys Leu1               5                  10                  15Lys Tyr Tyr Glu Lys Val Leu Pro Arg Arg Leu Val Val Gly Tyr Arg
         20                  25                  30Lys Ala Leu Asn Cys His Leu Pro Ala Ile Ile Phe Val Thr Lys Arg
     35                  40                  45Asn Arg Glu Val Cys Thr Asn Pro Asn Asp Asp Trp Val Gln Glu Tyr
 50                  55                  60Ile Lys Asp Pro Asn Leu Pro Leu Leu Pro Thr Arg Asn Leu Ser Thr65                  70                  75                  80Val Lys Ile Ile Thr Ala Lys Asn Gly Gln Pro Gln Leu Leu Asn Ser
             85                  90                  95Gln<210>15<211>74<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>15Thr Lys Thr Glu Ser Ser Ser Arg Gly Pro Tyr His Pro Ser Glu Cys1               5                  10                  15Cys Phe Thr Tyr Thr Thr Tyr Lys Ile Pro Arg Gln Arg Ile Met Asp
         20                  25                  30Tyr Tyr Glu Thr Asn Ser Gln Cys Ser Lys Pro Gly Ile Val Phe Ile
     35                  40                  45Thr Lys Arg Gly His Ser Val Cys Thr Asn Pro Ser Asp Lys Trp Val
 50                  55                  60Gln Asp Tyr Ile Lys Asp Met Lys Glu Asn65                  70<210>16<211>111<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>16Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys1               5                  10                  15Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu
         20                  25                  30Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln
     35                  40                  45Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu Leu Trp Val Gln Gln Leu Met
 50                  55                  60Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro Gln Lys Pro Ala Gln Gly Cys65                  70                  75                  80Arg Lys Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser
             85                  90                  95Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser Gln Thr Pro Lys Gly Pro
        100                 105                 110<210>17<211>69<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>17Gly Pro Tyr Gly Ala Asn Met Glu Asp Ser Val Cys Cys Arg Asp Tyr1               5                  10                  15Val Arg Tyr Arg Leu Pro Leu Arg Val Val Lys His Phe Tyr Trp Thr
         20                  25                  30Ser Asp Ser Cys Pro Arg Pro Gly Val Val Leu Leu Thr Phe Arg Asp
     35                  40                  45Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Arg Val Pro Trp Val Lys Met Ile Leu
 50                  55                  60Asn Lys Leu Ser Gln65<210>18<211>71<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>18Ala Arg Gly Thr Asn Val Gly Arg Glu Cys Cys Leu Glu Tyr Phe Lys1               5                  10                  15Gly Ala Ile Pro Leu Arg Lys Leu Lys Thr Trp Tyr Gln Thr Ser Glu
         20                  25                  30Asp Cys Ser Arg Asp Ala Ile Val Phe Val Thr Val Gln Gly Arg Ala
     35                  40                  45Ile Cys Ser Asp Pro Asn Asn Lys Arg Val Lys Asn Ala Val Lys Tyr
 50                  55                  60Leu Gln Ser Leu Glu Arg Ser65                  70<210>19<211>127<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>19Gln Gly Val Phe Glu Asp Cys Cys Leu Ala Tyr His Tyr Pro Ile Gly1               5                  10                  15Trp Ala Val Leu Arg Arg Ala Trp Thr Tyr Arg Ile Gln Glu Val Ser
         20                  25                  30Gly Ser Cys Asn Leu Pro Ala Ala Ile Phe Tyr Leu Pro Lys Arg His
     35                  40                  45Arg Lys Val Cys Gly Asn Pro Lys Ser Arg Glu Val Gln Arg Ala Met
 50                  55                  60Lys Leu Leu Asp Ala Arg Asn Lys Val Phe Ala Lys Leu His His Asn65                  70                  75                  80Met Gln Thr Phe Gln Ala Gly Pro His Ala Val Lys Lys Leu Ser Ser
             85                  90                  95Gly Asn Ser Lys Leu Ser Ser Ser Lys Phe Ser Asn Pro Ile Ser Ser
        100                 105                 110Ser Lys Arg Asn Val Ser Leu Leu Ile Ser Ala Asn Ser Gly Leu
    115                 120                 125<210>20<211>67<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>20Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser1               5                  10                  15His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro
         20                  25                  30Ala Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln
     35                  40                  45Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys
 50                  55                  60Ala Leu Asn Arg Phe Lys Met65                  70<210>21<211>77<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>21Val Pro Leu Ser Arg Thr Val Arg Cys Thr Cys Ile Ser Ile Ser Asn1               5                  10                  15Gln Pro Val Asn Pro Arg Ser Leu Glu Lys Leu Glu Ile Ile Pro Ala
         20                  25                  30Ser Gln Phe Cys Pro Arg Val Glu Ile Ile Ala Thr Met Lys Lys Lys
     35                  40                  45Gly Glu Lys Arg Cys Leu Asn Pro Glu Ser Lys Ala Ile Lys Asn Leu
 50                  55                  60Leu Lys Ala Val Ser Lys Glu Met Ser Lys Arg Ser Pro65                  70                  75<210>22<211>77<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>22Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile Lys1               5                  10                  15Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu Arg Val
         20                  25                  30Ile Glu Ser Gly Pro His Cys Ala Asn Thr Glu Ile Ile Val Lys Leu
     35                  40                  45Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp Val Gln
 50                  55                  60Arg Val Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala Glu Asn Ser65                  70                  75<210>23<211>103<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>23Thr Pro Val Val Arg Lys Gly Arg Cys Ser Cys Ile Ser Thr Asn Gln1               5                  10                  15Gly Thr Ile His Leu Gln Ser Leu Lys Asp Leu Lys Gln Phe Ala Pro
         20                  25                  30Ser Pro Ser Cys Glu Lys Ile Glu Ile Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly
     35                  40                  45Val Gln Thr Cys Leu Asn Pro Asp Ser Ala Asp Val Lys Glu Leu Ile
 50                  55                  60Lys Lys Trp Glu Lys Gln Val Ser Gln Lys Lys Lys Gln Lys Asn Gly65                  70                  75                  80Lys Lys His Gln Lys Lys Lys Val Leu Lys Val Arg Lys Ser Gln Arg
             85                  90                  95Ser Arg Gln Lys Lys Thr Thr
        100<210>24<211>77<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>24Gly Pro Val Ser Ala Val Leu Thr Glu Leu Arg Cys Thr Cys Leu Arg1               5                  10                  15Val Thr Leu Arg Val Asn Pro Lys Thr Ile Gly Lys Leu Gln Val Phe
         20                  25                  30Pro Ala Gly Pro Gln Cys Ser Lys Val Glu Val Val Ala Ser Leu Lys
     35                  40                  45Asn Gly Lys Gln Val Cys Leu Asp Pro Glu Ala Pro Phe Leu Lys Lys
 50                  55                  60Val Ile Gln Lys Ile Leu Asp Ser Gly Asn Lys Lys Asn65                  70                  75<210>25<211>73<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>25Ala Ser Val Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln1               5                  10                  15Gly Ile His Pro Lys Asn Ile Gln Ser Val Asn Val Lys Ser Pro Gly
         20                  25                  30Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Arg
     35                  40                  45Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Ile Val Lys Lys Ile Ile Glu
 50                  55                  60Lys Met Leu Asn Ser Asp Lys Ser Asn65                  70<210>26<211>73<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>26Ala Pro Leu Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln1               5                  10                  15Gly Ile His Leu Lys Asn Ile Gln Ser Val Lys Val Lys Ser Pro Gly
         20                  25                  30Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Gln
     35                  40                  45Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Met Val Lys Lys Ile Ile Glu
 50                  55                  60Lys Met Leu Lys Asn Gly Lys Ser Asn65                  70<210>27<211>73<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>27Ala Ser Val Val Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln1               5                  10                  15Gly Ile His Leu Lys Asn Ile Gln Ser Val Asn Val Arg Ser Pro Gly
         20                  25                  30Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Lys
     35                  40                  45Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Met Val Gln Lys Ile Ile Glu
 50                  55                  60Lys Ile Leu Asn Lys Gly Ser Thr Asn65                  70<210>28<211>76<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>28Gln His His Gly Val Thr Lys Cys Asn Ile Thr Cys Ser Lys Met Thr1               5                  10                  15Ser Lys Ile Pro Val Ala Leu Leu Ile His Tyr Gln Gln Asn Gln Ala
         20                  25                  30Ser Cys Gly Lys Arg Ala Ile Ile Leu Glu Thr Arg Gln His Arg Leu
     35                  40                  45Phe Cys Ala Asp Pro Lys Glu Gln Trp Val Lys Asp Ala Met Gln His
 50                  55                  60Leu Asp Arg Gln Ala Ala Ala Leu Thr Arg Asn Gly65                  70                  75<210>29<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>29Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro Leu Pro1               5<210>30<211>32<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>30Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg1               5                  10                  15Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys
         20                  25                  30<210>31<211>37<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>31Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val1               5                  10                  15Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu
         20                  25                  30Glu Met Ser Lys Leu
     35<210>32<211>69<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>32Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg1               5                  10                  15Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys
         20                  25                  30Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val
     35                  40                  45Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu
 50                  55                  60Glu Met Ser Lys Leu65<210>33<211>32<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>33Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg1               5                  10                  15Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys
         20                  25                  30<210>34<211>37<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>34Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val1               5                  10                  15Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu
         20                  25                  30Glu Met Ser Lys Leu
     35<210>35<211>69<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>35Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg1               5                  10                  15Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys
         20                  25                  30Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val
     35                  40                  45Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu
 50                  55                  60Glu Met Ser Lys Leu65<210>36<211>32<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>36Pro Xaa Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg1               5                  10                  15Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys
         20                  25                  30<210>37<211>37<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>37Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val1               5                  10                  15Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu
         20                  25                  30Glu Lys Ser Lys Leu
     35<210>38<211>69<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>38Pro Xaa Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg1               5                  10                  15Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys
         20                  25                  30Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val
     35                  40                  45Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu
 50                  55                  60Glu Lys Ser Lys Leu65<210>39<211>32<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>39Pro Xaa Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg1               5                  10                  15Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys
         20                  25                  30<210>40<211>37<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>40Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val1               5                  10                  15Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu
         20                  25                  30Glu Lys Ser Lys Leu
     35<210>41<211>69<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>41Pro Xaa Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg1               5                  10                  15Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys
         20                  25                  30Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val
     35                  40                  45Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu
 50                  55                  60Glu Lys Ser Lys Leu65

Claims (47)

1.一种合成趋化因子，在它上面连接有水溶性聚合物，并且具有以下调与它结合的趋化因子受体为特征的体外生物活性。
2.如权利要求1的合成趋化因子，其中，所述合成趋化因子的体内血清循环半衰期是缺乏所述水溶性聚合物的合成趋化因子的血清循环半衰期的10倍以上。
3.如权利要求1的合成趋化因子，其中，所述合成趋化因子进行以下修饰，(A)用选自脂族链、氨基酸、和氨基酸衍生物组成的一组基团的成分在其N-末端进行修饰；或(B)用选自脂族链、多环、氨基酸、和氨基酸衍生物组成的一组基团的成分在其C-末端进行修饰；或(C)同时用选自脂族链、氨基酸、和氨基酸衍生物组成的一组基团的成分在其N-末端进行修饰，并且用选自脂族链、多环、氨基酸、和氨基酸衍生物组成的一组基团的成分在其C-末端进行修饰。
4.如权利要求3的合成趋化因子，其中，所述合成用趋化因子是用选自脂族链、氨基酸、和氨基酸衍生物组成的一组基团的成分在其N-末端进行修饰。
5.如权利要求3的合成趋化因子，其中，所述合成用趋化因子是用选自脂族链、多环、氨基酸、和氨基酸衍生物组成的一组基团的成分在其C-末端进行修饰。
6.如权利要求3的合成趋化因子，其中，所述合成用趋化因子是同时用选自脂族链、氨基酸、和氨基酸衍生物组成的一组基团的成分在其N-末端进行修饰，并且用选自脂族链、多环、氨基酸、和氨基酸衍生物组成的一组基团的成分在其C-末端进行修饰。
7.如权利要求1或3中任意一项的合成趋化因子，其中，所述水溶性聚合物与所述合成趋化因子在选自C-末端位点、聚集位点、糖基化位点和糖胺聚糖(GAG)结合位点的位点连接。
8.如权利要求1或3中任意一项的合成趋化因子，其中，所述合成趋化因子是Rantes、MIP1α、MIP1β、SDF-1、IL-8或MCP-1的类似物。
9.如权利要求8的合成趋化因子，其中，所述合成趋化因子是Rantes的类似物，并且所述水溶性聚合物与C-末端位点连接。
10.如权利要求8的合成趋化因子，其中，所述合成趋化因子是Rantes的类似物，并且所述水溶性聚合物在聚集位点连接。
11.如权利要求8的合成趋化因子，其中，所述合成趋化因子是Rantes的类似物，并且所述水溶性聚合物在糖基化位点连接。
12.如权利要求8的合成趋化因子，其中，所述合成趋化因子是Rantes的类似物，并且所述水溶性聚合物在GAG位点连接。
13.如权利要求8的合成趋化因子，其中，所述合成趋化因子是MIP1α的类似物，并且所述水溶性聚合物与C-末端位点连接。
14.如权利要求8的合成趋化因子，其中，所述合成趋化因子是MIP1α的类似物，并且所述水溶性聚合物在聚集位点连接。
15.如权利要求8的合成趋化因子，其中，所述合成趋化因子是MIP1α的类似物，并且所述水溶性聚合物在糖基化位点连接。
16.如权利要求8的合成趋化因子，其中，所述合成趋化因子是MIP1α的类似物，并且所述水溶性聚合物在GAG位点连接。
17.如权利要求8的合成趋化因子，其中，所述合成趋化因子是MIP1β的类似物，并且所述水溶性聚合物与C-末端位点连接。
18.如权利要求8的合成趋化因子，其中，所述合成趋化因子是MIP1β的类似物，并且所述水溶性聚合物在聚集位点连接。
19.如权利要求8的合成趋化因子，其中，所述合成趋化因子是MIP1β的类似物，并且所述水溶性聚合物在糖基化位点连接。
20.如权利要求8的合成趋化因子，其中，所述合成趋化因子是MIP1β的类似物，并且所述水溶性聚合物在GAG位点连接。
21.如权利要求8的合成趋化因子，其中，所述合成趋化因子是SDF-1的类似物，并且所述水溶性聚合物与C-末端位点连接。
22.如权利要求8的合成趋化因子，其中，所述合成趋化因子是SDF-1的类似物，并且所述水溶性聚合物在GAG位点连接。
23.如权利要求8的合成趋化因子，其中，所述合成趋化因子是IL-8的类似物，并且所述水溶性聚合物与C-末端位点连接。
24.如权利要求8的合成趋化因子，其中，所述合成趋化因子是IL-8的类似物，并且所述水溶性聚合物在GAG位点连接。
25.如权利要求8的合成趋化因子，其中，所述合成趋化因子是MCP-1的类似物，并且所述水溶性聚合物与C-末端位点连接。
26.如权利要求8的合成趋化因子，其中，所述合成趋化因子是MCP-1的类似物，并且所述水溶性聚合物在聚集位点连接。
27.如权利要求8的合成趋化因子，其中，所述合成趋化因子是MCP-1的类似物，并且所述水溶性聚合物在糖基化位点连接。
28.如权利要求8的合成趋化因子，其中，所述合成趋化因子是MCP-1的类似物，并且所述水溶性聚合物在GAG位点连接。
29.如权利要求1的合成趋化因子，其中，所述水溶性聚合物具有下式：U-B-Polymer-J其中：
U包括共价连接所述合成趋化因子的官能团的残基；
B是具有三个或三个以上，并且可以存在或缺乏的支化核心；
Polymer是基本上无抗原性的水溶性聚合物；并且
而J是侧基的残基，它在生理学条件下具有选自负的、正的或中性的净电荷。
30.如权利要求29的合成趋化因子，其中，用间隔基或接头将U、B、Polymer和J中的一个或多个隔开；所述间隔基或接头具有下式：
           U-s1-B-s2-Polymer-s3-J其中，s1、s2和s3是间隔基或接头部分，它们可以相同或不同，并且可以独立存在或者缺乏。
31.如权利要求29的合成趋化因子，其中，U是选自肟、酰胺、胺、氨基甲酸乙酯、醚、硫醚、酯、酰肼、噻唑烷、和噁唑烷的键的残基。
32.如权利要求29的合成趋化因子，其中，B的一个臂与U连接，B的另一个臂与Polymer连接。
33.如权利要求29的合成趋化因子，其中，B包括4个或更多臂。
34.如权利要求33的合成趋化因子，其中，所述臂中的两个或两个以上包括选自肟、酰胺、胺、氨基甲酸乙胺、硫醚、酯、酰肼、噁唑烷、和噻唑烷的键的残基。
35.如权利要求33的合成趋化因子，其中，B包括选自氨基、羧基、和混合的氨基-羧基的支化核心部分。
36.如权利要求29的合成趋化因子，其中，所述Polymer选自聚环氧烷和聚酰胺环氧烷。
37.如权利要求29的合成趋化因子，其中，所述Polymer是具有下式的聚酰胺：-[C(O)-X-C(O)-NH-Y-NH]n-或-[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-，其中，X和Y是二价基团，可以相同或不同，并且可以是支化的或直链的，并且n是一个1-100的整数。
38.如权利要求37的合成趋化因子，其中，X和Y中的一个或两个包括选自：
-(O-CH2-CH2-)n-和-(CH2-CH-O)n-的重复单元，其中，n是一个1-100的整数。
39.如权利要求29的合成趋化因子，其中，J是可离子化的基团。
40.如权利要求39的合成趋化因子，其中，所述可离子化的基团选自羧基、胺和羟基。
41.如权利要求39的合成趋化因子，其中，所述水溶性聚合物具有净负电荷。
42.如权利要求39的合成趋化因子，其中，所述水溶性聚合物具有净正电荷。
43.如权利要求39的合成趋化因子，其中，所述水溶性聚合物具有净中性电荷。
44.一种生物活性合成趋化因子，该合成趋化因子包含与它连接的水溶性聚合物，并且它对包括病毒感染抑制作用在内的生物学反应的体外EC50等于或低于相应的野生型趋化因子，所述EC50是在基于细胞的体外测定方法中测量的，该测定的特征在于让所述生物活性合成趋化因子与它的一种或多种相应的趋化因子受体结合，其中，一种或多种所述受体是病毒感染的共同受体。
45.如权利要求44的生物活性合成趋化因子，其中，所述EC50低于选自下列一组的浓度：1000nM、700nM、500nM、400nM、300nM、200nM、100nM、10nM和1nM。
46.一种生物活性合成趋化因子，该合成趋化因子包含与它连接的水溶性聚合物，并且：
(1)EC50等于或低于相应的野生型趋化因子的EC50，所述EC50是在体外病毒感染测定方法中测量的，该测定的特征在于让所述生物活性合成趋化因子与它的一种或多种相应的趋化因子受体结合，其中，一种或多种所述受体是病毒的共同受体；和
(2)血清循环半衰期是缺乏所述水溶性聚合物的所述合成趋化因子的血清循环半衰期的10倍以上。
47.如权利要求46的生物活性合成趋化因子，其中，所述EC50低于选自下列一组的浓度：1000nM、700nM、500nM、400nM、300nM、200nM、100nM、10nM和1nM。
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