CN112129946A - 无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法及应用，无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法：①氧化：将牛血清白蛋白、乳清蛋白和酪蛋白中的一种或多种溶解于pH5‑6之间的乙酸盐缓冲液中，加入氧化剂，将糖链氧化成醛；②终止氧化：加入乙二醇终止氧化；③沉淀：室温或4℃下，2000g离心10min‑30min；④透析：取上清液于pH5‑6之间的乙酸盐缓冲液中透析，更换数次透析液；⑤定量：用分光光度法定量惰性蛋白含量。本发明制备方法制备得到的无糖链型惰性蛋白封闭剂在异常糖链蛋白检测中的应用，无糖链型惰性蛋白封闭剂加入结合有待封闭样本的固相的孔或反应杯中，于pH7.00‑7.20，4℃过夜或37℃恒温封闭1.5h，每孔或反应杯封闭剂用量：150‑300ul，封闭完毕后，进行分离。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法及应用。
背景技术
蛋白质糖基化作为一种重要的翻译后修饰，对蛋白质结构和功能起着重要的作用，已发现在哺乳动物细胞中，约50％的蛋白有糖基化发生，这种修饰在细胞识别、粘附、细胞间相互作用和生长发育等许多细胞功能中发挥关键作用。
异常糖链糖蛋白主要由糖基化不完全或新的糖基转移酶被激活而产生新的糖基化引起，大量研究表明异常糖链糖蛋白的产生与肿瘤关系密切，如恶性肿瘤患者甲胎蛋白、转铁蛋白、碱性磷酸酶、r-谷氨酰转移酶、人绒毛膜促性腺激素、T抗原、a1抗胰蛋白酶及前列腺酸性磷酸酶等糖链结构发生改变，达到一定程度后，此类物质向血液排放，并较多地存在于外周血液种。
凝集素是一种从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白。它具有能与糖蛋白专一性、非共价可逆结合的特点。凝集素对糖蛋白的结合强度可随分子相互作用的数目增加，凝集素对糖蛋白的结合解离常数为约Kd10-5～10-7。
现有技术中，已经存在利用异常糖链糖蛋白与不同植物凝集素的亲和性，用于各种类型的肿瘤的诊断。但现有技术的检测方法存在如下缺陷：
检测方法的操作步骤存在可优化的空间，现有技术无法实现定量检测，另外封闭剂的选择，影响封闭效果，导致检测结果易受干扰。
发明内容
本发明的目的之一在于解决现有技术的不足 ，提供提供一种无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法。
本发明的目的之二在于提供一种无糖链型惰性蛋白封闭剂的应用，具体为基于无糖链型惰性蛋白封闭剂的异常糖链糖蛋白的检测方法。
本发明解决其技术问题采用的技术方案如下：
无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法：
①氧化：将牛血清白蛋白、乳清蛋白和酪蛋白中的一种或多种溶解于pH5-6之间的乙酸盐缓冲液中，加入氧化剂，将糖链氧化成醛；
②终止氧化：加入乙二醇终止氧化；
③沉淀：室温或4℃下，2000g离心10min-30min；
④透析：取上清液于pH5-6之间的乙酸盐缓冲液中透析，更换数次透析液；
⑤定量：用分光光度法定量惰性蛋白含量。
优选的，步骤①中，氧化剂为高锰酸盐或高碘酸盐，氧化剂的终浓度为100-200mmol/L，在0-2℃下不停搅拌，氧化时间为10分钟-1小时。
优选的，乙二醇的终浓度为500-1000mmol/L，反应1h-2h。
本发明制备方法制备得到的无糖链型惰性蛋白封闭剂在异常糖链蛋白检测中的应用，无糖链型惰性蛋白封闭剂加入结合有待封闭样本的固相的孔或反应杯中，于pH7.00-7.20，4℃过夜或37℃恒温封闭1.5h，每孔或反应杯封闭剂用量：150-300ul，封闭完毕后，进行分离。
优选的，具体应用中，异常糖链蛋白的检测具体步骤如下：
第一步，样本制备及检测
S1样本处理
将待测标本使用样本稀释液稀释至1-20000倍，待测标本充分混匀获得样本液；
S2样本孵育
样本液置于固相A的孔中，所述固相A为聚苯乙烯和/或聚丙烯材质发光板，样本液pH控制在9.40-9.60，室温孵育2-3h或37℃恒温孵育30-60min，通过孵育使稀释后的样本结合在固相A上；或者，样本液置于反应杯，加入固相B，所述固相B为磁性微球，样本液pH控制在7.00-7.20， 室温孵育2-3h或37℃恒温孵育30-60min，通过孵育使稀释后的样本结合在固相B上；
S3分离
针对结合在固相A的，倾倒掉残余的样本稀释液，每孔加入300ul洗液，静置30s-60s，倾倒洗液，如此重复2-3次；针对结合在固相B的，将反应杯在磁分离器上静置1min-2min，每个反应杯加入300ul洗液，静置30s-60s，倾倒洗液，如此重复2-3次；
S4无糖链型惰性蛋白封闭剂封闭
采用无糖链型惰性蛋白封闭剂，于pH7.00-7.20，4℃过夜或37℃恒温封闭1.5h，每孔或反应杯封闭剂用量：300ul，封闭完毕后，针对不同的固相，按照S3的分离操作进行分离；
S5生物素标记的凝集素识别糖链异常蛋白
每孔或反应杯使用生物素标记的凝集素的浓度及用量：0.1-10ug/ml，50-200ul， pH：7.00-7.20，反应时间： 室温孵育2-3h或者37℃恒温孵育1h，针对不同的固相，按照S3的分离操作进行分离，凝集素与生物素的质量比为1：（1-5）；
S6采用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的链霉亲和素进行信号放大
辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶和SA的标记比例：1：（1-10），每孔或反应杯使用浓度及用量：0.05-0.2ug/ml，50-200ul，pH：7.00-7.20，反应时间： 室温孵育30-60min或者37℃恒温孵育15min，针对不同的固相，按照S3的分离操作进行分离；
第二步，制作标准曲线
在0-20000ng/ml范围内，制备4个及以上不同质量浓度的异常糖链糖蛋白样品作为标准品，按照步骤S2-S6对标准品进行处理，基于化学发光免疫分析仪或半自动发光仪获得发光值，将除0值以外的质量浓度和对应的发光值均转换成以2为底的对数，代入至四参数logistic曲线y = (A - D) / [1 + (x/C)^B] + D，线性拟合得到标准曲线；
第三步，样本浓度的计算
对步骤S6的样品，基于化学发光免疫分析仪或半自动发光仪检测获取发光值，代入标准曲线，计算获得待测标本中糖链异常蛋白的浓度。
优选的，步骤S1中，所述样本为血清、血浆和体液中的任意一种，样本稀释比例为1:（1-20000），固相A的结合异常糖链糖蛋白的能力不低于1000ng/cm2，固相B 结合异常糖链糖蛋白的能力不低于80ng异常糖链糖蛋白/10ug磁性微球。
优选的，所述固相A采用96孔发光板，每孔样本量50-200μl，所述固相B的浓度为0.1-0.5mg/ml，每反应杯中样本量10-200μl，固相B的添加量为50-200μl。
优选的，步骤S5中，凝集素与生物素的质量比为1：（1-5）。
优选的，针对固相A的样本稀释液，其组成如下：碳酸钠0.5-1.0g，碳酸氢钠10-15g，纯化水定容至1L；针对固相B的样本稀释液，其组成如下：NaH2PO4.2H2O：0.5-1g，Na2HPO4.12H2O：2-3g，纯化水定容至1L。
优选的，生物素标记的凝集素及辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的链霉亲和素所用的稀释液，其组成如下：
NaH2PO4.2H2O：0.5-1g
Na2HPO4.12H2O：2-3g
Zn2+：0.01-0.02g
Mg2+：0.2-0.4g
纯化水定容至1L。
优选的，凝集素为刀豆凝集素、曼陀罗凝集素、小扁豆凝集素、麦胚凝集素、E型红腰豆凝集素、L型红腰豆凝集素、桔果粉孢凝集素、花生凝集素、蓖麻凝集素I、朝鲜槐凝集素、橙黄网胞盘菌凝集素、双孢蘑菇凝集素、接骨木黑素凝集素和怀槐凝集素ІІ中的任意一种或几种的混合。
本发明有以下有益效果：本发明的方法可以对不同类型的异常糖链糖蛋白进行单独分析，也可以对不同类型的综合分析，另外实现定量检测，准确率高，可靠性好。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中所需要的试剂、原料均系市购。
实施例1 无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法：
①氧化：将牛血清白蛋白、乳清蛋白和酪蛋白中的一种或多种溶解于pH5之间的乙酸盐缓冲液中，加入氧化剂，将糖链氧化成醛；
②终止氧化：加入乙二醇终止氧化；
③沉淀：室温下，2000g离心10minmin；
④透析：取上清液于pH5之间的乙酸盐缓冲液中透析，更换数次透析液；
⑤定量：用分光光度法定量惰性蛋白含量。
步骤①中，氧化剂为高锰酸钾，氧化剂的终浓度为100mmol/L，在0℃下不停搅拌，氧化时间为1小时，乙二醇的终浓度为500mmol/L，反应2h；
实施例2无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法：
①氧化：将牛血清白蛋白、乳清蛋白和酪蛋白中的一种或多种溶解于pH6之间的乙酸盐缓冲液中，加入氧化剂，将糖链氧化成醛；
②终止氧化：加入乙二醇终止氧化；
③沉淀：室温或4℃下，2000g离心30min；
④透析：取上清液于pH6之间的乙酸盐缓冲液中透析，更换数次透析液；
⑤定量：用分光光度法定量惰性蛋白含量。
步骤①中，氧化剂为高碘酸钾，氧化剂的终浓度为200mmol/L，在2℃下不停搅拌，氧化时间为10分钟，乙二醇的终浓度为1000mmol/L，反应1h。
实施例3
无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法：
①氧化：将牛血清白蛋白、乳清蛋白和酪蛋白中的一种或多种溶解于pH5.5之间的乙酸盐缓冲液中，加入氧化剂，将糖链氧化成醛；
②终止氧化：加入乙二醇终止氧化；
③沉淀：室温或4℃下，2000g离心20min；
④透析：取上清液于pH5.5之间的乙酸盐缓冲液中透析，更换数次透析液；
⑤定量：用分光光度法定量惰性蛋白含量。
步骤①中，氧化剂为高锰酸钾，氧化剂的终浓度为150mmol/L，在1℃下不停搅拌，氧化时间为30分钟，乙二醇的终浓度为700mmol/L，反应1.5h。
实施例4异常糖链糖蛋白的检测方法
一种异常糖链糖蛋白的检测方法，所述检测方法的步骤如下：
第一步，样本制备及检测
S1样本制备
将待测标本使用样本稀释液稀释100倍，待测标本充分混匀获得样本液；
S2样本孵育
样本液置于固相A的孔中，所述固相A为聚苯乙烯发光板，样本液pH控制在9.40， 37℃恒温孵育30min，通过孵育使稀释后的样本结合在固相A上；
S3分离
倾倒掉残余的样本稀释液，每孔加入300ul洗液，静置30s，倾倒洗液，如此重复2-3次；
S4封闭
采用质量百分比0.5%的实施例1的无糖链型惰性蛋白为封闭剂，于pH7.00，4℃过夜封闭，每孔封闭剂用量：300ul，封闭完毕后，按照S3的分离操作进行分离；
S5生物素标记的凝集素识别糖链异常蛋白
每孔使用生物素标记的凝集素的浓度及用量：0.1ug/ml，50ul， pH：7.00，反应时间：20℃孵育3h，按照S2的分离操作进行分离；
S6采用辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素进行信号放大
辣根过氧化物酶和SA的标记比例：1：1，每孔使用浓度及用量：0.05ug/ml，50ul，pH：7.00，反应时间： 室温孵育60min，按照S3的分离操作进行分离；
第二步，标准曲线制作
在0-20000ng/ml范围内，制备6个不同质量浓度的异常糖链糖蛋白样品作为标准品，按
照步骤S2-S6对标准品进行处理，基于化学发光免疫分析仪获得发光值，将除0值以外的质
量浓度和对应的发光值均转换成以2为底的对数，代入至四参数logistic曲线y = (A - D)
/ [1 + (x/C)^B] + D，线性拟合得到标准曲线；、
| 样品编号 | 浓度 | 发光值 | 样品类型 |
| 1 | 10000.00 | 5307942 | 标准品 |
| 2 | 5000.00 | 5277470 | 标准品 |
| 3 | 2500.00 | 3869936 | 标准品 |
| 4 | 1250.00 | 1070794 | 标准品 |
| 5 | 625.00 | 336441 | 标准品 |
| 6 | 0.00 | 8235 | 标准品 |
数据拟合方法：四参数logistic方程。
两点校准方法：两点校准方法二。
拟合得到的标准曲线为：y = (22.37146 – 18.08321) / [1 + (x/10.36658)^-24.31571] + 18.08321，相关系数R=0.99990。
第三步，检测获取发光值，发光值为307007 ，代入标准曲线，计算获得待测标本中异常糖链糖蛋白的浓度为523ng/ml，乘上稀释倍数100最终得到标本中异常糖链糖蛋白的浓度为52300ng/ml。
实施例4中，所述样本为血清，其中血清样本稀释比例为1:（100，固相A的结合异常糖链糖蛋白的能力1000ng/cm2，所述固相A采用96孔发光板，每孔样本量50μl，步骤S5中，凝集素与生物素的质量比为1：1，针对固相A的样本稀释液，其组成如下：碳酸钠0.5g，碳酸氢钠10g，纯化水定容至1L，生物素标记的凝集素及辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素所用的稀释液，其组成如下：
NaH2PO4.2H2O：0.5g
Na2HPO4.12H2O：2g
Zn2+：0.01g
Mg2+：0.2g
纯化水定容至1L。
实施例中，凝集素为橙黄网胞盘菌凝集素。
实施例5
一种异常糖链糖蛋白的检测方法，所述检测方法的步骤如下：
S1样本制备
将待测标本使用样本稀释液稀释至1000倍，待测标本充分混匀获得样本液；
S2样本孵育
样本液置于反应杯，加入固相B，所述固相B为磁性微球，样本液pH控制在7.00， 37℃恒温孵育30min，通过孵育使稀释后的样本结合在固相B上；
S3分离
将反应杯在磁分离器上静置1min，每个反应杯加入300ul洗液，静置30s，倾倒洗液，如此重复2-3次；
S4封闭
采用质量百分比1.5%的实施例2的无糖链型惰性蛋白为封闭剂，于pH7.20， 37℃恒温封闭1.5h，每孔封闭剂用量：300ul，封闭完毕后，按照S3的分离操作进行分离；
S5生物素标记的凝集素识别糖链异常蛋白
每孔使用生物素标记的凝集素的浓度及用量： 10ug/ml， 200ul， pH： 7.20，反应时间： 37℃恒温孵育1h，按照S3的分离操作进行分离；
S6采用碱性磷酸酶标记的链霉亲和素进行信号放大
碱性磷酸酶和SA的标记比例：1： 10，每孔使用浓度及用量： 0.2ug/ml， 200ul，pH：7.20，反应时间： 37℃恒温孵育15min，按照S3的分离操作进行分离；
第二步，标准曲线制作
在0-20000ng/ml范围内，制备6个不同质量浓度的异常糖链糖蛋白样品作为标准品，按
照步骤S2-S6对标准品进行处理，基于半自动发光仪获得发光值，将除0值以外的质量浓度
和对应的发光值均转换成以2为底的对数，代入至四参数logistic曲线y = (A - D) / [1
+ (x/C)^B] + D，线性拟合得到标准曲线；、
| 样品编号 | 浓度 | 发光值 | 样品类型 |
| 1 | 10000.00 | 11747658 | 标准品 |
| 2 | 5000.00 | 11011723 | 标准品 |
| 3 | 2500.00 | 7100455 | 标准品 |
| 4 | 1250.00 | 2199305 | 标准品 |
| 5 | 625.00 | 659483 | 标准品 |
| 6 | 0.00 | 17238 | 标准品 |
数据拟合方法：四参数logistic方程。
两点校准方法：两点校准方法二。
拟合得到的标准曲线为：y = (23.55064 – 18.72888) / [1 + (x/10.32234)^-18.42038] + 18.72888，相关系数R=0.99989。
第三步，检测获取发光值1136359，代入标准曲线，计算获得待测标本中糖链异常糖链糖蛋白的浓度为908ng/ml,乘上稀释倍数1000最终得到标本中异常糖链糖蛋白的浓度为908ug/ml。
本实施例中，所述样本为血浆，固相B 结合异常糖链糖蛋白的能力80ng异常糖链糖蛋白/10ug磁性微球，所述固相B的浓度为0.5mg/ml，每反应杯中样本量200μl，固相B的添加量为200μl，步骤S5中，凝集素与生物素的质量比为1：5；针对固相B的样本稀释液，其组成如下：NaH2PO4.2H2O： 1g，Na2HPO4.12H2O：3g，纯化水定容至1L，生物素标记的凝集素及碱性磷酸酶标记的链霉亲和素所用的稀释液，其组成如下：
NaH2PO4.2H2O： 1g
Na2HPO4.12H2O： 3g
Zn2+： 0.02g
Mg2+： 0.4g
纯化水定容至1L，凝集素为橙黄网胞盘菌凝集素。
实施例6
一种异常糖链糖蛋白的检测方法，所述检测方法的步骤如下：
S1样本制备
将待测标本使用样本稀释液稀释至1000倍，待测标本充分混匀获得样本液；S2样本孵育
样本液置于固相A的孔中，所述固相A为聚丙烯材质发光板，样本液pH控制在9.60， 室温孵育2h，通过孵育使稀释后的样本结合在固相A上；
S3分离
倾倒掉残余的样本稀释液，每孔加入300ul洗液，静置60s，倾倒洗液，如此重复2-3次；
S4封闭
采用质量百分比1.0%的实施例3的无糖链型惰性蛋白为封闭剂，于pH7.20，4℃过夜封闭，每孔封闭剂用量：300ul，封闭完毕后，按照S3的分离操作进行分离；
S5生物素标记的凝集素识别糖链异常蛋白
每孔使用生物素标记的凝集素的浓度及用量： 10ug/ml，100ul， pH：7.10，反应时间：室温孵育3h，按照S3的分离操作进行分离；
S7采用辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素进行信号放大
辣根过氧化物酶和SA的标记比例：1：5，每孔使用浓度及用量： 0.2ug/ml， 200ul，pH：7.20，反应时间： 室温孵育60min，按照S3的分离操作进行分离；
第二步，标准曲线制作
在0-20000ng/ml范围内，制备6个不同质量浓度的异常糖链糖蛋白样品作为标准品，按
照步骤S2-S6对标准品进行处理，基于化学发光免疫分析仪获得发光值，将除0值以外的质
量浓度和对应的发光值均转换成以2为底的对数，代入至四参数logistic曲线y = (A - D)
/ [1 + (x/C)^B] + D，线性拟合得到标准曲线；、
| 样品编号 | 浓度 | 发光值 | 样品类型 |
| 1 | 10000.00 | 8738450 | 标准品 |
| 2 | 5000.00 | 8631496 | 标准品 |
| 3 | 2500.00 | 5130898 | 标准品 |
| 4 | 1250.00 | 2071810 | 标准品 |
| 5 | 625.00 | 497098 | 标准品 |
| 6 | 0.00 | 13893 | 标准品 |
数据拟合方法：四参数logistic方程。
两点校准方法：两点校准方法二。
拟合得到的标准曲线为：y = (23.23463 – 17.08044) / [1 + (x/9.88786)^-13.53895] + 17.08044，相关系数R=0.99819。
第三步，检测获取发光值2574463，代入标准曲线，计算获得待测标本中异常糖链糖蛋白的浓度为1420ng/ml,乘上稀释倍数1000最终得到标本中异常糖链糖蛋白的浓度为1420ug/ml。
步骤S1这种，所述样本为体液，固相A的结合异常糖链糖蛋白的能力1200ng/cm2，所述固相A采用96孔发光板，每孔样本量200μl，步骤S5中，凝集素与生物素的质量比为1：3，针对固相A的样本稀释液，其组成如下：碳酸钠1.0g，碳酸氢钠15g，纯化水定容至1L，生物素标记的凝集素及辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素所用的稀释液，其组成如下：
NaH2PO4.2H2O： 1g
Na2HPO4.12H2O： 3g
Zn2+： 0.02g
Mg2+： 0.4g
纯化水定容至1L，凝集素为橙黄网胞盘菌凝集素。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而 且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发 明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性 的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要 求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
Claims (10)
1.无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法，其特征在于，
①氧化：将牛血清白蛋白、乳清蛋白和酪蛋白中的一种或多种溶解于pH5-6之间的乙酸盐缓冲液中，加入氧化剂，将糖链氧化成醛；
②终止氧化：加入乙二醇终止氧化；
③沉淀：室温或4℃下，2000g离心10min-30min；
④透析：取上清液于pH5-6之间的乙酸盐缓冲液中透析，更换数次透析液；
⑤定量：用分光光度法定量惰性蛋白含量。
2.根据权利要求1所述无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法，其特征在于，步骤①中，氧化剂为高锰酸盐或高碘酸盐，氧化剂的终浓度为100-200mmol/L，在0-2℃下不停搅拌，氧化时间为10分钟-1小时。
3.根据权利要求1所述无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法，其特征在于，乙二醇的终浓度为500-1000mmol/L，反应1h-2h。
4.权利要求1-3任意一项制备方法制备得到的无糖链型惰性蛋白封闭剂在异常糖链蛋白检测中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，无糖链型惰性蛋白封闭剂加入结合有待封闭样本的固相的孔或反应杯中，于pH7.00-7.20，4℃过夜或37℃恒温封闭1.5h，每孔或反应杯封闭剂用量：150-300ul，封闭完毕后，进行分离。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，异常糖链蛋白检测的具体步骤如下：
第一步，样本制备及检测
S1样本处理
将待测标本使用样本稀释液稀释至1-20000倍，待测标本充分混匀获得样本液；
S2样本孵育
样本液置于固相A的孔中，所述固相A为聚苯乙烯和/或聚丙烯材质发光板，样本液pH控制在9.40-9.60，室温孵育2-3h或37℃恒温孵育30-60min，通过孵育使稀释后的样本结合在固相A上；或者，样本液置于反应杯，加入固相B，所述固相B为磁性微球，样本液pH控制在7.00-7.20， 室温孵育2-3h或37℃恒温孵育30-60min，通过孵育使稀释后的样本结合在固相B上；
S3分离
针对结合在固相A的，倾倒掉残余的样本稀释液，每孔加入300ul洗液，静置30s-60s，倾倒洗液，如此重复2-3次；针对结合在固相B的，将反应杯在磁分离器上静置1min-2min，每个反应杯加入300ul洗液，静置30s-60s，倾倒洗液，如此重复2-3次；
S4无糖链型惰性蛋白封闭剂封闭
采用无糖链型惰性蛋白封闭剂，于pH7.00-7.20，4℃过夜或37℃恒温封闭1.5h，每孔或反应杯封闭剂用量：300ul，封闭完毕后，针对不同的固相，按照S3的分离操作进行分离；
S5生物素标记的凝集素识别糖链异常蛋白
每孔或反应杯使用生物素标记的凝集素的浓度及用量：0.1-10ug/ml，50-200ul， pH：7.00-7.20，反应时间： 室温孵育2-3h或者37℃恒温孵育1h，针对不同的固相，按照S3的分离操作进行分离，凝集素与生物素的质量比为1：（1-5）；
S6采用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的链霉亲和素进行信号放大
辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶和SA的标记比例：1：（1-10），每孔或反应杯使用浓度及用量：0.05-0.2ug/ml，50-200ul，pH：7.00-7.20，反应时间： 室温孵育30-60min或者37℃恒温孵育15min，针对不同的固相，按照S3的分离操作进行分离；
第二步，制作标准曲线
在0-20000ng/ml范围内，制备4个及以上不同质量浓度的异常糖链糖蛋白样品作为标准品，按照步骤S2-S6对标准品进行处理，基于化学发光免疫分析仪或半自动发光仪获得发光值，将除0值以外的质量浓度和对应的发光值均转换成以2为底的对数，代入至四参数logistic曲线y = (A - D) / [1 + (x/C)^B] + D，线性拟合得到标准曲线；
第三步，样本浓度的计算
对步骤S6的样品，基于化学发光免疫分析仪或半自动发光仪检测获取发光值，代入标准曲线，计算获得待测标本中糖链异常蛋白的浓度。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述样本为血清、血浆和体液中的任意一种，固相A的结合异常糖链蛋白的能力不低于1000ng/cm2，固相B 结合异常糖链蛋白的能力不低于80ng异常糖链糖蛋白/10ug磁性微球，所述固相A采用96孔发光板，每孔样本量50-200μl，所述固相B的浓度为0.1-0.5mg/ml，每反应杯中样本量10-200μl，固相B的添加量为50-200μl。
8.根据权利要求1所述异常糖链蛋白的检测方法，其特征在于，针对固相A的样本稀释液，其组成如下：碳酸钠0.5-1.0g，碳酸氢钠10-15g，纯化水定容至1L；针对固相B的样本稀释液，其组成如下：NaH2PO4.2H2O：0.5-1g，Na2HPO4.12H2O：2-3g，纯化水定容至1L。
9.根据权利要求1所述异常糖链蛋白的检测方法，其特征在于，生物素标记的凝集素及辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的链霉亲和素所用的稀释液，其组成如下：
NaH2PO4.2H2O：0.5-1g
Na2HPO4.12H2O：2-3g
Zn2+ ：0.01-0.02g
Mg2+：0.2-0.4g
纯化水定容至1L。
10.根据权利要求1所述异常糖链蛋白的检测方法，其特征在于，凝集素为刀豆凝集素、曼陀罗凝集素、小扁豆凝集素、麦胚凝集素、E型红腰豆凝集素、L型红腰豆凝集素、桔果粉孢凝集素、花生凝集素、蓖麻凝集素I、朝鲜槐凝集素、橙黄网胞盘菌凝集素、双孢蘑菇凝集素、接骨木黑素凝集素和怀槐凝集素ІІ中的任意一种或几种的混合。
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