CN110763848A - ELISA检测唾液样品中SAα2-6Gal糖链含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种ELISA检测唾液样品中SAα2‑6Gal糖链含量的方法：本方法以黏蛋白作为标准品，利用标准曲线可计算出一定唾液蛋白包被浓度下，与唾液样品含有等量SAα2‑6Gal糖链含量的黏蛋白含量，据此可以计算得到唾液样品中SAα2‑6Gal糖链的含量，定量结果准确。

Description

ELISA检测唾液样品中SAα2-6Gal糖链含量的方法
技术领域
本发明涉及唾液酸糖链定量检测，具体涉及一种检测SAα2-6Gal糖链含量的方法。
背景技术
酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA)是一种酶联免疫测定技术。它利用抗原抗体之间专一性的结合将待测物与酶连接，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色物质，在一定波长处产生吸光度值，产物的吸光度值与标本中待测物的量若直接相关，则可根据吸光度值来定量检测样本中待测物的含量。
凝集素(Lectin)是一类从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提取的蛋白质或糖蛋白质，能够识别特定的糖链结构(可以与糖类专一的、非共价结合)。例如，黑接骨木凝集素(Sambucus nigra agglutinin，SNA)特异性识别糖链末端α2-6连接的唾液酸(SA)，而马鞍树凝集素-Ⅱ(Maackia Aimrensis Lectin-Ⅱ，MAL-Ⅱ)特异性识别糖链末端α2-3连接的唾液酸(SA)。
胎球蛋白中含有唾液酸成分，其中SAα2-3Gal糖链含量为1.15％，SAα2-6Gal糖链含量为1.47％，即含有定量的糖链。黏蛋白是由杯状细胞分泌的高分子糖蛋白，该蛋白质表面含有丰富的O-糖链结构，其中SAα2-3Gal糖链含量为0.39％，SAα2-6Gal糖链含量为0.26％，即含有定量的唾液酸糖链。
目前检测样品中SAα2-6Gal糖链含量的方法主要是基于ELISA的检测方法和高效液相色谱法(HPLC)，但以上检测方法对于SAα2-6Gal糖链定量检测均存在一定的不足。例如，基于ELISA的检测方法没有合适的标准品，因此，该方法只能对SAα2-6Gal糖链含量进行相对定量，不能进行绝对定量；而对于利用高效液相色谱法定量检测SAα2-6Gal糖链，由于目前缺乏将目标糖链特异性的水解为游离状态的水解酶，因此利用HPLC对样品中的SAα2-6Gal糖链进行定量时，首先需要定量唾液样品中的总唾液酸含量和SAα2-3Gal糖链含量，然后再根据两者的差值计算SAα2-6Gal糖链的含量，造成实验步骤繁琐、耗时长，且实验成本较高。目前尚未见到利用黏蛋白作为标准品定量检测样品中SAα2-6Gal糖链的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种ELISA检测唾液样品中SAα2-6Gal糖链含量的方法。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种检测唾液样品中SAα2-6Gal糖链含量的方法，包括以下步骤：
1)以黏蛋白作为含有SAα2-6Gal糖链结构的标准品，将该标准品固定在第一固相载体表面，然后利用显色试剂及可特异性识别SAα2-6Gal糖链结构的凝集素建立ELISA反应体系，并利用该反应体系计算黏蛋白包被浓度－吸光度值标准曲线；
2)将唾液样品按照不同的唾液蛋白包被浓度固定在第二固相载体表面，然后利用显色试剂及可特异性识别SAα2-6Gal糖链结构的凝集素建立ELISA反应体系，并利用该反应体系计算唾液蛋白包被浓度－吸光度值曲线；
3)在所述吸光度值曲线中确定唾液蛋白参考浓度(即对应吸光度值符合所述标准曲线线性范围限制的某一唾液蛋白包被浓度)，根据唾液蛋白参考浓度在所述吸光度值曲线中对应的吸光度值及所述标准曲线计算该吸光度值对应的黏蛋白包被浓度(即相对黏蛋白含量)，然后根据已知的黏蛋白SAα2-6Gal糖链结构含量(例如，重量百分比)计算(将相对黏蛋白含量与已知的黏蛋白SAα2-6Gal糖链结构含量相乘)唾液蛋白参考浓度下唾液样品中SAα2-6Gal糖链结构的含量，然后根据唾液样品的唾液蛋白浓度(即唾液总蛋白浓度)与唾液蛋白参考浓度的比值(即唾液样品中唾液蛋白稀释倍数)，计算唾液样品中的SAα2-6Gal糖链结构的含量。
优选的，所述黏蛋白包被浓度≤100μg/mL。
优选的，所述步骤2)中，唾液蛋白包被浓度为2～100μg/mL。
优选的，所述唾液蛋白参考浓度为2～5μg/mL。
优选的，所述可特异性识别SAα2-6Gal糖链结构的凝集素选自生物素标记的SNA。
优选的，所述生物素标记的SNA的工作浓度为2～5μg/mL。
优选的，所述显色试剂包括HRP标记的链霉亲和素。
优选的，所述HRP标记的链霉亲和素的工作浓度为2.5～5μg/mL，上述浓度的HRP标记的链霉亲和素与生物素标记的SNA的体积比为1:1～2。
优选的，所述显色试剂还包括TMB底物显色液，吸光度值的测量波长选自450nm。
优选的，所述第一固相载体表面及第二固相载体表面位于同一酶标板上。
一种检测唾液样品中SAα2-6Gal糖链含量的ELISA试剂盒，该试剂盒包括上述酶标板、黏蛋白标准品、显色试剂及可特异性识别SAα2-6Gal糖链结构的凝集素。
本发明的有益效果体现在：
本发明以黏蛋白作为标准品，通过建立针对标准品及唾液样品的ELISA反应体系，可以利用标准曲线计算出在一定唾液蛋白包被浓度下，与唾液样品中含有等量SAα2-6Gal糖链含量的黏蛋白的含量，据此可以计算得到唾液样品中SAα2-6Gal糖链的绝对含量，定量结果准确。
进一步的，本发明引入生物素-链霉亲和素系统增加检测灵敏性，黏蛋白浓度在0～100μg/mL范围内时，其450nm处吸光度值与浓度具有良好的线性关系。
附图说明
图1为本发明实施例中建立的检测SAα2-6Gal糖链含量方法的原理示意图。
图2为胎球蛋白标准品(a)及黏蛋白标准品(b)、(c)在450nm处的吸光度值随浓度的变化规律示意图。
图3为不同浓度生物素标记的SNA条件下，黏蛋白浓度的吸光度值示意图。
图4为实际唾液样品检测中绘制的黏蛋白标准曲线(a)及唾液样品吸光度检测曲线(b)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
1.检测原理
参见图1，本发明基于ELISA技术，即利用凝集素与糖蛋白(Glycoprotein)上糖链之间的特异性结合反应，在将待测唾液样品(检测目标为SAα2-6Gal糖链)和标准品固定于固相载体表面后，直接用生物素(Biotin)标记的特异性凝集素分别与待测唾液样品和标准品孵育(即加入特异性识别目标糖链结构的生物素化凝集素，使糖蛋白表面待测糖链与该凝集素结合，在本发明中所使用的能够特异性识别SAα2-6Gal糖链的凝集素为SNA)，再经过与辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)标记的链霉亲和素(Streptavidin-HRP)孵育(即再加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，利用生物素-链霉亲和素特异性结合反应，将辣根过氧化物酶引入反应体系)，再利用加入的辣根过氧化物酶的特异性底物(TMB substrate)显色液(TMB底物显色液)显色，TMB底物显色液在HRP的作用下产生蓝色可溶性物质，硫酸终止反应后，溶液呈黄色，可在450nm处检测显色后反应体系的吸光度值。
利用以上ELISA技术，根据建立的标准曲线及唾液样品稀释后一定唾液蛋白包被浓度对应的吸光度值，计算该吸光度值下的标准品包被浓度，将计算出的标准品包被浓度乘以已知的标准品上SAα2-6Gal糖链所占的比值，即可得到对应唾液蛋白包被浓度下唾液样品中的SAα2-6Gal糖链含量。将该SAα2-6Gal糖链含量乘以所述唾液蛋白包被浓度对应的唾液样品稀释倍数，即可得到唾液样品的SAα2-6Gal糖链含量。
2.ELISA检测SAα2-6Gal糖链含量方法的建立
1)唾液样品和蛋白标准品包被：以黏蛋白(mucin)或者胎球蛋白(fetuin)为标准品，将唾液样品和标准品分别用pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液稀释后，按照100μL/孔加入酶标板不同反应孔(96孔板)中，4℃过夜包被。
2)封闭未结合部位：从4℃取出酶标板，置室温30min，弃去孔内的溶液并用吸水纸拍干，每孔加入100μL含3％(质量分数)牛血清白蛋白(BSA)的PBST(PBST配方：含有0.05％Tween 20的PBS溶液)，室温孵育1h，封闭孔底部未包被的部位。
3)清洗：经过步骤2)后，弃去孔内溶液并用PBST清洗4～5次，每次清洗时PBST应加满整个反应孔，轻柔摇动3min，弃去孔内溶液并用吸水纸拍干。
4)生物素化凝集素的孵育：用含有1％BSA的PBST将生物素标记的SNA(美国Vector公司)稀释，然后在酶标板各反应孔中加入100μL，室温孵育1h，反应结束后，用PBST清洗3次。
5)生物素-链霉亲和素反应：用PBST将HRP标记的链霉亲和素(美国Vector公司)稀释2000倍，即浓度为2.5μg/mL，每孔加入100μL，室温孵育30min，然后用PBST清洗96孔板4～5次。
6)显色与终止：经过步骤5)后，每孔中加入100μL TMB底物显色液(上海碧云天生物技术有限公司)，室温孵育15～20min；然后每孔加入50μL 2M硫酸终止反应，即可进行检测。
7)检测：利用酶标仪检测各反应孔在波长为450nm处的吸光度值。
3.标准品及其线性范围的筛选
分别选用来源于猪胃的黏蛋白(sigma，M2378-100G，分子量为640kDa)和来源于胎牛血清的胎球蛋白(sigma，F3385-100MG，分子量为64kDa)作为标准品。将标准品用pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液稀释成1000、500、200、100、50、20、10、5、1，及0μg/mL(0μg/mL就是指缓冲溶液本身)后分别包被于酶标板反应孔内，用2μg/mL生物素标记的SNA检测不同标准品及包被浓度的吸光度值(参照上述ELISA检测SAα2-6Gal糖链含量方法)，以不同标准品及其浓度对其吸光度值作图(图2)，确定标准品及其浓度的最佳线性范围。如图2所示，以胎球蛋白作为标准品(图2a)时，其450nm处的吸光度值随浓度变化规律较差；而利用黏蛋白作为标准品(图2b)时，其450nm处的吸光度值随浓度变化规律较好，且当黏蛋白浓度在0～100μg/mL范围内时(图2c)，其浓度与450nm处的吸光度值呈线性相关，其相关系数R2为0.9781，本发明发现在该浓度范围内，黏蛋白作为标准蛋白，可以用来计算在某一唾液蛋白包被浓度下，与唾液样品中含有等量SAα2-6Gal糖链的黏蛋白的含量，并利用计算得到的黏蛋白的含量乘以已知的黏蛋白上SAα2-6Gal糖链所占的比值，最终计算出唾液样品中SAα2-6Gal糖链的含量。
4.生物素化SNA浓度的筛选
将黏蛋白用pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液稀释成100、50、20、10、5、1，及0μg/mL后包被于酶标板反应孔内，分别用10、5，及2μg/mL的生物素标记的SNA进行检测(参照上述ELISA检测SAα2-6Gal糖链含量方法)，以不同浓度生物素标记的SNA条件下，黏蛋白包被浓度对其吸光度值作图(图3)，确定最佳的生物素标记SNA的使用浓度。如图3所示，在某一黏蛋白浓度下，随着生物素标记的SNA的浓度增加，其450nm处的吸光度值也随之增大，且使用不同浓度生物素标记的SNA对SAα2-6Gal糖链含量进行检测时，黏蛋白浓度与其吸光度值之间的相关性也不同，如利用10、5，及2μg/mL的生物素标记的SNA进行检测时，黏蛋白浓度与450nm吸光度值之间的相关系数R2分别为0.8867、0.9474，及0.9433。因此，确定生物素标记的SNA的使用浓度为5μg/mL或2μg/mL。
5.ELISA检测唾液样本中SAα2-6Gal糖链的含量及其验证
饭后或者饭前2小时以上，用0.9％生理盐水漱口2次，用舌尖顶住上颚让唾液自然分泌，收集大约1mL唾液。新鲜采集的唾液在4℃、12000rpm条件下离心15min，收集上清，得唾液样品，利用bradford蛋白浓度测定试剂盒对唾液样品(例如，样品1-样品7共7个个体的唾液样品)中唾液蛋白浓度(即表1中唾液总蛋白浓度)进行定量检测。
用pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液将黏蛋白稀释为100、50、20、10、5、2，及0μg/mL，唾液样品按照唾液蛋白浓度计用pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液稀释为100、50、20、10、5，及2μg/mL，按照上述ELISA检测SAα2-6Gal糖链含量的方法进行检测，最终计算出唾液样品中SAα2-6Gal糖链的含量。如图4所示，标准品(黏蛋白)在0-100μg/mL范围内的标准曲线，其相关系数R2为0.9148，线性关系良好(图4a)；不同唾液样品在450nm的吸光度值随唾液蛋白浓度的变化参见图4b，随着唾液蛋白浓度的增加，其450nm吸光度值也随之增大。在检测唾液样品中SAα2-6Gal糖链含量时，根据标准曲线的线性范围，筛选出450nm吸光度值在标准曲线线性范围内时对应的一个唾液蛋白浓度(参见表1的唾液蛋白包被浓度)，根据标准曲线方程，计算出该唾液蛋白浓度下唾液样品的450nm吸光度值所对应的黏蛋白包被浓度(参见表1中的相对黏蛋白含量)，即表示在该唾液蛋白浓度下，与唾液样品中含有等量SAα2-6Gal糖链对应的黏蛋白的含量，然后用计算得到的相对黏蛋白含量乘以已知的黏蛋白上SAα2-6Gal糖链所占黏蛋白总量的比值(wt％)，即得到该唾液蛋白浓度下唾液样品中SAα2-6Gal糖链的含量，再乘以唾液总蛋白浓度与唾液蛋白包被浓度(表1)的比值，即可计算出唾液样品中SAα2-6Gal糖链的含量。
利用HPLC对上述ELISA检测SAα2-6Gal糖链含量方法的检测结果进行验证，即对同一唾液样品中SAα2-6Gal糖链的含量同时按HPLC和上述ELISA检测SAα2-6Gal糖链含量方法两种方法进行定量检测，结果表明同一唾液样品用两种方法检测SAα2-6Gal糖链含量的结果基本一致(参见表2)，说明以黏蛋白作为标准品，利用上述ELISA检测SAα2-6Gal糖链含量方法可以对唾液样品中SAα2-6Gal糖链的含量进行较为准确的检测。
表1.ELISA方法检测唾液样品中SAα2-6Gal糖链含量的实验数据
Figure BDA0002293717030000061
表2.不同方法检测样品中SAα2-6Gal糖链含量结果的比较

Claims (10)

1.一种检测唾液样品中SAα2-6Gal糖链含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)以黏蛋白作为标准品，将该标准品固定在第一固相载体表面，然后利用显色试剂及可特异性识别SAα2-6Gal糖链的凝集素建立ELISA反应体系，并利用该反应体系计算黏蛋白包被浓度－吸光度值标准曲线；
2)将唾液样品按照不同的唾液蛋白包被浓度固定在第二固相载体表面，然后利用显色试剂及可特异性识别SAα2-6Gal糖链的凝集素建立ELISA反应体系，并利用该反应体系计算唾液蛋白包被浓度－吸光度值曲线；
3)在所述吸光度值曲线中确定唾液蛋白参考浓度，根据唾液蛋白参考浓度在所述吸光度值曲线中对应的吸光度值及所述标准曲线计算该吸光度值对应的黏蛋白包被浓度，然后根据已知的黏蛋白SAα2-6Gal糖链含量计算唾液蛋白参考浓度下唾液样品中SAα2-6Gal糖链的含量，然后根据唾液样品的唾液蛋白浓度与唾液蛋白参考浓度的比值，计算唾液样品中的SAα2-6Gal糖链的含量。
2.根据权利要求1所述一种检测唾液样品中SAα2-6Gal糖链含量的方法，其特征在于：所述黏蛋白包被浓度≤100μg/mL。
3.根据权利要求1所述一种检测唾液样品中SAα2-6Gal糖链含量的方法，其特征在于：所述步骤2)中，唾液蛋白包被浓度为2～100μg/mL。
4.根据权利要求1所述一种检测唾液样品中SAα2-6Gal糖链含量的方法，其特征在于：所述唾液蛋白参考浓度为2～5μg/mL。
5.根据权利要求1所述一种检测唾液样品中SAα2-6Gal糖链含量的方法，其特征在于：所述可特异性识别SAα2-6Gal糖链的凝集素选自生物素标记的SNA。
6.根据权利要求5所述一种检测唾液样品中SAα2-6Gal糖链含量的方法，其特征在于：所述生物素标记的SNA的工作浓度为2～5μg/mL。
7.根据权利要求1所述一种检测唾液样品中SAα2-6Gal糖链含量的方法，其特征在于：所述显色试剂包括HRP标记的链霉亲和素。
8.根据权利要求7所述一种检测唾液样品中SAα2-6Gal糖链含量的方法，其特征在于：所述HRP标记的链霉亲和素的工作浓度为2.5～5μg/mL。
9.根据权利要求1所述一种检测唾液样品中SAα2-6Gal糖链含量的方法，其特征在于：所述第一固相载体表面及第二固相载体表面位于同一酶标板上。
10.一种检测唾液样品中SAα2-6Gal糖链含量的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括黏蛋白标准品、用于包被黏蛋白的第一固相载体、用于包被唾液样品的唾液蛋白的第二固相载体，以及用于在对应固相载体上建立ELISA反应体系的显色试剂和可特异性识别SAα2-6Gal糖链的凝集素。
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