KR20130049477A - 트로포닌 ｉ의 고감도 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

프로타민을 이용하여 샘플내 분석대상물의 고감도 검출할 수 있는 검출 방법이 개시된다. 상기 검출 방법에 따르면, 프로타민이 샘플내 존재하는 피브리노겐과 정전 결합 하는 것에 의해 비특이적 결합을 감소시킴으로써, 분석대상물의 검출 민감도 및 검출 재현성이 현저히 향상될 수 있다.

Description

트로포닌 Ｉ의 고감도 검출 방법{HIGH SENSITIVE METHOD FOR ASSAYING TROPONIN I}
프로타민을 이용하여 샘플내 분석대상물을 고감도로 검출할 수 있는 면역분석 시약, 바이오센서 및 분석대상물의 검출 방법을 제공하고자 한다.
생화학적 결합 분석은 생물학적 표본 내의 분석대상물의 존재 및 농도를 결정하기 위하여 폭넓게 이용되고 있다. 이러한 분석은 결합 파트너에 대한 개념에 기초한다. 관심 분석대상물은 분석대상물 결합 작용제 (예를 들면, 분석 대상물 또는 분석 대상물의 수용체에 대한 항체)에 결합하고, 이에 따라 분석대상물 및 분석대상물 결합 작용제는 "결합 파트너"로 지칭된다. 결합 파트너 중 하나가 고체상에 결합될 때, 분석은 혼성(heterogeneous) 분석으로 지칭된다. 예를 들면, 이러한 혼성 분석은 샌드위치 방법, 간접 방법 및 경쟁 방법을 포함한다.
분석의 민감도는 통상적으로 분석대상물의 부재시에 수득된 판독 신호와 비교하여 당해 분석에 의해 생성된 신호에서의 통계학적으로 유의한 변화를 발생시킨 분석대상물의 가장 적은 양을 의미한다. 민감도의 증가가 요구되고 있는데 이는 보다 적은 양의 분석대상물에 대한 검출을 가능하게 할 뿐만 아니라, 분석대상물에 대한 전반적으로 더 높은 민감도를 제공하기 때문이다.
비특이적 결합은 고체상과 혼성 분석 시스템 내의 결합 파트너 간의 비특이적 상호작용을 의미한다. 비특이적 결합은 종종 혼성 분석의 민감도를 감소시킨다. 따라서, 이러한 비특이적 결합을 감소시키는 방법이 요구되고 있다.
프로타민을 이용하여 샘플내 분석대상물을 고감도로 검출할 수 있는 면역분석 시약, 바이오센서 및 분석대상물의 검출 방법을 제공하고자 한다.
일 측면에 따르면,
분석대상물 함유 샘플 및 프로타민을 포함하고,
상기 프로타민은 샘플 내의 피브리노겐과의 정전 결합으로 프로타민-피브리노겐 복합체를 형성하는, 분석대상물의 고감도 검출용 면역분석 시약이 개시된다.
다른 측면에 따르면,
분석대상물에 특이적인 포획 항체가 고정된 기판;
프로타민에 의해 피브리노겐이 제거된 면역분석 시약; 및
상기 기판에 고정된 포획 항체와 동일한 검출 항체를 포함하는 바이오센서가 개시된다.
다른 측면에 따르면,
분석대상물에 특이적인 포획 항체를 기판 상에 고정시키는 단계;
프로타민에 의해 피브리노겐이 제거된 면역분석 시약을 준비하는 단계;
상기 포획 항체와 동일한 검출 항체를 상기 면역분석 시약에 첨가하여 검출 항체-분석대상물 복합체를 형성하는 단계;
상기 검출 항체-분석대상물 복합체를 상기 포획 항체에 결합시켜 검출 항체-분석대상물-포획 항체 복합체를 형성하는 단계; 및
상기 분석대상물을 검출하는 단계를 포함하는 분석대상물의 고감도 검출 방법이 개시된다.
상기에 따르면, 프로타민이 샘플내 존재하는 피브리노겐과 정전결합 하는 것에 의해 비특이적 결합을 감소시킴으로써, 분석대상물의 검출 민감도 및 검출 재현성이 현저히 향상될 수 있다.
도 1은 금 염색 분석법(gold staining assay)을 나타낸다.
도 2는 효소 결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay)을 나타낸다.
본 명세서에 달리 정의되어 않는 한, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다. 본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 비록 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명을 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 달리 언급되지 않는 한, "또는"은 "및/또는"을 의미한다. 더욱이, 용어 "포함하는" 뿐만 아니라, 다른 형태, 예를 들어, "가지는", "이루어지는" 및 "구성되는"는 제한적이지 않다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 씌여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.
본 명세서에 제공된 제목은 다양한 면 또는 전체적으로 명세서의 참조로서, 하기의 구현예를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.
트로포닌 I의 고감도 검출 방법을 제공하고자 한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "트로포닌 I(TnI)"은 액틴과 마이오신의 칼슘 의존성 상호작용을 조절하는, 트로포닌 T 및 트로포닌 C와 함께 근육 조직에서 일반적으로 발견되는 단백질이다. TnI는 3종의 이소타입(isotype), 예를 들면 완속 연축 골격근 이소폼 트로포닌 I(Slow-twitch skeletal muscle isoform troponin I), 급속-연축 골격근 이소폼 트로포닌 I(Fast-twitch skeletal muscle isoform troponin I), 및 심장 트로포닌 I(Cardiac troponin I)이 존재한다. 이 중에서, 심장 트로포닌 I는 N-말단에 추가적인 31개의 아미노산 잔기를 지니며, 심근에 존재하는 유일한 트로포닌 이소폼이다.
임상 연구에 의하면 심장 트로포닌 I(cTnI)은 급성 심근 경색 발생 4-6시간 후 혈류에서 검출가능하며, 그 이후에도 며칠 동안 상승된 채로 유지될 수 있음이 입증되었다(Mair et al., Clin Chem 41(9):1266-1272, 1995; Larue et al., Clin Chem 39(6):972-979, 1993). 따라서, cTnI의 상승은 크레아틴 키나아제-MB(CK-MB) 및 락테이트 데히드로게나아제 모두에 대한 진단 창을 커버한다(Bodor, J Clin Immunoassay 17(1):40-44, 1994). 또한, 다른 연구에서는 cTnI이 CK-MB보다 심근 손상에 대하여 더 높은 임상 특이성을 나타냄을 제시하고 있다(Adams et al., Circulation 88(1):101-106, 1993; Apple et al., Clin Chim Acta 237:59-66, 1995).
cTnI의 심장 특이성 및 민감도로 인해, cTnI은 불안정형 협심증 및 ST분절 비상승 급성 관상동맥 증후군(acute coronary syndrome, ACS)을 앓고 있는 환자들을 진단하는데 있어 신뢰할 수 있는 마커로 사용되어 왔다. ACS를 앓고 있는 환자에 대한 기존 임상 연구 (Lindahl et al., J Am Coll Cardiol 38:1497-1498, 2001; Venge et al., Am J Cardiol 89:1035-1041, 2002)는 cTnI 값의 미미한 증가가 단기 및 장기 사망 위험에 대한 중요한 예측 정보(prognostic information)를 제공한다는 것을 밝혀내었다 (Galvani et al., Circulation 95:2053-2059, 1997; Antman et al., N Eng J Med 335:1342-1349, 1996; Ottani et al., Am Heart J 40:917-927, 2000; Heidenreich et al., J Am Coll Cardiol 38:478-485, 2001). 궁극적으로, 예측에 대한 평가는 특이적인 치료적 개입에 의해 가장 혜택을 받을 것으로 여겨지는 환자를 확인하는데 유용하게 이용될 수 있다.
한편, TnI의 면역분석시, 샘플 내에는 단백질, 포도당, 이온 등과 같이 항원 항체간의 결합을 저해하는 요인들이 존재한다. 특히, 사람 혈장 내에 약 1.5-4.0 g/L 의 양으로 존재하는 단백질인 피브리노겐이 항원 항체 간의 반응을 크게 저해시킨다. 따라서, 샘플내 존재하는 피브리노겐을 제거하는 것에 의해 비특이적 결합을 감소시킴으로써, TnI 검출 민감도 및 검출 재현성을 향상시킬 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
일 구현예에 따르면, 분석대상물 함유 샘플 및 프로타민을 포함하고, 상기 프로타민은 샘플 내의 피브리노겐과의 정전 결합으로 프로타민-피브리노겐 복합체를 형성하는 분석대상물의 고감도 검출용 면역분석 시약이 제공된다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "샘플"은 넓은 범위의 생물학적 물질뿐만 아니라 생물학적 물질로부터 유도되거나 추출된 조성물을 의미한다. 분석대상물 함유 샘플은 임의의 적절한 샘플일 수 있다. 예를 들면, 상기 샘플은 혈청 샘플 또는 혈장 샘플과 같은 혈액 샘플일 수 있다.
상기 혈장 샘플은 혈액 세포가 현탁되어 있는 혈액의 액체 성분일 수 있다. 예를 들면, 혈장은 수분, 혈장단백질, 그 밖에 지질·당류·무기염류와 비단백질성 질소화합물로서 요소·아미노산·요산 등을 포함할 수 있다.
상기 혈장은 혈액 샘플 내의 혈액 세포로부터 원심분리에 의해 분리될 수 있다. 혈장 샘플은 항응고물질, 예를 들면, 나트륨 헤파린, 나트륨 시트레이트, 나트륨 플루오라이드 및 칼륨 옥살레이트 또는 칼륨 EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid)을 포함하는 혈관으로부터 얻어질 수 있다.
일 실시예에서, 혈장 샘플이 사용되었다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "분석대상물"은 측정하고자 하는 물질 또는 화학 성분을 의미한다.
일 실시예에서, 심장 트로포닌 I이 사용되었다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "피브리노겐"은 척추동물의 혈장 및 림프 속에 존재하며 혈액응고의 중심적 역할을 하는 인자를 의미한다. 피브리노겐은 340 KDa 에 이르는 당단백질로서, 혈장 내에서 약 1.5-4.0 g/L의 농도로 존재한다.
피브리노겐은 6합체의 분자로α(A), β(V), γ의 서로 다른 3개의 사슬이 각각 2개씩 존재한다. 이들 각각의 사슬들은 이황화결합(disulfide bond)을 통해 서로 결합하고 있다. 이들 3개의 사슬의 N-말단부는 사슬의 가교 결합에 참여하는 시스테인을 포함하고, C-말단부는 분자 인식 단위로서 역할을 할 수 있는 약 225개의 아미노산 잔기로 이루어진 도메인을 포함한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "프로타민"은 평균 전하량이 +20인 다중양이온으로서, 하기의 구조식으로 표현된다:
[구조식 1]
Figure pat00001

상기 프로타민의 염기성 구아니디늄기는 피브리노겐의 설페이트와 정전결합(electrostatic interaction)을 하는 것에 의해, 프로타민-피브리노겐 복합체를 형성함으로써, 트로포닌 I의 면역분석시 비특이적 결합을 감소시킬 수 있다.
상기 프로타민은 2 ng/ml 내지 4 mg/ml, 또는 1 mg/ml 내지 3 mg/ml, 또는 1.5mg/ml 내지 2.5 mg/ml의 양으로 사용될 수 있다.
일 실시예에서, 2.5 mg/ml의 프로타민이 사용되었다.
상기 면역분석 시약에 따르면, 프로타민이 샘플내 존재하는 피브리노겐과 정전 결합 하는 것에 의해 트로포닌 I의 비특이적 결합을 감소시키므로, 면역분석시 트로포닌 I의 검출 민감도 및 검출 재현성이 현저히 향상될 수 있다.
다른 구현예에 따르면, 상기 면역분석 시약을 이용한 바이오센서가 제공된다. 상기 바이오센서는 분석대상물에 특이적인 포획 항체("분석대상물 결합 작용제")가 고정된 기판, 프로타민에 의해 피브리노겐이 제거된 면역분석 시약 및 상기 기판에 고정된 포획 항체와 동일한 검출 항체를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "바이오센서"는 분석대상물의 특이적 인식 반응을 이용하여 분석대상물을 정성적 또는 정량적으로 검출할 수 있는 장치를 의미한다.
상기 바이오센서는 검출 방법에 따라 질량기반 센서, 광학적 센서, 전기적 센서 및 자기력 기반 센서로 나뉠 수 있다. 상기 질량기반 센서는 수정 진동자 미세저울(QCM; quartz crystal microbalance), 캔틸리버(cantilever) 센서 및 표면탄성파(SAW; surface acoustic wave) 센서 등을 포함할 수 있다. 상기 광학적 센서는 자외선-가시광선 분광 광도법(UV-visible spectrometry), 측색법(colorimetry) 및 표면 플라즈몬 공명(SPR; surface plasmon resonance) 등을 이용한 센서를 포함할 수 있다. 상기 전기적 센서는 전기화학(electrochemistry) 센서 및 전계효과 트랜지스터(FET; field effect transistor) 센서 등을 포함할 수 있다. 상기 자기력 기반 센서는 자기력 현미경(MFM; Magnetic Force Microscopy)을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 표면탄성파 센서가 사용되었다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "기판"은 자성 나노입자에 영향을 주지 않도록 자성을 띠지 않는 재료로 이루어진 박판을 의미한다.
상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속, 및 플라스틱으로 이루어진 군으로부터 1종 또는 2종 이상이 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 실시예에서, 실리콘 웨이퍼가 사용되었다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "분석대상물 결합 작용제"는 분석대상물 또는 분석대상물의 수용체에 대한 항체를 의미하는 것으로, 상기 분석대상물과 분석대상물 결합 작용제를 "결합 파트너"라고도 한다.
상기 항체는 트로포닌 I에 특이적인 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 및 이의 화학적 또는 유전적으로 조작된 항체일 수 있다. 예를 들면, 상기 트로포닌 I에 특이적인 모노크로날 항체는 클론 A34500 (TnI의 아미노산 87-91에 결합), 81-7 (a34780, TnI의 아미노산 136-154에 결합), A34650 (TnI의 아미노산 41-49에 결합), 267 (ab 14530, TnI의 아미노산 169-184에 결합), 16Al1 (a24460, TnI의 아미노산 87-91에 결합), 19C7 (al9615, TnI의 아미노산 41-49에 결합), 560 (cTnI의 아미노산 83-93에 결합) 및 이들의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 실시예에서, 트로포닌 I에 특이적인 항체로서 16A11가 사용되었다.
구체적으로, 상기 바이오센서는 금 염색 분석법(Gold staining assay)에 의해 질량을 강화한 후 이용될 수 있다. 금 염색 분석법에 의한 트로포닌 I의 분석 방법을 도 1에 나타내었다.
우선, 기판(10) 상에 포획 항체(11)를 고정시킨다. 프로타민에 의해 샘플내 존재하는 피브리노겐이 제거된 면역분석 시약에 금 나노입자(14)가 결합된 검출 항체(13)를 첨가하여 "검출 항체(13)-트로포닌 I(12) 복합체"를 형성한다.
그 다음, 검출 항체(13)-트로포닌 I(12) 복합체를 포획 항체(11)에 결합시킴으로써 "검출 항체(13)-트로포닌 I(12)-포획 항체(11)" 복합체를 형성하고, HAuCl4의 Au+3 이온과 NH2OH 환원제를 첨가한다. Au+3 이온은 환원제에 의해 금 나노입자에 환원되어 질량 강화된 금 나노입자(17)를 형성함으로써 신호를 증폭시킬 수 있다. 그 다음, 표면탄성파 센서에서의 위상의 변화를 측정할 수 있다.
상기 바이오센서에 따르면, 분석대상물은 높은 민감도로 신속하게 검출될 수 있으며, 또한 검출 재현성이 현저히 향상될 수 있다. 이로써 분석대상물을 효율적으로 저농도까지 검출할 수 있다.
다른 구현예에 따르면, 상기 면역분석 시약을 이용한 분석대상물의 고감도 검출 방법이 제공된다. 상기 검출 방법은 분석대상물에 특이적인 포획 항체를 기판 상에 고정시키는 단계, 프로타민에 의해 피브리노겐이 제거된 면역분석 시약을 준비하는 단계, 상기 포획 항체와 동일한 검출 항체를 상기 면역분석 시약에 첨가하여 검출 항체-분석대상물 복합체를 형성하는 단계, 상기 검출 항체-분석대상물 복합체를 상기 포획 항체에 결합시켜 검출 항체-분석대상물-포획 항체 복합체를 형성하는 단계, 및 상기 분석대상물을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "검출 방법"은 분석대상물의 존재, 부재 또는 양을 확인하는 방법을 의미한다.
상기 검출 방법은 효소 결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 전기화학발광 분석법(electro-chemiluminescent assay, ECL), 방사면역분석법(radioimmunoassay, RIA), 고상 방사면역분석법(solid-phase radioimmunoassay, SPRIA), 면역블롯팅(immunoblotting), 면역침전법(immunoprecipitation), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining) 및 형광활성세포분리법(fluorescent activated cell sorting, FACS)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 실시예에서, ELISA가 사용되었다.
샌드위치형 면역분석시, 분석대상물은 기판 상에 고정된 포획 항체(capture antibody)에 의해 포획될 수 있다. 상기 고정화는 당업계에 공지된 기술, 예를 들면, 스트렙타비딘 코팅된 기판을 사용하는 것에 의해 달성될 수 있다.
상기 포획 항체는 직접적으로 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 예를 들면, 상기 포획 항체는 비오틴으로 표지되는 것에 의해 스트렙타비딘으로 코팅된 기판상에 결합될 수 있다. 또한, 선택적으로 포획 항체는 표지되지 않을 수 있으며, 목적 분석대상물은 포획 항체에 결합한 이후에, 표지된 검출 항체와 결합될 수 있다.
그 다음, 표지된 검출 항체(detection antibody)들이 포획된 분석대상물에 결합될 수 있다. 상기 표지는 당업계에 공지된 임의의 것을 포함할 수 있다. 상기 표지는 루시퍼라아제(luciferases), 루시페린(luciferin), 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 호스라디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase, HRP)와 같은 퍼옥시다아제, 알칼리 포스라파제(alkaline phosphatase, AP),β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 리소자임, 사카라이드 옥시다아제, 헤테로사이클릭 옥시다아제, 락토퍼옥시다아제, 마이크로퍼옥시다아제 및 이들의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 호스라디쉬 퍼옥시다아제는 오르토페닐렌 디아민(orthophenylene diamine, OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 히드록시클로라이드(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine hydrochloride, TMB)를 산화시키고, 상기 알칼리 포스파타제는 파라-니트로페닐 포스페이트(para-nitrophenyl phosphate)을 산화시킨다.
일 실시예에서, 호스라디쉬 퍼옥시다아제 표지 및 TMB가 사용되었다.
구체적으로, 상기 검출방법은 ELISA에 의해 수행될 수 있다. ELISA를 이용한 트로포닌 I의 검출 방법을 도 2에 나타내었다.
우선, 기판(10) 상에 포획 항체(11)를 고정시킨다. 프로타민에 의해 샘플내 존재하는 피브리노겐이 제거된 면역분석 시약에 HRP 효소 (15)로 표지된 검출 항체(13)를 첨가하여 "검출 항체(13)-트로포닌 I(12) 복합체"를 형성한다.
그 다음 검출 항체(13)-트로포닌 I(12) 복합체를 포획 항체(11)과 결합시키는 것에 의해 "검출 항체(13)-트로포닌 I(12)-포획 항체(11)" 복합체를 형성하고, TMB(16)를 첨가한 후, 발색 반응에 의한 빛의 세기를 측정할 수 있다.
상기 검출 방법에 따르면, 분석대상물을 높은 민감도로 신속하게 검출할 수 있다. 예를 들면, 상기 검출 방법은 상기 면역분석 시약을 사용하지 않는 방법에 비해 트로포닌 I의 검출 민감도가 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상 또는 5배 이상 현저히 향상될 수 있다. 또한, 상기 검출 방법은 상기 면역분석 시약을 사용하지 않는 방법에 비해 트로포닌 I의 검출 재현성이 2배 이상, 3배 이상 또는 4배 이상 현저히 향상될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시예를 제시한다. 하기 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] ELISA를 이용한 면역반응에서의 프로타민의 효과
인간으로부터 분리된 혈장에 프로타민 25 mg/ml를 첨가하고, 원심분리한 후, 상층액을 추출하였다. 상기 추출된 상층액을 이용하여 ELISA를 수행하였다. 이때, 검출항체로서 HRP가 표지된 16A11를 사용하고, TMB에 대한 산화 반응에 의한 발광 신호 세기를 확인하였다. 그 결과를 하기의 표 1에 나타내었다.
[표 1]
Figure pat00002
CV(Coefficient of Variation): 변이 계수
상기 표 1을 참고하면, 프로타민을 첨가한 경우는 프로타민을 첨가하지 않은 경우에 비해 발광 신호가 모두 증가하였다. 또한, CV%가 35.4 및 24.7에서 각각 10.8 및 11.3으로 감소함으로써 현저하게 검출 재현성이 향상됨을 나타내었다.
[실시예 2] Gold staining assay를 이용한 면역반응에서의 프로타민의 효과
인간으로부터 분리된 혈장에 프로타민 25 mg/ml를 첨가하고, 원심분리한 후, 상층액을 추출하였다. 상기 추출된 상층액을 이용하여 Gold staining assay를 수행하였다. 이때, 검출 항체에 결합된 금나노입자에 금이온이 환원되어 나노입자의 사이즈를 키워 질량을 강화하는 것에 의해 표면탄성파 센서에서의 상(phase) 변화 기울기를 측정하였다. 그 결과를 하기의 표 2에 나타내었다.
[표 2]
Figure pat00003
상기 표 2를 참고하면, 프로타민을 첨가한 경우는 프로타민을 첨가하지 않은 경우에 비해 상 기울기가 모두 증가하였다. 또한, CV%가 25.9 및 23.1에서 각각 8.3 및 7.9로 감소함으로써 현저하게 검출 재현성이 향상됨을 나타내었다.
상기 실시예의 결과로부터, 프로타민을 첨가하는 경우 트로타민의 검출 감도 및 검출 재현성이 현저하게 향상됨을 알 수 있다.
이상 특정 실시예를 도시하고 설명하였으나, 본 발명의 기술사상은 첨부된 도면과 상기한 설명 내용에 한정되지 않으며, 본 발명의 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형이 가능함은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 사실이며, 이러한 형태의 변형은 본 발명의 정신에 위배되지 않는 범위 내에서 본 발명의 특허청구범위에 속한다고 볼 것이다.
10 : 기판
11 : 포획 항체
12 : 트로포닌 I
13 : 검출 항체
14 : 금 나노입자
15 : HRP
16 : TMB
17 : 질량 강화된 금 나노입자

Claims (15)

  1. 분석대상물 함유 샘플 및 프로타민을 포함하고,
    상기 프로타민은 샘플 내의 피브리노겐과의 정전 결합으로 프로타민-피브리노겐 복합체를 형성하는, 분석대상물의 고감도 검출용 면역분석 시약.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 분석대상물은 트로포닌 I인 것인, 면역분석 시약.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 샘플은 혈장인 것인, 면역분석 시약.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 프로타민은 2 ng/ml ~ 4 mg/ml의 양으로 존재하는 것인, 면역분석 시약.
  5. 분석대상물에 특이적인 포획 항체가 고정된 기판;
    프로타민에 의해 피브리노겐이 제거된 면역분석 시약; 및
    상기 기판에 고정된 포획 항체와 동일한 검출 항체를 포함하는, 바이오센서.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 분석대상물은 트로포닌 I인 것인, 바이오센서.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 샘플은 혈장인 것인, 바이오센서.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 바이오센서는 질량기반 센서, 광학적 센서, 전기적 센서 또는 자기력 기반 센서인 것인, 바이오센서.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속, 및 플라스틱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 것인, 바이오센서.
  10. 분석대상물에 특이적인 포획 항체를 기판 상에 고정시키는 단계;
    프로타민에 의해 피브리노겐이 제거된 면역분석 시약을 준비하는 단계;
    상기 포획 항체와 동일한 검출 항체를 상기 면역분석 시약에 첨가하여 검출 항체-분석대상물 복합체를 형성하는 단계;
    상기 검출 항체-분석대상물 복합체를 상기 포획 항체에 결합시켜 검출 항체-분석대상물-포획 항체 복합체를 형성하는 단계; 및
    상기 분석대상물을 검출하는 단계를 포함하는, 분석대상물의 고감도 검출 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 분석대상물은 트로포닌 I인 것인, 검출 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 샘플은 혈장인 것인, 검출 방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 검출 방법은 효소 결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 전기화학발광 분석법(electro-chemiluminescent assay, ECL), 방사면역분석법(radioimmunoassay, RIA), 고상 방사면역분석법(solid-phase radioimmunoassay, SPRIA), 면역블롯팅(immunoblotting), 면역침전법(immunoprecipitation), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining) 또는 형광활성세포분리법(fluorescent activated cell sorting, FACS)인 것인, 검출 방법.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 포획 항체 또는 검출 항체는 루시퍼라아제(luciferases), 루시페린(luciferin), 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼리 포스라파제(alkaline phosphatase, AP), β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 리소자임, 사카라이드 옥시다아제, 헤테로사이클릭 옥시다아제 또는 락토퍼옥시다아제, 마이크로퍼옥시다아제에 의해 표지되는 것인, 검출 방법.
  15. 제10항에 있어서,
    상기 검출 방법은 피브리노겐을 제거하기 전에 검출하는 경우에 비해 민감도가 향상되는 것인, 검출 방법.
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