JP5781603B2 - 結合反応の電気化学的検出方法 - Google Patents
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Description
血清の直接競合プロゲステロンイムノアッセイ
デバイス:電気化学的に撹拌されるセル、操作容量1mL、
電流測定モードのポテンシオスタット
緩衝液:酢酸緩衝液、pH4.4
サンプル:ヒト血清、原液
較正液:原液、プロゲステロン2ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mLと混合したヒト血清
方法ステップ:
・酢酸緩衝液pH4.4 450μLで電気化学測定セルを充填する
・(Ag/AgClに対して)+100mVに作用電極を分極させる
・二重特異性抗体結合体10μLを添加する(終濃度約0.1μg/mL)
・酸化還元マーカー−プロゲステロン結合体10μLを添加する(終濃度約100nM)
・H2O2/ペルオキシダーゼ30μLを添加する(終濃度H2O2 5mM、ペルオキシダーゼ0.02nM)
・基礎シグナルを測定する
・ヒト血清500μL(または較正液500μL)を添加する
・血清添加180秒後の最終シグナルを測定する
評価は、あらかじめ測定した用量効果曲線に基づいて、または2点較正に基づいて実施する。
唾液の直接競合プロゲステロンイムノアッセイ
デバイス:電気化学的に撹拌されるセル、操作容量1mL、
電流測定モードのポテンシオスタット
緩衝液:酢酸緩衝液、pH4.4
サンプル:ヒト唾液(1:5希釈)
較正液:1:5希釈、プロゲステロン2ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mLと混合したヒト唾液
方法ステップ:
・酢酸緩衝液pH4.4 450μLで電気化学測定セルを充填する
・(Ag/AgClに対して)+100mVに作用電極を分極させる
・二重特異性抗体結合体10μLを添加する(終濃度約0.1μg/mL)
・酸化還元マーカー−プロゲステロン結合体10μLを添加する(終濃度約100nM)
・H2O2/ペルオキシダーゼ30μLを添加する(終濃度H2O2 5mM、ペルオキシダーゼ0.02nM)
・基礎シグナルを測定する
・ヒト唾液1:5希釈500μL(または較正液500μL)を添加する
・唾液添加180秒後の最終シグナルを測定する
評価は、あらかじめ測定した用量効果曲線に基づいて、または2点較正に基づいて実施する。
尿の直接競合ヒト絨毛ゴナドトロピンイムノアッセイ(hCG)
デバイス:電気化学的に撹拌されるセル、操作容量1mL、
電流測定モードのポテンシオスタット
緩衝液:酢酸緩衝液、pH4.4
サンプル:ヒト血清、原液
較正液:原液、hCG10mIU/mL、20mIU/mL、40mIU/mL、100mIU/mL、200mIU/mLと混合したヒト血清
方法ステップ:
・酢酸緩衝液pH4.4 450μLで電気化学測定セルを充填する
・(Ag/AgClに対して)+100mVに作用電極を分極させる
・二重特異性抗体結合体10μLを添加する(終濃度約0.3μg/mL)
・酸化還元マーカー−hCG結合体10μLを添加する(終濃度約200nM)
・H2O2/ペルオキシダーゼ30μLを添加する(終濃度H2O2 5mM、ペルオキシダーゼ0.02nM)
・基礎シグナルを測定する
・ヒト血清500μL(または較正液500μL)を添加する
・血清添加180秒後の最終シグナルを測定する
評価は、あらかじめ測定した用量効果曲線に基づいて、または2点較正に基づいて実施する。
以下に、出願当初の請求項を実施の態様として付記する。
[1] 溶液中で電気化学的検出を用いて均質イムノアッセイ様式を実施するための方法であって、試薬である2つの異なる結合体がサンプルまたはサンプル/緩衝液混合物と合わせられ、1つ目の結合体が酸化還元マーカーと分析物分子とを含み、2つ目の結合体が抗酸化還元マーカー抗体または特異的に結合するその断片と前記分析物に特異的に結合する分子とを含む方法。
[2] 前記サンプル中に遊離の分析物の存在は、前記抗酸化還元マーカー抗体に対する前記酸化還元マーカーの結合を誘導または促進し、この結合によって、前記結合した酸化還元マーカーの酸化還元活性が阻害され(「消失され」)、それによって、検出可能なシグナルが発生するまたは変化する[1]に記載の方法。
[3] 前記酸化還元マーカーは、フェロセンおよびフェロセン誘導体、ビスビピリジルオスミウム複合体およびその他のオスミウム系複合体、ビピリジルルテニウム複合体およびその他のルテニウム系複合体、p−アミノフェノール、ヘキサシアノ鉄酸塩(II/III)、キノンならびに電気化学的イムノアッセイ用として公知であるその他の酸化還元マーカーの群から選択される[1]または[2]に記載の方法。
[4] 前記酸化還元マーカーはフェロセニウムであり、前記抗酸化還元マーカー抗体は好ましくはモノクローナル抗フェロセニウム抗体である[3]に記載の方法。
[5] 前記分析物に特異的に結合する分子は、前記分析物に特異的に結合する、抗分析物抗体、アプタマー、ペプチド、核酸またはキレート剤を表す[1]から[4]の何れか1項に記載の方法。
[6] 前記分析物に特異的に結合する前記分子は、抗分析物抗体またはその断片である[5]に記載の方法。
[7] 前記2つの結合体は、水溶性リンカー分子、特にPEGリンカーを含む[1]から[6]の何れか1項に記載の方法。
[8] 必要な試薬は可溶形態で添加され、前記結合事象の電気化学的検出はリアルタイムに実行される[1]から[7]の何れか1項に記載の方法。
[9] 前記必要な試薬の全ては既製の混合物として前記サンプルに添加され、前記結合事象の電気化学的検出はリアルタイムに実行される[1]から[7]の何れか1項に記載の方法。
[10] 前記必要な試薬の全ては、適切な反応容器中に乾燥試薬として提供され、前記サンプルおよび任意に緩衝液の添加によって溶解されるだけであり、その添加が前記分析の開始を示す、[1]から[7]の何れか1項に記載の方法。
[11] 前記イムノアッセイは、マイクロ流体分析システム(ラボオンチップ)および/または完全自動化分析装置で実施される[1]から[10]の何れか1項に記載の方法。
[12] 単一電極の代わりに構造電極、例えばくし形電極が前記検出に使用される[1]から[11]の何れか1項に記載の方法。
[13] 単純な電気化学的酸化還元反応の代わりに、酵素的に触媒される環状反応が利用される[1]から[12]の何れか1項に記載の方法。
[14] フェロセンおよびフェロセン誘導体、ビスビピリジルオスミウム複合体およびその他のオスミウム系複合体、ビピリジルルテニウム複合体およびその他のルテニウム系複合体、p−アミノフェノール、ヘキサシアノ鉄酸塩(II/III)、キノンならびに電気化学的イムノアッセイ用として公知であり適切なその他の酸化還元マーカーの群から選択される酸化還元マーカーに特異的に結合し、結合した前記酸化還元マーカーの酸化還元活性を大幅に、好ましくは90%超、より好ましくは95%超または完全に阻害する(消失させる)酸化還元マーカー抗体またはその断片。
[15] 抗フェロセニウム抗体またはその断片であり、それに結合した前記フェロセニウムの酸化還元活性を大幅にまたは完全に阻害する[14]に記載の酸化還元マーカー抗体またはその断片。
[16] [1]から[13]の何れか1項に記載の方法を実施するための二重特異性抗体結合体であって、[14]または[15]に記載の酸化還元マーカー抗体またはその断片および抗分析物抗体またはその断片を含む二重特異性抗体結合体。
Claims (16)
- 溶液中で電気化学的検出を用いて均質イムノアッセイ様式を実施するための方法であって、試薬である2つの異なる結合体がサンプルまたはサンプル/緩衝液混合物と合わせられ、1つ目の結合体が酸化還元マーカーと分析物分子とを含み、2つ目の結合体が抗酸化還元マーカー抗体または特異的に結合するその断片と前記分析物に特異的に結合する分子とを含む方法。
- 前記サンプル中に遊離の分析物の存在は、前記抗酸化還元マーカー抗体に対する前記酸化還元マーカーの結合を誘導または促進し、この結合によって、前記結合した酸化還元マーカーの酸化還元活性が阻害され(「消失され」)、それによって、検出可能なシグナルが発生するまたは変化する請求項1に記載の方法。
- 前記酸化還元マーカーは、フェロセンおよびフェロセン誘導体、ビスビピリジルオスミウム複合体およびその他のオスミウム系複合体、ビピリジルルテニウム複合体およびその他のルテニウム系複合体、p−アミノフェノール、ヘキサシアノ鉄酸塩(II/III)ならびにキノンの群から選択される請求項1または2に記載の方法。
- 前記酸化還元マーカーはフェロセニウムである請求項3に記載の方法。
- 前記抗酸化還元マーカー抗体はモノクローナル抗フェロセニウム抗体である請求項4に記載の方法。
- 前記分析物に特異的に結合する分子は、前記分析物に特異的に結合する、抗分析物抗体、アプタマー、ペプチド、核酸またはキレート剤を表す請求項1から5の何れか1項に記載の方法。
- 前記分析物に特異的に結合する前記分子は、抗分析物抗体またはその断片である請求項6に記載の方法。
- 前記2つの結合体は、水溶性リンカー分子を含む請求項1から7の何れか1項に記載の方法。
- 前記水溶性リンカー分子は、PEGリンカーである請求項8に記載の方法。
- 必要な試薬は可溶形態で添加され、前記結合事象の電気化学的検出はリアルタイムに実行される請求項1から9の何れか1項に記載の方法。
- 前記必要な試薬の全ては既製の混合物として前記サンプルに添加され、前記結合事象の電気化学的検出はリアルタイムに実行される請求項1から9の何れか1項に記載の方法。
- 前記必要な試薬の全ては、適切な反応容器中に乾燥試薬として提供され、前記サンプルおよび任意に緩衝液の添加によって溶解されるだけであり、その添加が前記分析の開始を示す、請求項1から9の何れか1項に記載の方法。
- 前記イムノアッセイは、マイクロ流体分析システム(ラボオンチップ)および/または完全自動化分析装置で実施される請求項1から12の何れか1項に記載の方法。
- 構造電極が前記検出に使用される請求項1から13の何れか1項に記載の方法。
- 前記構造電極がくし形電極である請求項14に記載の方法。
- 酵素的に触媒される環状反応が利用される請求項1から15の何れか1項に記載の方法。
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