KR102674120B1 - 스위칭 펩티드 및 이를 이용한 면역분석 방법 - Google Patents

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Abstract

전기화학적 면역분석 방법에 적용될 수 있는 스위칭 펩티드가 개시된다. 스위칭 펩티드는 결합 항체에 가역적으로 결합할 수 있는 펩티드 화합물; 및 펩티드 화합물에 결합된 화학적 표지물질을 구비한다.

Description

스위칭 펩티드 및 이를 이용한 면역분석 방법{SWITCHING PEPTIDES AND IMMUNOASSAY METHOD USING THE SWITCHING PEPTIDES}
본 발명은 면역 반응을 이용해 타겟 항원 물질을 분석하는데 사용될 수 있는 스위칭 펩티드 및 이를 이용한 면역분석 방법에 관한 것이다.
바이오 기술 분야에서 다양한 면역진단검사 또는 환경모니터링과 같은 바이오 검사를 위하여 임뮤노어세이(Immunoassay)가 사용되고 있다. 상기 임뮤노어세이는 항원-항체 반응의 특이성을 이용하여 특정 타겟 물질의 정량적 분석이 가능하며, 다른 분석방법에 비하여 높은 민감도를 갖는 이점이 있다.
상기 임뮤노어세이는 암 마커, 감염성 질환, 갑상선 기능, 빈혈, 알레르기, 임신, 약물남용, 통풍 진단 등과 같은 다양한 진단에 이용될 수 있다. 상기 임뮤노어세이를 다양한 종류의 항원의 진단 또는 분석에 이용하기 위해서는 상기 항원들 각각에 대하여 특이적인 반응성을 갖는 항체를 준비해야 한다.
그러나, 이러한 방법은 최근 빠른 속도로 다양화되고 있는 현대화된 질병들 또는 다수의 돌연변이종을 갖는 바이러스들을 감지하는 데에는 한계점이 있다. 특히, 상기 바이러스의 경우, 상기 바이러스와 특이적 결합성을 갖는 항체를 찾는 것이 불가능한 경우도 다수 있다.
또한, 상기 항원-항체 반응을 이용하는 경우, 상기 항체를 표지 물질과 결합시키는 추가적인 단계가 요구될 수 있다. 상기 표지 물질과 상기 항체의 결합성이 떨어지는 경우, 임뮤노어세이 분석 정확도 또는 신뢰도가 저하될 수 있다.
전술한 것과 같은 문제점으로 인해, 다양한 항체에 대하여 결합할 수 있는 다양한 종류의 표지 물질을 각각 개발해야 하는 문제도 있다.
본 발명의 일 목적은 결합 항체의 Fab 영역에 선택적으로 그리고 가역적으로 결합할 수 있는 펩티드 화합물과 검출 시료 용액 내에서 산화환원이 가능한 화학적 표지물질을 구비하여 전기화학적 면역분석 방법에 적용될 수 있는 스위칭 펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 스위칭 펩티드를 이용한 면역분석 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 실시예에 따른 스위칭 펩티드는 결합 항체에 가역적으로 결합할 수 있는 펩티드 화합물; 및 상기 펩티드 화합물에 결합된 화학적 표지물질을 포함한다.
일 실시예에 있어서, 상기 펩티드 화합물은 상기 결합 항체의 Fab(Fragment antigen-binding) 영역에 선택적으로 그리고 가역적으로 결합할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 펩티드 화합물은 상기 결합 항체의 경쇄 또는 중쇄의 제1 내지 제4 프레임워크 영역들(FR1, FR2, FR3 및 FR4) 중 하나 이상과 특이적으로 그리고 가역적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 펩티드 화합물은 상기 경쇄의 제2 프레임워크 영역(VL-FR2)의 아미노산 서열과 상동성(homology)을 갖는 제1 아미노산 서열을 갖는 제1 펩티드 화합물; 상기 경쇄의 제3 또는 제4 프레임워크 영역(VL-FR3, VL-FR4)의 아미노산 서열과 상동성(homology)을 갖는 제2 아미노산 서열을 갖는 제2 펩티드 화합물; 상기 중쇄의 제2 프레임워크 영역(VH-FR2)의 아미노산 서열과 상동성(homology)을 갖는 제3 아미노산 서열을 갖는 제3 펩티드 화합물; 및 상기 중쇄의 제3 또는 제4 프레임워크 영역(VH-FR3, VH-FR4)의 아미노산 서열과 상동성(homology)을 갖는 제4 아미노산 서열을 갖는 제4 펩티드 화합물로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 펩티드 화합물은 14 내지 20개의 아미노산을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 펩티드 화합물은 1650 내지 2500 Da의 분자량을 가질 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 화학적 표지물질은 시료 용액 내에서 가역적으로 산화 또는 환원될 수 있는 물질을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 화학적 표지물질은 페로센(ferrocene), 페로센메탄올(ferrocenemethanol), 페로센다이메탄올(ferrocenedimethanol), α-메틸페로센메탄올, 페로시안화(ferrocyanide) 이온, 페리시안화(ferricyanide) 이온, 육아민화 루테늄(ruthenium, Ru) 이온, 하이드로퀴논(hydronquinone), 아스코르브산(ascorbic acid), 도파민(dopamine), 페로센카복시산(ferrocene carboxylic acid), 페로센다이카복시산(ferrocene dicarboxylic acid) 및 페로센알데하이드(ferrocene aldehyde)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 면역분석 방법은 기판에 스위칭 펩티드가 결합된 결합 항체를 고정시키거나 상기 기판에 결합 항체를 고정한 후 상기 스위칭 펩티드를 결합 항체에 결합시키는 제1 단계; 상기 결합 항체를 검출 시료 용액으로 처리하는 제2 단계; 및 상기 처리 후의 검출 시료 용액에 대해 전기화학적 분석을 수행하여 상기 검출 시료 용액 내의 상기 결합 항체와 특이적으로 반응하는 타겟 항원을 정량적으로 분석하는 제3 단계를 포함하고, 상기 스위칭 펩티드는 상기 결합 항체의 Fab(Fragment antigen-binding) 영역에 선택적으로 그리고 가역적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 화합물 및 이에 결합되고 상기 검출 시료 용액 내에서 산화환원이 가능한 화학적 표지물질을 포함한다.
일 실시예에 있어서, 상기 제2 단계에서 상기 검출 시료 용액 내에 상기 타겟 항원이 존재하는 경우, 상기 타겟 항원이 상기 결합 항체에 결합되면 상기 스위칭 펩티드는 상기 결합 항체와 반응한 상기 타겟 항원의 양에 의존하여 정량적으로 상기 결합 항체로부터 유리될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 전기화학적 분석은 암페로메트리(amperometry), 크로노암페로메트리(chronoamperometry), 볼타메트리(voltammetry), 사이클릭 볼타메트리(cyclic voltammetry), 디프렌셜 포텐셜 볼타메트리(differential potential voltammmetry), 크로노퍼텐쇼메트리(chronopotentiometry) 및 폴라로그래피(polarography)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나의 방법으로 수행될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제3 단계에서 상기 결합 항체로부터 유리된 스위칭 펩티드의 화학적 표지물질과 암페로메트리 또는 볼타메트리를 위한 작동전극(working electrode) 사이에 산화환원 반응이 일어날 수 있다.
본 발명의 스위칭 펩티드 및 이를 이용한 면역분석 방법에 따르면, 결합 항체의 Fab 영역에 선택적으로 그리고 가역적으로 결합하고 화학적 표지물질을 구비하는 스위칭 펩티드를 이용하여, 광학계가 요구되니 않는 전기화학 분석방법을 통해 타겟 항원을 정량 분석 할 수 있으므로, 분석 기기의 소형화 및 저가화를 가능하게 할 수 있고, 이에 따라 현장 진단용 기기에 적용 가능하다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 스위칭 펩티드를 설명하기 위한 도면이다.
도 2는 결합 항체를 설명하기 위한 도면이다.
도 3a는 본 발명의 실시예에 따른 면역분석방법을 설명하기 위한 순서도이고, 도 3b 및 도 3c는 도 3a에 도시된 면역분석방법의 일 실시예를 설명하기 위한 모식도들이다.
도 4a는 L1 및 H2 펩티드 사이의 특이적 상호작용 그리고 L2 및 H1 펩티드 사이의 특이적 상호작용을 확인하는 방법 및 측정결과를 나타내는 도면이고, 도 4b는 PyMOL 소프트웨어를 사용하여 분석된 L1 및 H2 펩티드 사이의 특이적 상호작용 그리고 L2 및 H1 펩티드 사이의 특이적 상호작용을 설명하기 위한 도면이다.
도 5는 마이크로플레이트 상에 각각 분리 고정된 인간, 토끼, 염소 및 쥐로부터의 IgG들 그리고 이들과 다른 단백질들(인간 B형 간염 항원, C-반응성 단백질, 단백질-A, BSA)을 형광 라벨된 실시예 1에서 합성된 4종류 펩티드 화합물들(H1, H2, L1, L2)과 반응시킨 후 마이크로플레이트 바닥에서 측정된 형광 강도를 나타내는 그래프들이다.
도 6a는 실시예 1의 4종류의 펩티드들이 각각 결합된 항체를 단백질분해효소(protease)인 파파인(papain)으로 처리 전 및 후의 상태를 나태는 모식도이고, 도 6b는 상기 파파인(papain) 처리 이후 마이크로 플레이트의 바닥(B) 및 용액 내(S)에서 측정된 형광 강도를 나타내는 그래프들이다.
도 7a는 형광 라벨된 실시예 1의 펩티드 화합물들을 이용한 면역분석 방법을 설명하기 위한 모식도이고, 도 7b 및 도 7c는 도 7a에 도시된 면역분석 방법으로 측정된 항원의 농도에 따른 용액 내 및 마이크로플레이트 바닥에서의 형광 강도를 나타내는 그래프들이다.
도 8a 및 도 8b는 L1 스위칭 펩티드를 함유하는 시료 용액에 대해 DPA(Differential pulsed voltammetry) 방법으로 측정된 L1 스위칭 펩티드의 농도에 따른 전류값의 변화를 나타내는 그래프들이다.
도 9a 및 도 9b는 H2 스위칭 펩티드를 함유하는 시료 용액에 대해 DPA(Differential pulsed voltammetry) 방법으로 측정된 H2 스위칭 펩티드의 농도에 따른 전류값의 변화를 나타내는 그래프들이다.
도 10a 및 도 10b는 HBsAg 항원을 함유하는 검출 시료 용액에 대해 제1 L1 스위칭 펩티드(페로센이 말단에 결합된 L1 펩티드 화합물)를 이용한 전기화학적 면역분석 방법, 제2 스위칭 펩티드(형광 라벨된 L1 펩티드 화합물)를 이용한 광학적 면역분석 방법, 종래의 ELISA kit를 이용한 화학발광 기반 면역분석 방법 및 종래의 ELISA kit를 이용한 크로모제닉 면역분석 방법을 통해 측정된 항원의 농도에 따른 분석결과를 나타내는 그래프들이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다. 첨부된 도면에 있어서, 구조물들의 치수는 본 발명의 명확성을 기하기 위하여 실제보다 확대하여 도시한 것이다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 스위칭 펩티드를 설명하기 위한 도면이고, 도 2는 결합 항체를 설명하기 위한 도면이다.
도 1 및 도 2를 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 스위칭 펩티드(100)는 결합 항체(10)에 가역적으로 결합할 수 있는 펩티드 화합물(110) 및 상기 펩티드 화합물(110)에 결합된 화학적 표지물질(120)을 포함할 수 있다. 상기 스위칭 펩티드(100)는 타겟 항원과 특이적으로 결합하는 상기 결합 항체(10)에 가역적으로 결합할 수 있어서, 상기 타겟 항원이 상기 결합 항체에 특이적으로 결합하는 경우, 정량적으로 상기 결합 항체(10)로부터 유리될 수 있고, 그 결과 상기 결합 항체(10)로부터 유리된 상기 스위칭 펩티드(100)의 화학적 표지물질(120)을 매개로 한 산화환원 반응에 의해 상기 타겟 항원을 포함하는 검사시료의 전기화학적 특성이 변화할 수 있다.
상기 결합 항체(10)는 상기 타겟 항원의 에피토프(epitope)와 같은 특이적인 항원 결정기에 결합되거나 상기 항원 결정기와 반응함으로써 면역학적 이펙터 메카니즘을 유도할 수 있는 화합물이다. 상기 결합 항체는 단일특이성(monospecific)을 가질 수도 있고, 다특이성(polyspecific)을 가질 수도 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 결합 항체(10)는 항체, 항체 유도체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 상기 결합 항체(10)는 온전한(intact) 면역글로불린 분자일 수도 있고, 이와 달리 Fab, Fab', F(ab')2, Fc, F(v), N-글리칸 구조, 파라토프 등과 같은 온전한 항체의 구성 부분들 또는 상기 구성 부분들 중 적어도 일부를 포함할 수도 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 결합 항체는 인간 항체, 비인간 항체 또는 인간화된 비인간 항체일 수 있다.
상기 인간 항체는 인간에 의해 생산된 항체 또는 임의의 기술을 이용해서 합성된 아미노산 서열을 보유하는 합성 항체를 포함할 수 있다. 인간 항체의 이러한 정의는 특히 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다. 상기 인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리를 포함하는 당해기술에 공지된 다양한 기술을 이용해서 생성될 수 있다. 상기 비인간 항체는 다양한 종의 공급원, 예를 들면, 설치류, 토끼, 소, 양, 돼지, 개, 인간을 제외한 포유 동물 또는 조류로부터 획득된 항체일 수 있다. 상기 비인간 항체의 "인간화된" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래하는 최소 서열을 함유하는 키메라 항체일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 목적 특이성, 친화도 및/또는 수용력을 갖는 전술된 비인간 항체(공여자 항체)의 초가변 영역으로 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)일 수 있다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 잔기들은 상응하는 비-인간 잔기들에 의해 대체될 수 있다. 또한, 상기 인간화 항체는 수령체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능, 예컨대 결합 친화도를 추가 정련하기 위해 제조될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 결합 항체(10)는 상기 항체 분자, 면역글로불린 분자, 이의 단편 또는 이들 중 하나 이상의 집합체일 수 있다. 상기 결합 항체(10)는 상기 타겟 항원에 대한 특이적인 결합을 가능케 해주는 독특한 구조를 가질 수 있고, 각각의 결합 항체(10)는 2개의 동일한 구조의 경쇄(light chain) 및 2개의 동일한 구조의 중쇄(heavy chain)를 포함할 수 있다. 상기 중쇄 및 경쇄는 각각 가변 영역(variable region) 및 불변 영역(constant region)을 포함할 수 있다. 상기 중쇄와 경쇄의 가변 영역이 결합하여 항원 결합 부위(antigen binding site)를 형성할 수 있다. 상기 결합 항체(10)는 파파인(papain) 등과 같은 단백질분해효소(protease)에 의해 타겟 항원이 결합하는 부분은 Fab(antibody binding fragment) 영역 및 결정화된지지 기둥 부분인 Fc (Fragment crystallizable) 영역으로 분리될 수 있고, 상기 항원 결합 부위는 상기 항체의 Fab(antibody binding fragment) 영역에 포함될 수 있다.
한편, 상기 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들(variable regions) 각각은 초가변 영역(hypervariable region; HVR)인 3개의 상보성 결정 영역(Complementarity-determining regions, CDRs) 및 상기 상보성 결정 영역을 구조적으로 지지하는 4개의 프레임워크 영역(Frame regions, FRs) 영역들이 교대로 배열된 구조를 가질 수 있다. 상기 상보성 결정 영역은 항체마다 상이한 아미노산 서열을 가져 각각의 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 반면, 상기 프레임워크 영역은 생물의 서브패밀리(Subfamilies)에 따라 보존된 아미노산 서열을 갖고 있어서, 동일한 서브패밀리에 속하는 생물들의 항체들은 동일 또는 유사한 아미노산 서열을 갖는다.
이하 설명의 편의를 위해, 상기 결합 항체(10)의 경쇄의 가변영역에 있어서, N-말단으로부터 순차적으로 이격되게 배치된 4개의 프레임워크 영역들을 각각 제1 내지 제4 경쇄 프레임워크 영역들(VL-FR1, VL-FR2, VL-FR3 및 VL-FR4)이라 하고, 상기 제1 내지 제4 경쇄 프레임워크 영역들(VL-FR1, VL-FR2, VL-FR3 및 VL-FR4) 사이에 각각 위치하고 상기 N-말단으로부터 순차적으로 배치된 3개의 상보성 결정 영역들을 각각 제1 내지 제3 경쇄 상보성 결정 영역들(VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3)이라 한다. 그리고 상기 결합 항체(10)의 중쇄의 가변영역에 있어서, N-말단으로부터 순차적으로 이격되게 배치된 4개의 프레임워크 영역들을 각각 제1 내지 제4 중쇄 프레임워크 영역들(VH-FR1, VH-FR2, VH-FR3 및 VH-FR4)이라 하고, 상기 제1 내지 제4 중쇄 프레임워크 영역들(VH-FR1, VH-FR2, VH-FR3 및 VH-FR4) 사이에 각각 위치하고 상기 N-말단으로부터 순차적으로 배치된 3개의 상보성 결정 영역들을 각각 제1 내지 제3 중쇄 상보성 결정 영역들(VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3)이라 한다.
상기 펩티드 화합물(110)은 상기 결합 항체(10)의 Fab(Fragment antigen-binding) 영역에 선택적으로 그리고 가역적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 펩티드 화합물(110)은 상기 결합 항체(10)의 경쇄 또는 중쇄의 제1 내지 제4 프레임워크 영역들(FR1, FR2, FR3 및 FR4) 중 하나 이상과 특이적으로 그리고 가역적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 예를 들면, 상기 펩티드 화합물(110)은 상기 결합 항체(10)의 경쇄 또는 중쇄의 제1 내지 제4 프레임워크 영역들(FR1, FR2, FR3 및 FR4) 중 하나 이상과 상동성(homology)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 이 경우, 상기 펩티드 화합물(110)은 상기 경쇄 또는 중쇄의 제1 내지 제4 프레임워크 영역들(FR1, FR2, FR3 및 FR4) 중 하나 이상과 가역적으로 결합할 수 있고, 이에 따라 타겟 항원이 상기 결합 항체(10)에 결합하는 경우, 상기 결합 항체(10)에 결합된 상기 펩티드 화합물(10)은 상기 결합 항체(10)에 결합되는 항원의 양에 따라 정량적으로 상기 결합 항체(10)로부터 유리될 수 있다.
일 실시예로, 상기 펩티드 화합물(110)은 상기 제2 경쇄 프레임워크 영역(VL-FR2)의 아미노산 서열과 상동성(homology)을 갖는 제1 아미노산 서열을 갖는 제1 펩티드 화합물(L1), 상기 제3 또는 제4 경쇄 프레임워크 영역(VL-FR3, VL-FR4)의 아미노산 서열과 상동성(homology)을 갖는 제2 아미노산 서열을 갖는 제2 펩티드 화합물(L2), 상기 제2 중쇄 프레임워크 영역(VH-FR2)의 아미노산 서열과 상동성(homology)을 갖는 제3 아미노산 서열을 갖는 제3 펩티드 화합물(H1) 및 상기 제3 또는 제4 중쇄 프레임워크 영역(VH-FR3, VH-FR4)의 아미노산 서열과 상동성(homology)을 갖는 제4 아미노산 서열을 갖는 제4 펩티드 화합물(H2) 중에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 결합 항체(10)의 상기 제2 경쇄 프레임워크 영역(VL-FR2)과 상기 제3 또는 제4 중쇄 프레임워크 영역(VH-FR3, VH-FR4)은 서로 인접하게 위치하여 상호작용하고, 상기 제3 또는 제4 경쇄 프레임워크 영역(VL-FR3, VL-FR4)과 상기 제2 중쇄 프레임워크 영역(VH-FR2)은 서로 인접하게 위치하여 상호작용하므로, 상기 결합 항체(10)의 제2 경쇄 프레임워크 영역(VL-FR2)과 상동성이 있는 제1 아미노산 서열을 갖는 상기 제1 펩티드 화합물(L1)은 상기 결합 항체(10)의 제3 또는 제4 중쇄 프레임워크 영역(VH-FR3, VH-FR4)과 선택적으로 상호작용할 수 있고, 상기 결합 항체(10)의 제3 또는 제4 경쇄 프레임워크 영역(VL-FR3, VL-FR4)과 상동성(homology)을 갖는 제2 아미노산 서열을 갖는 상기 제2 펩티드 화합물(L2)은 상기 결합 항체(10)의 제2 중쇄 프레임워크 영역(VH-FR2)과 선택적으로 상호작용할 수 있고, 상기 결합 항체(10)의 제2 중쇄 프레임워크 영역(VH-FR2)과 상동성(homology)을 갖는 제3 아미노산 서열을 갖는 상기 제3 펩티드 화합물(H1)은 상기 결합 항체(10)의 제3 또는 제4 경쇄 프레임워크 영역(VL-FR3, VL-FR4)과 선택적으로 상호작용할 수 있으며, 상기 결합 항체(10)의 제3 또는 제4 중쇄 프레임워크 영역(VH-FR3, VH-FR4)과 상동성(homology)을 갖는 제4 아미노산 서열을 갖는 상기 제4 펩티드 화합물(H2)은 상기 결합 항체(10)의 제2 경쇄 프레임워크 영역(VL-FR2)과 선택적으로 상호작용할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 결합 항체(10)가 인간을 포함하는 동물의 서브패밀리(subfamilies)에 속하는 생물로부터 유래된 경우, 상기 펩티드 화합물(110)은 약 10 내지 25개의 아미노산을 포함할 수 있고, 약 1600 내지 3000 Da의 분자량을 가질 수 있다. 예를 들면, 상기 펩티드 화합물(110)은 약 14 내지 20개의 아미노산을 포함할 수 있고, 약 1650 내지 2500 Da의 분자량을 가질 수 있다. 일 실시예로, 상기 제1 내지 제4 펩티드 화합물(L1, L2, H1, H2)은 하기 표 1에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
서열번호 스위칭
펩티드
아미노산 서열 분자량 깁스프리에너지
(Kcal/mol)
1 H1 SYWIH WVKQR PGQGL EWIGE 2469.7 △G=-17.91
2 H2 VYYCA REPTG TGIYF DVWGK 2325.6 △G=-17.19
3 L1 TYLEW YPQKP GQSPK LLIYK 2452.8 △G=-15.37
4 L2 VYYCF QGSHV PFTK 1675.9 △G=-13.05
한편, 항체의 경쇄 및 중쇄의 프레임워크 영역들(FR1, FR2, FR3, FR4)은 생물의 서브패밀리(subfamilies)에 따라 보존된 아미노산 서열을 가지므로, 상기 펩티드 화합물(110)은 동일한 서브패밀리(subfamilies)에 속하는 다른 종의 생물들로부터 유래된 항체들에 대해 공통적으로 적용될 수 있으므로, 상기 펩티드 화합물(110)이 염소, 쥐, 토끼 등의 항체로부터 합성된 경우라 하더라도, 인간의 항체에 대해서도 앞에서 설명한 것과 동일한 작용 및 효과를 나타낼 수 있다.
상기 화학적 표지물질(120)은 상기 펩티드 화합물(110)에 결합될 수 있고, 검출 시료 내에서 가역적으로 산화 및 환원될 수 있다. 일 실시예로 상기 화학적 표지물질(120)은 페로센(ferrocene), 페로센메탄올(ferrocenemethanol), 페로센다이메탄올(ferrocenedimethanol), α-메틸페로센메탄올, 페로시안화(ferrocyanide) 이온, 페리시안화(ferricyanide) 이온, 육아민화 루테늄(ruthenium, Ru) 이온, 하이드로퀴논(hydronquinone), 아스코르브산(ascorbic acid), 도파민(dopamine), 페로센카복시산(ferrocene carboxylic acid), 페로센다이카복시산(ferrocene dicarboxylic acid), 페로센알데하이드(ferrocene aldehyde) 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
도 3a는 본 발명의 실시예에 따른 면역분석방법을 설명하기 위한 순서도이고, 도 3b 및 도 3c는 도 3a에 도시된 면역분석방법의 일 실시예를 설명하기 위한 모식도들이다.
도 3a 내지 도 3c를 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 면역분석방법은 기판에 스위칭 펩티드가 결합된 결합 항체를 고정시키거나 상기 기판에 결합 항체를 고정한 후 상기 스위칭 펩티드를 결합 항체에 결합시키는 제1 단계(S110); 상기 결합 항체를 검출 시료 용액으로 처리하는 제2 단계(S120); 및 상기 처리 후의 검출 시료 용액에 대해 전기화학적 분석을 수행하여 상기 검출 시료 용액 내의 타겟 항원을 정량적으로 분석하는 제3 단계(S130)를 포함한다.
상기 제1 단계(S110)에 있어서, 상기 스위칭 펩티드는 상기 결합 항체의 Fab(Fragment antigen-binding) 영역에 선택적으로 그리고 가역적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 화합물 및 이에 결합되고 상기 검출 시료 용액 내에서 산화환원이 가능한 화학적 표지물질을 포함할 수 있다. 일 실실예로, 상기 스위칭 펩티드로는 도 1 및 도 2를 참조하여 설명한 스위칭 펩티드(100)가 사용되므로 이에 대한 중복된 상세한 설명은 생략한다.
일 실시예에 있어서, 상기 결합 항체와 상기 스위칭 펩티드의 경우, 먼저 상기 기판에 결합 항체를 고정한 후 고정된 상기 결합 항체에 상기 스위칭 펩티드가 결합될 수도 있고, 이와 달리 상기 스위칭 펩티드를 상기 결합 항체에 결합시킨 후 상기 결합 항체를 상기 기판에 고정시킬 수도 있다.
상기 결합 항체를 상기 기판에 고정시키는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 상기 결합 항체는 상기 기판에 직접 결합될 수도 있고, 링커 화합물을 통해 상기 기판에 결합되어 고정될 수도 있다.
상기 스위칭 펩티드는 앞에서 설명한 바와 같이, 상기 결합 항체의 Fab(Fragment antigen-binding) 영역에 선택적으로 그리고 가역적으로 결합될 수 있다.
상기 제2 단계(S120)에 있어서, 상기 기판에 고정된 결합 항체 상에 검출 시료 용액을 도포할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 검출 시료 용액 내에 상기 결합 항체와 특이적으로 반응하는 타겟 항원이 존재하는 경우, 상기 검출 시료 용액을 상기 결합 항체 상에 도포하면, 상기 타겟 항원이 상기 결합 항체에 결합될 수 있고, 이 경우 상기 스위칭 펩티드는 상기 결합 항체와 반응한 상기 타겟 항원의 양에 의존하여 정량적으로 상기 결합 항체로부터 유리될 수 있다.
상기 제3 단계(S130)에 있어서, 상기 결합 항체 상에 상기 검출 시료 용액을 도포하고 일정시간 경과 후 상기 검출 시료 용액에 대한 전기화학적 분석을 수행하여 상기 검출 시료 용액 내의 상기 타겟 항원을 정량적으로 분석할 수 있다.
일 실시예로, 앞에서 설명한 바와 같이, 상기 타겟 항원이 상기 결합 항체와 반응하는 경우, 상기 펩티드 화합물은 상기 결합 항체와 반응한 타겟 항원의 양에 의존하여 정량적으로 상기 결합 항체로부터 유리될 수 있고, 이 경우 상기 처리 후의 검출 시료 용액 내의 상기 스위칭 펩티드의 농도가 증가하게 되고, 상기 스위칭 펩티드의 화학적 표지물질의 산화 또는 환원에 의해 상기 검출 시료 용액의 전기화학적 특성이 변화할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 처리 후의 검출 시료 용액에 대한 전기화학적 분석은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 상기 전기화학적 분석은 암페로메트리(amperometry), 크로노암페로메트리(chronoamperometry), 볼타메트리(voltammetry), 사이클릭 볼타메트리(cyclic voltammetry), 디프렌셜 포텐셜 볼타메트리(differential potential voltammmetry), 크로노퍼텐쇼메트리(chronopotentiometry), 폴라로그래피(polarography) 등의 방법으로 수행될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 도 3a 및 도 3b에 도시된 바와 같이, 상기 스위칭 펩티드의 화학적 표지물질이 페로센(Ferrocene)이고, 디프렌셜 포텐셜 볼타메트리(differential potential voltammmetry)의 방법으로 상기 전기화학적 분석을 수행하는 경우, 상기 스위칭 펩티드의 페로센은 작동전극(Working electrode)에 전자를 전달함으로써 페로센 이온으로 산화될 수 있고, 이에 따라 상기 검출 시료 용액의 전기화학 특성이 변화할 수 있고, 그 결과 기준 전극(Reference electrode)와 카운터 전극(Counter electrode) 사이에 흐르는 전류값이 변화할 수 있다. 상기 처리 후의 검출 시료 용액에 포함된 상기 스위칭 펩티드의 농도는 결합 항체와 결합하는 타겟 항원의 양에 따라 변화하므로, 본 발명에서는 상기 전류값의 변화를 측정하여 상기 타겟 항원을 정량적으로 분석할 수 있다. 한편, 상기 페로센 이온은 상기 작동전극으로부터 전자를 공급받아 페로센으로 환원될 수 있다.
본 발명의 스위칭 펩티드 및 이를 이용한 면역분석 방법에 따르면, 결합 항체의 Fab 영역에 선택적으로 그리고 가역적으로 결합하고 화학적 표지물질을 구비하는 스위칭 펩티드를 이용하여, 광학계가 요구되니 않는 전기화학 분석방법을 통해 타겟 항원을 정량 분석 할 수 있으므로, 분석 기기의 소형화 및 저가화를 가능하게 할 수 있고, 이에 따라 현장 진단용 기기에 적용 가능하다.
이하 본 발명의 구체적인 실시예들에 대해 상술한다. 다만, 하기 실시예들은 본 발명의 일부 실시 형태에 불과한 것으로서, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
표 1에 기재된 바와 같은 4 종류의 펩티드(H1, H2, L1, L2)를 합성하였다. 구체적으로, H1 펩티드는 중쇄의 FR2 영역과 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖도록 합성되었고, H2 펩티드는 중쇄의 FR 3 또는 4 영역과 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖도록 합성되었고, L1 펩티드는 경쇄의 FR2 영역과 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖도록 합성되었으며, L2 펩티드는 경쇄의 FR 3 또는 4 영역과 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖도록 합성되었다.
깁스자유에너지의 변화(△G)는, H1 펩티드 화합물에 대해서는 -17.91 kcal/mol, H2 펩티드에 대해서는 -17.19 kcal/mol, L1 펩티드에 대해서는 15.37 kcal/mol, L2 펩티드에 대해서는 -13.05 kcal/mol이었다.
[실험예 1]
도 4a는 L1 및 H2 펩티드 사이의 특이적 상호작용 그리고 L2 및 H1 펩티드 사이의 특이적 상호작용을 확인하는 방법 및 측정결과를 나타내는 도면이고, 도 4b는 PyMOL 소프트웨어를 사용하여 분석된 L1 및 H2 펩티드 사이의 특이적 상호작용 그리고 L2 및 H1 펩티드 사이의 특이적 상호작용을 설명하기 위한 도면이다. 이 때, L1 및 L2 펩티드의 말단에는 제1 형광 표지물질인 FAM(λex=488 nm, λem=532 nm)이 수식되었고, H1 및 H2 펩티드의 말단에는 제2 형광 표지물질인 TAMRA(λex=532 nm, λem=570 nm)이 수식되었다. 한편, 제1 펩티드(L1 또는 L2)는 파릴렌-H의 포르밀기와 펩티드 중 라이신 잔기(lysine residue)의 1차 아민기 사이의 공유결합을 통해 파릴렌-H 코팅된 마이크로플레이트에 고정되었고, 제2 펩티드(H2 또는 H1)는 고정된 제1 펩티드(L1 또는 L2)와 함께 배양되어 이들 사이의 특이 상호작용이 허용되었다. 한편, 고정된 제1 펩티드(L1 또는 L2)와 이와 함께 배양된 제2 펩티드(H2 또는 H1) 사이의 특이 상호작용은 제2 펩티드에 수식된 TAMRA(λem=570 nm)로부터의 녹색 형광 발광을 가진 FRET 효과가 마이크로플레이트의 바닥에서 관찰되는지 여부에 의해 판별될 수 있음을 알 수 있고, 제1 및 제2 펩티드 사이의 특이 상호작용이 발생하는 경우, FRET 효과가 마이크로플레이트의 바닥에서 관찰된다.
도 4a를 참조하면, L1 및 H2 펩티드 사이의 상호작용은 L1 펩티드의 농도를 변화시킴에 의해 관찰되었고, FRET 강도는 L1 펩티드 농도의 증가와 함께 증가되었다. 이러한 결과는 L1과 H2 펩티드 사이의 특이 상호작용이 발생하였음을 나타낸다.
그리고 H1과 L2 펩티드 사이의 상호작용은 H1 펩티드 농도를 변화시킴에 의해 관찰되었고, FRET 강도는 H1 펩티드 농도가 증가함에 따라 증가하는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과 역시 H1과 L2 펩티드 사이의 특이 상호작용이 발생하였음을 나타낸다.
이상의 결과로부터, L1 펩티드는 중쇄의 FR 3 또는 4 영역(H2 펩티드에 대응)에 선택적으로 그리고 가역적으로 결합하고, L2 펩티드는 중쇄의 FR 2 영역(H1 펩티드에 대응)에 선택적으로 그리고 가역적으로 결합하고, H1 펩티드는 경쇄의 FR 3 또는 4 영역(L2 펩티드에 대응)에 선택적으로 그리고 가역적으로 결합하며, H2 펩티드는 경쇄의 FR 2 영역(L1 펩티드에 대응)에 선택적으로 그리고 가역적으로 결합함을 알 수 있다.
도 4b를 참조하면, PyMOL을 통해 H1-L2 펩티들 사이의 수소 결합 및 H2-L1 사이의 수소결합을 분석한 결과, H1-L2 펩티드 사이의 경우, (1)글루타민(H1 펩티드의 잔류수 9)과 티로신(L2 펩티드의 잔류수 3) 사이에서 3.34 Å의 길이를 갖는 수소 결합 및 (2) L2 펩티드로부터의 펩티드 결합의 카르보닐기와 H1 펩티드로부터의 펩티드 결합의 전자 부족 수소 사이에서 3.39 Å의 길이를 갖는 수소결합이 발견되었고, H2-L1펩티드 사이의 경우, (1)아미노산들 사이(상호작용 I), (2)펩티드 결합들 사이(상호작용 Ⅱ, Ⅲ), (3)아미노산과 펩티드 결합 사이(상호작용 Ⅳ)에서 2.49 내지 3.93 Å의 길이를 갖는 4개의 수소결합이 발견되었다. 수소결합의 수는 H1-L2 펩티드 사이의 상호작용이 H2-L1 펩티드 사이의 상호작용보다 더 강하다는 것을 나타냄에 반해, 깁스자유에너지 변화의 유사한 값들은 IgG에 대한 펩티드 화합물들의 유사한 결합 친화도를 암시한다.
도 5는 마이크로플레이트 상에 각각 분리 고정된 인간, 토끼, 염소 및 쥐로부터의 IgG들 그리고 이들과 다른 단백질들(인간 B형 간염 항원, C-반응성 단백질, 단백질-A, BSA)을 형광 라벨된 실시예 1에서 합성된 4종류 펩티드 화합물들(H1, H2, L1, L2)과 반응시킨 후 마이크로플레이트 바닥에서 측정된 형광 강도를 나타내는 그래프들이다.
도 5를 참조하면, 인간, 토끼, 염소 및 쥐로부터의 IgG들만이 현저하게 높은 형광 강도를 나타내었고, 다른 항원성 단백질들은 베이스 라인 수준의 형광을 나타내었다. 이러한 결과는 실시예 1의 펩티드들이 항체에 선택적으로 결합되는 것을 보여준다.
도 6a는 실시예 1의 4종류의 펩티드들이 각각 결합된 항체를 단백질분해효소(protease)인 파파인(papain)으로 처리 전 및 후의 상태를 나태는 모식도이고, 도 6b는 상기 파파인(papain) 처리 이후 마이크로 플레이트의 바닥(B) 및 용액 내(S)에서 측정된 형광 강도를 나타내는 그래프들이다. 본 실험의 경우, 항체들(토끼 항-HRP 항체들)을 마이크로플레이트 상에 고정한 후 형광 라벨된 스위칭 펩티드로 처리하여 항체와 스위칭 펩티드 사이의 결합을 유도하였고, 이어서 비결합 스위칭 펩티드를 제거한 후 단백질분해효소인 파파인을 첨가하여 상기 고정된 항체들로부터 Fab 영역을 가수분해하였다.
도 6a를 참조하면, 형광 라벨된 스위칭 펩티드들은 항체들의 Fab 영역에 결합되기 때문에, 마이크로플레이트의 바닥(B)에서의 형광은 파파인 반응 이후 감소되고, 스위칭 펩티드가 결합된 Fab 영역이 가수분해되어 용액 내부로 용해되므로 용액 내의 형광은 증가될 것으로 예상되고, 이러한 예상은 도 6b의 그래프들에 의해 사실임이 입증되었다.
도 6b를 참조하면, 4종류의 스위칭 펩티드들(H1, H2, L1, L2) 모두에서 파파인 처리 전에 비해 파파인 처리 후에 마이크로플레이트 바닥(B)에서의 형광은 감소하였고, 용액 내(S)에의 형광은 증가하였다. 구체적으로, 마이크로플레이트 바닥에서의 형광 강도의 경우, H1 펩티드는 84.3%, H2 펩티드는 58.7%, L1 펩티드는 84.8%, L2 펩티드는 72.5% 감소한 것으로 평가되었다. 그리고 용액 내에서의 형광 강도의 경우, H1 펩티드는 2184%, H2 펩티드는 2356%, L1 펩티드는 1032%, L2 펩티드는 2452% 증가한 것으로 평가되었다.
이상의 결과들로부터 실시예 1의 4종류의 스위칭 펩티드는 항체의 Fab 영역에 결합됨을 알 수 있다.
하기 표 2는 서로 다른 동물들(토끼, 쥐 및 염소)로부터의 항체에 대한 실시예 1의 4종류 펩티드 화합물들(H1, H2, L1, L2)의 결합 특성을 평가한 결과들이다. 이러한 결과들은 마이크로플레이트에 고정된 항체들에 형광 라벨된 스위칭 펩티들을 겹합시킨 후 미반응 스위칭 펩티드를 제거하고, 이어서 타겟 항원(CRP for rabbit IgG, hCG for mouse IgG, HRP for rabbit IgG, HBsAg for goat IgG)을 각각 반응시킨 후에 측정된 형광 강도 값들이다.
펩티드 항체
(r=rabbit, g-goat, m-mouse)
용액 내(S) 마이크로플레이트 바닥(B)
항원 결합 전 항원 결합 후 변화
(%)
항원 결합 전 항원 결합 후 변화
(%)
H1 Anti-HRP antibody(r) 2596(±704) 21965(±7078) +746 11840(±290) 1451(±103) -87.7
Anti-HBsAg antibody(g) 2242(±91) 11453(±829) +410 11225(±305) 4618(±71) -58.9
Anti-hCG antibody(m) 1281(±63) 3921(±120) +206 5646(±20) 1940(±74) -65.6
Anti-CRP antibody(r) 2242(±91) 5659(±100) +152 4912(±1999) 3595(±30) -26.8
H2 Anti-HRP antibody(r) 2272(±668) 18128(±1456) +698 122230(±309) 1806(±290) -85.2
Anti-HBsAg antibody(g) 1784(±113) 9136(±835) +412 29367(±766) 18773(±1176) -36.1
Anti-hCG antibody(m) 1654(±54) 8545(±1291) +416 23320(±3260) 23320(±3260) -88.5
Anti-CRP antibody(r) 2099(±120) 16311(±165) +677 22205(±732) 22205(±732) -39.5
L1 Anti-HRP antibody(r) 2687(±711) 12280(±3141) +357 15608(±638) 1990(±251) -87.3
Anti-HBsAg antibody(g) 2779(±293) 20501(±2285) +638 11062(±4626) 5388(±581) -51.3
Anti-hCG antibody(m) 1248(±76) 3580(±416) +187 4630(±676) 1777(±44) -61.6
Anti-CRP antibody(r) 741(±197) 6505(±61) +778 6719(±132) 3456(±178) -48.6
L2 Anti-HRP antibody(r) 2315(±754) 16135(±1107) +597 12584(±210) 3208(±117) -74.5
Anti-HBsAg antibody(g) 2279(±635) 15359(±4050) +574 28002(±316) 9856(±1150) -64.8
Anti-hCG antibody(m) 1692(±126) 9402(±656) +456 33156(±4980) 3072(±184) -90.7
Anti-CRP antibody(r) 3274(±353) 32187(±13835) +883 20394(±54) 11236(±72) -44.9
표 2를 참조하면, 각각의 고정된 항체(IgG)는 대응되는 항원의 처리 이후 플레이트 바닥에서의 형광 강도는 감소하고, 용액 내에서의 형광 강도는 증가하는 것으로 측정되었다. 구체적으로, 토끼로부터의 항-HRP 항체들의 경우, H1, L1, H2 및 L2 펩티드들에 대해 플레이트 바닥에서의 형광 강도는 12.3%, 12.7%, 14.8% 및 25.5%만큼 각각 감소하였고, 용액 내에서의 형광 강도는 746%, 357%, 698% 및 597%만큼 각각 증가하였다. 염소로부터의 항-HBsAg 항체들의 경우, H1, L1, H2 및 L2 펩티드들에 대해 플레이트 바닥에서의 형광 강도는 41.1%, 48.7%, 63.9%, 및 35.2%만큼 각각 감소하였고, 용액 내에서의 형광 강도는 410%, 638%, 412%, 및 574%.만큼 각각 증가하였다.
이러한 결과는 실시예 1에서 합성된 4종류의 펩티드 화합물들은 소스 동물의 종과 무관하게 고정된 항체(IgG)에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 실시예 1의 4종류의 펩티드 화합물들 각각과 항체의 가역적인 결합으로 인해 항원이 항체의 결합 포켓에 결합되었을 때 항체로부터 정량적으로 유리됨을 보여준다.
도 7a는 형광 라벨된 실시예 1의 펩티드 화합물들을 이용한 면역분석 방법을 설명하기 위한 모식도이고, 도 7b 및 도 7c는 도 7a에 도시된 면역분석 방법으로 측정된 항원의 농도에 따른 용액 내 및 마이크로플레이트 바닥에서의 형광 강도를 나타내는 그래프들이다. 본 실험에서, 결합 항체로는 마이크로플레이트에 고정된 토끼로부터의 항-HRP 항체가 사용되었고, 항원으로는 HRP가 사용되었다.
도 7a 내지 도 7c를 참조하면, 항원 HRP의 농도를 0.3으로부터 100 μM까지 변화시키면서 면역분석을 수행한 결과, 4종류의 스위칭 펩티드들(H1, H2, L1, L2)에 대해, 항원(HRP)의 농도와 의존하여 용액 내에서의 형광 강도가 증가하는 것이 관찰되었다.
H1, H2, L1, 및 L2 펩티드들의 평형 유리 상수는1.65, 3.11, 3.29, 1.48 μM인 것으로 평가되었는데, 각 스위칭 펩티드에 대한 유리 상수의 차이는 각 스위칭 펩티드가 각 항원에 대해 다른 검출 영역을 가짐을 의미한다. HRP 항원의 경우, H1 펩티드가 HRP 농도 영역에서 가장 선형적으로 반응하였다. 이러한 결과는 스위칭 펩티드가 항원의 결합 양에 따라 고정된 항체로부터 유리되었고, 스위칭 펩티드를 사용한 원스텝 임뮤노어세이에서 용액 내의 형광 강도에 기초하여 항원의 정량 분석이 가능함을 보여준다.
한편, 도 7c에 도시된 바와 같이, 4종류의 스위칭 펩티드 모두에서 마이크로플레이트 바닥에서의 형광 강도는 항원의 농도에 의존하여 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 스위칭 펩티드가 항원의 양에 따라 항체로부터 정량적으로 유리되고, 용액 내에서뿐만 아니라 마이크로플레이트 바닥에서의 형광 강도의 변화를 통해 항원의 정량 분석이 가능함을 나타낸다.
[실시예 2]
L1, L2, H1, H2 펩티드 화합물들 각각의 말단에 페로센을 결합시켜 스위칭 펩드들을 합성하였다. 이 때, 상기 페로센은 카르복실기를 통해 하기 표 3에 기재된 바와 같이 상기 펩티드 화합물들 각각의 말단에 결합되었다.
스위칭 펩티드 아미노산 서열 분자량
(Da)
L1 FAM-T-Y-L-E-W-Y-P-Q-K-P-G-Q-S-P-K-L-L-I-Y-K 2663.34
L2 FAM-V-Y-Y-C-F-Q-G-S-H-V-P-F-T-K 1753
H1 FAM-S-Y-W-I-H-W-V-K-Q-R-P-G-Q-G-L-E-W-I-G-E 2681.02
H2 FAM-V-Y-Y-C-A-R-E-P-T-G-T-G-I-Y-F-D-V-W-G-K 2408.02
[실험예 2]
도 8a 및 도 8b는 L1 스위칭 펩티드를 함유하는 시료 용액에 대해 DPA(Differential pulsed voltammetry) 방법으로 측정된 L1 스위칭 펩티드의 농도에 따른 전류값의 변화를 나타내는 그래프들이다. 이 때, 작동 전극(Working electrode)으로 열분해된 탄소 전극(Pyrolyzed carbon electrode)이 사용되었다.
도 8a 및 도 8b를 참조하면, DPA 방법으로 측정된 전류값은 L1 스위칭 펩티드의 농도에 의존하여 변화하는 것으로 나타났다. 이는 L1 스위칭 펩티드를 이용한 DPA 기반 면역 분석 방법으로 항원을 정량적으로 분석할 수 있음을 보여준다.
도 9a 및 도 9b는 H2 스위칭 펩티드를 함유하는 시료 용액에 대해 DPA(Differential pulsed voltammetry) 방법으로 측정된 H2 스위칭 펩티드의 농도에 따른 전류값의 변화를 나타내는 그래프들이다. 이 때, 작동 전극(Working electrode)으로 열분해된 탄소 전극(Pyrolyzed carbon electrode)이 사용되었다.
도 9a 및 도 9b를 참조하면, DPA 방법으로 측정된 전류값 역시 H2 스위칭 펩티드의 농도에 의존하여 변화하는 것으로 나타났다. 이는 H2 스위칭 펩티드를 이용한 DPA 기반 면역 분석 방법으로 항원을 정량적으로 분석할 수 있음을 보여준다.
도 10a 및 도 10b는 HBsAg 항원을 함유하는 검출 시료 용액에 대해 제1 L1 스위칭 펩티드(페로센이 말단에 결합된 L1 펩티드 화합물)를 이용한 전기화학적 면역분석 방법, 제2 스위칭 펩티드(형광 라벨된 L1 펩티드 화합물)를 이용한 광학적 면역분석 방법, 종래의 ELISA kit를 이용한 화학발광 기반 면역분석 방법 및 종래의 ELISA kit를 이용한 크로모제닉 면역분석 방법을 통해 측정된 항원의 농도에 따른 분석결과를 나타내는 그래프들이다. 상기 제1 L1 스위칭 펩티드를 이용한 전기화학적 면역분석 방법의 결과는 기판에 고정되고 L1 스위칭 펩티드가 결합된 항-HBsAg 항체에 HBsAg 항원을 함유하는 검출 시료 용액을 처리한 후 상기 검출 시료 용액에 대해 DPA(Differential pulsed voltammetry) 방법으로 측정된 것이다.
도 10a 및 도 10b를 참조하면, 상기 제1 L1 스위칭 펩티드를 이용한 전기화학적 면역분석 방법은 종래에 상용화된 ELISA kit 기반의 면역분석 방법들과 비슷한 범위에서 측정이 가능한 것으로 나타났고, LOD(Limit of Detection)의 경우 상기 제1 L1 스위칭 펩티드를 이용한 전기화학적 면역분석 방법이 다른 방법들보다 더 민감한 것으로 나타났다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
10: 결합 항체 100: 스위칭 펩티드
110: 펩티드 화합물 120: 화학적 표지물질
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Claims (12)

  1. 결합 항체에 가역적으로 결합할 수 있는 펩티드 화합물; 및
    상기 펩티드 화합물에 결합된 화학적 표지물질을 포함하고,
    상기 항체가 IgG이고,
    상기 펩티드 화합물이 서열번호 1의 펩티드 화합물, 서열번호 2의 펩티드 화합물, 서열번호 3의 펩티드 화합물 및 서열번호 4의 펩티드 화합물로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상인 것인, 스위칭 펩티드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 펩티드 화합물은 상기 결합 항체의 Fab(Fragment antigen-binding) 영역에 선택적으로 그리고 가역적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 스위칭 펩티드.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 펩티드 화합물은 상기 결합 항체의 경쇄 또는 중쇄의 제1 내지 제4 프레임워크 영역들(FR1, FR2, FR3 및 FR4) 중 하나 이상과 특이적으로 그리고 가역적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 스위칭 펩티드.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 펩티드 화합물은 상기 경쇄의 제2 프레임워크 영역(VL-FR2)의 아미노산 서열과 100% 상동성(homology)을 갖는 제1 아미노산 서열을 갖는 제1 펩티드 화합물; 상기 경쇄의 제3 또는 제4 프레임워크 영역(VL-FR3, VL-FR4)의 아미노산 서열과 100% 상동성(homology)을 갖는 제2 아미노산 서열을 갖는 제2 펩티드 화합물; 상기 중쇄의 제2 프레임워크 영역(VH-FR2)의 아미노산 서열과 100% 상동성(homology)을 갖는 제3 아미노산 서열을 갖는 제3 펩티드 화합물; 및 상기 중쇄의 제3 또는 제4 프레임워크 영역(VH-FR3, VH-FR4)의 아미노산 서열과 100% 상동성(homology)을 갖는 제4 아미노산 서열을 갖는 제4 펩티드 화합물로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 스위칭 펩티드.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 펩티드 화합물은 14 내지 20개의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는, 스위칭 펩티드.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 펩티드 화합물은 1650 내지 2500 Da의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는, 스위칭 펩티드.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 화학적 표지물질은 시료 용액 내에서 가역적으로 산화 또는 환원될 수 있는 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는, 스위칭 펩티드.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 화학적 표지물질은 페로센(ferrocene), 페로센메탄올(ferrocenemethanol), 페로센다이메탄올(ferrocenedimethanol), α-메틸페로센메탄올, 페로시안화(ferrocyanide) 이온, 페리시안화(ferricyanide) 이온, 육아민화 루테늄(ruthenium, Ru) 이온, 하이드로퀴논(hydronquinone), 아스코르브산(ascorbic acid), 도파민(dopamine), 페로센카복시산(ferrocene carboxylic acid), 페로센다이카복시산(ferrocene dicarboxylic acid) 및 페로센알데하이드(ferrocene aldehyde)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 스위칭 펩티드.
  9. 기판에 스위칭 펩티드가 결합된 결합 항체를 고정시키거나 상기 기판에 결합 항체를 고정한 후 상기 스위칭 펩티드를 결합 항체에 결합시키는 제1 단계;
    상기 결합 항체를 검출 시료 용액으로 처리하는 제2 단계; 및
    상기 처리 후의 검출 시료 용액에 대해 전기화학적 분석을 수행하여 상기 검출 시료 용액 내의 상기 결합 항체와 특이적으로 반응하는 타겟 항원을 정량적으로 분석하는 제3 단계를 포함하고,
    상기 스위칭 펩티드는 상기 결합 항체의 Fab(Fragment antigen-binding) 영역에 선택적으로 그리고 가역적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 화합물 및 이에 결합되고 상기 검출 시료 용액 내에서 산화환원이 가능한 화학적 표지물질을 포함하는 것을 특징으로 하고,
    상기 항체가 IgG이고,
    상기 펩티드 화합물이 서열번호 1의 펩티드 화합물, 서열번호 2의 펩티드 화합물, 서열번호 3의 펩티드 화합물 및 서열번호 4의 펩티드 화합물로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상인 것인, 면역분석 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 제2 단계에서 상기 검출 시료 용액 내에 상기 타겟 항원이 존재하는 경우, 상기 타겟 항원이 상기 결합 항체에 결합되면 상기 스위칭 펩티드는 상기 결합 항체와 반응한 상기 타겟 항원의 양에 의존하여 정량적으로 상기 결합 항체로부터 유리되는 것을 특징으로 하는, 면역분석 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 전기화학적 분석은 암페로메트리(amperometry), 크로노암페로메트리(chronoamperometry), 볼타메트리(voltammetry), 사이클릭 볼타메트리(cyclic voltammetry), 디프렌셜 포텐셜 볼타메트리(differential potential voltammmetry), 크로노퍼텐쇼메트리(chronopotentiometry) 및 폴라로그래피(polarography)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 면역분석 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 제3 단계에서 상기 결합 항체로부터 유리된 스위칭 펩티드의 화학적 표지물질과 암페로메트리 또는 볼타메트리를 위한 작동전극(working electrode) 사이에 산화환원 반응이 일어나는 것을 특징으로 하는, 면역분석 방법.


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