KR20220054134A - 스위칭 결합제, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 약학 조성물, 검사 키트 및 항원과 항체의 분석 방법 - Google Patents

스위칭 결합제, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 약학 조성물, 검사 키트 및 항원과 항체의 분석 방법 Download PDF

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신승식
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Abstract

본 발명은 항체의 항원 결합 부위에 결합하는 스위칭 결합제, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약학 조성물, 검사 키트 및 항원과 항체의 분석 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 스위칭 결합제는 항체의 항원 결합 부위를 구성하는 중 쇄 또는 경 쇄의 프레임워크 영역으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 상기 아미노산 서열은 상기 중 쇄 또는 상기 경 쇄와 함께 상기 항원 결합 부위를 구성하는 경 쇄 또는 중 쇄의 프레임워크 영역에 결합하는 제 1 항체 결합부 또는 제 2 항체 결합부를 포함하며, 특이적으로 상기 항체의 상기 항원 결합 부위에 결합한 후, 타겟 항원이 제공될 경우 상기 프레임워크 영역으로부터 분리될 수 있다.

Description

스위칭 결합제, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 약학 조성물, 검사 키트 및 항원과 항체의 분석 방법{Switching bonding agent, method of fabricating the same, and pharmaceutical composition, assay kit, and method of analyzing antigen and antibody using the same}
본 발명은 임뮤노어세이(immunoassay) 기술에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 스위칭 결합제, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 약학 조성물, 검사 키트 및 항원과 항체의 분석 방법에 관한 것이다.
바이오 기술 분야에서 다양한 면역 진단 검사 또는 환경 모니터링과 같은 바이오 검사를 위하여 임뮤노어세이(또는 면역 검정법이라 함)가 사용되고 있다. 상기 임뮤노어세이는 항원-항체 반응이 갖는 고도의 특이성을 이용하여 항원 또 항체를 검출하거나 정량하는 방법으로서, 항원이나 항체 중 어느 한쪽 또는 양쪽을 여러 가지 방법으로 표지한 다음 시료와 반응시킨 후, 시료에 항체 또는 항원이 있으면 항원-항체 반응물이 생기므로 표지한 생성물을 측정함으로써 항체 또는 항원을 정성적으로 또는 정량적으로 측정하는 것이 가능하며, 다른 분석 방법에 비해 높은 민감도를 갖는 이점이 있다.
상기 임뮤노어세이는 암 마커, 감염성 질환, 갑상선 기능, 빈혈, 알레르기, 임신, 약물 남용 또는 통풍 진단과 같은 다양한 진단에 이용될 수 있다. 상기 임뮤노어세이를 다양한 종류의 항원의 진단 또는 분석에 이용하기 위해서는 항원들 각각에 대하여 특이적인 반응성을 갖는 항체를 준비해야 한다.
그러나, 이러한 방법은 최근 빠른 속도로 다양화되고 있는 현대화된 질병들 또는 다수의 돌연변이종을 갖는 바이러스들을 감지하는데 한계점이 있다. 특히, 상기 바이러스의 경우, 상기 바이러스와 특이적 결합성을 갖는 항체를 확보하는 것이 불가능한 경우도 다수 있다.
또한, 상기 항원-항체 반응을 이용하는 경우, 상기 항체를 표지 물질과 결합시키는 추가적인 단계가 요구될 수 있다. 상기 표지 물질과 상기 항체의 결합성이 떨어지는 경우, 임뮤노어세이 분석 정확도 또는 신뢰도가 저하될 수 있다. 전술한 것과 같이, 종래의 이뮤노어세이에는 다양한 항체들마다 결합할 수 있는 다양한 종류의 표지 물질을 각각 개발해야 하는 문제도 있다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는, 다양한 종류의 질병들 또는 상기 질병들의 원인이 되는 항원을 검출할 수 있어 항체 종류에 제한되지 않고, 적용 가능성이 향상된 스위칭 결합제를 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 전술한 이점을 갖는 스위칭 결합제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 전술한 이점을 갖는 스위칭 결합제를 이용하여, 분석의 신뢰도 및 정확도가 향상된 검사 키트를 제공하는 것뿐만 아니라, 항체에 대한 항원의 결합력을 측정할 수 있는 검사 키트를 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 또 다른 기술적 과제는, 전술한 이점을 갖고, 분석 신뢰도 및 정확도가 향상되고, 분석을 위한 처리 단계들이 간소화되어 신속성 및 사용 용이성이 향상된 분석 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 스위칭 결합제는 항체의 항원 결합 부위를 구성하는 중 쇄의 프레임워크 영역으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 상기 아미노산 서열은 상기 중 쇄와 함께 상기 항원 결합 부위를 구성하는 경 쇄의 프레임워크 영역에 가역적으로 결합하는 제 1 항체 결합부를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 스위칭 결합제는 항체의 항원 결합 부위를 구성하는 경 쇄의 프레임워크 영역으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 상기 아미노산 서열은 상기 경 쇄와 함께 상기 항원 결합 부위를 구성하는 중 쇄의 프레임워크 영역에 가역적으로 결합하는 제 2 항체 결합부를 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 스위칭 결합제의 아미노산 서열은 중 쇄 또는 상기 경 쇄의 프레임워크 영역에 인접한 상보성 결정 영역에도 가역적으로 결합할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 스위칭 결합제는 펩타이드, 단백질, 압타머, 나노바디(nanobody), 파지 디스플레이(phage display), 이스트 디스플레이(yeast display), 및 항체로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 스위칭 결합제의 아미노산 일부가 무기물로 치환될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 제 1 항체 결합부는 -Y-, -I-, -W- 및 -Q- 중 적어도 어느 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 제 2 항체 결합부는 -Y-, -Q-, -P-, -L- 및 -F-중 적어도 어느 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 스위칭 결합제는 서열번호 1: S-Y-W-I-H-W-V-K-Q-R-P-G-Q-G-L-E-W-I-G-E, 서열번호 2: V-Y-Y-C-A-R-E-P-T-G-T-G-I-Y-F-D-V-W-G-K, 서열번호 3: T-Y-L-E-W-Y-P-Q-K-P-G-Q-S-P-K-L-L-I-Y-K, 서열번호 4: V-Y-Y-C-F-Q-G-S-H-V-P-F-T-K의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 제 1 항체 결합부는 상기 경 쇄의 프레임워크 영역과 정전기 상호작용, 수소 결합, 반데르발스 힘, 소수성 상호작용 및 이들의 조합 중 적어도 하나 이상에 의해 결합하는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 제 2 항체 결합부는 상기 중 쇄의 프레임워크 영역과 정전기 상호작용, 수소 결합, 반데르발스 힘, 소수성 상호작용 및 이들의 조합 중 적어도 하나 이상에 의해 결합하는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 스위칭 결합제는 상기 제 1 항체 결합부의 아미노산 변조에 의해 항체 결합 부위의 결합력의 조절이 가능할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 스위칭 결합제는 상기 제 2 항체 결합부의 아미노산 변조에 의해 항체 결합 부위의 결합력의 조절이 가능할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 스위칭 결합제는 상기 수소 결합에 의해, 상기 스위칭 결합제와 상기 프레임워크 영역 사이에 사이드 체인(side chain) 기능기 결합 또는 펩타이드 결합의 극성 부위와 결합이 이루어질 수 있다.
일 실시예에서, 상기 스위칭 결합제는 상기 스위칭 결합제가 상기 항체의 상기 항원 결합 부위에 결합된 경우, 상기 항체와 특이적으로 반응하는 타겟 항원이 상기 항체에 결합함으로써, 상기 스위칭 결합제는 상기 항체로부터 분리될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 스위칭 결합제의 상기 항체 결합부는 상기 중 쇄 또는 상기 경 쇄의 상기 항원 결합 부위에 4 Å 내지 8 Å 범위 내로 결합될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 스위칭 결합제는 자연적 또는 인위적인 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 스위칭 결합제는 인간 항체, 비인간 항체, 인간화된 비인간 항체 또는 이들의 조합과 결합하며, 상기 스위칭 결합제가 상기 항체에 결합된 상태에서 상기 항체와 상기 타겟 항원의 결합이 가능할 수 있다.
상기의 과제를 해결하기 위한 본 발명의 다른 실시예에 따른 질병 스크리닝, 진단, 예방 또는 치료 통합의 약학 조성물은 상기 스위칭 결합제를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 약학 조성물에서 상기 스위칭 결합제는 펩타이드, 단백질, 압타머 및 나노바디(nanobody), 파지 디스플레이(phage display), 이스트 디스플레이(yeast display), 및 항체로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 약학 조성물에서 상기 스위칭 결합제는 서열번호 1: S-Y-W-I-H-W-V-K-Q-R-P-G-Q-G-L-E-W-I-G-E, 서열번호 2: V-Y-Y-C-A-R-E-P-T-G-T-G-I-Y-F-D-V-W-G-K, 서열번호 3: T-Y-L-E-W-Y-P-Q-K-P-G-Q-S-P-K-L-L-I-Y-K, 서열번호 4: V-Y-Y-C-F-Q-G-S-H-V-P-F-T-K의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
상기의 과제를 해결하기 위한 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 검사 키트는 상기 스위칭 결합제를 포함하고, 상기 스위칭 결합제는 자연적 또는 인위적인 표지 물질로 표지되며, 상기 스위칭 결합제가 프레임워크 영역에 결합 및 분리되는 양을 측정하여 항체에 대한 항원의 결합력을 측정할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 스위칭 결합제는 펩타이드, 단백질, 압타머 및 나노바디(nanobody), 파지 디스플레이(phage display), 이스트 디스플레이(yeast display), 및 항체로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 다른 실시예에서 상기 결합력은 항체의 항원 결합 계수(Kd)의 산출을 통해 측정될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 항원 결합 계수(Kd)는 0.7 x 10-6 M 내지 3.4 x 10-6 M의 범위를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 검사 키트는 상기 스위칭 결합제를 포함하고, 상기 스위칭 결합제는 자연적 또는 인위적인 표지 물질로 표지되며, 상기 스위칭 결합제가 프레임워크 영역에 결합 및 분리되는 양을 측정 항체 및 타겟 항원을 식별 또는 정량할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 검사 키트는 면역 분석용(immunoassay) 키트로서, 상기 면역분석용 키트는 루미넥스 분석, 단백질 마이크로 어레이 분석, 엘리사 (ELISA) 분석, 면역-PCR 분석 (immune-PCR), 캡처-ELISA 분석, ELISPOT 분석, 방사선 면역 분석(RIA), 측방 흐름 면역 분석(lateral flow immunoassay: LFIA), 통과흐름 면역 분석(flow-through immunoassay: FTIA), 단백질 마이크로플루이딕(microfluidic) 면역 분석, 단백질 마크로플루이딕(microfluidic) 면역 분석, 단백질 모세관 전기영동 분석(capillary electrophoresis: CE), 전기 화학 바이오 센서, 방사 면역 침전 분석, 면역 침전 분석, 면역조직화학염색 분석, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산 분석, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역 전기 영동 분석, 조직면역 염색 분석, 보체 고정 분석, FACS 분석, 단백질 칩 분석, 면역 형광 염색 분석 및 면역 친화성 정제 분석 키트일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 검사 키트는 상기 항체가 고정되지 않은 용액 내에서 상기 항체가 항원과 결합할 때의 항원 결합 계수(Kd)를 측정할 수 있다.
상기의 과제를 해결하기 위한 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 상기 스위칭 결합제를 이용한 분석 방법은 항체의 항원 결합 부위를 구성하는 프레임워크 영역으로부터 스위칭 결합제의 아미노산 서열을 선택하는 단계, 타겟 항원과 특이적으로 결합하는 항체에 상기 스위칭 결합제를 제공하여 상기 항체의 프레임워크 영역(framework region: FR)의 적어도 일부분에 가역적으로 결합시키는 전처리 단계, 상기 전처리 단계의 결과물 내에 상기 타겟 항원을 포함하는지 여부의 판단이 필요한 피분석물을 제공하는 단계 및 상기 프레임워크 영역에 결합된 잔량의 스위칭 결합제 또는 상기 프레임워크 영역으로부터 분리된 스위칭 결합제 중 적어도 어느 하나를 정량하여 상기 피분석물 내에 상기 타겟 항원을 식별 또는 정량 분석하는 분석 단계를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 스위칭 결합제는 펩타이드, 단백질, 압타머, 나노바디(nanobody), 파지 디스플레이(phage display), 이스트 디스플레이(yeast display) 및 항체로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 항체는 기판, 비드(bead), 섬유, 고분자 구조체 또는 이들의 조합인 지지체에 고정될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 항체는 고정되지 않고, 용액에 용해된 상태일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 전처리 단계는, 상기 항체에 상기 스위칭 결합제를 제공하여 상기 항체와 상기 스위칭 결합제의 제 1 결합체 및 상기 항체와 결합되지 않은 스위칭 결합제를 포함하는 혼합 용액을 얻는 단계 및 상기 혼합 용액으로부터 상기 항체와 상기 결합되지 않은 스위칭 결합제를 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 스위칭 결합제는 자연적 또는 인위적 표지 물질로 표지되고, 상기 분석 단계에서, 상기 타겟 항원의 분석은 상기 표지 반응을 측정하여 이루어질 수 있다. 상기 분석 단계는, 상기 항체로부터 분리된 스위칭 결합제와 상기 항체와 상기 타겟 항원의 제 2 결합체를 분리하는 단계 및 상기 분리된 스위칭 결합제를 식별 또는 정량하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기의 과제를 해결하기 위한 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 상기 스위칭 결합제의 제조 방법은 상기 항체의 중 쇄 및 경 쇄의 상기 프레임워크 영역이 서로 자가 결합하는 아미노산 서열 확인하는 단계 상기 아미노산 서열의 소수성 지수를 얻는 단계 및 상기 소수성 지수를 비교하여, 상기 중 쇄 및 상기 경 쇄의 항원 결합 부위를 구성하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열간 동일한 성질을 가지는 부분의 상기 아미노산 서열을 포함하는 스위칭 결합제를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 아미노산 서열은 상기 프레임워크 영역에 인접한 상보성 결정 영역을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 스위칭 결합제는 펩타이드, 압타머, 단백질, 나노바디(nanobody), 파지 디스플레이(phage display), 이스트 디스플레이(yeast display) 및 항체로부터 구성된 군에서 선택될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 아미노산 서열은 정전기 상호작용, 수소 결합, 반데르발스 힘, 소수성 상호작용 및 이들의 조합 중 적어도 하나 이상에 의해 결합할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 스위칭 결합제는, 항체의 항원 결합 부위, 특히, 항체마다 동일 또는 상당히 유사한 아미노산 서열을 가진 프레임워크 영역으로부터 선택되어 여러 종류의 항체에 결합이 가능하고, 항체 종류에 상관없이 항체와 상기 항체에 결합하는 항원의 식별 또는 이들의 정량을 위한 분석에 이용될 수 있고, 상기 선택된 아미노산 서열의 변조를 통해 항체에 결합하는 결합력을 조절할 수 있는 이점이 있다. 여러 종류의 항체에 결합이 가능하여, 항체 종류에 상관없이 항체와 상기 항체에 결합하는 항원의 식별 또는 이들의 정량을 위한 분석에 이용될 수 있으며, 항체에 대한 결합력을 조절할 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 스위칭 결합제의 제조 방법은, 항체의 항원 결합 부위 특히, 프레임워크 영역으로부터 추출되는 것을 특징으로 하여, 다양한 항체에 결합할 수 있는 스위칭 결합제를 제조할 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 바이러스 또는 질병 스크리닝, 진단, 예방 또는 치료 통합의 약학 조성물 약학 조성물은, 전술한 이점을 갖는 스위칭 결합제를 이용하여, 다양한 바이러스를 포함하는 항원에 대한 진단, 예방 또는 치료를 위한 약제를 개발할 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 스위칭 결합제를 이용한 검사 키트는, 전술한 이점을 갖는 스위칭 결합제를 이용하여, 항원과 항체의 식별 및 정량뿐만 아니라, 항원의 항체에 대한 결합력을 측정할 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 스위칭 결합제를 이용한 분석 방법은, 전술한 이점을 갖는 스위칭 결합제를 이용하여, 항체 또는 항원과 같은 분석 대상물을 세척하거나 시약처리를 추가하는 단계를 생략하여 항원의 결합 여부 및 결합량을 신속하게 분석이 가능하고, 사용 용이성이 향상된 임뮤노어세이가 가능할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 프레임워크 영역으로부터 추출된 스위칭 결합제와 프레임워크 영역의 결합에 관한 도면이다.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 프레임워크 영역에 대한 스위칭 결합제의 결합을 나타낸 도면이다.
도 3은 일 실시예에 따른 스위칭 결합제를 도시한 도면이다.
도 4a는 일 실시예에 따른 스위칭 결합제를 이용한 분석 방법의 순서도를 도시한 도면이고, 도 4b는 본 발명의 다른 실시예에 따른 스위칭 결합제를 이용한 분석 방법의 순서도이며, 도 4c는 또 다른 실시예에 따른 스위칭 결합제를 이용한 분석 방법의 순서도이고,
도 5a 및 도 5b는 서열번호 2의 스위칭 결합제와 서열번호 3의 스위칭 결합제 사이의 결합을 도시한 도면이고, 도 5c는 서열번호 2의 스위칭 결합제와 서열번호 3의 스위칭 결합제간 상호 작용을 부위별로 표시한 그래프이며, 도 5d는 서열번호 2의 스위칭 결합제와 서열번호 3의 스위칭 결합제간 소수성 지수를 도시한 도면이다.
도 6a 및 도 6b는 서열번호 1의 스위칭 결합제와 서열번호 4의 스위칭 결합제 사이의 결합을 도시한 도면이고, 도 6c는 서열번호 1의 스위칭 결합제와 서열번호 4의 스위칭 결합제간 상호 작용을 부위별로 표시한 그래프이며, 도 6d는 서열번호 1의 스위칭 결합제와 서열번호 4의 스위칭 결합제간 소수성 지수를 도시한 도면이다.
도 7a는 스위칭 결합제별 항체-결합력 측정 결과를 나타내는 도면이고, 도 7b는 항체에 결합하는 스위칭 결합제별 결합력에 대한 SPR 분석 결과를 나타낸 도면이고, 도 7c 및 도 7d는 항체에 결합하는 펩타이드의 항체 Fab 부위 결합에 대한 결과를 도시한 도면이다.
도 8a 내지 8d는 일 실시예에 따른 스위칭 결합제의 분석 방법에 따른 분석 결과를 도시한 그래프이다.
도 9a 및 9b는 다른 실시예에 따른 스위칭 결합제를 이용한 분석 방법에 따른 분석 결과를 도시한 그래프이다.
도 10a 내지 도 10d는 또 다른 실시예에 따른 스위칭 결합제를 이용한 분석 방법에 따른 분석 결과를 도시한 그래프이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 실시예들은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위하여 제공되는 것이며, 하기 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 오히려, 이들 실시예는 본 개시를 더욱 충실하고 완전하게 하고, 당업자에게 본 발명의 사상을 완전하게 전달하기 위하여 제공되는 것이다.
도면에서 동일 부호는 동일한 요소를 지칭한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "및/또는"은 해당 열거된 항목 중 어느 하나 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시예를 설명하기 위하여 사용되며, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다. 또한, 본 명세서에서 단수로 기재되어 있다 하더라도, 문맥상 다수를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprise)" 및/또는 "포함하는(comprising)"이란 용어는 언급한 형상들, 숫자, 단계, 동작, 부재, 요소 및/또는 이들 그룹의 존재를 특정하는 것이며, 다른 형상, 숫자, 동작, 부재, 요소 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니다.
본 명세서에서 기판 또는 다른 층 "상에(on)" 형성된 층에 대한 언급은 상기 기판 또는 다른 층의 바로 위에 형성된 층을 지칭하거나, 상기 기판 또는 다른 층 상에 형성된 중간 층 또는 중간 층들 상에 형성된 층을 지칭할 수도 있다. 또한, 당해 기술 분야에서 숙련된 자들에게 있어서, 다른 형상에 "인접하여(adjacent)" 배치된 구조 또는 형상은 상기 인접하는 형상에 중첩되거나 하부에 배치되는 부분을 가질 수도 있다.
본 명세서에서, "아래로(below)", "위로(above)", "상부의(upper)", "하부의(lower)", "수평의(horizontal)" 또는 "수직의(vertical)"와 같은 상대적 용어들은, 도면들 상에 도시된 바와 같이, 일 구성 부재, 층 또는 영역들이 다른 구성 부재, 층 또는 영역과 갖는 관계를 기술하기 위하여 사용될 수 있다. 이들 용어들은 도면들에 표시된 방향뿐만 아니라 소자의 다른 방향들도 포괄하는 것임을 이해하여야 한다.
이하에서, 본 발명의 실시예들은 본 발명의 이상적인 실시예들(및 중간 구조들)을 개략적으로 도시하는 단면도들을 참조하여 설명될 것이다. 이들 도면들에 있어서, 예를 들면, 부재들의 크기와 형상은 설명의 편의와 명확성을 위하여 과장될 수 있으며, 실제 구현시, 도시된 형상의 변형들이 예상될 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시예는 본 명세서에 도시된 영역의 특정 형상에 제한된 것으로 해석되어서는 아니 된다. 또한, 도면의 부재들의 참조 부호는 도면 전체에 걸쳐 동일한 부재를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "펩타이드"는, 아미노산 중합체 쇄이며, 제 1 아미노산의 아미노기와 상기 제 1 아미노산에 인접하는 제 2 아미노산의 카복시기가 물 분자를 잃으면서 축합하여 중합되는 아마이드이다. 본 명세서에 설명되는 모든 펩타이드 서열은 관례에 따라서 왼쪽으로 N-말단 끝과 오른쪽으로 C-말단 끝을 가지는 순서로 기재된다. 또한, 본 발명에서 '펩타이드'라는 용어는 천연 또는 합성 단백질, 단백질 단편, 단백질 서열의 펩타이드 유사체를 지칭할 수 있다. 상기 유사체는 절절한 공간적 배향에서 이에 상응하는 기본적 아미노산 또는 펩타이드가 나타내는 크기, 전하 또는 소수성 등의 유사한 물리적 특성을 나타내는 물질로서 정의된다. 예를 들어, 펩타이드 유사체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 사이에 존재하는 아미드 결합이 탄소-탄소 결합 또는 당업계에 공지된 다른 결합으로 치환된 화합물일 수 있다. 또한, 본 발명에서 용어 "펩타이드(peptide)"는 "단백질(protein)" 및 "폴리펩타이드(polypeptide)"라는 용어와 호환적으로 사용될 수 있으며, 이는 여러 개의 아미노산이 펩타이드 결합에 의해 연결된 화합물로 아미노산 잔기들의 개수가 10 개 이상 50 개 이하인 분자 구조체를 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "아미노산"은 광의적 개념으로 자연적으로 발생하는 아미노산과 그 잔기뿐만 아니라, 화학적으로 변형된 아미노산 즉, 아미노산 모방체 및 유사물을 포함하며, 본 발명에서 상기 모방체 및 유사물은 기능적 등가물을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "압타머(aptamer)"는 그 자체로 안정된 3차 구조를 가지며, 특정 물질에 고친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 DNA 핵산 분자를 의미한다. 상기 압타머는 당해 기술분야에 잘 알려진 방법으로 제조될 수 있고, 상기 방법은 필요에 따라 적절히 변형될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항원-항체 반응"은 백혈구의 B 세포에서 생성된 항체들과 면역 반응 과정의 항원들 사이의 특정한 화학 상호작용이다. 여러 종류의 항체들과 항원들 사이에서, 각각의 항체는 특정한 항원에만 결합할 수 있다. 상기 결합의 특이성은 각각의 상기 항체의 특정한 화학적 구조 때문이다. 상기 항원들은 정전기 상호작용, 수소 결합, 반데르발스 결합 그리고 소수성 상호작용과 같은 약한 비공유결합을 통해 항체와 결합하게 된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 2개의 중 쇄와 2개의 경 쇄로 구성된 기본적인 4-폴리펩티드쇄로 구성된 것을 지칭하며, 상기 쇄들은 서로 이황화 결합에 의해 안정화되며 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 가진 당단백질로서 항원 결합 부분을 포함하는 임의의 분자 구조체를 포함한다.
상기 항체는 혈청의 기본 구성요소일 수 있으며, 상기 항체들, 면역글로불린 분자들 또는 이의 단편들의 집합체일 수 있고, 항체 또는 면역글로불린의 단일 분자일 수 있다. 상기 항체 분자는 항원 또는 상기 항원의 에피토프와 같은 특이적인 항원 결정기에 결합되거나 상기 항원 결정기와 반응함으로써 항원에 항체가 결합하면 그 항체를 NK(natural killer) 세포가 인식하여 제거하는 항체의존성 세포 매개성 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity: ADCC) 과 같은 면역학적 이펙터 메커니즘을 유도할 수 있다. 상기 항체는 단일특이적(monospecific)일 수 있으며, 상기 항체들의 조성물은 동일한 항체들로 구성되어 모노클로날일 수 있고, 동일한 항원의 다른 에피토프들 또는 다른 항원들의 에피토프들과 반응하는 다른 종류의 항체들을 포함하여 폴리클로날일 수 있다. 각 항체는 상기 항체의 대응하는 항원에 대한 특이적인 결합을 가능케 해주는 독특한 구조를 가질 수 있다.
상기 항체는 항체, 항체 유도체 또는 이의 단편이 포함될 수 있고, 항체에 관한 상세한 설명은 본 발명의 항체 선별 방법에도 적용된다. 항체는 상기 단편들 중 폴리펩타이드와 같은 항체의 등가물 또는 항체 동족체들은 Fc 영역, 면역글로불린 결합 도메인, 결합 도메인을 모방하는 펩타이드, Fc 영역에 상동성인 영역 또는 적어도 이의 일부를 포함한다. 또한, 항체는 다른 폴리펩타이드에 융합된 면역글로불린 결합 도메인을 포함하는 키메라 분자 또는 그의 등가물을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체들은 온전한(intact) 면역글로불린 분자일 수 있고, Fab, Fab', F(ab')2, Fc, VHH, Fv, N-글리칸 구조 및 파라토프와 같은 상기 항체의 구성 부분들 및 상기 구성 부분들 중 적어도 일부를 포함할 수 있다.
상기 항원 결합 단편(fragment antibody binding: Fab)은 항원 결합 부위를 포함하는 항체의 항원 결합 단편이고, 경 쇄의 가변 영역(VL) 및 불변 영역(CL)을 포함하는 경 쇄 단편, 및 중 쇄의 가변 영역(VH) 및 제 1 불변 영역(CH1)을 포함하는 항체 단편을 의미한다.
상기 결정 분절 영역(fragment crystallizable region: Fc 영역)은 항원과 결합하지 않지만 결정을 형성하는 부분에 해당하고, 일반적으로 면역글로불린 중 쇄의 C-말단 폴리펩타이드 서열을 포함하는 이량체 콤플렉스를 말한다. Fc 영역은 천연 또는 변이 Rc 서열을 포함할 수 있다. 면역글로불린의 중 쇄에서 Fc 서열의 경계가 여러 개일 수 있지만, IgG 중 쇄 Fc 서열은 통상적으로 위치 Cys226의 아미노산 잔기 또는 약 위치 Pro230로부터 Fc의 카복실 말단으로 뻗는 것으로 정의된다. 면역글로불린의 Fc 서열은 일반적으로 중 쇄의 2개의 불변 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 임의로 CH4 도메인을 포함한다. 예를 들면, 천연 항체에서, Fc 도메인은 IgG, IgA 및 IgD isotype에서 항체의 2개의 중 쇄의 CH2 및 CH3으로부터 유래된 2개의 동일한 단백질 단편들로 이루어지고, IgM 및 IgE Fc 도메인은 각각의 폴리펩타이드 쇄에서 3개의 중 쇄 불변 도메인인, CH2 내지 CH4를 함유한다. Fc 영역은 단백질을 모아 놓으면, 결정을 형성할 수 있는데, 이는 비록 IgG 항체의 항원 특이성이 다르다 하더라도, 상기 Fc 영역을 구성하는 단백질의 아미노산 배열이 서로 같다는 것으로, 항원과의 결합에는 관여하지 않는다는 것이다. 또한, 상기 Fc 영역은 일정한 수의 아미노산 잔기를 하나의 구분으로 하여 -S-S- 루프에 의해 고차구조를 형성하며, 각 구분은 펩타이드 결합으로 연결되어 있다.
상기 Fv(fragment variable)는 항원과 직접적으로 결합하는 항체의 가변부위로 중 쇄 가변부위(heavy chain variable domain: VH) 와 경 쇄 가변부위(light chain variable domain: LH)로 구성되어 있다.
상기 VHH는 경쇄가 없는 단일 도메인 분자로, 나노바디(nanobody) 라고도 불리는 단일 가변도메인(single variable domain) 으로써, 천연 발생 단일 도메인 분자는 낙타, 단봉낙타, 알파카 및 과나코와 같은 낙타류와 상어로부터 유래 또는 수득 될 수 있고, 항체 분자를 재조합하여 확보할 수 있다.
상기 항체에 있어서, 상기 중 쇄 또는 경 쇄는 각각 가변 영역(variable region) 및 불변 영역(constant region)을 포함할 수 있다. 상기 가변 영역은 항원에 대한 특이성을 갖고 있으며, 항체마다 서로 다르다. 상기 가변 영역은, 초가변 영역(hypervariable region; HVR) 즉, 상보성 결정 영역(complementarily determining regions: CDRs) 및 상기 상보성 결정 영역을 지지하는 프레임 워크 영역(framework region: FR)을 포함할 수 있다. 상기 상보성 결정 영역(CDR)은 항체마다 상이한 아미노산 서열을 가져 각각의 항원과 특이적으로 결합할 수 있다.
상기 프레임워크 영역(FR)은 초가변 영역 잔기 이외의 불변 도메인 잔기를 지칭한다. 불변 도메인의 상기 프레임워크 영역(FR)은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어지는 것으로 가변 영역에 존재하는 상기 CDR 이외의 영역으로, 3개의 CDR를 연결하는 발판 역할을 하여 상기 CDR의 구조적 안정성에 기여한다. 또한, 프레임워크 영역(FR)의 아미노산 서열은 항체의 종류, 즉, 항체의 발현 종이 달라지더라도 상보성 결정 영역(CDR)에 비하여 변화가 적은 특징이 있다. 따라서, 상기 CDR 및 상기 FR 서열은 일반적으로 중 쇄의 가변 영역(VH) 또는 경 쇄의 가변 영역(VL)에서 하기 순서로 나타날 수 있다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4. 상기 중 쇄 및 경 쇄의 가변 영역 두 개가 합쳐져 항원 결합 부위(antigen binding site)를 형성하는 것이다.
상기 불변 영역은 항체마다 실질적으로 동일하다. 상기 불변 영역은, 일반적으로 단백질에 선택적으로 결합하여 생물학적 활성을 조절하는 소분자인 이펙터(effector) 세포와 같은 면역계의 다양한 세포 및 전형적인 보체 시스템의 구성요소를 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 이하, 본 발명의 다양한 실시예들에 대하여 상세히 설명하기로 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 스위칭 결합제들(100)이 항체(10)의 프레임워크 영역(FR, FR')에 결합된 것을 도시한다.
도 1을 참조하면, 스위칭 결합제(100)는 항체(10)의 항원 결합 부위(15)를 구성하는 경 쇄(VL)의 프레임워크 영역(FR')에 가역적으로 결합하는 제 1 스위칭 결합제(HA, HB) 또는 중 쇄(VH)의 프레임워크 영역(FR)에 가역적으로 결합하는 제 2 스위칭 결합제(LA, LB)를 포함한다.
제 1 스위칭 결합제(HA, HB)는 항체(10)의 항원 결합 부위(15)를 구성하는 중 쇄(VH)의 프레임워크 영역(FR)으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 유사하게, 제 2 스위칭 결합제(LA, LB)는 항체(10)의 항원 결합 부위(15)를 구성하는 경 쇄(VL)의 프레임워크 영역(FR')으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
다른 실시예에서, 스위칭 결합제(100)는 프레임워크 영역(FR, FR')과 프레임워크 영역(FR, FR')에 인접한 상보성 결정 영역(CDR, CDR')을 포함하는 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 1에 도시된 것과 같이, 제 1 스위칭 결합제(HA, HB)의 아미노산 서열은 중 쇄(VH)의 상보성 결정 영역들(CDR) 중 CDR1 영역(CDR1)과 프레임워크 영역들(FR) 중 FR2 영역(FR2)의 서열 일부 또는 전부를 포함하는 아미노산 서열(이하, HAR 부위(HAR)이라 지칭한다) 또는 중 쇄(VH)의 CDR3 영역(CDR3)과 FR3 영역(FR3)의 일부 또는 전부를 포함하는 아미노산 서열(이하, HBR 부위(HBR)이라 지칭한다)에서 선택될 수 있다.
유사하게, 제 2 스위칭 결합제(LA, LB)의 아미노산 서열은 경 쇄(VL)의 서로 인접한 프레임워크 영역들(FR') 중 FR2' 영역(FR2')의 일부 또는 전부와 이에 인접하는 상보성 결정 영역들(CDR') 중 CDR1' 영역(CDR1')의 일부 또는 전부를 포함하는 아미노산 서열(이하, LAR 부위(LAR)이라 지칭한다) 또는 경 쇄(VL)의 서로 인접한 프레임워크 영역들(FR') 중 FR3' 영역(FR3')의 일부 또는 전부와 이에 인접하는 상보성 결정 영역들(CDR') 중 CDR3' 영역(CDR3')의 일부 또는 전부를 포함하는 아미노산 서열(이하, LBR 부위(LBR)라 지칭한다)로부터 선택될 수 있다.
항체(10)의 HAR 부위(HAR)와 LBR 부위(LBR) 및 HBR 부위(HBR)와 LAR 부위(LAR)는 서로 상호 자가 결합 또는 형상학적 교차 결합이 가능하기 때문에, 항원 결합 부위(15)가 3차원적으로 꼬인 구조를 갖도록 한다. 또한, 상기 부위들(HAR, LAR, HBR, LBR)은 프레임워크 영역(FR, FR')을 필수 구성으로 갖기 때문에, 전술한 상호 결합 특성을 통해 항체(10)의 구조를 지지한다. 본 발명의 실시예에 따른 스위칭 펩타이드(100)는 항체(10)의 상기 부위들이 갖는 아미노산 서열을 포함하기 때문에, 항체(10)의 항원 결합 부위에 자가 결합 또는 교차 결합이 가능하다.
본 발명의 스위칭 결합제(100)는 도 1에 도시된 HAR 부위(HAR), HBR 부위(HBR), LAR 부위(LAR) 또는 LBR 부위(LBR)로부터 선택되는 것에 한정되는 것은 아니다. 이는 프레임워크 영역(FR)의 아미노산 서열로부터 다양하게 선택될 수 있다. 예를 들면, FR3 영역(FR3) 또는 FR3' 영역(FR3')에서 스위칭 결합제(100)의 아미노산 서열이 선택될 수 있으며, FR 영역들(FR)을 연결하여 사용한 서열도 사용될 수 있다. 일 실시예에서, FR 영역(FR, FR') 중 적어도 어느 하나를 반드시 포함하는 부위로, FR1 영역(FR1), FR1 영역(FR1)과 CDR1 영역(CDR1), FR2 영역(FR2), FR1 영역(FR1) 내지 FR2 영역(FR2) 또는 FR2 영역(FR2) 내지 FR3 영역(FR3)와 같은 중 쇄(VH)의 영역 또는 FR1' 영역(FR1'), FR1' 영역(FR1')과 CDR1' 영역(CDR1'), FR2' 영역(FR2'), FR1' 영역(FR1') 내지 FR2' 영역(FR2') 또는 FR2' 영역(FR2') 내지 FR3' 영역(FR3')와 같은 경 쇄(VL)의 영역으로부터 선택된 아미노산 서열의 경우도 포함될 수 있음은 분명하다. 이와 같이, 스위칭 결합제(100)는 상보성 결정 영역(CDR, CDR')에 비하여, 다양한 항체들에도 불구하고 동일 또는 상당히 유사한 서열을 가지는 특징이 있는 프레임워크 영역(FR, FR')의 아미노산 서열을 필수 구성으로 포함하여 설계되기 때문에, 항체 또는 항원의 종류에 상관없이 항체의 항원 결합 부위에 결합이 가능해진다. 이에 대한 다양한 실시예는 도 2에서 상세히 설명한다.
제 1 스위칭 결합제(HA, HB)는 전술한 항체(10)의 구조적 상호 결합 특성에 의해, 경 쇄(VL)의 프레임워크 영역들(FR') 중 적어도 어느 하나에 가역적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 제 1 스위칭 결합제(HA)는 LBR 부위(LBR)와, 제 1 스위칭 결합제(HB)는 LAR 부위(LAR)와 상호 결합할 수 있다. 유사하게, 제 2 스위칭 결합제(LA, LB)는 중 쇄(VH)의 프레임워크 영역들(FR) 중 적어도 어느 하나에 가역적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 제 2 스위칭 결합제(LA)는 HAR 부위(HAR)와, 제 2 스위칭 결합제(LB)는 HBR 부위(HBR)와 상호 결합할 수 있다. 이는 스위칭 결합제(100)가 항체(10)의 항원 결합 부위(15)를 구성하는 프레임워크 영역(FR, FR')에 결합하여, 항체(10)의 항원 결합 부위(15)의 구조를 지지하게 된다.
일 실시예에서, 제 1 스위칭 결합제(HA, HB)는 제 1 항체 결합부(도 5b의 AB1 및 도 6b의 AB1')를 포함할 수 있다. 상기 제 1 항체 결합부(AB1, AB1')에 의해, 제 1 스위칭 결합제(HA, HB)는 항체(10)의 경 쇄(VL)의 프레임워크 영역(FR')과 주요하게 결합할 수 있다. 일 실시예에서, 제 1 항체 결합부(AB1, AB1')는 -Y-, -I-, -W- 및 -Q- 중 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 제 1 항체 결합부(AB1, AB1')는 항체(10)의 중 쇄(VH)에서 선택된 아미노산 서열 중 항체(10)의 경 쇄(VL)와 특이적으로 결합하는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 제 1 항체 결합부(AB1, AB1')를 포함하는 서열로, 바람직하게는 서열 번호 1 및 서열 번호 2의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 아미노산 서열 중 밑줄 친 아미노산 잔기는 제 1 항체 결합부(AB1, AB1') 일 수 있다. 아미노산 서열의 N 터미널에서 C 터미널 방향의 아미노산 서열은 다음과 같을 수 있다.
서열번호 1(이하, H1이라 지칭한다): S-Y-W-I-H-W-V-K-Q-R-P-G-Q-G-L-E-W-I-G-E
서열번호 2(이하, H2이라 지칭한다): V-Y-Y-C-A-R-E-P-T-G-T-G-I-Y-F-D-V-W-G-K
서열번호 1(H1)의 경우, 아미노산 서열 중 9 번째 아미노산 잔기인 Q와 17 번째 아미노산 잔기인 W는 제 1 항체 결합부(AB1') 일 수 있다. 서열번호 2(H2)의 경우, 아미노산 서열 중 3 번째 아미노산 잔기인 Y, 13 번째 아미노산 잔기인 I와 18 번째 아미노산 잔기인 W는 제 1 항체 결합부(AB1)일 수 있다. 이에 대한 상세한 설명은 도 5a 내지 도 6e에서 상세히 설명한다.
다만, 전술한 서열번호 1 및 2는 비제한적인 예시일 뿐, 본 발명의 실시예는, 상호 결합할 수 있는 중 쇄(VH)의 프레임워크 영역(FR)으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 여하의 물질일 수 있다.
일 실시예에서, 제 2 스위칭 결합제(LA, LB)는 제 2 항체 결합부(도 5B의 AB2 및 6b의 AB2')를 포함할 수 있다. 제 2 항체 결합부(AB2)는 제 2 스위칭 결합제(LA, LB)가 항체(10)의 중 쇄(VH)의 프레임워크 영역(FR)에 결합할 수 있도록 한다. 일 실시예에서, 제 2 항체 결합부(AB2, AB2')는 -Y-, -Q-, -P-, -L- 및 -F- 중 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 제 2 항체 결합부(AB2, AB2')는 항체(10)의 경 쇄(VL)에서 선택된 아미노산 서열 중 항체(10)의 중 쇄(VH)와 특이적으로 상호 결합할 수 있는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 제 2 항체 결합부(AB2, AB2')를 포함하는 아미노산 서열로, 바람직하게는, 스위칭 결합제(100)는 서열번호 3 및 서열번호 4의 아미노산 서열 중 하나를 포함할 수 있다. 상기 아미노산 서열 중 밑줄 친 아미노산 잔기는 제 2 항체 결합부(AB2, AB2')일 수 있다. 아미노산 서열의 N 터미널에서 C 터미널 방향의 아미노산 서열은 다음과 같을 수 있다.
서열번호 3(이하, L1이라 지칭한다): T-Y-L-E-W-Y-P-Q-K-P-G-Q-S-P-K-L-L-I-Y-K
서열번호 4(이하, L2이라 지칭한다): V-Y-Y-C-F-Q-G-S-H-V-P-F-T-K
서열번호 3의 경우, 아미노산 서열 중 6 번째 아미노산 잔기인 Y, 8 번째 아미노산 서열인 Q, 14 번째 아미노산 잔기인 P와 16 번째 아미노산 잔기인 L은 제 2 항체 결합부(AB2) 일 수 있다. 서열번호 4의 경우, 아미노산 서열 중 3 번째 아미노산 잔기인 Y, 12 번째 아미노산 잔기인 F는 제 2 항체 결합부(AB2') 일 수 있다.
이는 비제한적인 것으로, 서로 자가 결합할 수 있는 경 쇄(VL)의 프레임워크 영역(FR)을 포함하는 항원 결합 부위(15)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 모두 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 제 1 항체 결합부(AB1, AB1') 또는 제 2 항체 결합부(AB2, AB2')는 상기 중 쇄(VH) 또는 경 쇄(VL)의 프레임워크 영역(FR, FR')과 정전기 상호작용, 수소 결합, 반데르발스 힘, 소수성 상호 작용 및 이들의 조합 중 적어도 하나 이상에 의해 결합할 수 있다. 예를 들면, 스위칭 결합제(100)를 구성하는 제 1 항체 결합부(AB1, AB1') 및 제 2 항체 결합부(AB2, AB2')는 프레임워크 영역(FR, FR')과 사이드 체인의 기능기 또는 펩타이드 결합의 극성부위와 수소 결합에 의해 상호 결합 할 수 있다. 다만, 상기 제 1 항체 결합부(AB1, AB1') 및 제 2 항체 결합부(AB2, AB2')는 상기 사이드 체인에 의한 기능기와 펩타이드 결합의 극성 부위를 통한 상호 결합에 한정되는 것은 아니며, 극성 뿐만 아니라 무극성 결합의 경우와 같이, 스위칭 결합제(100)와 항체(10)의 프레임워크 영역(FR, FR')와 결합할 수 있는 다양한 결합 예시도 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 스위칭 결합제(100)은 결합력 조절이 가능할 수 있다. 예를 들어, 제 1 항체 결합부(AB1, AB1') 또는 제 2 항체 결합부(AB2, AB2')의 아미노산 변조에 의해 스위칭 결합제(100)의 결합력 조절이 가능할 수 있다. 구체적으로, 상호 결합을 하는 스위칭 결합제(100)와 항원 결합 부위(15)를 구성하는 프레임워크 영역(FR, FR')의 아미노산 서열 상 입체구조를 고려하여 선별할 수 있고, 상기 선별된 아미노산 서열의 변조에 따라 스위칭 결합제(100)와 프레임워크 영역(FR, FR')간 항체 결합 부위의 결합력 조절이 가능할 수 있다. 이를 통해, 다양한 종들의 항체(10)에 결합할 수 있는 스위칭 결합제(100)를 제공할 수 있다.
다른 실시예에서, 항체(10)에 대한 스위칭 결합제(100)의 결합력은 항체(10)와 타겟 항원(20)의 결합력보다 더 큰 결합력을 가질 수 있다. 제 1 항체 결합부(AB1, AB1') 및 제 2 항체 결합부(AB2, AB2')는 변조에 의한 결합력 조절이 가능한 부위로 이에 대한 구체적이고 상세한 설명은 도 5a 내지 도 6e에서 후술하도록 한다.
일 실시예에서, 항체(10)의 프레임워크 영역(FR, FR')에 가역적으로 결합된 스위칭 결합제(100)는 항체(10)와 특이적으로 반응하는 타겟 항원(도 4a의 20)이 항체(10)에 결합되는 경우, 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 분리될 수 있다. 타겟 항원(20)이 항체(10)와 결합되면 타겟 항원(20) 또는 스위칭 결합제(100)와 결합되지 않은 상태의 항체(10)의 농도가 감소할 수 있고, 상기 농도의 감소에 따라 항체(10)와 스위칭 결합제(100)의 결합 반응의 평형을 유지하기 위하여 스위칭 결합제(100)가 결합된 항체(10)의 농도도 감소할 수 있다. 다른 실시예에서, 스위칭 결합제(100)가 프레임워크 영역(FR, FR')에 결합된 항체(10)가 타겟 항원(20)과 결합되는 경우, 타겟 항원(20)의 입체 장애(steric hindrance) 효과에 의하여 스위칭 결합제(100)가 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 떨어져 나갈 수 있다. 이는 비제한적 예시로, 항체(10)에 타겟 항원(20)이 결합하는 경우 다양한 요인에 의하여 스위칭 결합제(100)와 프레임워크 영역(FR, FR')의 결합이 약화되거나 파괴될 수 있으며, 전술한 예시들은 본원 발명을 한정하지 않는다.
일 실시예에서, 스위칭 결합제(100)는 타겟 항원(20)이 항체(10)에 결합하는 과정에 영향을 미치지 아니할 수 있다. 예를 들면, 스위칭 결합제(100)는 항체의 프레임워크 영역(FR, FR')의 일부 영역의 아미노산 서열을 포함하여 프레임워크 영역(FR, FR')의 일부 또는 이를 포함하는 인접 영역(HAR, HBR)과 결합되어 있고, 타겟 항원(20)은 항체(10)의 상보성 결정 영역(CDR, CDR')을 인식하여 항체(10)와 결합하므로 타겟 항원(20)은 스위칭 결합제(100)가 결합된 항체(10)에 결합될 수 있다. 이후, 타겟 항원(20)과 항체(10)의 결합은 타겟 항원(20)에 입체 장애 효과를 발생시킴으로써 결합되어 있던 스위칭 결합제(100)의 분리를 일으켜 타겟 항원(20)의 검출 또는 분석이 가능하도록 한다.
일반적으로 항원-항체 반응은 비특이적 반응이 많아 제어가 어렵고, 세척 공정 또는 추가적인 시약 처리를 필요로 한다. 본 발명의 스위칭 결합제(100)는 항체(10)에 대한 결합과 분리의 특이적 동작을 수행하는 스위칭 특성을 갖지만, 상기 세척 공정의 단계를 생략하면서도 신속하고 정확하게 one-step으로 항원의 정량 및 분석을 가능하게 하는 이점이 있다.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 프레임워크 영역(FR) 및 프레임워크 영역(FR)에 인접한 상보성 결정 영역(CDR)에 대한 스위칭 결합제(100)의 결합을 나타낸 도면이다.
도 2를 참조하면, 일 실시예에 따르면, 스위칭 결합제(100a, 100b)는 프레임워크 영역(FR) 중 FR1 영역(FR1)의 전부 또는 일부, 프레임워크 영역(FR) 중 FR2 영역(FR2)의 전부 또는 일부, 프레임워크 영역(FR) 중 FR3 영역(FR3)의 전부 또는 일부, 또는 프레임워크 영역(FR) 중 FR4 영역(FR4)의 전부 또는 일부의 조합에 결합될 수 있다. 예를 들면, 스위칭 결합제(100a)는 프레임워크 영역들(FR) 중 FR1 영역(FR1)에 결합되고, 스위칭 결합제(100b)는 FR2 영역(FR2)에 결합될 수 있다. 스위칭 결합제(100)가 프레임워크 영역의 일부에 결합되는 경우에는, 프레임워크 영역의 30 % 내지 70 % 정도에 걸쳐 프레임워크 영역에 결합될 수 있다. 다만, 도 2에 도시된 스위칭 결합제(100a, 100b)는 프레임워크 영역(FR) 중 FR1 영역(FR1), 프레임워크 영역(FR) 중 FR2 영역(FR2)에만 결합되어 있지만, 이는 비제한적인 것으로, 프레임워크 영역 중 FR3 영역(FR3) 또는 프레임워크 영역 중 FR4 영역(FR4)에도 결합 가능하며, 전술한 바와 같이, 프레임워크 영역(FR) 중 FR1 영역(FR1) 내지 프레임워크 영역(FR) 중 FR2 영역(FR2) 또는 프레임워크 영역(FR) 중 FR2 영역(FR2) 내지 프레임워크 영역(FR) 중 FR4 영역(FR4)와 같은 프레임워크 영역(FR)를 연결하여 사용한 서열에도 결합 할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 스위칭 결합제(100c)는 적어도 하나 이상의 프레임워크 영역(FR) 및 적어도 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)에 동시에 결합할 수 있다. 예를 들면, 스위칭 결합제(100c)의 전체 아미노산 서열 중 일부는 프레임워크 영역(FR)에 결합되고, 다른 일부는 상보성 결정 영역(CDR)에 결합될 수 있다. 다른 실시예에서, 상보성 결정 영역(CDR)은 스위칭 결합제(100c)가 결합되는 프레임워크 영역(FR)으로부터 연장되는 영역일 수 있다. 예를 들면, 스위칭 결합제(100c)의 아미노산 서열 중 일 부분이 FR2와 결합되는 경우, 다른 부분은 상보성 결정 영역(CDR) 중 CDR1 부위(CDR1) 또는 상보성 결정 영역(CDR) 중 CDR2 부위(CDR2)와 접촉되어 결합될 수 있다. 다만 이는 비제한적인 것으로, 프레임워크 영역(FR)간 사이에 위치하는 상보성 결정 영역(CDR)에도 유사하게 결합될 수 있다. 예를 들어, 프레임워크 영역(FR) 중 FR3 영역(FR3)와 프레임워크 영역(FR) 중 FR4 영역(FR4) 사이 상보성 결정 영역(CDR) 중 CDR4 부위(CDR4)에 스위칭 결합제(100)이 연속하여 결합될 수 있다.
도 2를 참조하여, 중 쇄(VH)에 결합하는 스위칭 결합제들에 관하여 개시되어 있지만, 본 발명의 실시예에 따른 스위칭 결합제들은 경 쇄(VL)의 프레임워크 영역(FR')에 대해서도 유사하게 결합될 수 있다.
일 실시예에서, 항체(10)는 isotype, hollotype 또는 idotype 항체를 포함하여, 특정되지 않는 한 모든 항체를 포함할 수 있다. 특히, 항체(10)가 isotype 항체인 경우, 항체(10)는 IgG, IgA, IgM, IgD 또는 IgE과 같은 항체를 포함할 수 있다. 다른 실시예에 따르면, 항체(10)은 인간 항체, 비인간 항체, 인간화된 비인간 항체 또는 이들의 조합일 수 있다. 스위칭 결합제(100)는 전술한 바와 같이 항체의 3차원 구조를 이루기 위해 상호 결합을 일으키는 항원 결합 부위(15)를 구성하는 프레임워크 영역(FR, FR') 부위 및 프레임워크 영역(FR, FR')에 인접한 상보성 결정 영역(CDR, CDR')에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 것으로, 프레임워크 영역(FR, FR')의 아미노산 서열은 항체(10)의 종류가 달라지더라도 상보성 결정 영역(CDR, CDR')에 비하여 변화가 적어 유사하게 유지될 수 있다. 그러므로, 항체(10)의 source 동물, 예를 들어, mouse, rabbit, goat 또는 human에 대해 동일 또는 상당히 유사한 아미노산 서열을 가져 다양한 항체(10)에 비특이적인 결합을 할 수 있다. 이에 따라, 다양한 항체에 적용할 수 있어 가용 범위가 확장된 스위칭 결합제(100)가 제공될 수 있다.
일 실시예에서, 스위칭 결합제(100)는 펩타이드, 단백질, 압타머, 나노바디(nanobody), 파지 디스플레이(phage display), 이스트 디스플레이(yeast display) 또는 또 다른 항체일 수 있다.
상기 펩타이드는 화학적 합성, 아미노산 전구체를 사용한 고체상 기술 및 자동화된 펩타이드 합성기에 의한 합성 또는 재조합 수단에 의해 생산될 수 있다. 전술한 펩타이드 합성 방법들은 비제한적 예시이며, 공지된 다양한 종류의 펩타이드 합성 방법들이 적용될 수 있다.
상기 단백질은 아미노산이 펩타이드 결합을 하여 생긴 여러 개의 아미노산으로 이루어진 고분자 화합물이다. 일 실시예에서, 상기 단백질은 자동화 유기 합성 방법을 이용하여 합성될 수 있고, 거대 분자 전달 도메인을 인코딩하는 핵산 서열이 핵산 발현 벡터 내로 클로닝되는 것과 같이 유전적으로 조작된 재조합 단백질을 발현시킬 수 있다.
상기 압타머는 비제한적 예로서 표적 분자의 결합을 이용한 시험관 내 선택법에 의해 얻을 수 있다. 표적 분자, 특히 중 쇄(VH) 또는 경 쇄(VL)의 프레임워크 영역(FR, RR')에 특이적으로 결합하는 압타머의 선별은 유기 분자, 뉴클레오타이드, 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 세포 표면상의 마커 분자, 이온, 금속, 염, 다당류가 각 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 압타머를 분리하는 것에 의해 달성될 수 있다. 또한, 압타머의 선별은 SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment) 방법으로 생체 내 또는 시험관 내 선택 기술을 이용할 수도 있다.
나노바디(nanobody)는 단일 도메인 항체로서, 항체 단일 단편으로 구성된 단량체 가변 항체 도메인이며, 항체와 마찬가지로 특정 항원에 선택적으로 결합할 수 있다. 나노바디는 중 쇄 항체, 경 쇄가 자연적으로 없는 항체, 종래의 4-쇄 항체에서 유래한 단일 도메인 항체, 조작된 항체 및 항체에서 유래된 것 외의 단일 도메인 스캐폴드를 포함할 수 있다.
또한, 파지 디스플레이(phage display)는 펩타이드나 항체 같은 단백질의 일부 또는 전체 단백질을 박테리오파지의 표면에 제시하는 것이다. 상기 파지 디스플레이를 통해 단백질-단백질 상호 작용의 규명을 위해 널리 사용되고 있으며, 이 밖에도 치료, 진단 또는 실험용으로 중요한 특정 항체의 탐색에 유용하다. 또한, 이스트 디스플레이(yeast display)는 항체를 분리하고 공학적으로 만들기 위해 효모 세포벽에 통합된 재조합 단백질의 발현을 사용하는 단백질 공학적 기법이다.
스위칭 결합제(100)로서의 항체는 인간 항체, 비인간 항체 또는 인간화된 비인간 항체일 수 있다. 상기 인간 항체는 인간에 의해 생산된 항체에 대응하고/하거나 본원에서 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하기 위한 임의의 기술을 이용해서 제조된 아미노산 서열을 보유하는 항체일 수 있다. 상기 인간 항체는 파지-디스플레이, 인간 하이브리도마(human hybridoma) 기법에 의해 형성될 수 있다. 상기 비인간 항체는 다양한 종의 공급원, 예를 들면, 설치류, 토끼, 소, 양, 돼지, 개와 같은 인간을 제외한 포유 동물이나 조류로부터 획득된 항체일 수 있다. 상기 인간화된 비인간 항체는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 일 실시예에서, 상기 인간화된 비인간 항체는 사람 배열 대신에 비인간 항체로부터 선택된 배열도 함유할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 인간화 항체는 보존적 아미노산의 치환, 즉 항체 결합 및/또는 생물학적 활성이 크게 바뀌지 않는 동종 또는 다른 종에서 유래된 비천연 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능, 예컨대 결합 친화도를 추가 정련하기 위해 제조될 수 있다. 전술한 스위칭 결합제(100)의 예시는 비제한적인 예로, 항체의 중 쇄 또는 경 쇄와 가역적으로 결합할 수 있는 전술한 아미노산 서열을 포함하는 다양한 예시를 포함할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 스위칭 결합제(100)에서, 상기 아미노산 서열 중 일부가 무기물로 대체되는 물질이라도, 항체(10)의 중 쇄 또는 경 쇄의 프레임워크 영역(FR, FR')을 포함하는 항원 결합 부위(15)에 결합할 수 있고, 스위칭 결합제(100)는 해당 물질을 포함할 수 있다. 상기 무기물은 예를 들면, 이산화규소(SiO2), 산화알루미늄(Al2O3), 산화칼슘(CaO), 산화마그네슘(MgO), 산화철(Fe2O3), 산화타이타늄(TiO2), 산화칼륨(K2O), 산화나트륨(Na2O), 석회석(CaCO3), 돌로마이트(CaMg(CO3)2), 활석(Mg3Si4O10(OH)2), 산화은(Ag2O), 산화크로늄(Cr2O3), 산화코발트(CoO2), 산화구리(CuO), 산화아연(ZnO)로 이루어진 그룹 중 하나 이상으로 이루어질 수 있다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 스위칭 결합제(100)를 도시한다.
도 3을 참조하면, 일 실시예에서, 스위칭 결합제(100)는 화학적, 전기적, 자기적 또는 광학적 표지 반응을 나타내는 표지 물질(200)로 표지될 수 있다. 표지 물질(200)의 표지로 항원-항체 반응에 있어서, 스위칭 결합제(100)가 항체(10)에 결합 및 분리함으로써 도시되는 표지량에 의해 항체 및 항원을 식별 및 정량할 수 있고, 후술할 항체에 대한 항원의 결합력을 측정할 수 있는 이점이 있다.
상기 화학적 표지 반응의 경우, 올리고히스티딘 서열-태그, 염료 등에 의한 화학적 태깅(tagging)을 포함할 수 있다. 상기 전기적 표지 반응의 경우, 발현 기질의 산화-환원 반응에 의하여 발생한 전자의 전류 신호 반응을 포함할 수 있다. 상기 자기적 표지 반응의 경우, 방사능 표지된 특이적 결합 구성원, 구체적으로 항체 분자에 킬레이트화 그룹을 통한 다수의 상자성 이온이 부하될 수 있다. 킬레이트화 그룹으로 EDTA, 포피린, 폴리아민 크라운 에테르 및 폴리옥심이 포함될 수 있고, 상자성 이온의 예로 가돌리늄, 철, 망간, 레늄, 유로퓸, 란탄, 홀뮴 및 에르븀을 포함할 수 있다. 상기 상자성 이온이 부하되어, 방사능 표지된 특이적 결합 구성원, 특히 항체 및 항체의 단편을 통해 항체의 식별 및 위치 확인이 가능하다. 상기 광학적 표지 반응의 경우, 발광, 발색, 형광, 탁도, 자기력 또는 전기 저항 반응을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 표지 물질(200)은 스위칭 결합제(100)의 적어도 어느 일부에 결합될 수 있다. 표지 물질(200)은 발색 물질, 발광 물질, 형광 물질, 자성 물질, 금속 물질, 유기 합성 물질 또는 이들의 조합할 수 있다. 상기 발색 물질에 대한 일 실시예로, 표지 물질(200)은 홀스래디쉬 퍼옥시다아제(Horseradish peroxidase; HRP)이고, 기질은 과산화수소와 같은 과산화물 및/또는 3,3',5,5'-테트라 메틸 벤지딘(Tetramethylbenzidine; TMB)일 수 있다. 또는, 표지 물질(200)은 알칼라인 포스파타아제(Alkaline phosphatase; AP)일 수 있고, 상기 기질은 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 물질이 이용될 수 있으며, 이는 상기 표지 물질(200)이 상기 기질을 분해하여 광학 반응, 화학 반응 또는 전기 반응을 나타내는 효소 역할을 할 수 있는 것이다. 상기 형광 물질에 대한 일 실시예로, Applied Biosystems 사의 HEXTM, TAMRA, lumiprobe 사의 Cy5 또는 술포로다민 101 산 클로라이드(술포로다민 101 산 클로라이드; Texas Red)일 수 있으며, 바람직하게는 FAM 형광 또는 TAMRA 형광일 수 있다. 상기 금속 물질에 대한 일 실시예로, 산화-환원 반응을 겪을 수 있는 임의의 배위된 금속 원자, 예를 들어, 철, 코발트, 루테늄, 아연, 구리, 리튬 또는 은과 같은 물질을 포함할 수 있으며, 일부 특정 예로, 페로센, 아연 테트라벤조포르피린, 코발트 프탈로시아닌, 트리스-(2,2'-바이피리미딘)루테늄, 4-페로세닐벤질 알코올, 5-(4-하이드록시메틸페닐)-10,15,20-트리메시틸포르피나토아연(∥) 및 산화-환원-활성 칼릭사렌으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 유기 합성 물질에 대한 일 실시예로, 플루오르세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 파이크에리쓰린(phycoerythrin), 파이코시아닌(phycocyanin), 알로파이코시아닌(allophycocyanin) 또는 플루오르카민(fluorecamine)을 포함할 수 있다. 이는 비제한적인 예시이며, 스위칭 결합제(100)를 표지하기 위한 다양한 종류의 공지 기술들이 참조될 수 있다.
도 1 내지 도 3를 다시 참조하면, 일 실시예에서, 스위칭 결합제(100)의 제조 방법으로서, 항원 결합 부위(15)에서 아미노산 서열을 확인하는 단계, 상기 아미노산 서열의 소수성 지수를 얻는 단계, 상기 소수성 지수를 비교하여, 스위칭 결합제(100)를 추출하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 스위칭 결합제(100)에 관한 설명은 모순되지 않는 범위내에서 전술하여 설명한 것과 마찬가지이다.
상기 아미노산 서열을 확인하는 단계는, 항체(10)의 중 쇄 및 경 쇄의 프레임워크 영역을 포함하는 항원 결합 부위(15)에서, 항원 결합 부위(15) 상호 간 자가 결합하는 특징을 가지는 아미노산 서열을 확인할 수 있다. 상보성 결정 영역(CDR, CDR')과 비교하여, 프레임워크 영역(FR, FR')은 다양한 종류의 항체 간에 동일 또는 상당히 유사한 아미노산 서열을 가지고, 다양한 항체에 적용될 수 있는 이점이 있어, 프레임워크 영역(FR, FR')에서 선택될 아미노산 서열을 확인하는 것이다.
상기 아미노산 서열의 소수성 지수를 얻는 단계는, 항체에 대한 아미노산 서열 부위별 소수성 지수를 얻을 수 있다. 상기 소수성 지수에서 음의 값과 양의 값으로 구분할 수 있고, 양의 값은 친수성 성질을, 음의 값은 소수성 성질을 갖는 부분임을 확인할 수 있다. 이에 대한 상세한 설명은 도 5c와 도 5d 및 도 6c와 도 6d에서 후술하기로 한다.
상기 소수성 지수를 비교하여, 항원 결합 부위(15)를 구성하는 상기 중 쇄(VH) 및 경 쇄(VL)의 프레임워크 영역(FR, FR')의 아미노산 서열간 동일한 성질을 가지는 부분의 상기 아미노산 서열을 포함하는 스위칭 결합제(100)를 추출하는 단계를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 친수성 성질을 나타내는 서열간 또는 소수성 성질을 나타내는 서열간 상호 결합할 수 있다. 이를 통해, 친수성 성질을 가져 상호 결합이 가능한 부분 또는 소수성 성질을 가져 상호 결합이 가능한 부분의 아미노산 서열을 스위칭 결합제(100)의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 선택할 수 있다. 구체적으로, 상기 스위칭 결합제(100)를 선택하는 단계는, 상기 아미노산 서열의 정보를 통해, 중 쇄(VH) 또는 경 쇄(VL)의 프레임워크 영역(FR, FR')에 상호 결합 특성을 갖는 아미노산 서열을 추출하는 것이다. 항체(10)의 프레임워크 영역(FR, FR')을 포함하는 항원 결합 부위(15) 상호간 결합하는 특성을 통해, 스위칭 결합제(100)가 프레임워크 영역(FR, FR')에 결합하여, 프레임워크 영역(FR, FR')간 상호 작용하는 것과 마찬가지의 효과를 얻을 수 있는 이점을 가지기 때문이다. 스위칭 결합제(100)에 관한 상세한 설명은 전술한 바와 같다.
다른 실시예에서, 질병 스크리닝, 진단, 예방, 치료용 또는 진단과 치료 통합의 약학 조성물로서, 스위칭 결합제(100)를 포함할 수 있다. 스위칭 결합제(100)가 다양한 항체(10)의 프레임워크 영역에 특이적으로 결합 및 분리되는 특성을 통해, 다양한 바이러스에 대한 진단, 예방 또는 치료를 가능하게 하는 이점을 가진다. 상기 약학 조성물은 투여시에 경구 및 비경구의 여러가지 제형으로 투여될 수 있다. 제제화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면 활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 부형제 예를 들면, 전분, 탄산 칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토스(lactose), 젤라틴 등을 혼합하여 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 스위칭 결합제(100)에 대한 설명은 전술한 내용을 참고할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제가 포함될 수 있다. 상기 비수성용제, 상기 현탁제로는 프로필렌슬리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다.
도 4a는 일 실시예에 따른 스위칭 결합제(100)를 이용한 분석 방법의 순서도를 도시하고, 도 4b는 본 발명의 다른 실시예에 따른 스위칭 결합제(100)를 이용한 분석 방법의 순서도를 도시하며, 도 4c는 또 다른 실시예에 따른 스위칭 결합제(100)를 이용한 분석 방법의 순서도이다.
도 4a를 참조하면, 일 실시예에 따른 분석 방법은, 프레임워크 영역(FR, FR')로부터 아미노산 서열을 선택하는 단계(미도시)를 포함할 수 있다. 항체의 중 쇄(VH) 및 경 쇄(VL)가 인접하게 위치하여 상호 자가 결합하는 프레임워크 영역(FR, FR')로부터 스위칭 결합제(100)의 아미노산 서열을 선택할 수 있다. 상기 아미노산 서열을 선택하는 단계에 대해서는 항체(10)의 항원 결합 부위(15)를 구성하는 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 선택될 수 있는 것에 대해, 도 1 내지 도 2의 개시사항 및 후술하는 실시예를 참조할 수 있다. 따라서, 항체(10)의 항원 결합 부위(15) 중 항체(10)마다 동일 또는 상당히 유사한 프레임워크 영역(FR)를 포함하는 아미노산 서열을 추출하여 다양한 항체(10)에 적용할 수 있는 이점이 있다.
일 실시예에서, 항체(10)는 지지체(30)에 고정되어 준비될 수 있다. 지지체(30)는 기판, 비드(bead), 섬유 또는 고분자 구조체일 수 있다. 지지체(30)으로 사용될 수 있는 기질은 바이오칩 또는 바이오센서에 사용될 수 있는 것이라면 한정되지 않는다. 바람직하게는 별도의 처리를 하여 표면이 개질되거나 개질되지 않은 금, 세라믹, 유리, 고분자, 실리콘, 변형된 실리콘, 섬유 및 금속일 수 있다. 구체적으로 상기 고분자는 테트라플루오로에틸렌(tetrafluoroethylene), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리카보네이트(polycarbonate) 또는 폴리프로필렌(polypropylene)일 수 있으며, 상기 섬유는 니트로셀룰로오스(nitrocellulose), 재생 셀룰로오스(regenerated cellulose), 나일론(nylon) 막(membrane)일 수 있으며, 상기 기판 상에 처리하여 표면을 개질시킬 수 있는 물질은 고분자, 플라스틱, 수지, 탄수화물, 실리카, 실리카 유도물질, 탄소, 금속 무기 유리 및 막과 같은 물질일 수 있다. 지지체(30)는 상기 지지체(30) 역할뿐만 아니라, 고정된 항체와 시료와의 반응을 위한 장소를 제공한다. 상기 지지체의 규격 및 그 위에 항체가 고정되는 위치, 크기 및 모양은 분석의 목적, 점적 기기(spotting machine), 분주 기기(dispensing machine) 및 스캐너 등의 분석기기에 따라 변화될 수 있다.
도 4a는 항체(10)가 고체 지지체(30)를 이용하여 기판 상에 고정된 것을 도시하고 있으나, 이에 제한되지 않고, 항체(10)는 비드에 고정되어 용액 내에 배치되거나(도 4b 참조), 항체(10)는 고정되지 않고, 용액 내에 혼합 상태로 제공될 수도 있다(도 4c 참조). 즉, immunosorbent 타입의 임뮤노어세이와 homogeneous 타입의 임뮤노어세이에 적용이 가능하다.
일 실시예에서, 전처리 단계(S100)에서 항체(10)에 결합된 스위칭 결합제(110)를 정량할 수 있다. 예를 들면, 항체(10)는 기판에 고정되어 있고, 스위칭 결합제(100)는 스위칭 결합제(100)에 표지 물질(200)이 결합되어 표지 반응을 나타내고, 상기 기판 하면에서 스위칭 결합제(100)의 상기 표지 반응의 강도를 측정할 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 항체(10)에 타겟 항원(20)이 결합되기 전, 상기 항체(10)에 결합된 스위칭 결합제(110)를 정량하여, 항체(10)에 결합된 스위칭 결합제(110)의 양을 초기값으로 이용하여, 정확도 높은 타겟 항원(20)의 식별 또는 정량이 가능한 이점이 있다. 스위칭 결합제(100), 표지 물질(200) 및 표지 반응에 관한 상세한 설명은 전술한 개시 사항을 참조할 수 있다. 또한, 본 명세서에서, 스위칭 결합제(100)의 "양"은 스위칭 결합제(100)의 "농도"와 상호 호환되어 사용될 수 있고, 스위칭 결합제(100)의 양이 "많다" 또는 "적다"는 기재는 스위칭 결합제(100)의 농도가 "높다" 또는 "낮다"는 것으로 이해될 수 있다.
이후, 항체(10)에 피분석물을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, 항체(10)에 타겟 항원(20)을 결합시켜 결합된 스위칭 결합제(110)를 프레임워크 영역(FR, FR')로부터 분리시키는 항원 처리 단계(S200)가 수행될 수 있다. 상기 피분석물 내에는 타겟 항원(20)이 포함되거나, 포함되지 않을 수 있으며, 상기 피분석물 내에 상기 타겟 항원(20)이 포함되어 항체(10)에 타겟 항원(20)이 제공되는 경우, 상기 타겟 항원(20)의 상기 항체(10)와의 특이적 반응성에 의하여, 상기 항체(10)와 결합된 스위칭 결합제(110) 중 적어도 어느 일부는 상기 프레임워크 영역(FR, FR')로부터 분리되어 상기 항체(10)가 포함된 용액 상으로 유리될 수 있다. 이는 타겟 항원(20)의 농도가 높을수록, 항체(10)에 결합된 스위칭 결합제(110) 중 항체(10)로부터 분리되는 스위칭 결합제(100)의 비율이 증가할 수 있다.
이후, 항원 처리 단계 이후에 프레임워크 영역(FR, FR')에 결합된 잔량의 스위칭 결합제(120), 또는 프레임워크 영역(FR, FR')로부터 분리된 스위칭 결합제(130) 중 적어도 어느 하나를 정량 하여 타겟 항원(20)을 분석하는 분석 단계(S300)가 수행될 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 항체(10)에 피분석물을 제공한 후 세척 단계를 수행하지 않고 피분석물 내의 타겟 항원(20)을 스위칭 결합제(100, 120, 130)를 통해 분석할 수 있어, 신속한 분석이 가능하며, 세척을 위한 부가적인 장비가 요구되지 않고 추가적으로 항체 자체를 표지 시키는 단계를 포함하지 않아 one-step의 간소화가 가능하며, 적은 양을 사용하더라도 스위칭 결합제(100)에 표지되는 물질로 항원의 결합으로 인한 항원-항체 반응을 확인할 수 있어 소형화가 가능하므로, 사용 용이성이 향상된 one-step 임뮤노어세이를 제공할 수 있다.
일 실시예에서, 프레임워크 영역(FR, FR')에 결합된 잔량의 스위칭 결합제(120)를 정량 할 수 있다. 이 경우, 전처리 단계(S100)의 항체(10)에 결합된 스위칭 결합제(110)의 양보다 분석 단계에서 측정된 프레임워크 영역(FR, FR')에 결합된 잔량의 스위칭 결합제(120)의 양이 감소된 경우, 상기 피분석물 내에 타겟 항원(20)이 포함되어 있는지에 관한 정보를 획득할 수 있다. 이는, 타겟 항원(20)이 항체(10)에 결합될 경우에만, 상기 스위칭 결합제(110)가 분리되기 때문이다.
또한, 전처리 단계(S100)의 항체(10)에 결합된 스위칭 결합제(110)의 양에 대한 분석 단계에서 측정된 프레임워크 영역(FR, FR')에 결합된 잔량의 스위칭 결합제(120)의 양의 차이가 클수록 타겟 항원(20)의 양이 많다는 정보 또는 농도가 높다는 정보를 획득할 수 있다. 이에 따라, 본원 발명은 피분석물에 포함된 타겟 항원(20)의 양 또는 농도까지 식별 또는 정량 할 수 있다(이하, 제 1 분석이라 함).
다른 실시예에서, 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 분리된 스위칭 결합제(130)을 정량할 수 있다. 이 경우, 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 분리된 스위칭 결합제(130)의 양이 임계 값 이상인 경우, 상기 피분석물에 타겟 항원(20)이 포함된 것일 수 있다(이하, 제 2 분석이라 함).
또 다른 실시예에서, 프레임워크 영역(FR, FR')에 결합된 잔량의 스위칭 결합제 (120) 및 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 분리된 스위칭 결합제(130)를 모두 정량 할 수 있다. 정량된 결과 분석(제 1 분석, 제 2 분석)에 관한 상세한 설명은 전술한 개시 사항들이 참조될 수 있다. 이에 따라, 전처리 단계(S100)에서 측정된 항체(10)에 결합된 스위칭 결합제(110)의 양과 분석 단계(S300)에서 프레임워크 영역(FR, FR')에 결합된 잔량의 스위칭 결합제(120)의 양의 차이값(제 1 분석) 및 프레임워크(FR, FR')로부터 분리된 스위칭 결합제(130)의 양의 차이값(제 2 분석)을 이용하여 타겟 항원(20)의 정량을 위해 2가지 분석 방법이 활용될 수 있다. 상기 제 1 분석 및 제 2 분석을 통해 타겟 항원(20)의 정량 분석의 정확도 및 신뢰도가 향상된 one-step 임뮤노어세이를 제공할 수 있다. 상기 정량은 잔량의 스위칭 결합제(120) 및/또는 분리된 스위칭 결합제(130)에 결합된 표지 물질(200)의 전술한 표지 반응을 측정하여 판단할 수 있으며, 예를 들면, 상기 표지 반응의 형광의 양은 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer; FRET) 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 이를 통해, 스위칭 결합제(100)는 서로 다른 농도의 항원(20) 결합 시 항체(10)로부터 항원(20)의 농도에 정량적인 관계에 따라 유리되어 피분석물, 예를 들어 항원(20)의 정량이 가능한 one-step 임뮤노어세이의 구현이 가능하다. 도 4a에서 개시된 분석 방법에 대한 분석 결과는 도 8a 내지 도 8d에서 상세히 설명한다.
도 4b를 참조하면, 일 실시예에 따른 분석 방법은, 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 아미노산 서열을 선택하는 단계(미도시)를 포함할 수 있다. 상기 아미노산을 선택하는 단계에 관한 설명은 도 1 내지 도 2와 후술하는 실시예에서 상세히 설명한다.
일 실시예에서, 전처리 단계(S100')에서 항체(10) 비드에 고정될 수 있다. 상기 비드는 비제한적인 예시로서, 글래스(glass) 비드, 마그네틱 비드 또는 고분자 비드일 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 항체(10)를 고정하기 위한 지지체(30)로 기판이 아닌 용액 중에 배치되거나 분산될 수 있는 비드를 사용함으로써, 상기 비드에 항체(10)를 균일하게 고정시키기 용이하고, 후에, 항원 처리 단계(S200')에서 항체(10)와 타겟 항원(20)이 혼합되어 항체(10)와 타겟 항원(20)의 결합도가 상승하는 이점이 있다. 또한, 상기 비드는 기판과 같은 고정된 지지체와 달리 용액 상에 분산 또는 배치될 수 있어, 타겟 항원(20) 분석을 위한 용액 상의 공정이 가능한 이점이 있어, 항체(10)를 고정시키는 단계가 생략될 수 있고, 타겟 항원(20)과 항체(10)가 높은 확률로 결합하여 분석의 정확도가 향상되는 이점이 있다.
이후, 도 4a에서 설명한 것과 마찬가지로, 피분석물을 제공하는 단계 구체적으로, 항원 처리 단계(S200')에서, 용액 내에 존재하는 항체(10)에 피분석물인 타겟 항원(20)을 결합시켜 스위칭 결합제(100)를 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 분리시키는 단계가 수행될 수 있다. 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 스위칭 결합제(100)가 분리되는 것의 상세한 설명은 전술한 기재를 참조할 수 있다.
이후, 분석 단계(S300')에서, 항원 처리 단계 이후에 프레임워크 영역(FR, FR')에 결합된 잔량의 스위칭 결합제(120)와 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 분리된 스위칭 결합제(130)를 분리할 수 있다. 예를 들면, 비드, 비드에 고정된 항체(10) 및 항체(10)의 프레임워크 영역(FR, FR')에 결합된 잔량의 스위칭 결합제(120)의 스위칭 결합제와 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 분리된 스위칭 결합제(130)를 분리할 수 있다. 상기 스위칭 결합제의 밀도는 분리된 스위칭 결합제(130)의 밀도보다 클 수 있다. 이때, 상기 스위칭 결합제의 밀도는 분리된 스위칭 결합제(130)의 밀도보다 크다는 점을 이용하여 상기 스위칭 결합제를 분리할 수 있다. 이를 위해, 원심분리기를 이용하거나, 상기 스위칭 결합제를 침전시킬 수 있다. 도 4b의 분석 방법에 대한 분석 결과는 도 9b 및 도 9c에서 상세히 설명한다.
도 4c를 참조하면, 일 실시예에 따른 분석 방법은, 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 아미노산 서열을 선택하는 단계(미도시)를 포함할 수 있다. 상기 아미노산을 선택하는 단계에 관한 설명은 도 1 내지 도 2에서 상세히 설명한 사항을 참조할 수 있다.
전처리 단계(S100'')는 항체(10)에 스위칭 결합제(100)을 제공하여 항체(10)와 스위칭 결합제(100)의 제 1 결합체(b1) 및 항체(10)와 결합되지 않은 스위칭 결합제(100)을 포함하는 혼합 용액을 얻는 단계(S110) 및 상기 혼합 용액으로부터 항체(10)와 결합되지 않은 스위칭 결합제(100)를 제거하는 단계(S120)를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 혼합 용액을 탈염 컬럼(desalting column)에 통과시켜 상기 탈염 컬럼을 먼저 통과하는 결합되지 않은 스위칭 결합제를 제거하고, 상기 탈염 컬럼을 나중에 통과하는 제 1 결합체(b1)만을 획득할 수 있다. 전술한 방법은 예시적인 것으로, 상기 스위칭 결합제와 펩타이드(100)를 분리하기 위한 다양한 공지 기술들이 참조될 수 있다.
이후, 피분석물을 제공하는 단계로서, 항원 처리 단계(S200'')는, 항체(10)에 타겟 항원(20)을 결합시켜 제 1 결합체(b1)를 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 분리시키는 단계가 수행될 수 있다. 상기 타겟 항원(20)이 상기 항체(10)에 제공되는 경우, 타겟 항원(20)의 항체(10)와의 특이적 반응성에 의하여, 제 1 결합체(b1)에서 상기 항체(10)에 결합된 상기 스위칭 결합제(100)이 프레임워크 영역(FR, FR')으로 분리되어 용액 상으로 유리된다.
이후, 분석 단계(S300'')는, 항체(10)로부터 분리된 스위칭 결합제(130)와 타겟 항원(20)이 결합된 항체(10)의 제 2 결합체(b2)를 분리하는 단계(S310) 및 분리된 스위칭 결합제(130)를 정량하는 단계(S320)를 더 포함할 수 있다. 제 2 결합체(b2)와 분리된 스위칭 결합제(130)는 예시적으로, 단백질-A 컬럼(40)을 이용하여 분리될 수 있다. 이후, 분리된 스위칭 결합제(130)만을 선택적으로 획득하여 표지 반응을 통해 정량할 수 있다. 이때, 타겟 항원(20)의 농도가 높아짐에 따라 제 2 결합체(b2)와 분리된 스위칭 결합제(130)의 양이 증가하여 용액의 형광량이 증가한다.
일 실시예에서, 분석 단계(S300'')는 타겟 항원(20)의 농도의 증가에 따른 분리된 스위칭 결합제(130)의 양을 통해 항체 및 항원을 식별할 수 있는 검사 키트가 제공될 수 있다. 일 실시예에 따르면, 스위칭 결합제(100)를 이용한 상기 검사 키트는 면역 분석(immunoassay) 방식을 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 검사 키트는 루미넥스 분석, 단백질 마이크로어레이 분석, 엘리사(ELISA) 분석, 캡처-ELISA 분석, ELISPOT 분석, 방사선 면역 분석(RIA), 측방 흐름 면역 분석(lateral flow immunoassay: LFIA), 통과흐름 면역 분석(flow-through immunoassay: FTIA), 단백질 마이크로플루이딕(microfluidic) 면역 분석, 단백질 마크로플루이딕(microfluidic) 면역 분석, 단백질 모세관 전기영동 분석(capillary electrophoresis: CE), 면역 유전자증폭(immune-PCR) 분석, 전기 화학 바이오 센서, 방사 면역 침전 분석, 면역 침전 분석, 면역조직화학염색 분석, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산 분석, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역 전기 영동 분석, 조직면역 염색 분석, 보체 고정 분석, FACS 분석, 단백질 칩 분석, 면역 형광 염색 분석 및 면역 친화성 정제 분석 방식에 따라 응용될 수도 있다. 전술한 분석 방식은 예시적일 뿐, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석용 키트들에 관하여 상용화된 분석 방법에 관한 설명이 적용될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 검사 키트는 자연적 또는 인위적인 표지 물질(200)이 표지된 스위칭 결합제(100)을 포함할 수 있다. 상기 표지 물질(200)에 관한 설명은 도 3을 참조할 수 있다.
일 실시예에서, 분석 단계(S300'')는 타겟 항원(20)의 농도의 증가에 따른 분리된 스위칭 결합제(130)의 양을 측정하여 항체(10)에 대한 타겟 항원(20)의 결합력을 측정할 수 있는 검사 키트를 제공할 수 있다. 상기 결합력 측정을 위해, 항체(10)의 항원 결합 계수(Kd)를 측정할 수 있다. 상기 항원 결합 계수(Kd)는 항원과 항체의 결합 상호 작용의 세기를 나타내는 평형 해리 상수일 수 있다. 상기 항원 결합 계수(Kd)가 클수록 타겟 항원(20)과 항체(10)의 결합 친화도가 높을 수 있으며, 항원의 농도가 높아짐에 따라 분리된 스위칭 결합제(130)이 형광 표지 반응하여 용액의 형광량이 증가하고, 이에 따른 농도별 측정을 통해 계산할 수 있다. 이에 따라, 항원-항체간 결합에 의해 유리되는 스위칭 결합제(100)의 양을 통해 항원-항체 간의 결합 계수와 통상의 방법으로 측정한 결합 계수 간의 차이로 결합의 강도를 알 수 있다.
일 실시예에서, 상기 검사 키트는 항체(10)이 고정되지 않은 용액 내에서 항원(20)의 항체(10)에 대한 결합력을 측정할 수 있는 검사 키트를 제공할 수 있다. 본 발명의 실시예를 따르면, 고체 지지체(30)에 항체(10)을 고정시키지 않고 용액 내에 포함된 항체(10)가 타겟 항원(20)을 결합할 때의 항원 결합 계수(Kd)를 측정하는 방법을 이용하는 것으로, 항체(10)를 고정시키는 단계가 생략될 수 있어, 측정의 신뢰도 및 정확도가 향상되는 이점이 있다. 따라서, 항체의 프레임워크 영역(FR, FR')에 가역적으로 결합하는 스위칭 결합제(100)를 사용하여 용액내에서 항체가 항원과의 결합 강도인 항원 결합 계수(Kd)를 측정하는 분석 방법을 통해, one-step 임뮤노어세이가 가능한 검사 키트의 개발도 가능하다.
다른 실시예에서, 상기 검사 키트는 자연적 또는 인위적인 표지 물질(200)이 표지된 스위칭 결합제(100)을 포함할 수 있다. 스위칭 결합제(100)와 표지 물질(200)에 관한 설명은 도 1 내지 3을 참조할 수 있다. 도 4c의 분석 방법에 따른 분석 결과는 도 10a 내지 도 10d에서 상세히 설명한다.
도 5a는 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1) 사이의 결합을 도시하고, 도 5b는 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)의 아미노산 서열 간 특이적 결합을 도시하고, 도 5c는 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)간 상호 작용을 부위별로 표시한 그래프이고, 도 5d는 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)간 소수성 지수를 도시하는 도면이며, 도 5e는 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)간의 FRET 분석 그래프이다.
도 5a를 참조하면, 일 실시예에서, 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1) 간에 입체 구조를 이루며 상호 결합을 하고 있다. 즉, 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)는 일직선으로 상호 작용하고 있지 않다. 따라서, 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)의 하단과 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)의 상단 및 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)의 상단과 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)의 하단이 상호 작용하고 있다. 다른 실시예에서, 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1) 간의 인접 부위의 결합은 4 Å 내지 8 Å 정도, 바람직하게는 3 Å 내지 6 Å 정도의 짧은 거리에서 작용할 수 있다. 스위칭 결합제(H2, L1) 사이 결합 거리를 통해, 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2) 또는 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)와 자가 결합하여 상호 작용하는 프레임워크 영역(FR)도 마찬가지로, 구조적 특성상 인접 부위의 결합은 4 Å 내지 8 Å 정도, 바람직하게는 3 Å 내지 6 Å 정도의 짧은 거리에서 작용할 수 있다.
도 5b를 참조하면, 일 실시예에서, 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)의 아미노산 서열 일부가 수소 결합을 일으킬 수 있다. 구체적으로, 도 5b에 도시된 것과 같이, 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)는 V-Y-Y-C-A-R-E-P-T-G-T-G-I-Y-F-D-V-W-G-K의 서열을 포함하며, 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)는 T-Y-L-E-W-Y-P-Q-K-P-G-Q-S-P-K-L-L-I-Y-K의 서열을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 아미노산 서열에서, 주요하게 결합을 하는 제 1 항체 결합부(AB1) 또는 제 2 항체 결합부(AB2)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제 1 항체 결합부(AB1)로서, 서열번호 2의 펩타이드 서열(H2)의 아미노산 서열 중 3 번째 아미노산 서열인 Y와 18 번째 아미노산 서열 W는 아미노산의 side chain 기능기를 통해 상호 작용을 일으키며, 13 번째 아미노산 서열 I는 펩타이드 결합의 극성 부위와 상호 작용을 일으킬 수 있다.
다른 실시예에서, 경 쇄에서 추출된 아미노산 서열은 상기 경 쇄와 함께 상기 항원 결합 부위를 구성하는 중 쇄(VH)의 프레임워크 영역에 결합하는 제 2 항체 결합부(AB2)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제 2 항체 결합부(AB2)로서, 서열번호 3의 스위칭 결합제 서열(L1)의 아미노산 서열 중 6 번째 아미노산 서열 Y와 8 번째 아미노산 서열 Q의 사이드 체인 기능기를 통해 상호 작용을 일으키며, 14 번째 아미노산 서열 P와 16 번째 아미노산 L은 펩타이드 결합의 극성 부위와 상호 작용을 일으킨다. 따라서, 도면에 도시된 바와 같이, 빨간색으로 밑줄 표시된 아미노산은 사이드 체인 기능기를 통한 상호작용을 일으키며, 파란색으로 표시된 아미노산은 펩타이드 결합의 극성 부위 상호작용을 일으킬 수 있다. 다만, 이는 비제한적인 것으로, 도 1에서 전술한 바와 같이, 상호 교차하여 결합하는 항체의 항원 결합 부위의 구조적 특성뿐만 아니라, 극성 또는 비극성 결합과 같은 다양한 결합에 의해 상호 결합하는 아미노산 서열로 추출된 경우를 모두 포함할 수 있다.
도 5c 및 도 5d를 참조하면, 일 실시예에서, 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)간의 제 1 항체 결합부(AB1) 및 제 2 항체 결합부(AB2)는 아미노산의 side chain에 따른 소수성 지수(hydrophobiciy)를 가질 수 있다. 도 5c에서 소수성 지수가 양성인 부분의 경우 단백질의 안쪽에 위치하고 소수성이 음성인 경우 수용성이므로 단백질의 외부에 위치할 수 있다. 또한, 소수성 부분은 소수성 부분과 친수성 부분은 친수성 부분과 상호 작용을 일으킬 수 있다. 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)의 상단은 친수성이고, 하단은 소수성이다.
이에 따라, 친수성 부분과 소수성 부분은 성질이 같은 쪽에서 상호 작용을 일으키고, 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)의 하단 및 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)의 상단과 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)의 상단 및 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)의 하단이 입체 구조 상 상호 작용할 수 있다. 따라서, 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)는 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경 쇄(VL)의 LAR 부위(LAR)와 상호 작용할 수 있고, 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)는 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중 쇄(VH)의 HAR 부위(HAR)와 상호 작용할 수 있다. 입체 구조를 통해 관찰된 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)간의 4개의 수소 결합 위치의 아미노산을 입체 구조를 고려하여 상기 위치의 아미노산을 변조한다면 항체 결합 부위(15)의 결합력을 조절할 수 있는 이점이 있다.
도 5e를 참조하면, 일 실시예에서, 항체 결합 스위칭 결합제(100) 간의 상호 결합을 보여주는 FRET 실험 결과를 제공한다. 이는 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)간의 상호 결합을 나타낸다. 이에 따라, 서열번호 2의 스위칭 결합제(H1)는 경 쇄(VL)의 LAR 부위(LAR)와 자가 결합하여 상호 작용할 수 있고, 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)는 중 쇄(VH)의 HAR 부위(HAR)와 자가 결합하여 상호 작용할 수 있다는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해, 중 쇄(VH)에서 추출된 아미노산 서열을 가지는 스위칭 결합제(100)는 경 쇄(VL)의 프레임워크 영역(FR)를 포함하는 항원 결합 부위(15)와 상호 결합할 수 있고, 경 쇄(VL)에서 추출된 아미노산 서열을 가지는 스위칭 결합제(100)는 중 쇄(VH)의 프레임워크 영역(FR)를 포함하는 항원 결합 부위(15)와 상호 결합할 수 있다는 점을 확인할 수 있다. 이러한 상호 결합 특성을 통해, 스위칭 결합제(100)가 프레임워크 영역(FR, FR')을 포함하는 항원 결합 부위(15)에 결합하여, 프레임워크 영역(FR, FR')간 상호 작용하는 것과 마찬가지의 효과를 얻을 수 있기 때문이다.
도 6a 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)와 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2) 사이의 결합을 도시하고, 도 6b는 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)와 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)의 아미노산 서열과 서열 내에서 특이적 결합을 도시하고, 도 6c는 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)와 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)간 상호 작용을 부위별로 표시한 그래프이고, 도 6d는 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)와 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)간 소수성 지수를 도시하며, 도 6e는 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)와 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)간 FRET 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6a를 참조하면, 일 실시예에서, 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)와 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2) 간에 입체 구조를 이루며 상호 작용을 하고 있다. 즉, 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)와 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)는 일직선으로 상호 작용하고 있지 않다. 따라서, 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)의 하단과 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)의 상단 및 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)의 상단과 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)의 하단이 상호 작용하고 있다. 다른 실시예에서, 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)와 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2) 간의 인접 부위의 결합은 4 Å 내지 8 Å 정도, 바람직하게는 3 Å 내지 6 Å 정도의 짧은 거리에서 작용할 수 있다. 스위칭 결합제(H1, L2) 사이 결합 거리를 통해, 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1) 또는 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)와 자가 결합하여 상호 작용하는 프레임워크 영역(FR, FR')도 마찬가지로, 구조적 특성상 인접 부위의 결합은 4 Å 내지 8 Å 정도, 바람직하게는 3 Å 내지 6 Å 정도의 짧은 거리에서 작용할 수 있다.
도 6b를 참조하면, 일 실시예에서, 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)와 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)의 아미노산 서열의 일부가 수소 결합을 일으킬 수 있다. 구체적으로, 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)는 S-Y-W-I-H-W-V-K-Q-R-P-G-Q-G-L-E-W-I-G-E의 서열을 포함하며, 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)는 V-Y-Y-C-F-Q-G-S-H-V-P-F-T-K의 서열을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 도 5b와 유사하게, 상기 아미노산 서열에서, 주요하게 결합을 하는 제 1 항체 결합부(AB1') 또는 제 2 항체 결합부(AB2')를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 제 1 항체 결합부(AB1')로서, 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)의 아미노산 서열 중 9 번째 아미노산 서열인 Q는 아미노산의 사이드 체인 기능기를 통해 상호 작용을 일으키며, 17 번째 아미노산 서열인 W는 펩타이드 결합의 극성 부위와 상호 작용을 일으킨다. 다른 실시예에서, 제 2 항체 결합부(AB2')를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 제 2 항체 결합부(AB2')로서, 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)의 아미노산 서열 중 3 번째 아미노산 서열 Y의 사이드 체인 기능기를 통해 상호 작용을 일으키며, 12 번째 아미노산 서열 F는 펩타이드 결합의 극성 부위와 상호 작용을 일으킨다. 따라서, 도면에 도시된 바와 같이, 빨간색으로 밑줄 표시된 아미노산은 side chain 기능기를 통한 상호작용을 일으키며, 파란색으로 표시된 아미노산은 펩타이드 결합의 극성 부위 상호작용을 일으킬 수 있다.
도 6c 및 도 6d를 참조하면, 일 실시예에서, 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)와 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)간의 아미노산의 사이드 체인(side chain)에 따른 소수성 지수(hydrophobiciy)를 가질 수 있다. 도 6c에서 소수성 지수가 양성인 부분의 경우 단백질의 안쪽에 위치하고 소수성이 음성인 경우 수용성이므로 단백질의 외부에 위치할 수 있다. 또한, 소수성 부분은 소수성 부분과 친수성 부분은 친수성 부분과 상호 작용을 일으킬 수 있다. 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)와 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)의 상단은 친수성이고, 하단은 소수성이다.
이에 따라, 친수성 부분과 소수성 부분은 성질이 같은 쪽에서 상호 작용을 일으키고, 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)의 하단 및 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)의 상단과 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)의 상단 및 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)의 하단이 입체 구조상 상호 작용할 수 있다. 따라서, 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)는 경 쇄(VL)의 LBR 부위(LBR)와 상호 작용할 수 있고, 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)는 중 쇄(VH)의 HBR 부위(HBR)와 상호 작용할 수 있다. 입체 구조를 통해 관찰된 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)와 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)간의 2개의 수소 결합 위치의 아미노산을 입체 구조를 고려하여 상기 제 1 항체 결합부(AB1') 또는 제 2 항체 결합부(AB2')의 아미노산 잔기를 변조한다면 항체 결합 부위의 결합력을 조절할 수 있는 이점이 있다. 다만, 이는 본 발명을 한정하는 것은 아니며, 중 쇄(VH)와 경 쇄(VL)가 수소 결합하며 상호 작용하는 부위에서 추출된 아미노산 서열을 갖는 스위칭 결합제(100)와 상기 중 쇄(VH) 또는 경 쇄(VL)의 프레임워크 영역(FR)을 포함하는 항원 결합 부위(15) 사이의 결합이라면 모두 포함할 수 있다.
도 6e를 참조하면, 일 실시예에서, 항체 결합 스위칭 결합제 간의 상호 결합을 보여주는 FRET 실험 결과를 제공한다. 이는 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)와 서열번호 4의 스위칭 결합제(H2)간의 상호 결합을 나타낸다. 이를 통해, 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)는 경 쇄(VL)의 LBR 부위(LBR)와 상호 결합할 수 있고, 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)는 중 쇄(VH)의 HBR 부위(HBR)와 상호 결합할 수 있다는 것을 확인할 수 있다. 이러한 특성을 통해, 스위칭 결합제(100)가 프레임워크 영역(FR)에 결합하여, 프레임워크 영역(FR)간 상호 작용하는 것과 마찬가지의 효과를 얻을 수 있기 때문이다.
도 7a는 스위칭 결합제(100)별 항체-결합력 측정 결과를 도시하고, 도 7b는 농도에 따른 항체 결합 스위칭 결합제(100)의 결합력에 대한 SPR 분석 결과를 도시하며, 도 7c는 항체에 결합하는 스위칭 결합제(100)의 항체(10) Fab 부위 결합에 대한 결과를 도시하고, 도 7d는 항체(10)에 결합하는 스위칭 결합제(100)의 항체(10) Fab 부위 결합에 대한 다른 항원 및 단백질과의 비교 분석 그래프를 나타낸다.
도 7a를 참조하면, 스위칭 결합제(100)의 농도에 따른 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)의 형광량을 나타내는 그래프(A1), 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)의 형광량을 나타내는 그래프(A2), 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)의 형광량을 나타내는 그래프(A3) 및 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)의 형광량을 나타내는 그래프(A4)를 도시하고 있다.
일 실시예에서, 본 발명의 스위칭 결합제(100)는 농도가 높아질수록, 형광량의 세기가 강해지는 경향을 확인할 수 있다. 이를 통해, 본 발명의 스위칭 결합제(100)가 항체(10)와 결합하여, 결합된 스위칭 결합제(100)의 정량에 사용될 수 있다. 다른 실시예에서, 스위칭 결합제(100)의 농도별 형광량 측정을 통해 항원 결합 계수(Kd)를 측정할 수 있다. 각각의 서열번호 1 내지 서열번호 4 스위칭 결합제(100)의 항원 결합 계수는 Kd(H1)=1.42 x 10-6 M, Kd(H2)=1.94 x 10-5 M, Kd(L1)=6.62 x 10-6 M 및 Kd(L2)=6.68 x 10-6 M로 계산되었다.
이를 통해 각 스위칭 결합제별, 타겟 항원(20)의 항체(10)에 대한 상대적 결합력을 산출하여 정량 하는 이점이 있다. 상기 형광 분석의 구체적인 실험 방법은 실시예 3에서 후술하기로 한다. 다만, 도 7a에서 도시하고 있는 상기 항원 결합 계수(Kd)는 지지체(30)에 의해 고정된 항체(10)에 대한 값을 나타내는 것이나, 이에 한정하지 않고, 용액 내에서 항체(10)가 타겟 항원(20)을 결합할 때의 항원 결합 계수(Kd)를 측정하는 것도 가능하며 이는 도 10a 내지 10d에서 상세히 설명하기로 한다.
도 7b를 참조하면, 일 실시예에서, 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance: SPR) 분석 결과를 확인할 수 있다. 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance: SPR)은 금과 같은 금속 박막 표면에 물질이 결합하였을 때 금속 표면의 굴절률이 변하게 되는 현상으로서 빛을 조사하였을 때 반사되는 빛 중 SPR 현상이 일어나는 공명각을 조사하면 금속 표면에 결합된 물질의 농도를 측정할 수 있는 기술로서, 농도별 스위칭 결합제(100), 본 실험 예에서는 결합제 중 펩타이드를 처리한 SPR 신호 결과 값을 도시한다.
구체적으로, SPR 신호 결과 값을 확인하기 위해, 항체(10)의 고정에 앞서 금 표면을 Mercaptoundecanoic acid(MUA)를 1 mM로 overnight 처리하고 표면 개질하였으며, Carbodiimide/N-Hydroxysuccinimide (EDC/NHS, 0.4 M/0.1 M)를 1:1 비율로 섞어 10 분 처리하여 작용기를 활성화하였다. 항체 고정은 항-HRP 항체를 항체 농도 50 μg/mL로 1.5 시간을 처리하여 준비하였다. 이후, Ethanolamine 농도 1 M로 10분 블로킹한 후에 사용하였다. 스위칭 결합제(100) 모두는 10 및 20 μM의 두가지 농도에서 각각 사용하여 30분 인큐베이션하여 처리하였고, SPR 신호의 측정은 1 % Tween-20 세척액을 1 분간 흘린 후 용액이 멈춘 상태에서 3 분간 SPR 신호를 측정하는 루틴을 3차례 반복하여 평균값으로 신호를 산정할 수 있다.
다만, 상기 실시예는 본 발명의 실시예를 한정하는 것은 아니며, 스위칭 결합제(100)의 결합력을 측정할 수 있는 방법을 모두 포함할 수 있다. 그래프에서 서열번호 1의 펩타이드의 SPR 신호(H1), 서열번호 2의 펩타이드의 SPR 신호(H2), 서열번호 3의 펩타이드의 SPR 신호(L1) 및 서열번호 4의 펩타이드의 SPR 신호(L2)에 대하여, 저농도인 10 μM를 좌측에 그래프(B1)으로, 고농도인 20 μM를 우측에 그래프(B2)로 도시하고 있다. 좌측에 그래프(B1)로 도시된 저농도인 10 μM에서의 펩타이드 처리 결과 SPR 신호는 서열번호 1의 펩타이드(H1) = 34.4±3.3 (9.6%) RU, 서열번호 2의 펩타이드(H2) = 51.5±5.6 (10.9%) RU, 서열번호 3의 펩타이드(L1) = 25.3±3.2 (12.5%) RU 및 서열번호 4의 펩타이드(L2) = 124.6±16.9 (13.6%) RU, 로 계산되었다.
우측에 그래프(B2)로 도시된 고농도인 20 μM에서의 펩타이드 처리 결과 SPR 신호는 서열번호 1의 펩타이드(H1) = 121.4±3.7 (3.1%) RU, 서열번호 2의 펩타이드(H2) = 192.0±1.8 (0.9%) RU, 서열번호 3의 펩타이드(L1) = 40.4±3.2 (7.9%) RU 및 서열번호 4의 펩타이드(L2) = 418.2±26.5 (6.4%) RU의 분석 결과를 확인할 수 있다. 이를 통해 항체의 항원 결합 부위의 아미노산 서열을 분석하여 합성한 서열번호 1 내지 서열번호 4의 펩타이드가 항체에 결합하는 것을 알 수 있고, 그 중 상대적으로 서열번호 4의 펩타이드가 가장 많이 결합한다는 점을 알 수 있다.
도 7c 및 도 7d를 참조하면, 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)의 형광량을 나타내는 그래프(C1 D1), 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)의 형광량을 나타내는 그래프(C2, D2), 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)의 형광량을 나타내는 그래프(C3, D3) 및 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)의 형광량을 나타내는 그래프(C4, D4)를 도시하고 있다. 일 실시예에서, 서열번호 1 내지 서열번호 4의 스위칭 결합제(100)는 항체(10)의 단편 중 항원 결합 부위(15)를 포함하는 Fab 부위에만 결합함을 알 수 있다.
도 7c를 다시 참조하면, 일 실시예에서, 스위칭 결합제(100)는 항체(10)의 항원 결합 부위(15)에 결합할 수 있다. 구체적으로, 고체 지지체(30)에 고정된 항체(10)에 형광이 표지된 스위칭 결합제(100)를 결합시켰다. 항체 고정은 항-HRP 항체(10)를 항체 농도 10 μg/mL로 두 시간 처리하여 준비하였고, BSA 농도 8 mg/mL로 1 시간 블로킹을 한 후 사용하였다. 서열번호 1 내지 서열번호 4의 스위칭 결합제(100)는 스위칭 결합제(100) 농도 10 μM로 1 시간 인큐베이션 처리하였고, 항체(10)의 Fab 부위와 Fc 영역의 분해를 위해 papain을 농도 250 μg/mL로 37 도에서 2시간 처리한 후, 용액에서의 형광량 변화를 측정하고, 고체 지지체(30)에 남은 형광량을 구별하여 측정하였다.
일 실시예에서, 바닥에서의 형광량(A)과 용액에서의 형광량(B)을 확인할 수 있고, 항체(10)의 Fab 부위와 Fc 부위를 분해하는 단백질 분해 효소인 papain으로 처리 후 펩타이드(100)에 형광 측정을 한 결과, 형광량은 papain이 처리된 경우, Fc 부위가 고정된 바닥에서의 형광량(A)보다 분해되어 용액 속에 유리된 Fab 부위에서의 형광량(B) 더 높은 점을 확인할 수 있다. 즉, 서열번호 1 내지 서열번호 4의 스위칭 결합제(100)에 대해 항체 분해 효소인 papain 처리 전의 경우, 형광이 항체가 고정된 고체지지체(30)에서만 크게 관찰되는 것과 비교하여, papapin 처리 후의 경우, 항체(10)가 고정된 고체지지체에서 형광이 크게 감소하고 용액에서 크게 관찰되었다. 이를 통해, papain으로 분해되어 용액에 분포하는 Fab 영역에 서열번호 1 내지 서열번호 4의 스위칭 결합제(100)가 결합되는 것이고, 고체 지지체(30)로 고정되어 있는 Fc 영역에선 결합하지 않는 것을 알 수 있다.
도 7d를 다시 참조하면, 일 실시예에서, 서열번호 1 내지 서열번호 4의 스위칭 결합제(100)는 항체(10)에만 선택적으로 결합할 수 있다. 구체적으로, 고체지지체(30)에 항체(10) 및 단백질의 고정을 위해 human IgG, rabbit IgG, goat IgG 및 mouse IgG를 항체농도 100 μg/mL로 overnight 처리하여 준비하였고, 고정단백질은 HBsAg, CRP, protein A를 각각 농도 100 μg/mL로 overnight 처리하여 준비하였다. 이후 BSA 농도 10 mg/mL로 1시간 블로킹한 후 사용하였다. 서열번호 1 내지 서열번호 4의 스위칭 결합제(100)는 20 μM 농도를 각각 사용하여 1시간 인큐베이션하여 처리하였다.
도 7e를 참고하면, 형광이 표지된 서열번호 1 내지 서열번호 4의 펩타이드는 항원인 HBsAg 및 CRP와 단백질인 protein A에 비하여 항체인 human IgG, rabbit IgG, goat IgG 및 mouse IgG에 높은 형광량을 보이는 것을 확인하였다. 이는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 스위칭 결합제(100)가 항체(10)에 선택적으로 결합한다는 점을 확인할 수 있다.
도 8a 내지 도 8d는 본 발명의 일 실시예 중 도 4a의 분석 방법에 따른 타겟 항원(20)의 분석 결과를 나타낸 그래프로, 도 8a는 항체(10)는 항-HRP 항체(10)이고, 타겟 항원(20)은 HPR 일 때, 도 8b는 항체(10)는 항-hCG 항체(10)이고, 타겟 항원(20)은 hCG 일 때, 도 8c는 항체(10)는 항-CRP 항체(10)이고, 타겟 항원(20)은 CRP 일 때, 도 8d는 항체(10)는 항-HBsAg 항체(10)이고, 타겟 항원(20)은 HBsAg 일 때, 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8a와 관련하여, 항-HRP 항체를 고체지지체에 농도 1 μg/ml로 overnight 처리하여 고정하고, 서열번호 1 내지 서열번호 4의 스위칭 결합제(100)를 각각 10 μM 농도(100 μl/well)로 2시간동안 처리하였다. 이때 바닥의 형광을 측정한 후, rabbit의 IgG 항체에 대한 분석물로 항원 HRP를 농도 10 μg/ml로 1시간 처리하였다. 도 8b와 관련하여, 항-hCG 항체를 고정지지체에 농도 1 μg/ml로 overnight 처리하여 고정하고, 서열번호 1 내지 서열번호 4의 스위칭 결합제(100)를 각각 20 μM 농도(100 μl/well)로 2시간동안 처리하였다. 이때 바닥의 형광을 측정한 후, mouse의 IgG 항체에 대한 분석물로 항원 hCG를 농도 100 μg/ml로 2시간 처리하였다.
도 8c와 관련하여, 항-CRP 항체를 고체지지체에 농도 1 μg/ml로 overnight 처리하여 고정하고, 서열번호 1 내지 서열번호 4의 스위칭 결합제(100)를 각각 20 μM 농도(100 μl/well)로 2시간동안 처리하였다. 이때 바닥의 형광을 측정한 후(A), rabbit의 IgG 항체에 대한 분석물로 항원 HRP를 농도 10 μg/ml로 1시간 처리하였다. 도 8d와 관련하여, 항-HBsAg 항체를 고체지지체에 농도 1 μg/ml로 overnight 처리하여 고정하고, 서열번호 1 내지 서열번호 4의 스위칭 결합제(100)를 각각 20 μM 농도(100 μl/well)로 2시간동안 처리하였다. 이때 바닥의 형광을 측정한 후(A), goat의 IgG 항체에 대한 분석물로 항원 HBsAg를 농도 10 μg/ml로 1시간 처리하였다.
도 8a 내지 도 8d를 참조하면, 스위칭 결합제(100)는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 스위칭 결합제로, 특히, 결합제(100) 중 펩타이드를 이용하여 실험하였다. 도 8a 내지 도 8d에서 그래프 A는 전처리 단계(S100)에서 항체(10)에 결합된 스위칭 결합제(110)의 측정값, 그래프 B는 분석 단계(S300)에서 프레임워크 영역(FR)에 결합된 잔량의 스위칭 결합제(120)의 측정값, 그래프 C는 프레임워크 영역(FR)으로부터 분리된 스위칭 결합제(130)의 측정값일 수 있으며, 예시적으로, 스위칭 결합제(100)에 결합된 표지 물질(200)이 나타내는 표지 반응의 세기를 측정하여 정량하였다. 상기 표지 반응은 형광 반응일 수 있다. 전술한 물질들은 비제한적인 예시이며, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
도 8a 내지 도 8d를 참조하면, 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1), 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2), 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1) 및 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)에서 모두 항체(10)에 결합된 스위칭 결합제(110)의 양(A)보다 프레임워크 영역(FR)에 결합된 잔량의 스위칭 결합제(120)의 양(B)이 감소하였음을 알 수 있다. 또한, 프레임워크 영역(FR)으로부터 분리된 스위칭 결합제(130)의 양(C)이 측정됨을 알 수 있다. 이 결과, 항체(10)에 결합된 스위칭 결합제(110)의 양(A)에 대한 프레임워크 영역(FR)에 결합된 잔량의 스위칭 결합제(120)의 양(B)의 감소량이 프레임워크 영역(FR)으로부터 분리된 스위칭 결합제(130)의 양(C)보다 큰 것을 알 수 있다.
이는, 항체(10)에 결합된 스위칭 결합제(110)의 양(A)은 지지체(30)의 면 상에서 관찰된 형광의 세기이나, 프레임워크 영역(FR)으로부터 분리된 스위칭 결합제(130)의 양(C)은 용액 상에서 관찰된 형광의 세기이기 때문이다. 이에 따라, 타겟 항원(20)이 항체(10)에 결합되는 경우, 항체(10)에 결합된 스위칭 결합제(110)는 프레임워크 영역(FR)으로부터 분리되어 용액상으로 유리됨을 알 수 있으며, 본 발명의 실시예에 따라, 전술한 바와 같이 전처리 단계(S100)에서 측정된 항체(10)에 결합된 스위칭 결합제(110)의 양과 분석 단계(S300)에서 프레임워크 영역(FR)에 결합된 잔량의 스위칭 결합제(120)의 양의 차이 값에 의한 타겟 항원(20)의 정량이 가능하다. 동시에, 프레임워크(FR)로부터 분리된 스위칭 결합제(130)의 양을 이용한 타겟 항원(20)의 정량이 가능하여, 타겟 항원(20)의 분석을 2 트랙(2 track)으로 수행할 수 있어, 분석의 신속도, 정확도 및 신뢰도를 향상시킬 수 있는 이점이 있다.
또한, 정량 분석을 위한 측정간 재현성을 산출하기 위해, 서열번호 3의 결합제(L1)를 이용하여, HBsAg 농도 3.4 μg/ml에서 8번 반복실험을 한 후, HBsAg의 농도가 0인 baseline에서의 값으로 노멀라이즈 하였다. 이때, 해당 농도에서의 측정값은 3.1 ± 9.3% (n=8)로 산출되었다. 상기 결과는 분석물인 항원(20) HBsAg가 포함된 시료를 goat IgG 항체에 처리하여 세척 없이 one-step 임뮤노어세이에 의한 분석물의 측정이 높은 재현성을 보인다는 점을 나타낸다.
도 9a 및 9b는 도 4b의 분석 방법에 따른 타겟 항원(20)의 분석 결과를 나타낸 분석 그래프이다.
도 9a 및 도 9b를 참조하면, 일 실시예에서, 도 9a는 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1), 도 9b는 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)를 이용한 비드 기반 항체 결합 원스텝 임뮤노어세이 결과를 보여준다.
일 실시예에서, 전처리 단계(S100')에서 항-인플루엔자 B 항체(10)를 비드에 고정시키고, 항원 처리 하단계(S200')에서 피분석물은 10 ng/Ml 농도의 CRP를 포함하거나, 10 ng/Ml 농도의 인플루엔자 B를 포함할 수 있다. 좌측 그래프(A)는 서로 다른 타겟 항원(200)들 즉, CRP, 인플루엔자 B를 포함하는 피분석물들의 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 분리된 스위칭 결합제(130)를 정량한 그래프이고, 우측 그래프(B)는 프레임워크 영역(FR, FR')에 결합된 잔량의 스위칭 결합제(120)를 정량한 그래프이다. 전술한 물질들은 비제한적 예시로서, 본 발명을 제한하지 않는다.
일 실시예에서, 피분석물이 인플루엔자 B를 포함하는 경우에 비하여 피분석물이 CRP를 포함하는 경우, 분리된 스위칭 결합제(130)의 양이 작고, 잔량의 스위칭 결합제(120)의 양이 많은 것을 알 수 있다. 이는 피분석물이 인플루엔자 B인 경우, 상기 인플루엔자 B가 항-인플루엔자 B 항체(10)와 반응하여 스위칭 결합제(100)가 항체(10)의 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 해리되기 때문이다. 반면에, 피분석물이 CRP를 포함하는 경우에는 상기 CRP가 항-인플루엔자 B와 특이적으로 결합하지 않아 스위칭 결합제(100)가 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 해리되지 않는다.
일 실시예에서, 피분석물 내의 타겟 항원(20)의 농도가 높을수록 분리된 스위칭 결합제(130)의 양이 많을 수 있다. 또한, 피분석물 내의 타겟 항원(20)의 농도가 높을수록 잔량의 스위칭 결합제(120)의 양은 적을 수 있다. 도 9a 및 도 9b를 참조하면, 피분석물들이 동일하게 타겟 항원(20)으로 인플루엔자 B를 포함하는 경우에, 상기 인플루엔자 B의 농도가 높을수록 분리된 스위칭 결합제(130)의 양이 많은 것을 볼 수 있다. 예를 들면, 상기 피분석물에 포함된 상기 인플루엔자 B의 농도가 100 ng/mL인 경우에, 농도가 10 ng/mL인 경우에 비하여 분리된 스위칭 결합제(130)의 양이 많을 수 있다. 이는 타겟 항원(20)의 농도가 높을수록 많은 양의 타겟 항원(20)들이 항체(10)와 특이적으로 반응하여, 더 많은 양의 스위칭 결합제(100)가 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 해리되기 때문이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 분리된 스위칭 결합제(130)의 양 및/또는 잔량의 스위칭 결합제(120)의 양을 측정함으로써, 피분석물 내에 포함된 타겟 항원(20)을 식별할 수 있을 뿐만 아니라, 정량 또는 농도 측정까지 가능한 분석 방법이 제공될 수 있다. 이를 통해, 도 9a에서 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)을 이용한 비드 기반의 원스텝 임뮤노어세이가 가능하다는 점과, 도 9b에서 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)을 이용한 비드 기반의 원스텝 임뮤노어세이가 가능하다는 점에 대해 확인할 수 있어, 고체 지지체뿐만 아니라, 비드를 이용해 정량적인 임뮤노어세이가 가능하다. 다만, 이는 비제한적인 것으로, 서열번호 1 및 서열번호 3의 아미노산 서열에 한정되는 것은 아니다.
도 10a 내지 도 10d는 본 발명의 일 실시예 중 도 4c의 분석 방법에 따른 타겟 항원(20)의 분석 결과를 나타낸 분석 그래프이다.
도 10a 내지 10d를 참조하면, 스위칭 결합제(100)는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 스위칭 결합제를 이용한 것으로, 도 10a는 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1), 도 10b는 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2), 도 10c는 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1) 및 도 10d는 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)를 이용한 용액 내 항체의 항원 결합 계수를 측정한 결과를 보여준다. 일 실시예에서, 타겟 항원(20)은 HRP일 수 있고, 항체(10)는 항-HRP 항체(10)일 수 있다. 전술한 물질은 예시적인 것으로 본 발명을 한정하지 않는다.
일 실시예에서, 피분석물 내의 타겟 항원(20)의 농도를 증가시키면서 분리된 스위칭 결합제(130)의 양을 측정하고, 분리된 스위칭 결합제(130)의 양을 이용하여 항체(10)의 항원 결합 계수(Kd)를 계산하였다. 상기 항원 결합 계수(Kd)는 타겟 항원(20)인 HRP의 양이 증가할수록 용액의 형광량이 증가하였다. 일 실시예에서, 상기 스위칭 결합제(100)의 상기 항원 결합 계수(Kd)는 1.2 ~ 2.9 x 10-6 M 일 수 있다.
바람직하게는, 도 10a에 도시된 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1), 도 10b에 도시된 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2) 및 도 10d에 도시된 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)의 항원 결합 계수(Kd)는 각각 8.9 ⅹ 10-7 M, 1.2 x 10-6 M 및 2.9 x 10-6 M의 값을 가질 수 있다. 이를 통해, 고체 지지체에 항체(10)를 결합한 후 항원 결합 계수(Kd)를 측정하는 도 4a의 방법과 달리, 본 발명에서 제공하는 키트가 용액 내에서 항체가 항원을 결합할 때의 항원 결합 계수(Kd)를 측정하는 방법을 제공하여, 항체의 항원 결합 부위에 가역적으로 결합하는 스위칭 결합제(100)을 이용하여 용액 내 항체의 항원 결합 계수(Kd)를 측정할 수 있다.
이상에서 설명한 본 발명이 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러가지 치환, 변형 및 변경이 가능하다는 것은, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
10: 항체
20: 타겟 항원
30: 지지체
40: 단백질-A 컬럼
HA, HB, LA, LB, H1, H2, L1, L2, 100, 100a, 100b, 100c: 스위칭 결합제
HAR: HAR 부위
HBR: HBR 부위
LAR: LAR 부위
LBR: LBR 부위
110: 결합된 스위칭 결합제
120: 잔량의 스위칭 결합제
130: 분리된 스위칭 결합제
200: 표지 물질
FR: 프레임워크 영역
CDR: 상보성 결정 영역
VH: 중 쇄
VL: 경 쇄
AB1, AB1': 제 1 항체 결합부
AB2, AB2': 제 2 항체 결합부
<110> Optolane <120> Switching bonding agent, method of fabricating the same, and pharmaceutical composition, assay kit, and method of analyzing antigen and antibody using the same <130> PN01386 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 1 <400> 1 Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu 1 5 10 15 Trp Ile Gly Glu 20 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 2 <400> 2 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Pro Thr Gly Thr Gly Ile Tyr Phe Asp 1 5 10 15 Val Trp Gly Lys 20 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 3 <400> 3 Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Pro Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu 1 5 10 15 Leu Ile Tyr Lys 20 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 4 <400> 4 Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr Lys 1 5 10

Claims (38)

  1. 항체의 항원 결합 부위를 구성하는 중 쇄의 프레임워크 영역으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며,
    상기 아미노산 서열은 상기 중 쇄와 함께 상기 항원 결합 부위를 구성하는 경 쇄의 프레임워크 영역에 가역적으로 결합하는 제 1 항체 결합부를 포함하는 스위칭 결합제.
  2. 항체의 항원 결합 부위를 구성하는 경 쇄의 프레임워크 영역으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며,
    상기 아미노산 서열은 상기 경 쇄와 함께 상기 항원 결합 부위를 구성하는 중 쇄의 프레임워크 영역에 가역적으로 결합하는 제 2 항체 결합부를 포함하는 스위칭 결합제.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 아미노산 서열은 상기 중 쇄 또는 상기 경 쇄의 프레임워크 영역에 인접한 상보성 결정 영역에도 가역적으로 결합하는 스위칭 결합제.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 스위칭 결합제는 펩타이드, 단백질, 압타머, 나노바디(nanobody), 파지 디스플레이(phage display), 이스트 디스플레이(yeast display), 및 항체로 구성된 군에서 선택되는 스위칭 결합제.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 스위칭 결합제의 아미노산 일부가 무기물로 치환된 스위칭 결합제.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 1 항체 결합부는 -Y-, -I-, -W- 및 -Q- 중 적어도 어느 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 스위칭 결합제.
  7. 제 2 항에 있어서,
    상기 제 2 항체 결합부는 -Y-, -Q-, -P-, -L- 및 -F-중 적어도 어느 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 스위칭 결합제.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 스위칭 결합제는
    서열번호 1: S-Y-W-I-H-W-V-K-Q-R-P-G-Q-G-L-E-W-I-G-E
    서열번호 2: V-Y-Y-C-A-R-E-P-T-G-T-G-I-Y-F-D-V-W-G-K
    서열번호 3: T-Y-L-E-W-Y-P-Q-K-P-G-Q-S-P-K-L-L-I-Y-K
    서열번호 4: V-Y-Y-C-F-Q-G-S-H-V-P-F-T-K의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 스위칭 결합제.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 1 항체 결합부는 상기 경 쇄의 프레임워크 영역과 정전기 상호작용, 수소 결합, 반데르발스 힘, 소수성 상호작용 및 이들의 조합 중 적어도 하나 이상에 의해 결합하는 아미노산 잔기를 포함하는 스위칭 결합제.
  10. 제 2 항에 있어서,
    상기 제 2 항체 결합부는 상기 중 쇄의 프레임워크 영역과 정전기 상호작용, 수소 결합, 반데르발스 힘, 소수성 상호작용 및 이들의 조합 중 적어도 하나 이상에 의해 결합하는 아미노산 잔기를 포함하는 스위칭 결합제.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 제 1 항체 결합부의 아미노산 변조에 의해 항체 결합 부위의 결합력의 조절이 가능한 스위칭 결합제.
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 제 2 항체 결합부의 아미노산 변조에 의해 항체 결합 부위의 결합력의 조절이 가능한 스위칭 결합제.
  13. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
    상기 수소 결합에 의해, 상기 스위칭 결합제와 상기 프레임워크 영역 사이에 사이드 체인(side chain) 기능기 결합 또는 펩타이드 결합의 극성 부위와 결합이 이루어지는 스위칭 결합제.
  14. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 스위칭 결합제가 상기 항체의 상기 항원 결합 부위에 결합된 경우,
    상기 항체와 특이적으로 반응하는 타겟 항원이 상기 항체에 결합함으로써, 상기 스위칭 결합제는 상기 항체로부터 분리되는 스위칭 결합제.
  15. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 스위칭 결합제의 상기 항체 결합부는 상기 중 쇄 또는 상기 경 쇄의 상기 항원 결합 부위에 4 Å 내지 8 Å 범위 내로 결합된 스위칭 결합제.
  16. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 스위칭 결합제는 자연적 또는 인위적인 표지 물질로 표지된 스위칭 결합제.
  17. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 스위칭 결합제는 인간 항체, 비인간 항체, 인간화된 비인간 항체 또는 이들의 조합과 결합하며,
    상기 스위칭 결합제가 상기 항체에 결합된 상태에서 상기 항체와 상기 타겟 항원의 결합이 가능한 스위칭 결합제.
  18. 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 스위칭 결합제를 포함하는 질병 스크리닝, 진단, 예방 또는 치료 통합의 약학 조성물.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 스위칭 결합제는 펩타이드, 단백질, 압타머 및 나노바디(nanobody), 파지 디스플레이(phage display), 이스트 디스플레이(yeast display), 및 항체로 구성된 군에서 선택되는 질병 스크리닝, 진단, 예방 또는 치료 통합의 약학 조성물.
  20. 제 18 항에 있어서,
    상기 스위칭 결합제는
    서열번호 1: S-Y-W-I-H-W-V-K-Q-R-P-G-Q-G-L-E-W-I-G-E
    서열번호 2: V-Y-Y-C-A-R-E-P-T-G-T-G-I-Y-F-D-V-W-G-K
    서열번호 3: T-Y-L-E-W-Y-P-Q-K-P-G-Q-S-P-K-L-L-I-Y-K
    서열번호 4: V-Y-Y-C-F-Q-G-S-H-V-P-F-T-K의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 질병 스크리닝, 진단, 예방 또는 치료 통합의 약학 조성물.
  21. 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 스위칭 결합제를 포함하고,
    상기 스위칭 결합제는 자연적 또는 인위적인 표지 물질로 표지되며,
    상기 스위칭 결합제가 프레임워크 영역에 결합 및 분리되는 양을 측정하여 항체에 대한 항원의 결합력을 측정하는 검사 키트.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 스위칭 결합제는 펩타이드, 단백질, 압타머 및 나노바디(nanobody), 파지 디스플레이(phage display), 이스트 디스플레이(yeast display), 및 항체로 구성된 군에서 선택되는 검사 키트.
  23. 제 21 항에 있어서,
    상기 결합력은 항체의 항원 결합 계수(Kd)의 산출을 통해 측정되는 검사 키트.
  24. 제 21 항에 있어서,
    상기 항원 결합 계수(Kd)는 0.7 x 10-6 M 내지 3.4 x 10-6 M의 범위를 포함하는 검사 키트.
  25. 제 21 항에 있어서,
    상기 검사 키트는 상기 항체가 고정되지 않은 용액 내에서 상기 항체가 항원과 결합할 때의 항원 결합 계수(Kd)를 측정하는 검사 키트.
  26. 제 1 항 또는 제 2항에 기재된 스위칭 결합제를 포함하고,
    상기 스위칭 결합제는 자연적 또는 인위적인 표지 물질로 표지되며,
    상기 스위칭 결합제가 프레임워크 영역에 결합 및 분리되는 양을 측정 항체 및 타겟 항원을 식별 또는 정량하는 검사 키트.
  27. 제 26 항에 있어서,
    상기 검사 키트는 면역 분석용(immunoassay) 키트로서,
    상기 면역분석용 키트는 루미넥스 분석, 단백질 마이크로 어레이 분석, 엘리사 (ELISA) 분석, 면역-PCR 분석 (immune-PCR), 캡처-ELISA 분석, ELISPOT 분석, 방사선 면역 분석(RIA), 측방 흐름 면역 분석(lateral flow immunoassay: LFIA), 통과흐름 면역 분석(flow-through immunoassay: FTIA), 단백질 마이크로플루이딕(microfluidic) 면역 분석, 단백질 마크로플루이딕(microfluidic) 면역 분석, 단백질 모세관 전기영동 분석(capillary electrophoresis: CE), 전기 화학 바이오 센서, 방사 면역 침전 분석, 면역 침전 분석, 면역조직화학염색 분석, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산 분석, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역 전기 영동 분석, 조직면역 염색 분석, 보체 고정 분석, FACS 분석, 단백질 칩 분석, 면역 형광 염색 분석 및 면역 친화성 정제 분석 키트인 검사 키트.
  28. 항체의 항원 결합 부위를 구성하는 프레임워크 영역으로부터 스위칭 결합제의 아미노산 서열을 선택하는 단계;
    타겟 항원과 특이적으로 결합하는 항체에 상기 스위칭 결합제를 제공하여 상기 항체의 프레임워크 영역(framework region: FR)의 적어도 일부분에 가역적으로 결합시키는 전처리 단계;
    상기 전처리 단계의 결과물 내에 상기 타겟 항원을 포함하는지 여부의 판단이 필요한 피분석물을 제공하는 단계; 및
    상기 프레임워크 영역에 결합된 잔량의 스위칭 결합제 또는 상기 프레임워크 영역으로부터 분리된 스위칭 결합제 중 적어도 어느 하나를 정량하여 상기 피분석물 내에 상기 타겟 항원을 식별 또는 정량 분석하는 분석 단계를 포함하는 스위칭 결합제를 이용한 분석 방법.
  29. 제 28 항에 있어서,
    상기 스위칭 결합제는 펩타이드, 단백질, 압타머, 나노바디(nanobody), 파지 디스플레이(phage display), 이스트 디스플레이(yeast display) 및 항체로 구성된 군에서 선택되는 스위칭 결합제를 이용한 분석 방법.
  30. 제 28 항에 있어서,
    상기 항체는 기판, 비드(bead), 섬유, 고분자 구조체 또는 이들의 조합인 지지체에 고정된 분석 방법.
  31. 제 28 항에 있어서,
    상기 항체는 고정되지 않고, 용액에 용해된 상태인 분석 방법.
  32. 제 28 항에 있어서,
    상기 전처리 단계는,
    상기 항체에 상기 스위칭 결합제를 제공하여 상기 항체와 상기 스위칭 결합제의 제 1 결합체 및 상기 항체와 결합되지 않은 스위칭 결합제를 포함하는 혼합 용액을 얻는 단계; 및
    상기 혼합 용액으로부터 상기 항체와 상기 결합되지 않은 스위칭 결합제를 제거하는 단계를 포함하는 스위칭 결합제를 이용한 분석 방법.
  33. 제 28 항에 있어서,
    상기 스위칭 결합제는 자연적 또는 인위적 표지 물질로 표지되고,
    상기 분석 단계에서,
    상기 타겟 항원의 분석은 상기 표지 반응을 측정하여 이루어지는 스위칭 결합제를 이용한 분석 방법.
  34. 제 28 항에 있어서,
    상기 분석 단계는,
    상기 항체로부터 분리된 스위칭 결합제와 상기 항체와 상기 타겟 항원의 제 2 결합체를 분리하는 단계; 및
    상기 분리된 스위칭 결합제를 식별 또는 정량하는 단계를 더 포함하는 스위칭 결합제를 이용한 분석 방법.
  35. 항체의 프레임워크 영역(framework region: FR)에 가역적으로 특이적 결합하고, 상기 항체와 특이적 반응하는 타겟 항원이 결합되는 경우, 상기 프레임워크 영역으로부터 분리되는 스위칭 결합제의 제조 방법으로서,
    상기 항체의 중 쇄 및 경 쇄의 상기 프레임워크 영역이 서로 자가 결합하는 아미노산 서열 확인하는 단계;
    상기 아미노산 서열의 소수성 지수를 얻는 단계; 및
    상기 소수성 지수를 비교하여, 상기 중 쇄 및 상기 경 쇄의 항원 결합 부위를 구성하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열간 동일한 성질을 가지는 부분의 상기 아미노산 서열을 포함하는 스위칭 결합제를 선택하는 단계를 포함하는 스위칭 결합제 제조 방법.
  36. 제 32 항에 있어서,
    상기 아미노산 서열은 상기 프레임워크 영역에 인접한 상보성 결정 영역을 포함하는 스위칭 결합제 제조 방법.
  37. 제 32 항에 있어서,
    상기 스위칭 결합제는 펩타이드, 압타머, 단백질, 나노바디(nanobody), 파지 디스플레이(phage display), 이스트 디스플레이(yeast display) 및 항체로부터 구성된 군에서 선택되는 스위칭 결합제 제조 방법.
  38. 제 32 항에 있어서,
    상기 아미노산 서열은 정전기 상호작용, 수소 결합, 반데르발스 힘, 소수성 상호작용 및 이들의 조합 중 적어도 하나 이상에 의해 결합하는 스위칭 결합제 제조 방법.
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