JP5611831B2 - リウマチ性関節炎自己抗体との免疫反応性合成ペプチド - Google Patents

Description

（発明の要約）
本発明の実施形態は、リウマチ性関節炎に罹患しているか又はその危険性がある患者において検出される自己抗体により、具体的には自己免疫抗体により優先的に認識され、発症前の患者ならびにリウマチ性関節炎の症状を示す患者における該自己抗体の検出において増強された感度および特異性をもたらす、合成ペプチドに関する。

（好ましい実施形態の説明）
リウマチ性関節炎は、全身性の自己免疫疾患であり、慢性炎症性リウマチの中で最も頻度が高いと考えられている。罹患した患者の血清は自己抗体を含み、その割合はこの疾患に関するマーカーとなる特異性があり、早期であってもその診断を可能にする。これらの抗体により認識される抗原および従来の免疫学的な診断技術に用いることができる精製された抗原調製物を見出し特定する研究において、幅広い範囲の方法が公開されている。

分析物−抗体タンパク質相互作用は、シグナル伝達に関与する分子事象の制御において鍵となる重要な役割を果たす。これらのタンパク質−タンパク質接触面での比較的大きな表面プロフィールは、小分子の相互作用部位の設計および接近性を空間的に妨げる。タンパク質−タンパク質接触面を積極的に調節するエネルギーに満ちた残基（energetic residue）は、タンパク質表面の比較的小さな領域を用いる。表面エピトープを模倣する正しく選ばれたプロテイン・エピトープ・ミメティック（Protein Epitope Mimetic：ＰＥＭ）分子は、比較的小さな合成分子を三次元巨大分子の認識部位に空間的に適合させる際に、タンパク質全体の生物学的活性を模倣する手段を提供する。ペプチド模倣体設計は、ペプチドの三次元構造およびそれらが形成する連結した模倣複合体を用いることで開始し、残基のマトリックス構造の形式および配置に対する洞察を適用する。これは有機化学の一領域を提示し、そこでは、マトリックス配置および結合機序が、生物学的に活性な有機分子マトリックスの設計および合成を確実なものにする。

従って、自己抗体に、特にリウマチ性関節炎に罹患している患者において検出される自己免疫抗体に高感度で結合し、発症前の患者ならびにリウマチ性関節炎症状を示す患者におけるこれらの自己抗体の検出において増強された感度および特異性をもたらす、合成ペプチドの必要性が存在する。リウマチ性関節炎特異的自己抗体により認識される、そのようなペプチドが必要である。より正確な自己抗体濃度の定量的な相対測定のための増強された感度および特異性を提供するために、新規な複数のデザイナーペプチド（designer peptides）による抗シトルリン化リウマチ性関節炎自己抗体の検出に関するさらなる必要性が存在する。

本発明の実施形態は、合成ペプチド模倣エピトープを含む。選りすぐりの見込みのある抗原決定基を、これらの決定基を含むペプチドマトリックス中にアセンブルすることができる；ペプチドマトリックスからの直線配列中の連続するアミノ酸配列（連続エピトープ）および折り畳まれたタンパク質においては近接しているが折り畳まれていない場合には離れているアミノ酸（不連続エピトープ）の感度および特異性が、抗原の免疫優性エピトープを模倣するために、設計される。特定の実施形態において、エピトープは、免疫応答を惹起することができる抗原表面に位置する領域でありうる。

本発明の合成ペプチドはまた、一組のシトルリン残基をペプチドの選択された位置に含む独特の配列を有しており、シトルリン残基の間に最適な数の残基を有していてもよい。驚いたことに、選択されたアミノ酸残基のアセンブリおよび配列は、最適な電荷および疎水性を与え、自己免疫抗体との反応性を増強する。さらなる実施形態において、個々のペプチドは、シリーズで単量体、二量体、三量体および多量体のように環化されてもよい。特定の実施形態において、設計されたペプチド配列の多重体（multiplex）は、リウマチ性関節炎の診断に適当でありうる。

ペプチドを環化する方法は、当分野で周知である。例えば、そのような方法は、Cline DJ., Thorpe C, Schneider J.P. 「General method for facile intramolecular disulfide formation in synthetic peptides」、Analytical Biochemistry 335:168-170 (2004)に記載されており、これは出典明示により本明細書の一部とされる。

二量体および多量体を生成する方法もまた、当分野で周知である。例えば、そのような方法は、Marini M.A., Moore G.L., Christensen S.M., FishmanR.M., Jessee R.G., Medina F., Snell S.M., Zegna,A.I, 「Reexamination of the polymerization of pyridoxylated hemoglobin with glutaraldehyde.」、Biopolymers 29:871-882 (1990)に記載されており、これは出典明示により本明細書の一部とされる。

図１は、配列中のシトルリンの数および具体的な位置ならびにシトルリン残基間の例示的な間隔を示す一連の連結した残基を図示する、本発明の実施形態に関する９個の例示的なペプチド配列の表示である。 図２は、リウマチ性関節炎およびリウマチ性関節炎ではない患者の血清試料における、６個の例示的な本発明の合成ペプチドに関する合成ペプチド自己抗体複合体の存在についてのシグナル強度を示す棒グラフである。 図３は、多重の抗原（multiplex antigen）の希釈系列において検出される、合成ペプチド／抗体複合体の存在に正比例するシグナル強度を示すグラフである。 図４は、リウマチ性関節炎およびリウマチ性関節炎ではない患者の血清試料における合成ペプチド／抗体複合体の存在を示すシグナル強度の比較を示す棒グラフである。 図５は、本発明の例示的なペプチドを図示する表である。

本発明のペプチドは、天然では見出されない一連のシトルリン残基をペプチドの選択された位置に含む独特の配列を有しており、シトルリン残基の間に最適な数の残基も有している。選択されたアミノ酸残基のアセンブリおよび配列は、最適な電荷および疎水性を与え、自己免疫抗体との反応性を増強させる。さらに、各ペプチドは環化されてよい。そのような環化合成ペプチドは、さらにシリーズで単量体、二量体、三量体および多量体のように多量体化されてよい。驚いたことに、設計された合成抗原模倣体ペプチド配列中で間隔をあけてシトルリン残基を組み合わせること、ならびに本発明の実施形態に関する多量体混合物が、リウマチ性関節炎の増強された診断に、非常に適していることがはっきり示された。

これらの合成ペプチドは、以下の一般式を好ましくは有する：

［式中、Ｘ＝シトルリン残基、ａａ＝アミノ酸、ｎ＝０〜８、ｍ≧ｌである］。

本発明の１つの態様に関して、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２および配列番号：３３からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる合成ペプチドが提供される。さらなる実施形態において、該ペプチドは環化されていてもよい。

本発明の他の実施形態に関して、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドを少なくとも１つ含む、リウマチ性関節炎の危険性があるか又は罹患している患者により発現される自己免疫抗体を検出するための組成物が提供される。さらなる実施形態において、この組成物中のペプチドは環化されていてもよい。さらなる実施形態において、ペプチドは、シリーズで単量体、二量体、三量体および多量体のように環化されてよい。

本発明の他の態様に関して、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２および配列番号：３３からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドを少なくとも２個含み、該少なくとも２個のペプチドのうち少なくとも２個が環化されている、組成物が提供される。さらなる実施形態において、ペプチドは、シリーズで単量体、二量体、三量体および多量体のように環化されてよい。

本発明の他の態様に関して、ａ）０個〜８個のアミノ酸残基により隔てられた２個またはそれ以上のシトルリン残基を含む合成ペプチド；ｂ）０個〜８個のアミノ酸残基により隔てられた２個またはそれ以上のシトルリン残基を含むタンパク質から得られたアミノ酸配列を含む合成ペプチド；およびｃ）以下の一般式、

［式中、Ｘ＝シトルリン残基、ａａ＝アミノ酸、ｎ＝０〜８、ｍ≧ｌである］
で示されるシトルリン残基を含むペプチド、からなる群より選択される合成ペプチドが提供される。

本発明のさらなる他の態様に関して、本発明の合成ペプチドを、患者から得られた血漿または血清試料と接触させる工程、ならびに抗体−抗原複合体の存在が自己免疫抗体の存在を示し、その自己免疫抗体の存在が、該患者がリウマチ性関節炎の危険性があるか又は罹患していることを示すこととなる、抗体−抗原複合体の有無を検出する工程を含む、リウマチ性関節炎の危険性があるか又は罹患している患者により発現される自己免疫抗体を検出する方法が提供される。

本発明の他の態様に関して、本発明の合成ペプチド配列を製造する工程；リウマチ性関節炎の診断のための生物学的試料を提供する工程；その生物学的試料を、該生物学的試料中に存在しうるリウマチ性関節炎に特有の自己抗体との抗原／抗体複合体の形成を可能にする条件下で該人工抗原と接触させる工程；および形成されうるいずれかの抗原／抗体複合体を検出する工程を含む、リウマチ性関節炎のマイクロアレイ形式の診断方法が提供される。

本発明の実施形態において、合成ペプチドは、以下の式を有する：

［式中、Ｘ＝シトルリン残基、ａａ＝アミノ酸、ｎ＝０〜８、ｍ≧ｌである］。

上記の式で示される例示的なペプチドは、限定するものではないが、配列番号：１〜配列番号：３３を含む。

図１は、本発明の実施形態に従う９個の例示的なペプチドを示す。各ペプチドは、番号付けされ、文字「Ｘ」で示されるシトルリン残基を有する。一連の連結した残基は、Ｘが配列中の特定の位置で繰返すこと及び互いに隔てられたＸの距離を示す。配列番号：３０、配列番号：１９、配列番号：２２、配列番号：２８および配列番号：８のペプチドはそれぞれ３、０、１−１および２アミノ酸の間隔で隔てられたＸ−Ｘをそれぞれ有しており、多重ペプチド（mutiple peptide）で用いられる場合には約１：１の構成比率で混合し、結果として高い自己抗体シグナルが得られる。

さらなる態様において、本ペプチドは、最適な残基を、例えばこれらのペプチドが環化されるか又は分子間の様式で連結され、その構造の安定性および化学的安定を最大にすることを可能にする内因性のジスルフィド結合を備える残基を、さらに含んでいてよい。環化することには、ペプチドに空間的にバランスのよい位置関係を与えるという追加の利点がある。

本発明の他の実施形態は、約１：１混合の配列番号：３０、配列番号：１９、配列番号：２２および配列番号：２８および配列番号：２３のペプチドを含む、リウマチ性関節炎の自己抗体の最適な抗原結合性を提供するための、組成物である。

これらの合成抗原模倣体ペプチドの設計では、フレキシブルな残基、例えばグリシン、セリンまたはトレオニンをシトルリン残基の近傍に配置し、ペプチドの柔軟性をもたらす小さな残基を含ませるようにする。そのような残基は、グリシンおよびセリンがあり、これらは一本鎖抗体を含み、タンパク質ドメイン間のリンカーとして一般的に用いられる。これらのペプチドは、バランスのとれた電荷を維持するために及び比較的非中性のｐＨを維持するために、可溶性の残基、例えばアルギニン、グルタミンおよびロイシンを含むべきである。驚いたことに、本発明の実施形態の多重の合成抗原性模倣体の抗原をマイクロアレイ・アッセイ形式で用いる場合、これらのペプチドの環化は、捕捉抗原の安定性およびアッセイ物質に固定化されるその能力も改善する。

本発明のさらなる実施形態は、単量体、二量体、三量体および多量体のような合成ペプチドからなる組成物である。このような組成物は、増大する検出効果に良い影響を及ぼしうる。例えば、合成ペプチドは、アミノ酸が以下の１文字コードで示される単量体として組成物中に存在していてよい：ＣＫＤＮＳＤＸＳＴＹＸＷＴＲＣＫ。二量体の例としては、以下がある：ＣＫＤＮＳＤＸＳＴＹＸＷＴＲＣＫ＋ＣＫＤＮＳＤＸＳＴＹＸＷＴＲＣＫ。三量体の例としては、以下がある：ＣＫＤＮＳＤＸＳＴＹＸＷＴＲＣＫ＋ＣＫＤＮＳＤＸＳＴＹＸＷＴＲＣＫ＋ＣＫＤＮＳＤＸＳＴＹＸＷＴＲＣＫ。多量体の例としては、以下がある：［ＣＫＤＮＳＤＸＳＴＹＸＷＴＲＣＫ］＋Ｘｎ。

さらなる態様において、本発明のペプチドは、リウマチ性関節炎の存在または疾病素因について試験される患者の体液試料と接触させる組成物中に含ませることができる。この組成物は、配列番号：１〜配列番号：３３の合成ペプチドを１つまたはそれ以上を含んでいてよい。例えば、この組成物は、約１：１：３：３：３の重量比で、配列番号：１９、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２８および配列番号：３０のアミノ酸配列からなるペプチドを含む。

一般に、本発明の合成ペプチド配列は、約１：３の重量比で、好ましくは約１：１の重量比で組成物中に混合されてよい。

特定の実施形態において、ペプチド配列は、１ミリリッターあたり約１０ミリグラム〜１ミリリッターあたり１ミリグラムの濃度範囲で組成物に、好ましくは１ミリリッターあたり３ミリグラムの濃度で組成物に混合されてよい。

患者からの血漿試料または血清試料を本発明の合成ペプチドを含む混合液と接触させると、その結果得られる抗体／ペプチド複合体は、当分野で既知の方法により検出することができる。例えば、この複合体は、蛍光標識されてよく、その蛍光強度を測定することができる。蛍光のレベルは、リウマチ性関節炎の結果として発現される自己免疫抗体に対する合成ペプチドの結合レベルに正比例するであろう。

本発明の実施形態は、以下の実施例によりさらに説明され、例示されるであろう。

材料および方法
ペプチドは、ペプチドのシステイン残基を酸化させ、分子内ジスルフィド結合を形成させることにより環化した。環化に続いて、ペプチドは、１２時間〜２０時間かけて多量体化を容易にするグルタルアルデヒドを通じて複合体化した。過剰なグルタルアルデヒドを、水素化ホウ素ナトリウムとの反応により取り除いた。次いで、複合体化したペプチドを、膜をベースにした回転ろ過カラムを用いて精製した。その結果得られたペプチドを、分光光度計により定量した。

複合体化ペプチドは、個別に作製されるか又はマイクロアレイ・プリントバッファー（printing buffer）中に一緒に混合した。この結果得られた溶液を、非接触（non-contact）マイクロアレイプリンターを用いてプリントした。その結果得られたマイクロアレイを、プリントしたペプチドを最適化するために順化させ、ブロッキングした。次いで、プリントしたマイクロアレイを、合成抗原模倣体ペプチドの反応性について、特に、抗シトルリン化タンパク質抗体を捕捉するその能力について、マイクロアレイ・アッセイを用いて試験した。

このアッセイにおいては、ゼロ、低レベル、中レベルおよび高レベルの抗シトルリン化タンパク質抗体を含む血清試料を、マイクロタイター形式のマイクロアレイ・プレートの９６穴の反応ウェルのマイクロアレイに付した。３０分間のインキュベーション後に、過剰量の血清試料を取り除いた。次に、そのマイクロアレイを、プレート洗浄器にて洗浄した。続いて、標識化した抗ヒトＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の混合物を加え、インキュベーションを３０分間続けた。別のプレートの洗浄工程に続いて、マイクロアレイのウェルを、次いで、乾燥させ、蛍光をマイクロアレイ読み取り器で読み取った。

幾つかのアッセイでは、シトルリン化ペプチドに加えて、抗−リウマチ因子ＩｇＡ、リウマチ因子ＩｇＧ、リウマチ因子ＩｇＭおよび抗シトルリン化タンパク質抗体を同時に検出するために、リウマチ因子試薬もまた、各ウェルにプリントした。すべてのアッセイに関して、スポット強度を集積するために、場合によりそのシグナルを濃度値に規格化するために、所有のアッセイデータ分析ソフトウェを用いた。

結果
試験した個々のペプチド
６個の合成ペプチドであるペプチド８Ｂ、８、１０Ｂ、１０、１ＩＢおよび１１［配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２９および配列番号：３０］を、上記の方法に従って調製し、結果として得られたマイクロアレイ・プレートを、２４個の試料を用いて試験した。各ペプチドに対する各試料の応答を分析し、プロットした。結果は、試料の識別表示に対してプロットした各試料の蛍光強度値であった。図２で示されるように、太線は閾値を示す。

多量体混合物の定量的な応答を確立するための試験
２個の試料を混合したプールを、表示の希釈係数を用いて希釈し、上記のアッセイを用いて試験した。結果は、試料の識別表示に対してプロットした各試料の蛍光強度値であった。図３に示されるように、最も希釈した試料から最も希釈していない試料につれて、その応答に漸進性の増加が観察された。

ＣＰＰ混合物を用いた正常試料および患者試料パネルを用いた試験
健常ドナーから得られ商業用のＥＬＩＳＡキットにより正常であることが試験された１２個の試料、およびリウマチ性関節炎であるとされる患者から得られ幾つかのＥＬＩＳＡキットを用いて試験することにより確認された１２個の試料を、試験した。結果は、試料の識別表示に対してプロットした各試料の蛍光強度値であった。太線は、最終的な試験結果に対して試料を区別するために用いた閾値を示した。図４で示されるように、１２個の正常試料はすべて正常であると示され、１２個の試料のうち９個が抗シトルリン化タンパク質抗体に関して陽性であることが示された。

本発明は、図で例示されるように本発明の実施形態の詳細に言及して説明されるが、これらの詳細な説明は、添付する特許請求の範囲で請求される発明の範囲を制限することを意図するものではない。

Claims (19)

1. 配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１９、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、および配列番号：３０からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる合成ペプチド。
2. 環化されている、請求項１記載の合成ペプチド。
3. 担体と、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１９、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、およびその組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含む、組成物。
4. 配列番号：１９、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２８および配列番号：３０のアミノ酸配列からなるペプチドを含む、請求項３記載の組成物。
5. ペプチドが、約１：１：３：３：３の重量比を有する、請求項４記載の組成物。
6. 請求項１で規定されるアミノ酸配列のいずれかの二量体を含む、請求項３記載の組成物。
7. 請求項１で規定されるアミノ酸配列のいずれかの三量体を含む、請求項３記載の組成物。
8. 請求項１で規定されるアミノ酸配列のいずれかの多量体を含む、請求項３記載の組成物。
9. ペプチドが、環化されている、請求項３記載の組成物。
10. 配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１９、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、および配列番号：３０からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる少なくとも２個のペプチドを含み、該少なくとも２個のペプチドが環化されている、組成物。
11. リウマチ性関節炎の危険性があるか又は罹患している患者により発現される自己免疫抗体を検出する方法であって、請求項１記載の合成ペプチドを患者からの試料と接触させる工程、および抗体−抗原複合体の存在を検出する工程を含み、抗体−抗原複合体の存在が自己免疫抗体の存在を示すものである、方法。
12. 患者からの試料が、血漿および血清から選択される、請求項１１記載の方法。
13. 合成ペプチドの自己免疫抗体との免役応答を定量化する工程をさらに含む、請求項１１記載の方法。
14. 少なくとも３種の免疫グロブリンが定量化される、請求項１３記載の方法。
15. 少なくとも３種の免疫グロブリンが、免疫グロブリンＩｇＧ、免疫グロブリンＩｇＡおよび免疫グロブリンＩｇＭである、請求項１４記載の方法。
16. 定量化が、酵素免疫吸着測定法の免役化学（ＥＬＩＳＡ）の使用を含む、請求項１４記載の方法。
17. リウマチ性関節炎の危険性があるか又は罹患している患者により発現される自己免疫抗体を検出する方法であって、請求項３記載の組成物を患者からの試料と混合する工程、および抗体−抗原複合体の存在を検出する工程を含み、抗体−抗原複合体の存在が自己免疫抗体の存在を示すものである、方法。
18. 組成物が、配列番号：１９、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２８および配列番号：３０のアミノ酸配列からなるペプチドを含む、請求項１７記載の方法。
19. 患者におけるリウマチ性関節炎の診断のための、請求項３〜１０のいずれか１項記載の組成物。
    

Images