CN101918432A

CN101918432A - 与风湿性关节炎自身抗体发生免疫反应的合成肽

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Publication number: CN101918432A
Application number: CN2008801189988A
Authority: CN
Inventors: P·利; M·凌
Original assignee: SQI Diagnostics Systems Inc
Current assignee: SQI Diagnostics Systems Inc
Priority date: 2007-12-03
Filing date: 2008-12-03
Publication date: 2010-12-15
Anticipated expiration: 2028-12-03
Also published as: EP2229402A1; JP5611831B2; CA2707870C; CA2707870A1; AU2008331381A1; WO2009070875A1; EP2229402A4; US8318440B2; JP2011505390A; EP2229402B1; US20110065134A1; ES2390394T3; CN101918432B; AU2008331381B2

Abstract

本发明的实施方式涉及一种选定的合成肽模拟序列的三维基质，所述的合成肽模拟序列优先被从患有风湿性关节炎的患者中检测到的自身抗体、特别是自身免疫抗体所识别，所述合成肽模拟序列能够提高对症状发生前的患者、表现出风湿性关节炎症状的患者以及确诊为风湿性关节炎阳性的患者中的这些自身抗体进行检测的特异性和敏感性。

Description

与风湿性关节炎自身抗体发生免疫反应的合成肽

发明概述

本发明的具体实施方式与合成肽有关，所述的合成肽优先被从具有风湿性关节炎风险或者患有风湿性关节炎的患者中检测到的自身抗体、特别是自身免疫抗体所识别，所述合成肽能够提高对症状发生前的患者以及表现出风湿性关节炎症状的患者中的这些自身抗体进行检测的特异性和敏感性。

本发明的肽具有独特序列且在天然中没有发现，其包括沿着肽链上选定位点的一系列瓜氨酸残基以及这些瓜氨酸残基间优化数量的残基。所选氨基酸残基的组装和序列赋予最优的电荷和疏水性，以提高与自身免疫抗体的反应性。进一步地，所述各个肽还可被环化。这些环化的合成肽还可以进一步以单体、二聚体、三聚体以及多聚体的形式被多聚化。意想不到的是，设计的合成抗原模拟肽序列中的瓜氨酸残基间距的组合、以及根据本发明实施方式的多聚体混合物被证明非常适用于提高风湿性关节炎的诊断。这些合成肽优选具有下面的通式：

[X(aa)_nX]_m，其中X＝瓜氨酸残基，aa＝具有n＝0-8的氨基酸，m≥1。

根据本发明的一个方面，提供了一种合成肽，其由选自下列的氨基酸序列构成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33。在进一步的实施方式中，这些肽可以被环化。

根据本发明的另一个方面，提供了一种用于检测具有风湿性关节炎风险或者患有风湿性关节炎的患者所表达的自身免疫抗体的组合物，该组合物含有至少一个肽，所述肽由选自下列的氨基酸序列构成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33以及它们的组合。进一步的实施方式中，组合物中的肽可以被环化。进一步的实施方式中，肽可以被环化为单体、二聚体、三聚体和多聚体等一系列形式。

根据本发明的另一个方面，提供了含有至少两个肽的组合物，所述肽含有选自下述组中的一个氨基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33，其中至少两个所述的至少两个肽是环化的。进一步的实施方式中，肽可以被环化为单体、二聚体、三聚体和多聚体等一系列形式。

根据本发明的另一个方面，提供了选自以下组的一种合成肽，包括：a)含有两个或两个以上被0-8个氨基酸残基分隔开的瓜氨酸残基的合成肽；b)含有衍生自含有两个或两个以上被0-8个氨基酸残基分隔开的瓜氨酸残基的蛋白的氨基酸序列的合成肽，以及c)含有下述通式的瓜氨酸残基的肽：

根据本发明的另一个方面，提供了一种检测由具有风湿性关节炎风险或者患有风湿性关节炎的患者表达的自身免疫抗体的方法，该检测方法包括将本发明的合成肽与病人的血浆或血清样品接触并检测抗原-抗体复合物的存在的步骤，其中该复合物的存在表明自身免疫抗体的存在，而其中自身免疫抗体的存在则表明该患者具有风湿性关节炎风险或者患有风湿性关节炎。

根据本发明的另一个方面，提供了一种以微阵列形式诊断风湿性关节炎的方法，该方法包括以下步骤：制备本发明的合成肽序列；提供用于诊断风湿性关节炎的生物样品；在允许与生物样品中可能存在的风湿性关节炎特异性自身抗体形成抗原-抗体复合物的条件下，将所述的生物样品与所述的人工抗原接触；以及检测任何可能形成的抗原-抗体复合物。

附图简述

图1是与本发明实施方式对应的9个阐述一系列缀合残基的示例性肽序列的描述，表明序列中瓜氨酸的数量和特异性位点以及瓜氨酸残基之间的示例性间隔。

图2是表示本发明的6个示例性合成肽在风湿性关节炎和非风湿性关节炎患者血清样品中形成合成肽/自身抗体复合物存在的信号强度柱状图。

图3是表示在一系列梯度稀释的多重抗原中检测时与合成肽/抗体复合物的存在直接成比例的信号强度的图表。

图4是表示风湿性关节炎患者和非风湿性关节炎患者血清样品中合成肽/抗体复合物存在的信号强度比较的柱状图。

图5是描述本发明的示例性肽的表格。

优选实施方式的描述

风湿性关节炎是一种系统性自身免疫疾病，同时也被认为是最为常见的慢性炎症性风湿病。受影响的患者血清中含有自身抗体，其中的一部分特异性地构成该疾病的标识物，从而使得对该疾病即使进行早期诊断也成为可能。已经发表了多种方法在研究中发现并鉴别被这些抗体识别的抗原，以及可用于传统免疫诊断技术的纯化的抗原制剂。

分析物-抗体的蛋白相互作用在信号传导相关的分子事件控制中起到了关键性作用。这些蛋白质-蛋白质界面上较大的表面轮廓使得小分子活性位点的设计和可及性(accessibility)存在空间位阻问题。有效调节蛋白质-蛋白质界面的活性残基使用蛋白质表面上相对小的区域。正确选择模拟表面表位的蛋白表位模拟(protein epitope mimetic，PEM)分子提供了一种在相对较小的、合成的、分子(水平)的、具有空间容纳性的三维大分子识别位点中模拟整个蛋白质活性的方法。肽模拟设计始于肽的三维结构和它们形成的偶联模拟复合物，并需要了解其中残基基质结构的类型和定位。这代表了根据基质构象和结合机理确定设计方案并合成具有生物活性的有机分子基质的有机化学领域。

因此需要能够和自身抗体、特别是从患有风湿性关节炎的患者中检测到的自身免疫抗体以高度敏感性结合的合成肽，其能够提高对症状发生前的患者以及表现出风湿性关节炎症状的患者中的这些自身抗体进行检测的特异性和敏感性。对于这种被风湿性关节炎特异性自身免疫抗体识别的肽存在需求。此外还需要通过新的、多样化设计的肽对于抗-瓜氨酸化风湿性关节炎的自身抗体进行检测，以提供更高的敏感性和特异性用于自身抗体浓度更加准确的定量化相对测量。

本发明的实施方式涉及合成肽模拟表位的合成。一个选择为，有效抗原决定簇可以被集中到包含这些决定簇的肽基质中；在一个线性排列中的毗邻氨基酸序列(连续表位)以及在折叠蛋白中非常近、而在非折叠时遥远的氨基酸(非连续表位)的敏感性和特异性形成了用于模拟免疫显性抗原表位的肽基质。在某些实施方式中，表位可以是能够引起免疫反应的、位于抗原表面的一个集中区域。

本发明的合成肽具有独特序列，其在肽链上特定位点处含有多个瓜氨酸残基，并且也可以在瓜氨酸残基间含有优选数量的残基。令人惊奇的是，对所选氨基酸残基的组合和排序得到了优化的电荷和疏水性，提高了它与自身免疫抗体的反应性。在进一步的实施方式中，所述各肽可以单体、二聚体、三聚体和多聚体的形式发生环化。在某些实施方式中，设计的不同肽序列可以适用于风湿性关节炎的诊断。

环化肽的方法是本领域众所周知的。举例来说，这样的方法在Cline D.J.，Thorpe C.，Schneider J.P.General method for facile intramolecular disulfide formationin synthetic peptides，Analytical Biochemistry，335：168-170(2004)中有所描述，在此整合到本发明中作为参考。

二聚体和多聚体的构建方法也属于本领域所熟知的技术。例如这些方法在Marini M.A.，Moore G.L.，Christensen S.M，Fishman R.M.，Jessee R.G.，Medina F.，Snell S.M.，Zegna，A.I.Reexamination of the polymerization of pyridoxylatedhemoglobin with glutaraldehyde，Biopolymers 29：871-882(1990)中有所描述，在此整合到本发明中作为参考。

本发明的具体实施方式中，合成肽符合下述通式：

符合上述通式的示例性肽包括但不限于SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：33。

图1显示了根据本发明的具体实施方式的9个示例性肽。每个肽都被编号，而且其中的瓜氨酸残基都以字母X标注。一系列缀合的残基显示X在序列中的特定位点重复出现，而且各X之间有一定距离的间隔。肽SEQ ID NO：30、SEQID NO：19、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：8各自的X-X之间的间隔分别是3、0、1-1和2个氨基酸，当它们以约1∶1的比例形式在肽混合物中被使用的时候会产生强自身抗体信号。

在进一步的实施方式中，肽还可以进一步含有可选的残基，例如那些带有固有的二硫键的，其能够使这些肽发生环化，或者以分子间的方式连接从而使结构和化学稳定性最大化。环化还具有为肽提供空间透视的额外优势。

本发明的另一个具体实施方式是一种提供与风湿性关节炎自身抗体发生优化的抗原结合的组合物，该组合物包含以大约1∶1的比例混合的肽SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：23。

这些合成抗原模拟肽设计时确保在瓜氨酸残基的周边插入一些柔性残基，例如甘氨酸、丝氨酸或者苏氨酸，同时包含一些更小的残基以保持肽的柔性。这样的残基包括甘氨酸和丝氨酸，它们常用于包括单链抗体在内的蛋白结构域之间的接头。这些肽应该包括可溶性残基，例如精氨酸、谷氨酰胺和亮氨酸来保持平衡的电荷和保持相对非中性的pH。令人惊奇的是，当本发明实施方式的多重合成抗原模拟抗原用于微阵列检测形式时，肽的环化还改进了这些肽捕获抗原的稳定性和它们固定在测试基质上的性能。

本发明进一步具体实施方式是以单体、二聚体、三聚体和多聚体形式存在的合成肽的组合物。这些组合物有利于提高检测效率。例如组合物中可以含有按照下列用氨基酸单字符表示的单体的合成肽：CKDNSDXSTYXWTRCK。二聚体的例子如下：CKDNSDXSTYXWTRCK+CKDNSDXSTYXWTRCK。三聚体的例子如下：CKDNSDXSTYXWTRCK+CKDNSDXSTYXWTRCK+CKDNSDXSTYXWTRCK。多聚体的例子如下：[CKDNSDXSTYXWTRCK]+Xn。

在进一步的实施方式，本发明的肽可作为组合物的组分与病人的液体样品接触来检测病人是否患有风湿性关节炎或者有患病倾向。组合物可以包括SEQID NO：1至SEQ ID NO：33中一种或以上的合成肽。例如组合物包含按照重量比大约1∶1∶3∶3∶3比例混合的SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：30。

总的来说，本发明的合成肽序列在组合物中都可以按照重量比大约1-3，优选重量比大约1-1的比例进行混合。

在某些具体实施方式中，肽序列在组合物中的浓度可以是大约10mg/ml至大约1μg/ml，优选浓度约为3mg/ml。

一旦来自病人的血浆或者血清样品与含有本发明合成肽的混合物接触，其形成的抗体/肽复合物就能够按照本领域公知的方法检测到。举例来说，复合物可以被荧光标记，然后测量荧光的强度。荧光水平将被直接按比例换算成结合到由风湿性关节炎引起的自身免疫抗体上的合成肽的水平。

本发明的具体实施方式可以进一步通过下列实施例加以解释和例证。

材料和方法

通过氧化肽链中的半胱氨酸残基形成分子内二硫键环化肽。环化后，将肽通过戊二醛促进的多聚化处理12-20小时进行缀合。然后通过与硼氢化钠的反应除去多余的戊二醛。然后将缀合的肽通过膜旋转过滤柱加以纯化。最后以分光光度法对纯化后的肽定量。

缀合肽既可以单独制备，也可以混合在微阵列的点样缓冲液中。得到的溶液通过非接触性微阵列点样器点样。产生的微阵列通过改变条件来优化点样的肽并进行封闭。然后检测点样后的微阵列对合成抗原模拟肽的反应性，特别是它们用微阵列检测方式捕获抗-瓜氨酸化蛋白抗体的能力。

测试中，将不含或者含有低、中、高含量的抗瓜氨酸化蛋白抗体的血清样品上样到微阵列上并加入到微量滴定样式的每个微阵列板的96个反应孔中。温育30分钟后，去除过多的血清样品，在洗板器上洗涤微阵列。随后，加入带有标记的抗人IgA、IgG和IgM抗体并继续温育30分钟。再进行一次洗板过程后干燥微阵列孔，并用微阵列读取器进行荧光读数。

在某些测试中，为了同时检测抗风湿因子IgA、风湿因子IgG、风湿因子IgM和抗瓜氨酸化蛋白抗体，除瓜氨酸化的肽外，每个孔里也会对风湿因子试剂进行点样。对于所有检测，使用专用测试数据分析软件整合每个点的强度，并且任选地，将信号标准化转换为浓度值。

结果

检测的单个肽

按照上述方法准备六个合成肽，肽8B、8、10B、10、11B和11[SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29和SEQ IDNO：30]，再使用24个样品对得到的微阵列板进行检测。将每个样品对于各个肽的响应进行分析并进行标绘。结果得到每个样品的荧光强度值相对于各样品的标绘(图)。如图2所示，粗线表明切分阈值。

建立多聚体混合物定量响应的测试

由两个样品形成的混合池(mixed pool)用标注的稀释因子进行稀释，并用上述分析方法进行检测。结果得到每个样品的荧光强度值相对于各样品的标绘(图)。观察到从最大稀释度的样品到最小稀释度的样品的响应的累进增强，如图3所示。

用CCP混合物对正常和患者样品小组的检测

将通过商业化ELISA试剂盒检测正常的12个来自于健康志愿者的样品和用若干个ELISA试剂盒检测确认的12个已知的风湿性关节炎患者的样品用于检测。结果得到每个样品的荧光强度值相对于各样品的标绘(图)。粗线表明用于区别样品进入最终检测结果的切分阈值。如图4所示，12个正常样品的检测结果都被发现为正常，12个样品中的9个显示抗瓜氨酸化蛋白抗体阳性。

虽然参考了如图表所示的本发明实施方式的细节对本发明进行了描述，但是这些细节并不意味着对如附加权利要求所述的本发明的范围进行限制。

Claims

1.一种合成肽，其由选自下列的氨基酸序列构成：SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33。

2.如权利要求1所述的合成肽，其中所述肽是环化的。

3.一种组合物，包括载体和由选自下列的氨基酸序列构成的肽：SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33以及它们的组合。

4.如权利要求3所述的组合物，其中该组合物包括由下述氨基酸序列构成的肽：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：30。

5.如权利要求4所述的组合物，其中肽具有约为1∶1∶3∶3∶3的重量比。

6.如权利要求3所述的组合物，其中组合物包括如权利要求1中定义的任何氨基酸序列的二聚体。

7.如权利要求3所述的组合物，其中组合物包括如权利要求1中定义的任何氨基酸序列的三聚体。

8.如权利要求3所述的组合物，其中组合物包括如权利要求1中定义的任何氨基酸序列的多聚体。

9.如权利要求3所述的组合物，其中所述肽是环化的。

10.一种组合物，包括由选自下列的氨基酸序列构成的至少两个肽：SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33，其中所述的至少两个肽是环化的。

11.一种检测具有风湿性关节炎风险或患有风湿性关节炎的患者表达的自身免疫抗体的方法，包括以下步骤：将权利要求1所述合成肽与来自于患者的样品接触，检测抗体-抗原复合物的存在，其中所述抗体-抗原复合物的存在表明自身免疫抗体的存在。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述抗原-抗体复合物的存在表明所述患者具有风湿性关节炎风险或患有风湿性关节炎。

13.如权利要求11所述的方法，其中所述来自于患者的样品选自血浆和血清。

14.如权利要求11所述的方法，进一步包括对具有自身免疫抗体的合成肽的免疫反应定量的步骤。

15.如权利要求14所述的方法，其中对至少三种免疫球蛋白定量。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述的至少三种免疫球蛋白是免疫球蛋白IgG、免疫球蛋白IgA和免疫球蛋白IgM。

17.如权利要求15所述的方法，其中定量包括使用酶联免疫吸附测定免疫化学(ELISA)。

18.一种检测具有风湿性关节炎风险或患有风湿性关节炎的患者表达的自身免疫抗体的方法，包括以下步骤：将权利要求3所述的组合物与来自于患者的样品进行混合，检测抗体-抗原复合物的存在，其中该抗体-抗原复合物的存在表明自身免疫抗体的存在。

19.根据权利要求18的方法，其中组合物包括由下列氨基酸序列构成的肽：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：28和SEQ IDNO：30。

20.权利要求1的合成肽用于诊断患者风湿性关节炎的用途。