CN107056891B

CN107056891B - 一组用于制备系统性红斑狼疮诊断产品的多肽及其应用

Info

Publication number: CN107056891B
Application number: CN201710256996.6A
Authority: CN
Inventors: 林金飞; 陈涛; 张召; 曾玲; 陈林
Original assignee: Guangdong Longsee Medical Technology Co ltd
Current assignee: Guangdong Longsee Medical Technology Co ltd
Priority date: 2017-04-19
Filing date: 2017-04-19
Publication date: 2021-03-09
Anticipated expiration: 2037-04-19
Also published as: CN107056891A

Abstract

本发明公开了一组用于制备系统性红斑狼疮诊断产品的多肽及其应用。本发明的一组用于制备系统性红斑狼疮诊断产品的多肽，包含14条特异性的多肽表位，将其与固相载体连接形成芯片，以血液样本是否对所述14条多肽中的至少5条有响应，来判定是否为候选SLE样本；本发明的该组多肽、芯片、试剂盒可对人或除人以外的动物的血液样本进行快速、准确的分析判断，结果准确可靠，灵敏度可高达93.9％，准确性达91.7％，显著优于现有技术，并且特异性测试表明能显著区分于其他两种自身免疫性疾病(类风湿关节炎与皮肌炎)，可替代传统繁琐的血清学诊断方法。

Description

一组用于制备系统性红斑狼疮诊断产品的多肽及其应用

技术领域

本发明涉及免疫检测技术，更具体地，涉及一组用于制备系统性红斑狼疮诊断产品的多肽及其应用。

背景技术

系统性红斑狼疮(Systemic Lupus erythrematodes，SLE)是一种多因素参与的可累及全身多系统、多器官的自身免疫性疾病，伴有多种免疫学异常，严重时可以引起肾功能衰竭、感染、中枢神经系统损伤而导致死亡。如果出现多系统的损害，诊断并不困难，但此时大多已是疾病的中晚期，患者已有重要器官的受累，预后较差。在SLE的早期可能仅表现为一个或两个系统受累，容易误诊或漏诊，因此，SLE的早期诊断对改善其预后、防止重要器官受累尤为重要。

目前，临床开展的SLE相关自身抗体常规检测项目主要有抗核抗体、抗dsDNA抗体、抗ENA抗体、抗磷脂抗体等，对于临床疑似SLE的病人应进行自身抗体检测，由于特异性和灵敏度不高，现有SLE检测方法还不存在较理想的血清学检测指标。大量自身抗体的出现是自身免疫性疾病的重要特征之一，但由于其发病机制尚不明确，难以直接利用自身抗原检测抗体。

抗原表位(epitope)是抗原分子中识别、结合抗体的基础，因此是检测抗体的实际有效组分，以抗原表位肽或其模拟肽(mimotope)作为诊断工具有以下几个优势：1)可以提高诊断的灵敏度和特异性，避免了生物大分子易产生的非特异性结合；2)扩大疾病诊断的范围，对于研究较少或难以体外应用的自身抗原如核酸抗原、多糖抗原、脂类抗原，以模拟肽作为天然抗原的替代物进行诊断，也可以获得与天然抗原表位一致的结果；3)多肽制备、应用的成本低、易于质控。因此，寻找一种敏感性强、特异性高而又简便易行的血清学检测方法，应用于SLE的辅助诊断及SLE治疗药物的疗效评价，对SLE的早期诊断及治疗具有重要意义。

现有技术中有利用9条多肽表位制备蛋白芯片，其灵敏度达86.4％，准确率达89％。然而SLE疾病对多种抗体都有免疫学反应，而且多肽表位对于其他自身免疫疾病可能存在明显的明显交叉反应，从而严重影响检测结果的准确度。而且随着检测多肽表位数量的增加，需要克服交叉反应的难度越大；因此，制备出特异性好，交叉反应小，准确率高的SLE检测蛋白芯片是需要克服许多难点。

发明内容

本发明的目的在于提供一组用于制备系统性红斑狼疮诊断产品的多肽及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

一组用于制备系统性红斑狼疮诊断产品的多肽，包括14条多肽，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1～14所示。

一种用于制备系统性红斑狼疮诊断产品的芯片，其包括固相载体，固相载体直接或间接独立固定有权利要求1所述的多肽。

作为上述芯片的优选，固相载体为氨基化修饰的玻片。

一种诊断系统性红斑狼疮的试剂盒，含有上述用于制备系统性红斑狼疮诊断产品的芯片。

作为上述试剂盒的改进，还含有稀释液、洗液、酶标二抗、发光底物中的一种或多种。

作为上述试剂盒的优选，稀释液为蛋白稳定剂。

作为上述试剂盒的优选，洗液为中性缓冲液。

作为上述试剂盒的优选，酶标二抗为含辣根过氧化物酶标记的二抗。

作为上述试剂盒的优选，发光底物为荧光素555。

用于制备系统性红斑狼疮诊断产品的多肽、用于制备系统性红斑狼疮诊断产品的芯片、诊断系统性红斑狼疮的试剂盒在制备诊断系统性红斑狼疮的产品中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明的一组用于制备系统性红斑狼疮诊断产品的多肽，包含14条特异性的多肽表位，将其与固相载体连接形成芯片，以血液样本是否对所述14条多肽中的至少5条有响应，来判定是否为候选SLE样本；本发明的该组多肽、芯片、试剂盒可对人或除人以外的动物的血液样本进行快速、准确的分析判断，结果准确可靠，灵敏度可高达93.9％，准确性达91.7％，显著优于现有技术，并且特异性测试表明能显著区分于其他两种自身免疫性疾病(类风湿关节炎与皮肌炎)，可替代传统繁琐的血清学诊断方法。

本发明的芯片上所采用的固相载体为经过氨基化修饰的玻片，其表面形成一层氨基基团，多肽中的羧基可以与氨基进行脱水缩合从而把多肽牢牢的“抓住”使得固定在其上的多肽片段更稳定，在点样操作上更加简便，所用的多肽和样本量在玻片上用量更低，大大节约了制备成本，具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1：本发明的一种用于制备系统性红斑狼疮诊断产品的芯片点样示意图，图中1XPBS表示用PBS溶液点样，B-250X表示用2mg/ml BSA溶液稀释250倍后点样；其余点样孔代表相应的多肽；

图2：本发明的14条多肽在SLE病人血清与正常人血清中的差异表达，纵坐标相对荧光信号强度，横坐标为相应的多肽；

图3：本发明检测芯片在检测SLE患者血清、类风湿关节炎患者血清及皮肌炎患者血清的14条多肽表达情况，其中SLE患者血清多肽表达结果进行了归一化处理，荧光强度归一化处理结果为纵坐标，横坐标为相应的多肽。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。

本发明涉及的试剂的配方如下：PBS溶液：3.58g Na₂HPO₄、0.25g NaH₂PO₄、8gNaCl、0.2g KCl、1L去离子水；封闭液：0.1g BSA、100mL PBS；1％PBST溶液：5mL Tween20、500mL PBS；5％BSA溶液：5g BSA、100mL PBS；荧光素555，购于Streptavidin,HiLyteFluorTM555conjugated；辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG，购于JacksonImmunoResearch。

实施例1、一组用于制备系统性红斑狼疮诊断产品的多肽

SLE疾病的个体差异性比较大，本发明从SLE临床诊断指标的12种抗体中筛选出73条检验多肽，集合成一款芯片，然后再用这款芯片通过大量临床实验进行验证，然后得出下述具有代表性的14条多肽，为本发明的一组用于制备系统性红斑狼疮诊断产品的多肽，其氨基酸序列分别如下：

PO-4：MSLRGKA(SEQ ID NO：1)；

PO-11：NGYKRVL(SEQ ID NO：2)；

SMD1-2：KAVKMTLKNREPVQLET(SEQ ID NO：3)；

SMD2-2：NPLIAGK(SEQ ID NO：4)；

SMD3-4：GRGKAAILKAQVA(SEQ ID NO：5)；

snRNP-B/B’-3：FRKIKPKNSKQAEREEKRV(SEQ ID NO：6)；

U1-snrnp A-2：KEVSSATNALRSMQGFPF(SEQ ID NO：7)；

U1-snrnp A-3：IAKMKGTFVER(SEQ ID NO：8)；

DNA topoisomerase 1(full length)-1：NQYREDWKSKEMKVRQRA(SEQ ID NO：9)；

DNA topoisomerase 1(full length)-2：VMKDAKTKK(SEQ ID NO：10)；

DNA topoisomerase 1(full length)-5：GNHPKMGMLKRR(SEQ ID NO：11)；

U1-SnRNP 68/70KDa-5：RERKEELRGGGGD(SEQ ID NO：12)；

Nucleolin-2：TPAKGKKAAK(SEQ ID NO：13)；

Nucleolin-3：NFNKSAPELKTGI(SEQ ID NO：14)。

实施例2、一种用于制备系统性红斑狼疮诊断产品的芯片的制备方法

(1)氨基化修饰玻片的制备

将玻片浸于醇钠溶液中超声振洗20min，用去离子水清洗3遍，晾干；晾干的玻片置于含0.3％(V/V)APTS的95％丙酮溶液中浸洗2min，再取出用丙酮浸洗6次，每次5min，再用去离子水清洗3次，室温晾干。

(2)芯片的点样

将SEQ ID NO:1～14所示的多肽样品(由上海生物工程公司合成)分别用PBS稀释至400μg/mL，吸取每个蛋白样品30μL加入到384孔板中，用点样仪(Nano-PlottertmNP 2.1)将多肽样品点样在氨基化修饰后的玻片上，点样量为400pL，点间距离为400μm，点样操作完成后，将玻片置于室温干燥；其中，三个正极分别是：稀释200倍的荧光素555、稀释400倍的荧光素555、稀释800倍的荧光素555，负极为PBS，点样示意图如图1所示；

(3)芯片的后处理

将干燥好的玻片用16孔玻片孵化器固定，每孔加入100μL的封闭液，孵育封闭30min；封闭完成后，除掉封闭液，甩干，即得芯片产品。

实施例3、一种诊断系统性红斑狼疮的试剂盒

一种诊断系统性红斑狼疮的试剂盒，包括如下成分：

(1)检测芯片：优选为实施例2制备的芯片产品

(2)稀释液：是蛋白稳定剂，本实施例为5％BSA溶液；作用是稀释待测蛋白至可检测浓度范围；

(3)洗液：是中性缓冲液，本实施例为1％PBST溶液，作用是在固相载体表面孵育血液样本及酶标二抗后，需用洗液清洗掉固相载体表面未结合的抗体和酶标二抗；

(4)酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的二抗，本实施例为辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG；作用是细胞蛋白中的应激蛋白可与固相载体上的一抗结合，二抗可与一抗结合，酶标二抗在酶标二抗溶液中的浓度选用0.08～0.23ng/mL。；

(5)发光底物：本实施例为荧光素555，其作用是二抗上的标记物可与发光底物反应，从而发出可检测的光，荧光素555的使用浓度可选用0.5～5.0ng/mL；

该试剂盒的使用及判定方法如下：

用稀释液将将待测血液样本稀释至合适的检测浓度，血液样品可以是全血、血浆或血清，获得稀释血液样品；按100μL/孔在芯片上加入稀释血液样品，常温孵育4h，分别用洗液、PBS溶液清洗5次，甩干；按100μL/孔在芯片上加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG溶液，常温孵育4h，分别用洗液、PBS溶液清洗5次，甩干；按100μL/孔在检测芯片上加入荧光素555，避光孵育1h，分别用洗液、PBS溶液清洗5次，甩干；用LuxScan^TM10K-B扫描仪扫描玻片，设置扫描参数：Power＝100％、PMT＝550，读取荧光信号强度，以PBS溶液为阴性对照。

计算信噪比，所述信噪比＝(多肽点荧光信号强度-阴性对照点荧光信号强度)/阴性对照点荧光信号强度；响应是指：信噪比≥5。当检测到SEQ ID NO:1～14所示的多肽有至少5条多肽对待检样本有响应，判定待测样本候选为系统性红斑狼疮样本。

实施例4、实际样品检测

收集700份血清样本，分别采用实施例3的试剂盒以及传统临床诊断的方法进行对比检测。

所述的传统临床诊断方法为SLE的“金标准”方法，根据美国风湿病学会1997年SLE分类标准的基础上做了新的修订，具体为1、颊部红斑；2、盘状红斑；3、光过敏；4、口腔溃疡；5、关节炎；6、浆膜炎；7、肾损害：8、神经系统异常：9、血液学异常：10、免疫学异常：11、抗核抗体阳性。以上11项中先后或同时至少5项阳性者可确诊。

根据检测结果，计算并评价准确率、灵敏度、特异性、假阳性率、假阴性率，评价方法如下：准确率是指：两种检测方法结果一致的样本占总样本的比例；灵敏度是指：用“金标准”方法确诊的阳性样本并经试剂盒测定的阳性样本占用“金标准”方法确诊的阳性样本的比例；特异性是指：用“金标准”方法确诊的阴性样本并经试剂盒测定的阴性性样本占用“金标准”方法确诊的阴性样本的比例；假阳性率是指：用“金标准”方法确诊的阴性样本并经试剂盒测定的阳性样本占用“金标准”方法确诊的阴性样本的比例；假阴性性率是指：用“金标准”方法确诊的阳性样本并经试剂盒测定的阴性样本占用“金标准”方法确诊的阳性样本的比例。

表1、试剂盒及“金标准”方法的检测结果

准确率＝(398+244)/700＝91.7％；

灵敏度＝398/424＝93.9％；

特异性＝244/276＝88.0％；

假阳性率＝32/276＝11.6％；

假阴性率＝26/424＝6.13％；

如表1所示，在这700份血清中，采用SLE的“金标准”方法确诊，SLE病人阳性血清为424例，SLE病人阴性血清为276例；采用本发明的试剂盒诊断SLE病人阳性血清为430例，SLE病人阴性血清为270例，准确率为91.7％，灵敏度为93.9％，特异性88.0％，假阳性率11.6％，假阴性率6.13％，本发明的检测方法与临床诊断数据基本一致，其完全符合作为检测试剂盒的要求，具有良好的准确率、灵敏度和特异性，可以替代传统繁琐的血清学诊断方法，适用于科研过程中SLE的诊断及SLE治疗药物的疗效评价。

对SLE病人与正常人的血清中14条多肽进一步进行表达分析，用微阵列扫描仪获取相对荧光信号强度，统计结果如图2所示，14条多肽中有13条多肽在SLE病人与正常人之间差异表达，，因此采用本发明提供的14种多肽制备的芯片及试剂盒，可以良好的辅助诊断SLE。。

实施例5、特异性检测

利用实施例3的试剂盒，针对14条多肽诊断指标进行特异性测试，选取了SLE患者血清及另外两种自身免疫性疾病(类风湿关节炎患者血清与皮肌炎患者血清)分别进行了测试，然后将SLE患者血清多肽检测结果进行归一化处理。

结果如图3所示，在相同条件下，实施例3的试剂盒对其他两种自身免疫性疾病特异性很好，交叉反应小。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东南芯医疗科技有限公司

<120> 一组用于制备系统性红斑狼疮诊断产品的多肽及其应用

<130>

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Leu Arg Gly Lys Ala

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Asn Gly Tyr Lys Arg Val Leu

1 5

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Lys Ala Val Lys Met Thr Leu Lys Asn Arg Glu Pro Val Gln Leu Glu

1 5 10 15

Thr

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Asn Pro Leu Ile Ala Gly Lys

1 5

<210> 5

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Gly Arg Gly Lys Ala Ala Ile Leu Lys Ala Gln Val Ala

1 5 10

<210> 6

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Phe Arg Lys Ile Lys Pro Lys Asn Ser Lys Gln Ala Glu Arg Glu Glu

1 5 10 15

Lys Arg Val

<210> 7

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Lys Glu Val Ser Ser Ala Thr Asn Ala Leu Arg Ser Met Gln Gly Phe

1 5 10 15

Pro Phe

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Ile Ala Lys Met Lys Gly Thr Phe Val Glu Arg

1 5 10

<210> 9

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Asn Gln Tyr Arg Glu Asp Trp Lys Ser Lys Glu Met Lys Val Arg Gln

1 5 10 15

Arg Ala

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Val Met Lys Asp Ala Lys Thr Lys Lys

1 5

<210> 11

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Gly Asn His Pro Lys Met Gly Met Leu Lys Arg Arg

1 5 10

<210> 12

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Arg Glu Arg Lys Glu Glu Leu Arg Gly Gly Gly Gly Asp

1 5 10

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Thr Pro Ala Lys Gly Lys Lys Ala Ala Lys

1 5 10

<210> 14

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Asn Phe Asn Lys Ser Ala Pro Glu Leu Lys Thr Gly Ile

1 5 10

Claims

1.一组用于制备系统性红斑狼疮诊断产品的多肽，包括14条多肽，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1～14所示。

2.一种用于制备系统性红斑狼疮诊断产品的芯片，其包括固相载体，固相载体直接或间接独立固定有权利要求1所述的多肽。

3.根据权利要求2所述的芯片，其特征在于：固相载体为氨基化修饰的玻片。

4.一种诊断系统性红斑狼疮的试剂盒，含有权利要求2或3所述的芯片。

5.根据权利要求4所述的诊断系统性红斑狼疮的试剂盒，其特征在于：还含有稀释液、洗液、酶标二抗、发光底物中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的诊断系统性红斑狼疮的试剂盒，其特征在于：稀释液为蛋白稳定剂。

7.根据权利要求5所述的诊断系统性红斑狼疮的试剂盒，其特征在于：洗液为中性缓冲液。

8.根据权利要求5所述的诊断系统性红斑狼疮的试剂盒，其特征在于：酶标二抗为含辣根过氧化物酶标记的二抗。

9.根据权利要求5所述的诊断系统性红斑狼疮的试剂盒，其特征在于：发光底物为荧光素555。

10.权利要求1所述的多肽、权利要求2或3所述的芯片、权利要求4～9任一项所述的试剂盒在制备诊断系统性红斑狼疮的产品中的应用。