CN101726586A - 一种红斑狼疮检测蛋白芯片及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种红斑狼疮检测蛋白芯片及其试剂盒，该芯片包括基片和阵列式分布的蛋白标志物与对照的点涂层，所述的标志物与对照的点涂层是指在基片上均匀分布的，点阵于基片上的dsDNA、ssDNA、Histon、SS-A(Ro60)、SS-B(La)、Sm和RNP/Sm七个抗原标志物及阳性对照、阴性对照。本发明涉及的检测指标全面且恰当，应用反应条件一致，可以一次性检测多个指标，方便快捷，大大提高了检测的效率，降低了检测成本。本发明可以适用于疑似红斑狼疮病患人群的辅助诊断。

Description

一种红斑狼疮检测蛋白芯片及其试剂盒

技术领域

本发明涉及蛋白芯片疾病检测产品，具体地说，涉及一种红斑狼疮检测蛋白芯片及其试剂盒。

背景技术

系统性红斑狼疮(Systemic Lupus erythrematodes，SLE)是一种多因素参与的可累及全身多系统、多器官的自身免疫性疾病，伴有多种免疫学异常，严重时可以引起肾功能衰竭、感染、中枢神经系统损伤而导致死亡。如果出现多系统的损害，诊断并不困难，但此时大多已是疾病的中晚期，患者已有重要器官的受累，预后较差。在SLE的早期可能仅表现为一个或两个系统受累，容易误诊为其他疾病。因此，SLE的早期诊断对改善其预后、防止重要器官受累尤为重要。

目前应用最广的美国风湿病学会1982年修订的系统性红斑狼疮诊断标准中明确提出将狼疮细胞(LE)阳性，抗双链DNA抗体(dsDNA)阳性，抗Sm抗体阳性，或梅毒血清试验假阳性作为SLE的免疫学诊断标准。我国于1986年在中华医学会风湿病学专题会议上也规定LE细胞阳性，抗dsDNA抗体阳性，抗Sm抗体阳性作为SLE的诊断标准之一。由于SLE早期的临床表现复杂，不易与其它疾病区分，因此越来越多的研究显示：红斑狼疮标志物检测成为SLE早期发现的重要工具之一，同时也可提示预后或监测病程，而且血清SLE标志物联合检测可以提高SLE检测的敏感性和特异性。

虽然对SLE的免疫学诊断标准中主要只明确规定了抗dsDNA抗体和抗Sm抗体这两项指标，而实际在临床诊断过程中，往往是对整个抗核抗体(antinuclear antibodies；ANA)谱进行检测，医生也是通过ANA的综合指标来判断病人所患的是何种疾病(抗dsDNA抗体属于ANA的一种，抗Sm抗体则为一种抗可提取的核抗原[extractable nuclear antigen.ENA]抗体，同属ANA族抗体)。随着人们对SLE的了解日益加深，近年国外对SLE标志物的检测已不仅仅局限于传统的ANA(包括ENA)检测，而是更加有针对性地进行监测，同时也修正了以往的错误看法：如曾经人们将抗SS-A(Ro)作为干燥综合症(

s syndrome，SS)的特异性标志，但近期的研究则发现抗SS-A(Ro)有两种不同的蛋白——52KDa Ro蛋白(Ro52)和60KDaRo蛋白(Ro60)，两者可分别用于辨别SS和SLE。又如人们曾认为ssDNA虽然敏感性高，但在很多自身免疫疾病中都有阳性，因此没有SLE特异性，不具有检测意义，从而将ssDNA排除于ANA检测项目之外。但根据S.S.Badakere等人在印度的研究成果表明，抗ANA抗体阴性的SLE患者体内能够检出抗ssDNA阳性，从而建议将ssDNA也列入SLE的检测项目之一(Antinuclear Antibody-negative Systemic LupusErythematosus in India with Anti-ssDNA Antibodies，Rheumatology，Dec 1987；26：476-477.)。

鉴于人们对SLE血清标志物理解的加深，医生在临床诊断过程中可选择使用这些更有效、更有针对性的指标，来帮助他们判断病人所患的疾病。而目前国内市场上对SLE血清标志物的检测处于ANA和ENA广谱检查水平，医院中比较主流的检测方式仍为自动化免疫分析仪和ELISA。自动化免疫分析仪虽然可以同时检测多种ANA和ENA标志物，但检测结果中有很多指标并不是医生所需要参考的，浪费了时间和成本；甚至还有个别指标是无法通过此种方式检测的。ELISA检测方式要么只能是对ANA和ENA的整体普查，无法显示具体指标的检测值；要么进行有针对的单指标检测，但每次只能检测一种指标。若想通过ELISA方法查看与SLE相关的所有标志物表达水平，必须进行多次检测，耗时巨大且需要病人提供大量的血清样本。由此可见国内市场上的这些检测明显缺乏有效性和针对性，并且缺少专门针对这些最新研究成果进行检测的多指标蛋白检测产品。

发明内容

本发明要提供一种专门用于红斑狼疮检测，可以一次性进行多个相关指标检测，并且指标选择恰当的多种蛋白标志物检测芯片，以及包含该芯片的试剂盒。

本发明目的是这样实现的，发明人根据已报道的红斑狼疮标志物的临床应用情况以及中国红斑狼疮的流行病学特点，选取dsDNA、ssDNA、Histon、SS-A(Ro60)、SS-B(La)、Sm和RNP/Sm 7个标志物，与阳性指标，阴性指标构成阵列式点样涂层，同时点阵于一张基片上，每个阵列可有多次重复。

本发明涉及的用于红斑狼疮检测蛋白芯片，由基片和阵列式分布于基片上的红斑狼疮抗原检测指标以及对照检测指标涂层组成，所述的红斑狼疮抗原检测指标包括dsDNA、ssDNA、Histon、SS-A(Ro60)、SS-B(La)、Sm和RNP/Sm共7个红斑狼疮标志物，以共价键盘或非共价键固定在基片上面。所述的基片可以是玻璃片基，硝酸纤维素膜或尼龙膜。

上述基片的一个优选例是醛基化玻片。

上述的对照检测指标涂层包括阳性对照和阴性对照；阳性对照为兔IgG抗体，阴性对照为抗原点样所用的稀释液。

上述涂层上的每个阵列中的检测指标，每个有2-10个重复，对照指标有1-5个重复。阵列的多少和大小与待检样品的数目，基片大小，以及点样直径有关。

上述检测指标与检测阵列的优选例是：当检测指标点样直径为0.1mm时，点间距0.6mm，阵列大小为6mm×5mm，可在硝酸纤维素膜蛋白芯片上设置24个阵列。

本发明还提供了包含上述红斑狼疮检测蛋白芯片的试剂盒，还包括标准品和质控品；标准品与质控品为瓶装，用纸质模板固定于包装盒内。

所述的试剂盒，还包括样本稀释液，酶标工作液，浓缩洗涤液，检测液；各液体为瓶装，与标准品和质控品一起用纸质模板固定于包装盒内。各部分由纸质模具固定于一包装盒内，不限放置方式，检测时配套使用。

所述的标准品由5-10个不同浓度梯度的蛋白混合液组成，每个蛋白混合液装入一个容器，蛋白混合液由7个SLE标志物的蛋白检测指标按不同浓度混合而成。标准品用于在每次标本检测结束后做标准曲线，可以定量测定样品中的检测指标的蛋白浓度。

所述的质控品由3-6个不同浓度的蛋白混合液组成，每个蛋白混合液装入一个容器，蛋白混合液由7个SLE标志物的蛋白检测指标按不同浓度混合而成。质控品可以监测整个检测系统的CV值，保证每次检测结果的有效性。

所述的样本稀释液是一种蛋白稳定剂；可以是由3％BSA和0.05％防腐剂(Proclin^TM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配制而成；

所述的酶标工作液由含有HRP标记的、所述的7个抗SLE标志物的相应`*+-抗体，以及检测抗体HRP-羊抗兔IgG的前述样本稀释液组成；

所述的浓缩洗涤液是一种中性缓冲液；可以是磷酸盐缓冲液；

所述的检测液指配套使用的两种试剂，一种含有鲁米诺和化学发光增强剂，另一种含有过氧化氢。

本发明涉及的检测指标全面且恰当，应用反应条件一致，可以一次性检测多个指标，方便快捷，大大提高了检测的效率，降低了检测成本。本发明可以适用于疑似红斑狼疮病患人群的普查。可同时筛查的指标包括：抗dsDNA、抗ssDNA、抗Histon、抗SS-A(Ro60)、抗SS-B(La)、抗Sm和抗RNP/Sm抗体。辅助诊断SLE和药物诱导的LE。

附图说明：

图1是红斑狼疮检测蛋白芯片的外观图，1为反应区域，底部为点样涂层的基片。

图2是点样阵列示意图，第1行为阳性对照兔IgG抗体和阴性对照，各有3个重复点样；其余各行分别为蛋白检测指标点样dsDNA、ssDNA、Histon、SS-A(Ro60)、SS-B(La)、Sm和RNP/Sm，每行两个指标，第一行dsDNA、ssDNA，第二行Histon、SS-A(Ro60)，第三行SS-B(La)、Sm，第四行RNP/Sm，各有5个重复点样。

图3是红斑狼疮检测蛋白芯片试剂盒示意图。2代表浓缩洗涤液；3代表1瓶样本稀释液和1瓶酶标工作液；4代表2瓶配套使用的检测试剂；5代表标准品；6代表质控品。

图4为检测血清示意图，其中12个矩形表示所在加样区域加的是标准品，6个标准品每个重复2次；5个多边形表示所在加样区域加的是质控品；其余圆形表示所在加样区域加的是样本。

图5为结果检测为SLE阴性的反应区阵列图，其中左上角3个亮点是阳性对照的信号，阴性对照和具有高度特异性的Sm和RNP/Sm没有信号，其余指标有微弱信号。在该种实验结果下，虽然dsDNA检出为阳性，但具有高度特异性的Sm和RNP/Sm未检测到，具有中度特异性的Histon、SS-A(Ro60)均为阴性，因此可判定该血清样本为SLE阴性。病人需做其他方面的检查以查看是否有其他种类的自身免疫系统疾病。

图6为结果检测为SLE阳性的反应区阵列图。左上角3个亮点表示阳性对照的信号。在该种实验结果下，dsDNA和ssDNA、Sm和RNP/Sm检出为阳性，具有中度特异性的Histon、SS-A(Ro60)等指标为弱阳性。由于Sm具有高度特异性，加上dsDNA为阳性，因此符合中华医学会制定的关于SLE的诊断标准，可经判断该血清样本为SLE阳性。

具体实施方式：

实施例1：

一种红斑狼疮检测蛋白芯片的制备

其步骤主要是：(1)准备基质硝酸纤维素膜；(2)设计芯片，确定点阵的排列方式和点样位置；(3)点样针从384孔板吸出抗体喷点于硝酸纤维素膜上；(4)装配硝酸纤维素膜，并且进行封闭、干燥、包装、保存。

上述用于检测男性多肿瘤标志物抗体的蛋白芯片的制备方法具体包括以下步骤：

1.红斑狼疮标志物检测抗原抗体的确定

检测指标抗原的确定：

红斑狼疮标志物全部是由人血清中提取的纯化后抗原。

检测指标抗体的确定：

所采用的检测抗体对均为小鼠杂交瘤单克隆抗体对，其检测精度和准确度明显优于多克隆抗体。

2.点样制备具检测指标涂层的膜芯片

用Gesim点样仪喷点，点样针从384孔板吸出抗体喷点于硝酸纤维素膜上，点阵形式为10×5矩形阵列，当点直径为0.1mm，点横向间距为0.6mm，抗原阵列的大小为6mm×5mm；点样后贴膜，封闭；最后将芯片干燥、包装后于4℃保存。

3.蛋白芯片组装

用具有分隔反应区域的器具将反应区域固定。组装方式见ZL032298900。组装完成后的示意图如图1。

实施例2：

试剂盒的制备

一种红斑狼疮检测蛋白芯片试剂盒，由红斑狼疮检测蛋白芯片，标准品，质控品，样本稀释液，酶标工作液，浓缩洗涤液，检测液组成；各部分为瓶装，用纸质模板固定于包装盒内(如图2)，不限放置方式，检测时配套使用。以下是各部分的制备方法：

1.红斑狼疮检测蛋白芯片为6×8孔板，由硝酸纤维素膜做为片基，组装方式见ZL032298900。完成后外观图见图1。

2.标准品提供6瓶，每瓶0.25ml。

用含有3％BSA和0.05％防腐剂(Proclin^TM300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配置，其中抗dsDNA、抗ssDNA、抗Histon、抗SS-A(Ro60)、抗SS-B(La)、抗Sm和抗RNP/Sm标准品的终浓度见下表：

3.质控品提供4瓶，每瓶0.2ml。

质控品分为5个浓度，分别是质控品I、质控品II、质控品III、质控品IV、质控品V。这五个质控品浓度分别趋近于相应标准品浓度。

质控品是用含有3％BSA和0.05％防腐剂(Proclin^TM300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配制，下表显示抗dsDNA、抗ssDNA、抗Histon、抗SS-A(Ro60)、抗SS-B(La)、抗Sm和抗RNP/Sm标准品的终浓度及质控界限。

上述质控品质控界限测定方法如下：

分别由2个实验人员按照标准实验操作检测质控品I、质控品II、质控品III、质控品IV、质控品V，重复4次/板，每天每人重复测2块芯片，重复检测10天，分别计算质控品I、质控品II、质控品III、质控品IV、质控品V的均值和标准差，质控界限为

4.样本稀释液

由3％BSA和0.05％防腐剂(Proclin^TM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配制而成。提供1瓶，9ml。用于稀释血清样本(体积比1∶1)。

5.酶标工作液

由3％BSA和0.05％防腐剂(Proclin^TM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配成溶液，含有HRP标记的上述7个抗SLE标志物的相应抗体，以及检测抗体HRP-羊抗兔IgG。提供6ml，1瓶。

6.浓缩洗涤液(10×)

为磷酸盐缓冲液。由以下方法配置而成：磷酸二氢钾6.8g，磷酸氢二钠7.1g，TWEEN-2010ml，溶于1000ml纯化水。各化学物质均为分析纯。

提供50ml，1瓶。使用前用450ml去离子水稀释，混匀。

7.检测液

使用PIERCE公司的ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate作为配套检测液。A液、B液各1瓶，每瓶0.6ml。

实施例3：

蛋白芯片及试剂盒的应用及检测

本发明所述的用于检测红斑狼疮的蛋白芯片的应用，主要采用抗原-抗体-酶标二抗方法检测人血液中的红斑狼疮标志物抗体，方法是将人血清加于芯片表面，样本中的抗体分别于固定在芯片上的相对应的抗原结合，甩干后加入酶标二抗反应，洗去未结合的二抗，加入检测液后1分钟，扫描并收集信号，样本点的信号强度与血清中抗体的浓度成正比。

在上述用于检测红斑狼疮的蛋白芯片试剂盒的应用中，其抗原抗体反应及检测的具体使用方法如下：

(1)对喷点抗原、阳性对照、阴性对照的芯片用3％BSA溶液进行封闭，室温2小时，封闭基片表面非特异性位点；

(2)甩干封闭液后，室温放置4小时，进行干燥；

(3)在芯片的反应区域，加入经等1∶20稀释的人血清样品，以及6份标准品的2次重复，4份质控品(加样方式见示意图4)；每孔加100ul，置于恒温反应仪中37℃，振荡反应1小时，使抗原与抗体充分反应；

(4)甩干后，每孔加入酶标二抗100ul，置于恒温反应仪中37℃，振荡反应30分钟，并且用10倍稀释的磷酸缓冲液在摇床上振荡洗涤三次，每次1分钟；

(5)将PIERCE公司的

ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate的配套使用的检测液A液和B液1∶1混合，加入芯片上各反应区域上，每阵列加60ul，进行化学发光；

(6)用CCD检测仪进行化学发光的扫描并收集信号，依据扫描结果显示分析检测结果。

如图5为结果检测为SLE阴性的阵列图，图6为结果检测为SLE阳性的阵列图。

Claims (10)

1.一种红斑狼疮检测蛋白芯片，其特征在于，由基片和阵列式分布于基片上的红斑狼疮抗原检测指标以及对照检测指标涂层组成，所述的抗原检测指标包括dsDNA、ssDNA、Histon、SS-A(Ro60)、SS-B(La)、Sm和RNP/Sm共7个标志物，以共价键或非共价键固定在基片上面。

2.如权利要求1所述的红斑狼疮检测蛋白芯片，其特征在于，所述的基片可以是玻璃片基，硝酸纤维素膜或尼龙膜。

3.如权利要求2所述的红斑狼疮检测蛋白芯片，其特征在于，所述的玻璃片基是带有醛基修饰的载玻片。

4.如权利要求1或2或3所述的红斑狼疮检测蛋白芯片，其特征在于，所述的对照指标包括1个阳性对照和1个阴性对照；阳性对照为兔IgG抗体，阴性对照为抗原点样所用的稀释液。

5.如权利要求4所述的红斑狼疮检测蛋白芯片，其特征在于，所述的涂层上每个检测指标有2-10个重复，对照指标有1-5个重复。

6.一种红斑狼疮检测蛋白芯片试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的红斑狼疮检测蛋白芯片，标准品和质控品；标准品与质控品为瓶装，用纸质模板固定于包装盒内。

7.如权利要求6所述的红斑狼疮检测蛋白芯片试剂盒，其特征在于，还包括样本稀释液，酶标工作液，浓缩洗涤液和检测液；各液体为瓶装，用纸质模板固定于包装盒内。

8.如权利要求6或7所述的红斑狼疮检测蛋白芯片试剂盒，其特征在于，所述的标准品由5-10个不同浓度梯度的蛋白混合液组成，每个蛋白混合液装入一个容器，蛋白混合液由7个红斑狼疮标志物的蛋白检测指标按不同浓度混合而成。

9.如权利要求6或7所述的红斑狼疮检测蛋白芯片试剂盒，其特征在于，所述的质控品由3-6个不同浓度的蛋白混合液组成，每个蛋白混合液装入一个容器，蛋白混合液由7个红斑狼疮标志物的蛋白检测指标按不同浓度混合而成。

10.如权利要求7所述的红斑狼疮检测蛋白芯片试剂盒，其特征在于，各部分配制方法如下：

所述的样本稀释液为蛋白稳定剂；

所述的酶标工作液由含有HRP标记的相应抗体，以及检测抗体HRP-羊抗兔IgG的前述样本稀释液组成；

所述的浓缩洗涤液为中性缓冲液；

所述的检测液指配套使用的两种试剂，一种含有鲁米诺和化学发光增强剂，另一种含有过氧化氢。

Images