CN101750492A - 自身免疫性肝炎检测蛋白芯片及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于自身免疫性肝炎检测的蛋白芯片及其试剂盒，可以同时检测ANA(dsDNA、RNP、Sm、SS-A/Ro、SS-B/La、Scl-70、Jo-1)、SMA、LKM-1、SLA/LP、F-actin和AMA共12个免疫蛋白标志物。克服了现有产品检测指标单一，检测指标不全面的缺陷，提供一种检测结果更全面、过程更简洁的检测方法。

Description

自身免疫性肝炎检测蛋白芯片及其试剂盒

技术领域

本发明涉及蛋白芯片疾病检测产品，具体地说，涉及一种自身免疫性肝炎检测蛋白芯片及其试剂盒。

背景技术

自身免疫性肝脏疾病主要包括原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)、自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)、原发性硬化性胆管炎(primary scleroticcholangitis，PSC)，以及这三种疾病中任何两者之间的重叠综合征。虽然它们均属自身免疫性肝病，但病因、临床表现、及治疗各不相同，而早期诊断和早期治疗又是控制疾病进展的关键，故及时诊断及鉴别诊断成为临床治疗的首要措施。实验室检测特别是免疫指标的测定在临床诊断及鉴别诊断中有着重要的作用。

目前医院中对AIH的诊断方式普遍采用国际自身免疫性肝炎小组(IAIHG)制定的AIH记分系统。表1中为1999年修订版的AIH记分表，与1993年制定的评分系统相比新修订后的AIH评分系统更为科学。确诊或疑诊AIH的敏感性达89.8％。但也存在不足，尤其是其特异性较低，故有学者建议对那些评分已达AIH确诊或疑诊标准，但常规激素治疗无效者，需行胆管造影术以排除原发性胆管疾病。另外也有文献报道使用修订后的AIH评分系统难以诊断急性发作的AIH。AIH的评分系统仍需进一步完善。

表1自身免疫性肝炎国际评分系统(1999 IAIHG)

确诊：总积分治疗前＞15及治疗后＞17；疑诊治疗前10-15及治疗后12-17分.

AIH是一种原因不明的慢性进展性肝炎，发生于儿童和各年龄段的成年人，女性多见。目前普遍将AIH分为三种类型，I型主要以ANA(抗核抗体)，SMA(平滑肌抗体)、ANCA(抗嗜中性粒细胞胞浆抗体)、ASGP-R(抗去唾液酸糖蛋白受体)抗体阳性为特征：II型主要以LKM-1(肝肾微粒体1抗原)、LC-1(肝细胞溶质蛋白1)抗体为特征。AIH患者往往发病年龄小，治疗效果差。经过免疫抑制治疗，大多数I型AIH患者血清ANA和抗SMA可转阴，但抗体水平不能预示疾病的预后。这表明ANA和SMA均不参与AIH的发病机制，它们的诊断价值大于其预后价值。抗LKM-1抗体的靶抗原为细胞色素单氧化酶，是构成AIH患者识别线性抗原的决定簇，因与HCV病毒基因序列有部分同源性，所以约在7％慢性丙型肝炎患者血清中出现。III型为近年的发现，主要以anti-SLA(anti soluble liver antigen，抗可溶性肝抗原)为标志物。除此以外，还有抗可溶性肝、胰抗原(anti-LP)等蛋白也作为一些AIH特异性标志物被逐渐应用到诊断中。

随着对SMA研究的深入，人们发现作为SMA复合物组成部分的F-actin(纤维状肌动蛋白)在AIH病人中表现出很高的特异性。根据2006年的最新研究成果表明，F-actin阳性在AIH患者中的敏感度能够达到74％，而传统认为具有很高特异性的SMA在同样的患者群中只有34％的敏感度，同样F-actin与SMA的特异度则分别为98％和99％(Evaluation of F-actin ELISAfor the diagnosis of autoimmune hepatitis.Frenzel C，Herkel J，Lüth S，etc.Am JGastroenterol.2006 Dec；101(12)：2731-6)。

除F-actin外，SLA(可溶性肝抗原)也是目前人们发现的最新的AIH血清学标志之一。SLA抗体的阳性率虽然不高，但它对AIH特异性较高，可出现在LKM-1阴性的AIH患者血清中，而且在病毒性肝炎患者血清中呈阴性反应，不易造成误诊。

间接免疫荧光法(IIF)、酶免疫条带技术和Western Blot是当前进行AIH免疫学诊断的主要方法。这三种方法虽然技术上相对比较成熟，检测结果准确。但这些方法不是只能进行单指标检测，就是检测步骤繁琐，操作复杂而且耗费时间。并且这些方法目前用于产业化检测的领域仍然限于传统AIH免疫项目检测上，无法检测特异度和灵敏度更好的免疫指标(如SLA、F-actin)。

因此市场上迫切需要一种既能够快速而准确地提供免疫学检测结果，又能够将更新、更好的指标应用于产业化的检测产品。

发明内容

本发明要提供一种专门用于自身免疫性肝炎检测的多指标蛋白芯片及其试剂盒。解决目前市场上自身免疫学检测产品检测功能单一、检测指标滞后，并且没有集成化的缺点。

本发明的技术方案如下：提供一种自身免疫性肝炎检测蛋白芯片，由基片和阵列式分布于基片上的蛋白检测指标以及对照检测指标涂层组成，所述的蛋白检测指标包括dsDNA(双链DNA)、RNP(核糖核蛋白)、Sm Ag(Sm抗原)、SS-A/Ro(干燥综合症A抗原)、SS-B/La(干燥综合症B抗原)、Scl-70(拓扑异构酶I)、Jo-1(组氨酰tRNA合成酶)、SMAg(平滑肌抗原)、LKM-1(肝肾微粒体1抗原)、SLA/LP(可溶性肝抗原)、F-actin(纤维状肌动蛋白)和AMAg(抗线粒体抗原)共12个标志物，以共价键盘或非共价键固定在基片上面。

所述的基片可以是玻璃片基，硝酸纤维素膜或尼龙膜。

上述基片的一个优选例是醛基化玻片。

上述的对照检测指标涂层包括阳性对照和阴性对照；阳性对照为兔IgG抗体，阴性对照为抗体点样所用的稀释液。

上述涂层上的每个阵列中蛋白检测指标每个有2-10个重复，对照指标有1-5个重复。阵列的多少和大小与待检样品的数目，基片大小，以及点样直径有关。

上述蛋白检测指标与检测阵列的优选例是：当蛋白检测指标点样直径为0.1mm时，点间距0.6mm，阵列大小为6mm×5mm，可在硝酸纤维素膜蛋白芯片上设置24个阵列。

本发明还提供了包含上述自身免疫性肝炎检测蛋白芯片的试剂盒，还包括标准品和质控品；标准品与质控品为瓶装，用纸质模板固定于包装盒内。

上述的试剂盒，还包括样本稀释液，酶标工作液，浓缩洗涤液，检测液；各液体为瓶装，与标准品和质控品一起用纸质模板固定于包装盒内。各部分由纸质模具固定于一包装盒内，不限放置方式，检测时配套使用。

上述的标准品由5-10个不同浓度梯度的蛋白混合液组成，每个蛋白混合液装入一个容器，蛋白混合液由7个多AIH标志物蛋白检测指标按不同浓度混合而成。标准品用于在每次标本检测结束后做标准曲线，可以定量测定样品中的检测指标的蛋白浓度。

上述的质控品由3-6个不同浓度的蛋白混合液组成，每个蛋白混合液装入一个容器，蛋白混合液由7个多AIH标志物蛋白检测指标按不同浓度混合而成。质控品可以监测整个检测系统的CV值，保证每次检测结果的有效性。

上述的样本稀释液是一种蛋白稳定剂；可以是由3％BSA和0.05％防腐剂(Proclin^TM300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配制而成；

上述的酶标工作液由含有HRP标记的相应抗原或单克隆抗体，以及检测抗体HRP-羊抗兔IgG的前述样本稀释液组成；

上述的浓缩洗涤液是一种中性缓冲液；可以是磷酸盐缓冲液；

上述的检测液指配套使用的两种试剂，一种含有鲁米诺和化学发光增强剂，另一种含有过氧化氢。

本发明根据已报道的自身免疫性肝炎标志物的临床应用情况以及中国自身免疫性肝炎的流行病学特点，选取ANA[包括dsDNA Ab(双链DNA抗体)、RNP Ab(核糖核蛋白抗体)、Sm(Smith)、SS-A/Ro Ab(干燥踪合症A抗体)、SS-B/La Ab(干燥踪合症B抗体)、Scl-70Ab(拓扑异构酶I抗体)、Jo-1 Ab(组氨酰tRNA合成酶抗体)]、SMA、LKM-1Ab、SLA/LP Ab、F-actin Ab和AMA共12个标志物作为检测对象。其检测指标不仅含盖了1999年修订版的Brighton记分系统中所规定的ANA、SMA、LKM-1和AMA共4项指标，同时也加入了具有更高特异度的SLA/LP以及F-actin。由于Ingrid Wies，Silvia Brunner等人在著名的权威临床医学杂志《柳叶刀》上发表论文指出SLA与LP其实为同种抗原(Identification of targetantigen for SLA/LP autoantibodies in autoimmune hepatitis.THE LANCET·Vol 355·April 29，2000)，因此在本芯片中将这两个指标合并为一种，即SLA/LP，以便本发明的使用者能够充分理解所测指标的含义。该发明可以大大节省时间和资源，提高检测效率；同时还添加了更为合适的免疫学指标，填补了国内的空白，使得AIH检测准确率和敏感度大大提高。

附图说明：

图1是自身免疫性肝炎检测蛋白芯片的外观图，1为反应区域，底部为点样涂层的基片。

图2是点样阵列示意图，第1行为阳性对照兔IgG抗体和阴性对照，各有3个重复点样；其余各行分别为蛋白检测指标点样dsDNA、RNP、Sm Ag、SS-A/Ro、SS-B/La、Scl-70、Jo-1、SMAg、LKM-1、SLA/LP、F-actin和AMAg共12个标志物，每行两个指标，第一行dsDNA、RNP，第二行Sm Ag、SS-A/Ro，第三行SS-B/La、Scl-70，第四行Jo-1、SMAg，第五行LKM-1、SLA/LP，第六行F-actin、AMAg，各有5个重复点样。

图3是自身免疫性肝炎检测蛋白芯片试剂盒示意图。2代表浓缩洗涤液；3代表1瓶样本稀释液和1瓶酶标工作液；4代表2瓶配套使用的检测试剂；5代表标准品；6代表质控品。

图4为检测血清示意图，其中12个矩形表示所在加样区域加的是标准品，6个标准品每个重复2次；5个多边形表示所在加样区域加的是质控品；其余圆形表示所在加样区域加的是样本。

图5是一种典型的HIA疑似病人检测结果示意图。其中SS-A/Ro、SS-B/La和dsDNA呈强阳性，其余ANA指标呈弱阳性，SMAg和F-actin呈阳性，LKM-1、SLA/LP和AMAg呈阴性。

具体实施方式：

应当理解，下面实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：如萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第三版，或按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1：

一种自身免疫性肝炎检测蛋白芯片的制备

其步骤主要是：(1)准备基质硝酸纤维素膜；(2)设计芯片，确定点阵的排列方式和点样位置；(3)点样针从384孔板吸出抗体喷点于硝酸纤维素膜上；(4)装配硝酸纤维素膜，并且进行封闭、干燥、包装、保存。

上述用于检测多种AIH标志物抗体的蛋白芯片的制备方法具体包括以下步骤：

1.自身免疫性肝炎标志物检测抗原抗体的确定：

用于制备自身免疫性肝炎检测蛋白芯片检测指标抗原的确定，主要采用提取或重组的方式，各指标来源见下表：

抗原	来源	抗原	来源
				dsDNA	质粒	RNP(proteins A，C，68kDa)	重组表达
Sm Ag(proteins B，B’，D)	胸腺/牛	SS-A/Ro(60kDa-protein)	胸腺/牛
				SS-B/La	重组表达	Scl-70(DNA-topoisomerasel)	重组表达

抗原	来源	抗原	来源
				Jo-1(Histidyl-tRNA-synthetase)	重组表达	SMAg(smooth muscle antigen)	胃/大鼠
LKM-1	肾/大鼠	SLA/LP	重组表达
				F-actin	血管平滑肌47/大鼠	AMAg	肾/大鼠

用于制备试剂盒中标准品的检测指标抗体的确定：

所采用的检测抗体对均为小鼠杂交瘤单克隆抗体对，其检测精度和准确度明显优于多克隆抗体。

2.点样制备具检测指标涂层的膜芯片

用Gesim点样仪喷点，点样针从384孔板吸出抗体喷点于硝酸纤维素膜上，点阵形式为10×5矩形阵列，当点直径为0.1mm，点横向间距为0.6mm，抗体阵列的大小为6mm×5mm；点样后贴膜，封闭；最后将芯片干燥、包装后于4℃保存。

3.蛋白芯片组装

用具有分隔反应区域的器具将反应区域固定。组装方式见ZL032298900。组装完成后的示意图如图1。

实施例2：

试剂盒的制备

一种自身免疫性肝炎检测蛋白芯片试剂盒，由自身免疫性肝炎检测蛋白芯片，标准品，质控品，样本稀释液，酶标工作液，浓缩洗涤液，检测液组成；各部分为瓶装，用纸质模板固定于包装盒内(如图2)，不限放置方式，检测时配套使用。以下是各部分的制备方法：

1.自身免疫性肝炎检测蛋白芯片为6×8孔板，由硝酸纤维素膜做为片基，组装方式见ZL032298900。完成后外观图见图1。

2.标准品提供6瓶，每瓶0.25ml。

用含有3％BSA和0.05％防腐剂(Proclin^TM300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配置，其中Anti-dsDNA、Anti-RNP、Anti-Sm、Anti-SS-A/Ro、Anti-SS-B/La、Anti-Scl-70、Anti-Jo-1、Anti-SMA、Anti-LKM-1、Anti-SLA/LP、Anti-F-actin和Anti-AMA标准品的终浓度见下表：

3.质控品提供5瓶，每瓶0.2ml。

质控品分为5个浓度，分别是质控品I、质控品II、质控品III、质控品IV、质控品V。

这五个质控品浓度分别趋近于相应标准品浓度。

质控品是用含有3％BSA和0.05％防腐剂(Proclin^TM300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配制，下表显示Anti-dsDNA、Anti-RNP、Anti-Sm、Anti-SS-A/Ro、Anti-SS-B/La、Anti-Scl-70、Anti-Jo-1、Anti-SMA、Anti-LKM-1、Anti-SLA/LP、Anti-F-actin和Anti-AMA标准品的终浓度及质控界限。

上述质控品质控界限测定方法如下：

分别由2个实验人员按照标准实验操作检测质控品，重复4次/板，每天每人重复测2块芯片，重复检测10天，分别计算质控品的均值和标准差，质控界限为±15％。

4.样本稀释液

由3％BSA和0.05％防腐剂(Proclin^TM300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配制而成。提供1瓶，9ml。用于稀释血清样本(体积比1∶1)。

5.酶标工作液

由3％BSA和0.05％防腐剂(Proclin^TM300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配成溶液，含有HRP标记的12个AIH标志物特异的单克隆抗体，以及检测抗体HRP-羊抗兔IgG。提供6ml，1瓶。

6.浓缩洗涤液(10×)

为磷酸盐缓冲液。由以下方法配置而成：磷酸二氢钾6.8g，磷酸氢二钠7.1g，TWEEN-2010ml，溶于1000ml纯化水。各化学物质均为分析纯。

提供50ml，1瓶。使用前用450ml去离子水稀释，混匀。

7.检测液

使用PIERCE公司的

ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate作为配套检测液。A液、B液各1瓶，每瓶0.6ml。

实施例3：

蛋白芯片及试剂盒的应用及检测

本发明所述的用于检测自身免疫性肝炎的蛋白芯片的应用，主要采用抗原-抗体-酶标二抗方法检测人血液中的自身免疫性肝炎标志物抗体。方法是将人血清加于芯片表面，样本中的抗体分别于固定在芯片上的相对应的抗原结合；甩干后加入酶标二抗反应，洗去未结合的二抗；加入检测液后1分钟，扫描并收集信号，样本点的信号强度与血清中抗体的浓度成正比。

在上述用于检测自身免疫性肝炎的蛋白芯片试剂盒的应用中，其抗原抗体反应及检测的具体使用方法如下：

(1)对喷点抗原、阳性对照、阴性对照的芯片用3％BSA溶液进行封闭，室温2小时，封闭基片表面非特异性位点；

(2)甩干封闭液后，室温放置4小时，进行干燥；

(3)在芯片的反应区域，加入经等1∶20稀释的人血清样品，以及6份标准品的2次重复，5份质控品(加样方式见示意图4)；每孔加100ul，置于恒温反应仪中37℃，振荡反应1小时，使抗原与抗体充分反应；

(4)甩干后，每孔加入酶标二抗100ul，置于恒温反应仪中37℃，振荡反应30分钟，并且用10倍稀释的磷酸缓冲液在摇床上振荡洗涤三次，每次1分钟；

(5)将PIERCE公司的

ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate的配套使用的检测液A液和B液1∶1混合，加入芯片上各反应区域上，每阵列加60ul，进行化学发光；

(6)用CCD检测仪进行化学发光的扫描并收集信号，依据扫描结果显示分析检测结果。

如图5为一种典型的AIH疑似病人检测结果示意图。

Claims (10)

1.一种自身免疫性肝炎检测蛋白芯片，其特征在于，由基片和阵列式分布于基片上的蛋白检测指标以及对照检测指标涂层组成；所述的蛋白检测指标包括dsDNA(双链DNA)、RNP(核糖核蛋白)、Sm Ag(Sm抗原)、SS-A/Ro(干燥综合症A抗原)、SS-B/La(干燥综合症B抗原)、Scl-70(拓扑异构酶I)、Jo-1(组氨酰tRNA合成酶)、SMAg(平滑肌抗原)、LKM-1(肝肾微粒体1抗原)、SLA/LP(可溶性肝抗原)、F-actin(纤维状肌动蛋白)和AMAg(抗线粒体抗原)共12个标志物，以共价键盘或非共价键固定在基片上面。

2.如权利要求1所述的自身免疫性肝炎检测蛋白芯片，其特征在于，所述的基片可以是玻璃片基，硝酸纤维素膜或尼龙膜。

3.如权利要求2所述的自身免疫性肝炎检测蛋白芯片，其特征在于，所述的玻璃片基是带有醛基修饰的载玻片。

4.如权利要求1或2或3所述的自身免疫性肝炎检测蛋白芯片，其特征在于，所述的对照指标包括1个阳性对照和1个阴性对照；阳性对照为兔IgG抗体，阴性对照为抗体点样所用的稀释液。

5.如权利要求4所述的自身免疫性肝炎检测蛋白芯片，其特征在于，所述的涂层上每个检测指标有2-10个重复，对照指标有1-5个重复。

6.一种自身免疫性肝炎检测蛋白芯片试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述自身免疫性肝炎检测蛋白芯片，标准品和质控品；标准品与质控品为瓶装，用纸质模板固定于包装盒内。

7.如权利要求6所述的自身免疫性肝炎检测蛋白芯片试剂盒，其特征在于，还包括样本稀释液，酶标工作液，浓缩洗涤液和检测液；各液体为瓶装，用纸质模板固定于包装盒内。

8.如权利要求6或7所述的自身免疫性肝炎检测蛋白芯片试剂盒，其特征在于，所述的标准品由5-10个不同浓度梯度的蛋白混合液组成，每个蛋白混合液装入一个容器，蛋白混合液由12个自身免疫性肝炎标志蛋白检测指标按不同浓度混合而成。

9.如权利要求6或7所述的自身免疫性肝炎检测蛋白芯片试剂盒，其特征在于，所述的质控品由3-6个不同浓度的蛋白混合液组成，每个蛋白混合液装入一个容器，蛋白混合液由12个自身免疫性肝炎标志蛋白检测指标按不同浓度混合而成。

10.如权利要求7所述的自身免疫性肝炎检测蛋白芯片试剂盒，其特征在于，各部分配制方法如下：

所述的样本稀释液为蛋白稳定剂；

所述的酶标工作液由含有HRP标记的相应抗原的单克隆抗体，以及检测抗体HRP-羊抗兔IgG的前述样本稀释液组成；

所述的浓缩洗涤液为中性缓冲液；

所述的检测液指配套使用的两种试剂，一种含有鲁米诺和化学发光增强剂，另一种含有过氧化氢。

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