CN102621308A - 胶体金层析法抗Jo-1抗体检测试纸及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胶体金层析法抗Jo-1抗体检测试纸以及制备方法。其胶体金层析法抗Jo-1抗体检测试纸包括有样品垫、结合垫、硝酸纤维素包被膜、吸水垫，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素包被膜、吸水垫由底板的一侧依次向所述底板的另一侧粘贴在所述底板上，其结合垫包被有金标抗体a和金标抗体b；硝酸纤维素包被膜上设置有检测线和质控线，检测线包被有Jo-1抗原蛋白，质控线包被有金标抗体c。本发明采用间接免疫测定法，引入Jo-1抗原蛋白，对结合垫和样品垫进行了工艺优化，来实现抗Jo-1抗体的高灵敏度、高特异、高准确性的检测性能，为辅助诊断皮肌炎/多发性肌炎提供参考依据。
Description
技术领域
本发明属于医学免疫应用领域，具体涉及到利用胶体金免疫层析技术检测抗Jo-1抗体的试纸及其制备方法。
背景技术
肌炎患者体内常能查及多种自身抗体，其中某些是该病高度特异性，如肌炎特异性抗体(MSA)。1980年，Nishikai和Reichlin用免疫扩散法在原发性多肌炎患者中发现一种自身抗体，命名为Jo-1抗体，1983年证实其抗原为组氨酰-tRNA合成酶抗体(HRS)。这种胞质酶催化组氨酰和tRNA的酯化反应。HRS在胞质内以同源二聚体形式存在，亚军分子量为50kD。
由于抗Jo-1抗体的相应抗原只位于胞浆，此抗体在ANA抗体中较为独特。Jo-1自身抗原为组氨酰tRNA合成酶。(Ge Q，Rrieu EP，TargoffIN，Primary structure and functional expression of humanGlycyl-tRNA synthetase，an autoantigen in myositis.J Biol Chen，1994，269：28790-28797.)此抗体尤见于自发性炎症性肌炎。它的检出率在原发性多肌炎为33％，原发性皮肌炎为25％。超过70％抗Jo-1抗体阳性的患者出现纤维化肺泡炎，部分出现多关节炎。因此，抗Jo-1抗体被认为是肺病相关肌炎的标记性抗体。(Bernstein R M.Auroanribodies inmyositis.Baillierres Clin Neurol，1993；2：599-615)
20-40％多发性肌炎患者Jo-1抗体阳性。多数Jo-1抗体阳性的多发性肌炎患者具有标志性HLA-DR3/-DRn52，并伴有间质性肺炎。多发性肌炎、Jo-1抗体阳性及HLA-DR3/-DRn52标志，称为“Jo-1综合症”。Jo-1抗体的效价与疾病的活动程度相关。Jo-1抗体对肌炎和间质性肺纤维化高度特异，特异性大于95％，儿童皮肌炎及其结缔组织病Jo-1抗体阳性极少见。Jo-1抗体是肌炎诊断以及疗效观察的一项有意义的指标。在单纯的肺纤维化，也可见Jo-1抗体阳性，其阳性率因检测方法而已，免疫双扩散法为18～23％、ELISA为36％。(Hirakata-M；Suwa-A；Nagai-S；etal.Anti-KS：identification of autoantibodies toasparaginy1-transfer RNA synthetase associated with interstitiallung disease.J-Immunol，1999；162：2315-2320.)
目前实验室常用的检测抗核膜糖蛋白(JO-1)抗体的方法主要有酶联免疫吸附剂试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、间接免疫荧光法(indirect immunoflurescence，IFF)、免疫印迹法(immunoblotting test，IBT)、线性免疫分析法(Line immuno assay，LIA)等。
免疫印迹法虽综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，但操作相对复杂，且试剂具有较强的毒性和污染性。
间接免疫荧光法可作半定量测定，但需有荧光显微镜观察结果，结果判定的客观性不足，标准化困难，技术程序比较复杂，也不适合高通量标本的检测。
线性免疫分析法主要用于疾病大类的筛查，针对性相对较差，同时也不适合高通量样本的检测。
ELISA法检测可用于高通量标本测定，灵敏度也较高，目前被广泛认可，但操作比较繁琐，需多次加样和洗涤，且易受温度和孵育条件的影响，在专业实验室里进行操作，给实验带来诸多不便。
目前市场上商品化抗Jo-1抗体检测试剂盒主要为免疫印迹法，操作程序烦琐，完成整个实验过程需三小时左右，亦需要专业免疫学技术人员在实验室中进行实验操作，同时易受各种温度和孵育时间等环境条件因素的影响，对试验带来诸多不便。
胶体金层析法应用到抗Jo-1抗体的检测中。胶体金免疫层析法(gold-immunochromatography assay，GICA)是应用胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，以条状纤维层析材料为固相，通过毛细效应使样品溶液在层析条上泳动，使样品中的待测物与结合垫上针对待测物的受体(如抗原或抗体)发生免疫反应，并与条状纤维层析材料上的抗原(或抗体)发生免疫反应而被截留，进而形成肉眼可见的紫红色条带，得到直观的实验结果，达到快速检测的目的(Sikowicz G et al.One-stepchromatographic immunoassay for qualitative determination ofchoricogonadotropin in urine.Clin Chem.1990(36)1579-1586.)。使用时只将样品加样到样品垫上，数分钟就根据检测线上紫红色条带出现情况来判断阴阳性结果。与其他检测方法相比，检测时间短，只需要5～10分钟，操作人员无需培训，操作简便、快速，无需低温保存，储运方便等优势。
在自身免疫性疾病方面，目前国外市场上出现了一些检测自身免疫疾病的试纸条产品，但抗Jo-1抗体的胶体金免疫试纸在国内外市场上仍没有问世。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服以上方法学的不足，将胶体金层析法应用到抗Jo-1抗体的检测中，同时首次将Jo-1抗原蛋白应用到胶体金层析法中，采用间接法来实现血液中的抗Jo-1抗体检测，实现高特异、高灵敏度、高准确性的检测性能，快速筛选出抗Jo-1抗体的阳性样本，能快速、便捷地辅助诊断皮肌炎/多发性肌炎。
本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种胶体金层析法抗Jo-1抗体检测试纸。
本发明所要解决的技术问题之二在于提供上述胶体金层析法抗Jo-1抗体检测试纸的制备方法。
作为本发明第一方面的一种胶体金层析法抗Jo-1抗体检测试纸，包括有样品垫、结合垫、硝酸纤维素包被膜、吸水垫，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素包被膜、吸水垫由底板的一侧依次向所述底板的另一侧粘贴在所述底板上，其特症在于：
所述的结合垫包被有金标抗体a和金标抗体b；
所述的硝酸纤维素包被膜上设置有检测线和质控线，所述的检测线包被有Jo-1抗原蛋白，所述的质控线包被有金标抗体c。
进一步，所述的金标抗体a中的抗体A为抗人IgG单克隆抗体、抗人IgG多克隆抗体、葡萄球菌A蛋白(SPA)、链球菌G蛋白(Protein G)中的一种或多种。
所述的抗人IgG多克隆抗体为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源中的一种。
所述的抗人IgG单克隆抗体为羊源或兔源中的一种。
所述金标抗体a中的抗体A优选为葡萄球菌A蛋白。
所述的金标抗体b中的抗体B和金标抗体c中的抗体C同时或不同时为单克隆抗体或多克隆抗体中的一种，其中金标抗体b中的抗体B和金标抗体c中的抗体C可发生特异性结合形成免疫复合物。
所述的多克隆抗体为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源中的一种，单克隆抗体为鼠源或兔源中的一种。
所述的金标抗体b中的抗体B优选为兔IgG，相应地金标抗体c中的抗体C优选为羊抗兔IgG。
所述的检测线上包被的Jo-1抗原蛋白为通过原核表达克隆化基因获得的Jo-1抗原蛋白。
所述Jo-1抗原蛋白是通过大肠杆菌原核表达的克隆化基因所获得的重组蛋白。
所述样本来自人血清、血浆、全血样本。
根据本发明应用的单克隆抗体可通过由Kohler等(Continuouscultures of fused cells secreting antibody of predefinedspecificity[J].Nature，1975(256)：495-497)首先描述的杂交瘤法进行制备，或者可通过重组DNA法进行制备(见美国专利4816567)。“单克隆抗体”由Clackson等(Making antibody fragments using phagedisplay libraries[J].Nature，1991：624-628)和Marks等(By-passingimmunization：Human antibodies from V-gene libraries displayed onphage[J].Journal of Molecular Biology，1991：581-597)所述技术从噬菌体抗体文库中分离。
根据本发明应用的多克隆抗体可通过陈学清等(免疫学常用实验方法.[M]，2000：15-26)通过免疫动物来制备。
本发明的SPA、Protein G通过原核表达克隆化重组基因，由J.萨姆布鲁克等(分子克隆实验指南.[M]，2002：1228-1232)描述的大肠杆菌原核表达克隆化基因。
作为本发明第二方面的一种胶体金层析法抗Jo-1抗体检测试纸的制备方法，该试纸由样品垫、结合垫、硝酸纤维素包被膜、吸水垫和底板共同组成，其特症在于该方法包括有以下步骤：
步骤1，硝酸纤维素包被膜的制备
(1)Jo-1抗原蛋白的制备，通过原核表达克隆化基因获得Jo-1抗原蛋白；
(2)金标抗体c的制备：用0.1M碳酸钾调节胶体金pH 7.0～9.0，按每毫升胶体金溶液缓慢加入4～25μg抗体C，搅拌10～30min，然后加入BSA至终浓度0.5～5％，搅拌10～30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4℃备用；
(3)硝酸纤维素包被膜的制备，用包被膜缓冲液稀释步骤(1)制备的Jo-1抗原蛋白至浓度为0.5～1.5mg/mL，包被于硝酸纤维素包被膜的检测线上；用包被膜缓冲液稀释将抗体c稀释到0.8～2.0mg/mL，以1～10μl/cm包被于硝酸纤维素膜的质控线上，硝酸纤维素包被膜制备好以后置放于37℃烘干备用；
步骤2，结合垫的制备
(1)金标抗体a的制备：用0.1M碳酸钾调节胶体金pH 7.0～9.0，按每毫升胶体金溶液缓慢加入4～25μg抗体A，搅拌10～30min，然后加入BSA至终浓度0.5～5％，搅拌10～30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4℃备用；
(2)金标抗体b的制备：用0.1M碳酸钾调节胶体金pH 7.0～9.0，按每毫升胶体金溶液缓慢加入4～25μg抗体B，搅拌10～30min，然后加入BSA至终浓度0.5～5％，搅拌10～30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4℃备用；
(3)结合垫的制备：经处理液浸渍处理的聚脂膜，烘干后，将金标抗体a和金标抗体b混合后，以0.5～4μl/cm的用量喷涂在预处理的聚脂膜上，25℃～37℃干燥后得结合垫，结合垫置于2℃～8℃的环境下备用；
步骤3，样品垫的制备
将玻璃纤维膜经处理液浸渍处理后制成样品垫，样品垫于37℃烘干后备用；
步骤4，在底板上顺次相互搭接粘贴经前述步骤1-3所制作完成的硝酸纤维素包被膜、结合垫、样品垫和吸水垫；
步骤5，对步骤4所制作完成的材料，切割成试纸条。
在所述的步骤1的(2)中，金标抗体c的制备：用0.1M碳酸钾调节胶体金pH 8.0～9.0，按每毫升胶体金溶液缓慢加入5～15μg抗体C，搅拌10～30min，然后加入BSA至终浓度0.5～1％，搅拌10～30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4℃备用；其中抗体C为羊抗兔IgG。
在所述的步骤2的(1)中，金标抗体a的制备方法为用0.1M碳酸钾缓冲液调节胶体金pH值至8.0～9.0，按每毫升胶体金溶液缓慢加入5～15μg抗体A，，搅拌10～30min，然后加入BSA至终浓度0.5～1％，搅拌10～30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4℃备用；其中抗体A为羊抗人IgG。
在所述的步骤2的(1)中，金标抗体a的制备方法为用0.1M碳酸钾缓冲液调节胶体金pH值至7.0～8.0，按每毫升胶体金溶液缓慢加入8～12μg抗体A，搅拌10～30min，然后加入BSA至终浓度0.5～1％，搅拌10～30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4℃备用。然后将金标SPAOD 302～4μl/cm喷涂于结合垫，干燥后备用；其中抗体A为鼠抗人IgG。
在所述的步骤2的(1)中，金标抗体a的制备方法为用0.1M碳酸钾缓冲液调节胶体金pH值至5.0～6.5，按每毫升胶体金溶液缓慢加入10～15μg抗体A，搅拌10～30min，然后加入BSA至终浓度0.5～1％，搅拌10～30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4℃备用。然后将金标SPA OD 202～4μl/cm喷涂于结合垫，干燥后备用；其中抗体A为葡萄球菌A蛋白。
在所述的步骤2的(2)中，金标抗体b的制备方法为用0.1M碳酸钾缓冲液调节胶体金pH值至7.0～8.0，按每毫升胶体金溶液缓慢加入5～15μg抗体B，兔IgG，搅拌10～30min，然后加入BSA至终浓度0.5～1％，搅拌10～30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4℃备用，其中抗体B为兔IgG。
所述的步骤2的(3)中，将制备好的金标抗体a和金标抗体b按体积比20～40∶15～20比例混合，用BIO-Dot喷膜机以2.0～4μl/cm喷涂在预处理的聚脂膜上，25℃～37℃干燥得结合垫，结合垫封袋后置于2℃～8℃的环境下备用；其中金标抗体a中的抗体A为葡萄球菌A蛋白，金标抗体b为金标兔IgG。
所述的缓冲液的目的为提供一定pH和离子强度使氯金酸胶体金呈现所需的电荷状态和离子强度，使其被标记的蛋白包被于氯金酸胶体金以Aucl-为核心的离子周围，且形成相对稳定的一种状态。每种蛋白由于其电荷状态和氨基酸组成不同，因此包被所需的条件也不同，需由试验来确定其缓冲液的种类、浓度、pH。一般来说，抗体标记所需的缓冲液可以为碳酸钾、硼酸缓冲液、磷酸缓冲液、碳酸缓冲液等，其浓度为0.1～0.5M，pH为5～10。
所述的步骤3中，切割成的试纸的宽度优选为4mm和3mm两种。
本发明的胶体金层析法抗Jo-1抗体检测试纸的应用，其是定性检测人血清中抗Jo-1抗体，辅助诊断皮肌炎/多发性肌炎。
本发明的检测原理具体为选用亲和层析纯化的重组表达的JO-1抗原蛋白，金标抗体a和金标兔IgG作为胶体金标记复合物，喷涂于结合垫，利用间接法来检测血清样品中是否含有抗JO-1抗体。检测时，样本随着层析泳动到结合垫并浸润金标复合物，其中的人IgG和金标抗体a结合形成人IgG-金标抗体a复合物，由于毛细效应，此人IgG-金标抗体a复合物沿包被膜泳动向前，若血清样品中有抗JO-1抗体，此人IgG-金标抗体a复合物与包被于硝酸纤维素膜上的抗原蛋白发生特异性免疫结合反应，形成金标抗体a-人IgG-Jo-1抗原蛋白三联体复合物而被截留在检测线上，逐渐富集形成较深的紫红色条带；由于毛细效应继续泳动向前，金标兔IgG与包被在质控线上的羊抗兔IgG发生特异的免疫反应被截留，逐渐富集在质控线上形成较深的紫红色条带，多余的未结合的物质继续层析到吸水垫上，因此在检测线和质控线都出现条带的判为阳性结果；若血清样品中不含有抗JO-1抗体，金标抗体a到达检测线时，不与包被在检测线上的抗原蛋白发生免疫反应，因此在检测线处没有出现紫红色条带，金标抗体a继续泳动向前到达吸水垫，而金标兔IgG继续泳动向前与包被于质控线处羊抗兔IgG发生特异的免疫反应而被截留，逐渐富集在质控线上形成紫红色条带，因此仅在质控上出现条带判为阴性结果。
本发明将基因工程菌表达的抗原蛋白首次引入到试纸条中，实现了高特异性、高灵敏度、高准确度的检测性能。与目前市面出现的商品化ELISA试剂盒相比，仍有诸多不同之处，其不受场地人员之限，检测时间短即5-10分钟，判读结果简便。此外本发明的试纸具有高特异性、高灵敏度、高准确度，能满足市场的快速筛选皮肌炎/多发性肌炎，为病人及早诊断治疗提供条件，同时，也能满足基层实验室、即时检测、床边检测的需求。
与现有的检测方法相比，本发明优点：
1.本发明的独特性在于基因重组表达的Jo-1抗原蛋白首次应用于胶体金层析试纸，大大提高了其检测灵敏度，通过胶体金试纸可快速筛选出抗JO-1抗体所有阳性样本(能检出大于25RU/ml的样本)。
2.本发明的优点是生产成本低。本发明所提供的抗JO-1抗体的检测试纸所需的核心试剂是抗体(a)即抗人IgG或SPA或PROTEIN G、抗体(c)、抗体(b)、抗原蛋白，其单条试纸所用试剂量少，且可通过购买商品化试剂或自制，抗原蛋白来源于自制的纯化基因工程抗原蛋白。
3.与已公开的用于抗JO-1抗体检测的其他方法相比，本发明的试纸具有许多其他方法所不能比拟的优点，如检测时间短(5～10min)；不需要任何特殊仪器，可实现床边检测和门诊即时检测；操作简便，只需一步反应，操作人员无需培训，检测成本低；对温度无特殊要求，无需冷冻，储存运输方便，室温可保存24个月。
附图说明
图1为本发明的侧面结构示意图。
图2为本发明的检测结果示意图。
其中：
图2a所示为：加样后，反应3～5min即可看到检测区D和控制区E相应位置上出现紫红色条带；
图2b所示为：当控制区E和检测区D均出现紫红色条带，结果为阳性，说明血清中含有抗Jo-1抗体；
图2c所示为：如只在控制区E出现一条紫红色条带，检测区D不出现紫红色条带，结果为阴性，说明血清中不含抗Jo-1抗体；
图2d、2e所示为：如控制区E不出现紫红色条带，无论检测区D是否有条带出现，都说明试纸失效。
具体实施方式
本发明所述的胶体金免疫层析法抗Jo-1抗体检测试纸，如图1所示，该试纸是在底板7上由一侧向另一侧顺次相互搭接地粘贴硝酸纤维素包被膜3、结合垫2、样品垫1、吸水垫6。
结合垫2上包被有金标抗体a和金标抗体b，金标抗体a的抗体A为羊抗兔IgG金标抗体或鼠抗人IgG金标抗体或葡萄球菌A蛋白(SPA)金标抗体或链球菌G蛋白金标抗体；金标抗体b中的抗体B为兔IgG。
硝酸纤维素包被膜3上设置有检测线4和质控线5，检测线4包被有Jo-1抗原蛋白，质控线5包被有金标抗体c，金标抗体c中的抗体为羊抗兔IgG。
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。
实施例1Jo-1抗原蛋白制备
应用于本试纸的Cenp-B抗原蛋白是通过基因克隆技术构建重组基因，然后采用原核表达技术成功表达出全部为人源的Cenp-B抗原蛋白。其中，Cenp-B抗原蛋白来源于纯化基因工程抗原蛋白。
实施例2抗体制备
抗体A及抗体C、抗体B用下述方法来制备。其中抗体A中的抗人IgG、抗体C及抗体B一般可通过在动物上经多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射纯化的免疫原和佐剂而产生。
通过将0.05mg～1mg免疫制剂(分别针对山羊或小鼠)与3倍体积的Freund’s完全佐剂混合得到注射溶液，将该注射溶液在动物皮内多部位注射，一个月后将动物用1/5至1/10原初量的人IgG的Freund’s完全佐剂混合液经多部位动物皮下注射而加强免疫。7～14天后将动物放血，测定血清抗人IgG滴度。对动物加强免疫直至滴度达到平台期。在许多免疫学教科书中描述了生产多克隆抗体的方法，例如，陈学清等《免疫学常用实验方法》。通过从被免疫的动物回收脾细胞并使细胞永生化，例如通过与骨髓瘤细胞融合或通过Epstein-Barr病毒转化，并且筛选能表达目的抗体的单克隆抗体(Kohler，Milstein.Derivation of specificantibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion[J].European Journal of Immunology，1976：501-511)。
可通过大肠杆菌原核表达克隆化基因来制备抗体A中的重组葡萄球菌A蛋白和链球菌G蛋白，具体操作方法参见J.萨姆布鲁克等(分子克隆实验指南.[M]，2002：1228-1232)，或购买商品化的重组葡萄球菌A蛋白或链球菌G蛋白。
实施例3
胶体金溶液制备
将0.01％的HAuCl4溶液加热至沸腾，迅速加入每100mL HAuCl4溶液加入适量的还原剂溶液，颜色从蓝色，然后浅蓝、蓝色，再加热出现红色，煮沸7～10min出现透明的橙红色。再用超滤或微孔滤膜(0.45μm)过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，液面出现油状物和大量黑色颗粒状沉淀物时弃用。
其中所使用的还原剂可以为柠檬酸三钠(Frens 1973)、鞣酸-柠檬酸三钠(Slot与Gueeze 1985年)、白磷，优选使用柠檬酸三钠，更优选地使用1％柠檬酸三钠。
其中所用玻璃容器应绝对清洁，用前需经酸洗、硅化。其水应为去离子超纯水，电阻率达18.2MΩ。
胶体金溶液制备过程中，各溶液的配制方法如下：
1.HAuCl4的配制：用超纯水溶解氯金酸，配成1％溶液，置4℃备用，有效期四个月。1000mL 1％HAuCl4溶液配方：10g HAuCl4、超纯水定容至1000mL。
2.1％柠檬酸三钠的配制：1％柠檬酸三钠(Sodium Citrate)的配制：用超纯水溶解Sodium Citrate，配成1％溶液，0.22μm膜滤过，现配现用。
实施例4
本发明的胶体金免疫层析法抗Jo-1抗体检测试纸的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤1，硝酸纤维素包被膜的制备
(1)采用实施例1的方法制备Jo-1抗原蛋白；
(2)羊抗兔IgG金标抗体的制备：
用0.1M碳酸钾调节实施例3制备的胶体金pH 7.0～9.0，按每毫升胶体金溶液缓慢加入4～25μg羊抗兔IgG，搅拌10～30min，然后加入BSA至终浓度0.5～1％，搅拌10～30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4℃备用；
(3)硝酸纤维素包被膜3的制备，用包被膜缓冲液稀释Jo-1抗原蛋白至浓度为1.0～1.5mg/mL，调整BI0-Dot仪器，喷涂于硝酸纤维素膜(NC)上检测线4处，靠近结合垫2端，距结合垫2约9.5mm，使Cenp-B抗原蛋白包被于硝酸纤维素包被膜的检测线4上；
用包被缓冲液将羊抗兔IgG稀释到0.8～1.5mg/mL，以1～10μl/cm用BIO-Dot仪器喷涂于硝酸纤维素膜(NC)上靠近吸水垫6的质控线5处，距吸水垫6约9mm。检测线4与质控线5两线距离约5～8mm，喷线应粗细均匀。37℃烘干，封装备用。
其使用的包被缓冲液可以是硼酸盐，碳酸盐，磷酸盐，Tris-HCl或Tris-磷酸盐，醋酸盐，巴比妥，等等，其缓冲液的目的为提供一定pH和离子强度使蛋白包被并牢固包被于NC膜，其缓冲液pH值一般约为6～9.5范围内，优选为6.5～7.5的中性缓冲范围内，且最优选缓冲液的pH值为7.0～7.4范围内。缓冲液优选为磷酸盐。
其中的硝酸纤维素膜(NC)可以为任何商品化硝酸纤维素膜，S&SAE99、whatman 8μm、millipore M135、sartorius CN140等。使用的具体的NC膜不是本发明的关键，但是在每次测定中，上述几种NC膜可以作为优选。不同厂家使用的含不同表面活性剂的不同缓冲液处理的膜，与所用检测线抗体溶液亲和力有不同程度的差距，也会很大程度造成线条不均匀，拖带或是弥散的现象，因此运用组装试纸来选择优选的NC膜。
步骤2，结合垫的制备
(1)羊抗人IgG金标抗体的制备：用0.1M碳酸钾调节实施例3制备的胶体金pH 8.0～9.0，按每毫升胶体金溶液缓慢加入8～12μg羊抗人IgG，搅拌10～30min，然后加入BSA至终浓度0.5～1％，搅拌10～30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4℃备用；
(2)兔IgG金标抗体的制备：用0.1M碳酸钾调节实施例3制备的胶体金pH值至7.0～8.0，按每毫升胶体金溶液缓慢加入8～12μg兔IgG，搅拌10～30min，然后加入BSA至终浓度0.5～1％，搅拌10～30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4℃备用。
(3)结合垫的制备：经缓冲液将聚脂膜浸泡30分钟，37℃烘干，将羊抗人IgG金标抗体和兔IgG金标抗体按一定的比例混合后，用BIO-Dot仪器，以0.5～4μl/cm的用量喷涂在预处理的聚脂膜上，25℃～37℃干燥，待干燥完毕之后得结合垫2，结合垫2真空包装，置2℃～8℃备用。置于2℃～8℃的环境下备用；
结合垫的制备过程中，可以使用的缓冲液包括以下几种：
(a)含有1％PVA、0.71％Na3PO4、1％BSA、0.05％NaN3、0.1％TritonX-100；
(b)1％PVA、1％BSA、0.05％PROCLINTM300、0.1％TritonX-100，pH7.0PBS；
(c)1％PVA、1％BSA、0.05％PROCLINTM300，pH7.0PBS；
(d)含有1％PVA、0.71％Na3PO4、1％BSA、0.05％NaN3、0.1％Tween-20；
(e)含有1％PVA、0.71％Na3PO4、1％BSA、0.05％NaN3、0.1％Tween-20，pH7.0PBS；
其优选的缓冲液是缓冲液(d)，因为它具有区别阴阳性样品的最大分辨率。PROCLINTM300和NaN3起防腐作用，而Tween-20具有去污和亲水作用。
羊抗人IgG金标抗体和兔IgG金标抗体之间的混合比例可以依照下述方法进行：
通过预实验基本确定兔IgG金标抗体的OD20，用BIO-Dot喷量1μl/cm喷于预处理的聚脂膜上，用0.01MPBS为上样缓冲液，即能得到预期的颜色强度的条带，确定兔IgG金标抗体的应用OD喷量为1μl。
随后将羊抗人IgG金标抗体进行梯度稀释到终浓度OD 100、80、60、40、20，然后将兔IgG金标抗体稀释到终浓度OD 20，用BIO-Dot将以上羊抗人IgG金标抗体和兔IgG金标抗体混合物喷量为3μl/cm喷于处理好的聚酯膜，将制备的硝酸纤维素包被膜3、结合垫2、样本垫1、吸水垫6依次粘贴于底板7上，用阳性血清、临界参考值血清、阴性血清为调试对象。判定依据：阳性血清的检测线4和质控线5两者的条带颜色强度一致为依据，临界参考值血清能出现，阴性血清无条带出现的那个OD值，即为这批的应用量。通过本试验得出OD20～40较为符合要求。
步骤3，样品垫的制备
将玻璃纤维膜按45mL/片，用缓冲液均匀洒涂于玻璃纤维膜上，于37℃烘干后得样品垫，样品垫用铝箔袋封装，备用；
该步骤可以用的缓冲液包括以下几种：
(a)0.05M Borax、0.01MPBS(pH 7.0)、0.1％Sodium Casein、1％PEG20000、2％BSA、0.05％NaN3；
(b)0.05M Borax、0.01MPBS(pH 7.0)、0.1％Sodium Casein、1％PEG20000、2％Casein、0.05％NaN3；
(c)0.05M Tris-cl(pH 7.0)、0.01MPBS、0.1％Sodium Casein、1％PEG20000、2％Casein、0.05％NaN3。
优选的缓冲液是缓冲液(a)，因为它具有区别阴阳性样品的最大分辨率，NaN3起防腐作用。
步骤4
首先进行原材料预裁剪：
样品垫的裁切：用裁切机将样品垫切成与PVC制成的底板等长度即长28cm，宽2.4cm，置干燥房间备用。
吸水垫的裁切：用裁纸机将吸水纸切成与PVC制成的底板等长度即长28cm，宽3cm制成吸水垫，置干燥房间备用。
结合垫的裁切：用裁切机将结合垫切成与PVC制成的底板等长度即长28cm，宽2.4cm，置干燥房间备用。
硝酸纤维素包被膜的裁切：用裁纸机将硝酸纤维素包被膜切成与PVC制成的底板等长度即长28cm，宽1cm，置干燥房备用。
将硝酸纤维素包被膜3、结合垫2、样本垫1、吸水垫6按图1所示依次层叠在PVC塑料制成的底板7上，组成大板。组装车间温度应控制在25℃～37℃，湿度20％～30％。
步骤5
切条：用切条机将大板切成单人份，每人份宽度按照一定要求切成2.5mm～4mm的宽度，随机抽检，灵敏度能检出室内质控样品(即弱阳性样本)，条带显色程度达到如图2d，且无非特异性条带，则产品通过质控规定成为合格产品。
组装、包装：将1人份已切好的试纸组装在备好的试纸卡里，使加样窗对应试纸的样品垫，结果显示窗对应检测区和控制区，组装车间温度应控制在25℃～37℃，湿度20％～30％。再与干燥剂、说明书、样品加样器封装在外包袋里，于4～25℃避光保存。
在上述胶体金层析法抗Cenp-B抗体检测试纸的制备过程中，各溶液的配置方法如下：
1.0.1M碳酸钾的配制：用超纯水配制，0.22μm膜滤过，置4℃备用，有效期一个月。1000mL 0.1M K2CO3溶液配方：13.8g K2CO3；超纯水定容至1000mL。
2.10％BSA的配制：用超纯水配制，0.05％叠氮钠(NaN3)，0.22μm膜滤过，置4℃备用，有效期两周。1000mL 10％BSA溶液配方：100g BSA，0.5g NaN3；超纯水定容至1000mL。
3、包被缓冲液的配制：9gNacl、1.15gNa2HPO4、0.23g NaH2PO4、10gSucrose、0.5gEDTA溶于1L超纯水中，过滤置于4℃备用。
4.洗涤液也即保存液的配制：
2％BSA、0.05％(NaN3)、0.01M pH 7.2PBS，0.22μm膜滤过，置4℃备用，有效期两周。1000mL标记洗涤保存液配方：20g BSA、0.5g NaN3、0.01MpH 7.2PBS定容至1000mL。
5.金标稀释液的配制：
1000mL稀释液的配制：2.423g tris，10gBSA，0.2gNaN3溶于超纯水中，调pH 8.0，定容到1000mL。
用稀释液将金标稀释到工作浓度后，加入20％Sucrose和5％的海藻糖。
实施例5
该实施例的胶体金免疫层析法抗Jo-1抗体检测试纸的制备方法，其步骤基本与实施例4相同，只是将该实施例的步骤2中(1)的羊抗人IgG金标抗体的制备步骤替换为葡萄球菌A蛋白(SPA)金标抗体的制备，具体如下：
用pH 9.0 0.2M硼酸缓冲液调节胶体金pH值至5.0～6.5，按每毫升胶体金溶液缓慢加入10～15μgSPA蛋白，搅拌10～30min，然后加入BSA至终浓度0.5～1％，搅拌10～30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4℃备用。
该实施例步骤2中的葡萄球菌A蛋白(SPA)金标抗体和兔IgG金标抗体之间的混合比例可以依照实施例4的方法进行。
实施例6
该实施例的胶体金免疫层析法抗Jo-1抗体检测试纸的制备方法，其步骤基本与实施例4相同，只是将该实施例的步骤2中(1)的羊抗人IgG金标抗体的制备步骤替换为鼠抗人IgG金标抗体的制备，具体如下：
用0.1M碳酸钾调节胶体金pH值至7.0～8.0，按每毫升胶体金溶液缓慢加入8～12μg鼠抗人IgG，搅拌10～30min，然后加入BSA至终浓度0.5～1％，搅拌10～30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4℃备用。
该实施例步骤2中的鼠抗人IgG金标抗体和兔IgG金标抗体之间的混合比例可以依照实施例4的方法进行。
实施例7
该实施例的胶体金免疫层析法抗Jo-1抗体检测试纸的制备方法，其步骤基本与实施例4相同，只是将该实施例的步骤2中(1)的羊抗人IgG金标抗体的制备步骤替换为链球菌G蛋白金标抗体的制备，具体如下：
用pH 9.0 0.2M硼酸缓冲液调节胶体金pH值至5.0～6.5，按每毫升胶体金溶液缓慢加入10～15μg链球菌G蛋白，搅拌10～30min，然后加入BSA至终浓度0.5～1％，搅拌10～30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4℃备用。
该实施例步骤2中的链球菌G蛋白金标抗体和兔IgG金标抗体之间的混合比例可以依照实施例4的方法进行。
本发明将重组表达的Jo-1抗原蛋白引入到胶体金层析法抗Jo-1抗体检测试纸，能实现血液样本中的抗Cenp-B抗体的检测，能快速、便捷地辅助诊断皮肌炎/多发性肌炎
实施例8
样本处理
取全血1～5ml，自然凝集5分钟后，3000～5000g/5min～10min，取上清即得到待测样品溶液，至少有100μl以上待测样品溶液。
用微量加样器吸取以上血清50～70μl样本于样品垫，缓慢加样。或者用吸管将血清样本缓慢滴加3～5滴于样品垫上，5～10min观察结果，根据条带出现情况来判读阴阳性结果。
实施例9
试剂盒的检测和临床性能评估
本发明的胶体金抗Jo-1抗体检测试纸的金标抗体a的抗体A优选为SPA，抗体b的抗体B为兔IgG，抗体c的抗体为羊抗兔IgG，对其试纸进行的临床性能进行以下评估。
1.稳定性试验
1.137℃加速稳定性
将试纸置于37℃进行加速实验，每天取出用室内质控品进行测试，通过阴阳性参考品(各10份)的阴阳性符合率的批内精密度来判断试纸的稳定性。4个月后结果显示，质控品的检测结果符合预期，各个阴阳性参考品的阴阳性符合率为100％。阴阳性参考品为10份抗JO-1抗体阳性血清和10份抗JO-1抗体阴性血清。
1.24℃稳定性实验
将试纸置于4℃进行常规稳定性实验，每月取出用室内质控品测试，同样通过阴阳性参考品(各10份)的阴阳性符合率的批内精密度来判断试纸的稳定性。12个月后结果显示，质控品检测结果符合预期，各个阴阳性参考品的阴阳性符合率为100％。18个月后结果显示，各个阴阳性参考品的阴阳性符合率仍为100％。24个月后检测结果显示，出现一例假阴性。综合以上结果说明试纸在2～8℃贮存，2年内是稳定的。
2.诊断灵敏度
从临床中收集到100份确诊为多发性肌炎病人的血清，用自制的胶体金试纸按照说明书上的操作步骤对上面收集到的多发性肌炎病人血清进行检测。5min后统计结果如下：
根据上面统计的结果，根据对100份确认的多发性肌炎病人血清的检测，可以发现有抗JO-1抗体阳性的样本数量为27例，阴性样本数量为73例。因此通过计算得出：
诊断灵敏性(％)＝27/(27+73)×100％＝27％
3.诊断特异性
从临床中收集到健康献血者血清血清300份，用自制的胶体金试纸按照说明书上的操作步骤对上面收集到的健康献血者进行检测。5min后统计结果如下：
根据对非多发性肌炎病人和健康献血者各300份血清的检测的统计结果，发现在健康献血者中测得抗JO-1抗体阴性的样本数量为286例，因此通过计算得出：
(健康献血者)诊断特异性(％)＝286/300×100％＝95.33％
以上是对本发明的描述而非限定，基于本发明思想的其它实施方式，均在本发明的保护范围之中。
Claims (14)
1.胶体金层析法抗Jo-1抗体检测试纸，包括有样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素包被膜(3)、吸水垫(6)，所述样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素包被膜(3)、吸水垫(6)由底板(7)的一侧依次向所述底板(7)的另一侧相互搭接粘贴在所述底板(7)上，其特征在于：
所述的结合垫(2)包被有金标抗体a和金标抗体b；
所述的硝酸纤维素包被膜(3)上设置有检测线(4)和质控线(5)，所述的检测线(4)包被有Jo-1抗原蛋白，所述的质控线(5)包被有金标抗体c。
2.根据权利要求1所述的胶体金层析法抗Jo-1抗体检测试纸，其特征在于：所述金标抗体a中的抗体A为抗人IgG单克隆抗体、抗人IgG多克隆抗体、葡萄球菌A蛋白(SPA)、链球菌G蛋白(Protein G)中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的胶体金层析法抗Jo-1抗体检测试纸，其特征在于：所述的抗人IgG多克隆抗体为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源中的一种；所述的抗人IgG单克隆抗体为鼠源或兔源中的一种。
4.根据权利要求1所述的胶体金层析法抗Jo-1抗体检测试纸，其特征在于：所述金标抗体a中的抗体A为葡萄球菌A蛋白。
5.根据权利要求1所述的胶体金层析法抗Jo-1抗体检测试纸，其特征在于：所述的金标抗体b中的抗体B和金标抗体c中的抗体C同时或不同时为单克隆抗体或多克隆抗体中的一种，其中金标抗体b中的抗体B和金标抗体c中的抗体C可发生特异性结合形成免疫复合物。
6.根据权利要求5所述的胶体金层析法抗Jo-1抗体检测试纸，其特征在于：所述的多克隆抗体为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源中的一种，所述的单克隆抗体为鼠源或兔源中的一种。
7.根据权利要求1所述的胶体金层析法抗Jo-1抗体检测试纸，其特征在于：所述的检测线上包被的Gp210抗原蛋白为通过原核表达克隆化基因获得的Gp210抗原蛋白。
8.一种胶体金层析法抗Jo-1抗体检测试纸的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
步骤1，硝酸纤维素包被膜的制备
(1)Jo-1抗原蛋白的制备，通过原核表达克隆化基因获得Jo-1抗原蛋白；
(2)金标抗体c的制备：用0.1M碳酸钾调节胶体金pH 7.0～9.0，按每毫升胶体金溶液缓慢加入4～25μg抗体C，搅拌10～30min，然后加入BSA至终浓度0.5～5％，搅拌10～30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4℃备用；
(3)硝酸纤维素包被膜的制备，用包被膜缓冲液稀释步骤(1)制备的Jo-1抗原蛋白至浓度为0.5～1.5mg/mL，包被于硝酸纤维素包被膜的检测线上；用包被膜缓冲液稀释将抗体c稀释到0.8～2.0mg/mL，以1～10μl/cm包被于硝酸纤维素膜的质控线上，硝酸纤维素包被膜制备好以后置放于37℃烘干备用；
步骤2，结合垫的制备
(1)金标抗体a的制备：用0.1M碳酸钾调节胶体金pH 7.0～9.0，按每毫升胶体金溶液缓慢加入4～25μg抗体A，搅拌10～30min，然后加入BSA至终浓度0.5～5％，搅拌10～30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4℃备用；
(2)金标抗体b的制备：用0.1M碳酸钾调节胶体金pH 7.0～9.0，按每毫升胶体金溶液缓慢加入4～25μg抗体B，搅拌10～30min，然后加入BSA至终浓度0.5～5％，搅拌10～30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4℃备用；
(3)结合垫的制备：经处理液浸渍处理的聚脂膜，烘干后，将金标抗体a和金标抗体b混合后，以0.5～4μl/cm的用量喷涂在预处理的聚脂膜上，25℃～37℃干燥后得结合垫，结合垫置于2℃～8℃的环境下备用；
步骤3，样品垫的制备
将玻璃纤维膜经处理液浸渍处理后制成样品垫，样品垫于37℃烘干后备用；
步骤4，在底板上顺次相互搭接粘贴经前述步骤1-3所制作完成的硝酸纤维素包被膜、结合垫、样品垫和吸水垫；
步骤5，对步骤4所制作完成的材料，切割成试纸条。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在所述的步骤1的(2)中，金标抗体c的制备：用0.1M碳酸钾调节胶体金pH 8.0～9.0，按每毫升胶体金溶液缓慢加入5～15μg抗体C，搅拌10～30min，然后加入BSA至终浓度0.5～1％，搅拌10～30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4℃备用；其中抗体C为羊抗兔IgG。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在所述的步骤2的(1)中，金标抗体a的制备方法为用0.1M碳酸钾缓冲液调节胶体金pH值至8.0～9.0，按每毫升胶体金溶液缓慢加入5～15μg抗体A，，搅拌10～30min，然后加入BSA至终浓度0.5～1％，搅拌10～30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4℃备用；其中抗体A为羊抗人IgG。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在所述的步骤2的(1)中，金标抗体a的制备方法为用0.1M碳酸钾缓冲液调节胶体金pH值至7.0～8.0，按每毫升胶体金溶液缓慢加入8～12μg抗体A，搅拌10～30min，然后加入BSA至终浓度0.5～1％，搅拌10～30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4℃备用。然后将金标SPAOD 30 2～4μl/cm喷涂于结合垫，干燥后备用；其中抗体A为鼠抗人IgG。
12.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在所述的步骤2的(1)中，金标抗体a的制备方法为用0.1M碳酸钾缓冲液调节胶体金pH值至5.0～6.5，按每毫升胶体金溶液缓慢加入10～15μg抗体A，搅拌10～30min，然后加入BSA至终浓度0.5～1％，搅拌10～30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4℃备用。然后将金标SPA OD 20 2～4μl/cm喷涂于结合垫，干燥后备用；其中抗体A为葡萄球菌A蛋白。
13.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在所述的步骤2的(2)中，金标抗体b的制备方法为用0.1M碳酸钾缓冲液调节胶体金pH值至7.0～8.0，按每毫升胶体金溶液缓慢加入5～15μg抗体B，兔IgG，搅拌10～30min，然后加入BSA至终浓度0.5～1％，搅拌10～30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4℃备用，其中抗体B为兔IgG。
14.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的步骤2的(3)中，将制备好的金标抗体a和金标抗体b按体积比20～40∶15～20比例混合，用BIO-Dot喷膜机以2.0～4μl/cm喷涂在预处理的聚脂膜上，25℃～37℃干燥得结合垫，结合垫封袋后置于2℃～8℃的环境下备用；其中金标抗体a中的抗体A为葡萄球菌A蛋白，金标抗体b为金标兔IgG。
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|---|---|
| CN (1) | CN102621308B (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103412119A (zh) * | 2013-07-31 | 2013-11-27 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种抗体检测用胶体金试纸条的制备方法及应用 |
| CN103529222A (zh) * | 2013-10-29 | 2014-01-22 | 华中农业大学 | 一种用于人畜共检的狂犬病病毒抗体胶体金检测试纸条及其制备方法 |
| CN105911276A (zh) * | 2016-07-12 | 2016-08-31 | 中国人民解放军南京军区福州总医院 | 一种七联金标检测卡及其的制备方法 |
| CN111103280A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-05-05 | 河北博海生物工程开发有限公司 | 一种检测抗胰岛素自身抗体的试纸条及其制备方法 |
| CN111693693A (zh) * | 2020-06-29 | 2020-09-22 | 陕西脉元生物科技有限公司 | 人体液中肌炎、重症肌无力自身抗体检测试剂盒及方法 |
| CN114002437A (zh) * | 2021-11-01 | 2022-02-01 | 西安文理学院 | 一种人血清白蛋白多克隆抗体胶体金层试纸条及其制备方法和应用 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040241876A1 (en) * | 2000-12-22 | 2004-12-02 | France Fannes | Flow through assay device, diagnostic kit comprising said assay device and use of said assay device in the detection of an analyte present in a sample |
| CN1740196A (zh) * | 2005-08-23 | 2006-03-01 | 北京诺赛基因组研究中心有限公司 | 可用于多发性肌炎/皮肌炎诊断的抗原提纯工艺方法及应用 |
| CN1746675A (zh) * | 2004-09-07 | 2006-03-15 | 李人 | 免疫层析测试条及其制造方法 |
| CN101021533A (zh) * | 2007-03-12 | 2007-08-22 | 深圳市伯劳特生物制品有限公司 | 风湿病自身抗体免疫印迹试剂盒 |
| CN101149385A (zh) * | 2007-10-26 | 2008-03-26 | 天津中新科炬生物制药有限公司 | 一种丙型肝炎病毒抗体快速诊断试纸及其制备方法 |
| CN101226192A (zh) * | 2008-02-03 | 2008-07-23 | 山东省医药生物技术研究中心 | 以bcip/nbt为底物的显色蛋白芯片及其在自身抗体检测中的应用 |
| US20100015607A1 (en) * | 2005-12-23 | 2010-01-21 | Nanostring Technologies, Inc. | Nanoreporters and methods of manufacturing and use thereof |
| CN101750492A (zh) * | 2008-12-04 | 2010-06-23 | 上海裕隆生物科技有限公司 | 自身免疫性肝炎检测蛋白芯片及其试剂盒 |
-
2011
- 2011-01-28 CN CN201110031772.8A patent/CN102621308B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040241876A1 (en) * | 2000-12-22 | 2004-12-02 | France Fannes | Flow through assay device, diagnostic kit comprising said assay device and use of said assay device in the detection of an analyte present in a sample |
| CN1746675A (zh) * | 2004-09-07 | 2006-03-15 | 李人 | 免疫层析测试条及其制造方法 |
| CN1740196A (zh) * | 2005-08-23 | 2006-03-01 | 北京诺赛基因组研究中心有限公司 | 可用于多发性肌炎/皮肌炎诊断的抗原提纯工艺方法及应用 |
| US20100015607A1 (en) * | 2005-12-23 | 2010-01-21 | Nanostring Technologies, Inc. | Nanoreporters and methods of manufacturing and use thereof |
| CN101021533A (zh) * | 2007-03-12 | 2007-08-22 | 深圳市伯劳特生物制品有限公司 | 风湿病自身抗体免疫印迹试剂盒 |
| CN101149385A (zh) * | 2007-10-26 | 2008-03-26 | 天津中新科炬生物制药有限公司 | 一种丙型肝炎病毒抗体快速诊断试纸及其制备方法 |
| CN101226192A (zh) * | 2008-02-03 | 2008-07-23 | 山东省医药生物技术研究中心 | 以bcip/nbt为底物的显色蛋白芯片及其在自身抗体检测中的应用 |
| CN101750492A (zh) * | 2008-12-04 | 2010-06-23 | 上海裕隆生物科技有限公司 | 自身免疫性肝炎检测蛋白芯片及其试剂盒 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 《ARTHRITIS & RHEUMATISM 》 19960229 DOLORES VAZQUEZ-ABAD and NAOMI F. ROTHFIELD SENSITIVITY AND SPECIFICITY OF ANTI-Jo-1 ANTIBODIES IN AUTOIMMUNE DISEASES WITH MYOSITIS 292-296 1-14 第39卷, 第2期 * |
| DOLORES VAZQUEZ-ABAD AND NAOMI F. ROTHFIELD: "SENSITIVITY AND SPECIFICITY OF ANTI-Jo-1 ANTIBODIES IN AUTOIMMUNE DISEASES WITH MYOSITIS", 《ARTHRITIS & RHEUMATISM 》 * |
| HANS L.P. VAN DUIJNHOVEN，ET AL.: "A Comparison of ELISA Assays as Routine Diagnostic Test for Detection of Autoantibodies Against Extractable Nuclear Antigens", 《CLINICAL BIOCHEMISTRY》 * |
| 杨湘越 等: "新型自身抗体联合检测斑点免疫金渗滤法的建立及应用评价", 《实用医学杂志》 * |
| 许艳丽 等: "免疫胶体金技术及其在真菌毒素检测中的应用", 《中国酿造》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103412119A (zh) * | 2013-07-31 | 2013-11-27 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种抗体检测用胶体金试纸条的制备方法及应用 |
| CN103412119B (zh) * | 2013-07-31 | 2015-10-28 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种抗体检测用胶体金试纸条的制备方法及应用 |
| CN103529222A (zh) * | 2013-10-29 | 2014-01-22 | 华中农业大学 | 一种用于人畜共检的狂犬病病毒抗体胶体金检测试纸条及其制备方法 |
| CN105911276A (zh) * | 2016-07-12 | 2016-08-31 | 中国人民解放军南京军区福州总医院 | 一种七联金标检测卡及其的制备方法 |
| CN111103280A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-05-05 | 河北博海生物工程开发有限公司 | 一种检测抗胰岛素自身抗体的试纸条及其制备方法 |
| CN111693693A (zh) * | 2020-06-29 | 2020-09-22 | 陕西脉元生物科技有限公司 | 人体液中肌炎、重症肌无力自身抗体检测试剂盒及方法 |
| CN111693693B (zh) * | 2020-06-29 | 2022-03-04 | 陕西脉元生物科技有限公司 | 人体液中肌炎、重症肌无力自身抗体检测试剂盒及方法 |
| CN114002437A (zh) * | 2021-11-01 | 2022-02-01 | 西安文理学院 | 一种人血清白蛋白多克隆抗体胶体金层试纸条及其制备方法和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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