CN101988924B - 检测血液抗环瓜氨酸多肽抗体的试纸条及制备方法 - Google Patents

检测血液抗环瓜氨酸多肽抗体的试纸条及制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101988924B
CN101988924B CN200910055724.5A CN200910055724A CN101988924B CN 101988924 B CN101988924 B CN 101988924B CN 200910055724 A CN200910055724 A CN 200910055724A CN 101988924 B CN101988924 B CN 101988924B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
pad
coated
map
bsa
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200910055724.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101988924A (zh
Inventor
张玥
韩永俊
高成秀
孙宏彬
杨超文
司徒维娜
左宗宝
钱杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Kexin Biotech Co Ltd
Original Assignee
Shanghai Kexin Biotech Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Kexin Biotech Co Ltd filed Critical Shanghai Kexin Biotech Co Ltd
Priority to CN200910055724.5A priority Critical patent/CN101988924B/zh
Priority to PCT/CN2010/075228 priority patent/WO2011012053A1/zh
Publication of CN101988924A publication Critical patent/CN101988924A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101988924B publication Critical patent/CN101988924B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2440/00—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material
    • G01N2440/18—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material citrullination
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/101—Diffuse connective tissue disease, e.g. Sjögren, Wegener's granulomatosis
    • G01N2800/102—Arthritis; Rheumatoid arthritis, i.e. inflammation of peripheral joints

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了胶体金层析法检测抗环瓜氨酸肽抗体的试纸条及其制备方法。所述试纸条包括底板(7)上顺次相互搭接地粘贴硝酸纤维素膜(3)、结合垫(2)、样品垫(1)、吸水垫(6)。硝酸纤维素膜上有检测区(4)和质控区(5)，检测区包被环瓜氨酸肽抗原，质控区包被可作为质控物的抗体，结合垫包被两种不同的胶体金标记抗体。本发明试纸条引入分枝环瓜氨酸肽，对样品垫和结合垫预处理进行工艺改进，发明了高灵敏度、特异性强的抗环瓜氨酸肽抗体试纸条，能快速筛选出阳性样本，对早期辅助诊断RA和疾病监测起重要作用。

Description

检测血液抗环瓜氨酸多肽抗体的试纸条及制备方法
技术领域
本发明属于医学免疫应用领域，具体涉及到利用胶体金免疫层析技术检测抗环瓜氨酸肽抗体的试纸条及其制备方法。
背景技术
类风湿性关节炎又称类风关(RA)，RA是一种以关节组织或关节翳的异常生长而引起的慢性多关节损伤为特征的系统炎症性疾病，导致无规则的关节丧失功能。最近的研究显示RA患者的关节损伤出现在疾病开始两年后，早期有效治疗可以预防这一疾病的随后进展。因此，早期诊断和早期治疗已成为重点。然而，RA患者在疾病早期并不总是显示出典型的症状和现象，因为它们可能并不完全符合RA诊断标准，这就使得诊断变得困难起来。RA因RF对应的IgG Fc段的自身抗体，以及其他抗体的出现而被划分为系统性自身免疫性疾病中，迄今，RF是应用于临床的RA唯一血清学标志物。然而RF在RA中的敏感性在60-80％之间，其特异性也相当低，因为RF在其他疾病中也可以被广泛而频繁地识别出来，包括各种结缔组织疾病，慢性肝脏疾病和感染性疾病，甚至少数健康人群当中。因此RF被应用于RA的诊断标准，然而它的早期诊断价值并不令人满意。
最近几年，几个新的抗体已在RA患者中被发现，其临床特点和可能的病理角色也已经呈现出来。特别是新的抗瓜氨酸蛋白自身抗体如filaggrin和它的环化形式(即环瓜氨酸肽：CCP)在RA患者中可以接受的敏感性和高度的特异性而备受关注，因此成为早期诊断的标志物和关节损伤的前兆因子。最近研究已证实RA患者不但产生RF因子也会有其他各种不同的抗体。尽管大多数抗体对于RA并非特异的，但瓜氨酸蛋白自身抗体(APF、AKA、抗filaggrin抗体、抗CCP抗体和抗Sa抗体)仅在RA中被识别出来，抗CCP抗体因其高度的敏感性和特异性尤其引起关注。抗CCP抗体是诊断RA，特别是早期RA的首选指标，适用于难以确诊的RA和需鉴别诊断RA及其他炎症性关节炎和其他形式的多关节炎的诊断，同时可以确认血清学RF阴性的RA。具体表现在以下四个方面：1.抗CCP抗体对临床诊断RA的准确性：特异性95％，敏感性80％[1]；2.抗CCP抗体可在多数首次就诊的RA患者检出-出现在早期RA患者[2]；3.抗CCP抗体滴度与疾病活动性相关-预示转归[3]；4.持续监测抗CCP抗体作为早期RA侵蚀性的进展指标[4]。
目前抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体的检测方法为酶联免疫吸附法(ELISA)，目前市场上商品化抗CCP抗体检测试剂盒主要为ELISA试剂盒。ELISA法操作程序烦琐，完成整个实验过程需三小时左右，亦需要专业免疫学技术人员在实验室中进行实验操作，并且需经酶标仪检测后读取实验结果，这在基层医疗机构的实验室和小型门诊中较难实现该项目的实验检测，同时基于ELISA方法学易受各种温度和孵育时间等环境条件因素的影响，对试验带来诸多不便。
胶体金免疫层析法(gold-immunochromatography assay，GICA)是应用胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，以条状纤维层析材料为固相，通过毛细效应使样品溶液在层析条上泳动，使样品中的待测物与结合垫上胶体金标记物发生免疫反应，并与条状纤维层析材料上的抗原(或抗体)发生免疫反应而被截留，进而形成肉眼可见的紫红色条带，得到直观的实验结果，达到快速检测的目的[5]。使用时只需要把样品加样到试纸条的样品垫上，数分钟就根据检测线上紫红色条带出现与否来判断阴阳性结果。与其他检测方法相比，稳定性好，操作人员无需培训，操作简便、快速，无需低温保存，储运方便。
目前尚未有检测抗CCP抗体胶体金免疫层析法检测用试纸条。本发明将环瓜氨酸肽引入到试纸条中，实现了高特异性、高灵敏度、高准确度的检测性能。判读结果简便，仅需数分钟；为快速筛选RA实现早期诊断早期治疗提供条件；满足基层实验室、即时检测、床边检测的需求。
相比上述优点，现有的检测抗环瓜氨酸肽抗体的方法存在如下不足之处：
1.检测步骤烦琐，检测时间长；
2.检测试剂需要冷藏运输和保存；
3.检测需要特殊的仪器设备。例如，ELISA法需要酶标仪；
4.不适合单人份操作，对于ELISA法需同时做标准品和阴阳性对照品，多人份同时检测才能节省检测成本。
发明内容
本发明为了克服以上方法学的不足，将胶体金层析法应用到抗环瓜氨酸肽抗体的检测中，同时首次将环瓜氨酸肽应用到胶体金层析法中，采用间接法来实现血浆以及血清样本中的抗环瓜氨酸肽抗体的检测，大大降低了经济成本，实现高特异性、高灵敏度、高准确性的检测性能，能快速、便捷地辅助诊断早期类风湿关节炎(RA)。
本发明第一方面提供一种检测抗环瓜氨酸肽抗体的试纸条，所述试纸条包括水平方向上依次相互搭接粘贴在底板上的结合垫和硝酸纤维素膜，其中，所述结合垫包被有金标抗体(a)和金标抗体(b)，所述硝酸纤维素膜有检测线和质控线，检测线包被可与抗环瓜氨酸肽抗体特异性结合的检测抗原，质控线包被质控抗体(c)；
其中，抗体(a)仅在与抗环瓜氨酸肽抗体结合的情况下与检测抗原结合；
其中，抗体(b)不与抗环瓜氨酸肽抗体以及检测抗原结合。
在一优选实施例中，所述试纸条还包括样品垫和/或吸水垫。
在一优选实施例中，所述试纸条包括底板和从水平方向上看顺次相互搭接粘贴在该底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。
在一优选实施例中，所述结合垫上金标抗体(a)和金标抗体(b)的OD比为5∶1至1∶1，优选为OD50～100/OD 10～40。
在一优选实施例中，所述抗体(a)、(b)和(c)选自单克隆抗体或多克隆抗体，所述单克隆抗体为鼠源或兔源，所述多克隆抗体为鼠源、兔源、马源、羊源或豚鼠源，其中抗体(a)还可以为葡萄球菌A蛋白或链球菌G蛋白。
在一优选实施例中，所述抗体(a)选自鼠抗人IgG、葡萄球菌A蛋白、链球菌G蛋白和羊抗人IgG。
在一优选实施例中所述抗体(b)和(c)选自选自羊IgG和抗羊IgG、兔IgG和抗兔IgG、和鼠IgG和抗鼠IgG。
在一优选实施例中，所述检测抗原为环瓜氨酸肽与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、亲合素、链霉亲合素、甲状腺球蛋白、匙孔血蓝蛋白、卵蛋白和人工合成的多聚赖氨酸。
在一优选实施例中，所述抗原包括2～8个环瓜氨酸肽和连接所述肽的多聚赖氨酸核心基质(MAP)，MAP可与载体蛋白连接，其中，各环瓜氨酸肽可为相同或不同的抗原表位。优选为MAP-载体蛋白偶联物。
本发明第二方面提供一种制备本发明试纸条的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提供底板；
2)提供结合垫，并用金标抗体(a)和金标抗体(b)包被该结合垫；
3)提供硝酸纤维素膜，其中，所述硝酸纤维素膜有检测线和质控线，用可与抗环瓜氨酸肽抗体特异性结合的检测抗原包被该检测线，用质控抗体(c)包被该检测线；和
4)在所述底板上顺次相互搭接粘贴所述硝酸纤维素膜和结合垫，从而得到所述试纸条。
本发明也提供一种试剂盒，该试剂盒包括本发明的试纸条、加样器、和说明书。
与现有的试纸条和检测方法相比，本发明优点包括：
1.本发明首次将环瓜氨酸肽引入胶体金层析试纸条中，实现了快速简便地对早期类风湿关节炎的辅助诊断。
2.本发明所使用的检测抗原中，分枝环瓜氨酸肽的抗原决定族可不一样，检测抗原表位多样化，提高了检测特异性。
3.本发明的环瓜氨酸肽抗原很好地模拟了天然的表位构象，从而提高其对类风湿关节炎的检测敏感度。
4.本发明将环瓜氨酸肽与载体蛋白偶联形成大分子蛋白，使其能很好的包被于膜上。另外，载体蛋白的引入，大大增加了瓜氨酸的表位空间，减少了免疫反应的空间位阻，提高了检测灵敏度。
5.与已公开的用于抗环瓜氨酸肽抗体检测的检测方法相比，将样品直接加样于试纸条的样品垫后，5～10min即可观测结果；不需要任何特殊仪器，可实现床边检测和门诊即时检测；操作简便，只需一步反应，操作人员无需培训，因此检测成本低；对温度无特殊要求，无需冷冻，储存运输方便，室温下可保存12个月。
附图说明
图1为本发明的侧面结构示意图。该试纸条是在支撑胶板(7)上顺次相互搭接地粘贴样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(6)。所述的硝酸纤维素膜(3)有检测线(4)和质控线(5)，检测线(4)包被有检测抗原，质控线(5)包被有抗体(c)。
图2为本发明的检测结果示意图。加样后，反应3～5分钟后，如图2a和2b所示，结果为阳性，表明血清中含有抗环瓜氨酸肽抗体；如图2c显示，结果为阴性，说明血清中不含抗环瓜氨酸肽抗体；如图2d、2e显示，结果为试纸条失效，即质控线处不出现紫红色条带，无论检测线处是否有条带出现，都说明试纸条失效。
具体实施方式
本发明第一方面涉及一种检测抗环瓜氨酸肽抗体的试纸条，所述试纸条包括水平方向上依次相互搭接粘贴在底板上的结合垫和硝酸纤维素膜，其中，所述结合垫包被有金标抗体(a)和金标抗体(b)，所述硝酸纤维素膜有检测线和质控线，检测线包被可与抗环瓜氨酸肽抗体特异性结合的检测抗原，质控线包被质控抗体(c)；其中，抗体(a)仅在与抗环瓜氨酸肽抗体结合的情况下与检测抗原结合；其中，抗体(b)不与抗环瓜氨酸肽抗体以及检测抗原结合。
在一优选实施方式中，本发明的试纸条还包括样品垫和/或吸水垫。
可以采用本领域现有技术已知的各种材料来制备本发明所使用的底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。可从市场上购得以下规格的产品，用于制备本发明的试纸条：
  名称  来源   型号   规格
  吸水纸  上海金标公司   SX27   20*30cm
  PVC胶板  上海金标公司   SM31-40   30*80
  玻璃纤维  上海金标公司   SB08   20*30cm
  聚酯膜  上海金标公司   VL78   20*30cm
  硝酸纤维素膜  Millipore公司   HFB13504   2.5cm*100mtrs
在一优选实施例中，本发明的结合垫选自聚脂膜或玻璃纤维膜载体。
本发明的结合垫可以是经过处理液浸渍处理的结合垫(例如，选自聚脂膜或玻璃纤维膜载体)，所述处理液含有0.5％～10％一种或几种大分子惰性蛋白，0.1％～3％离子盐缓冲液和0.1％～1％一种或几种表面活性剂。所述表面活性剂可为酸性、中性、碱性或两性活性剂。根据工艺优化实验选择合适的试剂成分，浸泡20～60分钟，37℃烘干。其中大分子惰性蛋白优选为PVA、BSA，离子盐缓冲液优选为磷酸钠盐，表面活性剂优选为Triton X-100。
在一优选实施例中，结合垫经如下处理液处理：用超纯水配制的1％PVA、0.71％Na3PO4、1％BSA、0.05％NaN3、0.1％TritonX-100。
本发明的样品垫可经样品垫处理液处理，该样品垫处理液含有0.5％～10％一种或几种大分子惰性蛋白，0.1％～3％离子盐缓冲液和0.01％～0.05％一种或几种表面活性剂。所述表面活性剂可为酸性、中性、碱性或两性活性剂。可根据工艺优化实验选择合适的试剂成分，将样品垫按30～50mL/片用处理液均匀洒在样品垫上，于37℃烘干后为备用样品垫。其中，所述大分子惰性蛋白优选为BSA、PEG20000、胆酸钠，离子盐缓冲液优选为Borax缓冲液，表面活性剂优选为TWEEN-20。
在一优选实施例中，样品垫经如下处理液处理：用超纯水配制的0.05MBorax、0.1％Sodium Casein、1％PEG20000、2％BSA、0.05％Tween-20、0.05％NaN3。
本发明的试纸条中，水平方向上，所述样品垫(如果存在的话)、结合垫、硝酸纤维素膜、和吸水垫(如果存在的话)依次相互搭接粘贴在底板上。
本文所述“水平方向上”或类似描述是指以图1所示的试纸条为例，从左向右看，或者从右向左看，各垫或膜的搭接顺序依次是样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。即，不论从哪个方向看，这些膜和垫的搭接顺序不变。
本文所述“搭接”，是指所述垫或膜至少有一端与其它垫或膜的至少一端相互接触，包括各垫或膜的至少一端的至少一部分压在其它垫或膜的至少一端的至少一部分之上，或被压在该至少一部分之下的接触，如图1所示。图1显示了本发明的一个优选实施方式。但是，以其它方式相互接触，例如从垂直方向看，样品垫的一部分被压在结合垫的下方等等，也包括在所述“搭接”的范围之内，只要各膜和垫之间的接触能有效地使样品基于毛细作用依次通过各膜和垫即可。
样品垫的长度约为2.0～2.5cm，其与结合垫的搭接部分约长4～8mm。结合垫的长度约为5～10mm，其与硝酸纤维素膜的搭接部分长约1～3mm。硝酸纤维素膜的长度约为1.5～2.5cm。吸水垫的长度约为1.5～3.0cm，其与硝酸纤维素膜的搭接部分长约1～3mm。
底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫的组装的试纸条的宽带可根据实际情况而定，通常在2mm到5cm的范围内，优选为3mm、4mm等。它们的厚度也是本领域常规的厚度。
结合垫上质控线和检测线的宽度通常为1-3mm左右。检测线与搭接的结合垫端的距离约为8-13mm，检测线与质控线之间的距离通常为5-8mm，而质控线与搭接的吸水垫端的距离约为5-8mm。
用于本发明的抗体(a)、(b)和(c)可选自单克隆抗体或多克隆抗体，所述单克隆抗体为鼠源或兔源，所述多克隆抗体为鼠源、兔源、马源、羊源或豚鼠源，其中抗体(a)还可以为葡萄球菌A蛋白或链球菌G蛋白。
所述抗体使用其最广义意义包括单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体、和抗体片段，只要它们具有所需结合的特异性。
根据本发明应用的单克隆抗体可通过由Kohler等[6]首先描述的杂交瘤法进行制备，或者可通过重组DNA法进行制备(见美国专利4816567)。“单克隆抗体”还可利用例如Clackson等[7]和Marks等[8]所述技术从噬菌体抗体文库中分离。
根据本发明应用的多克隆抗体可通过陈学清等[9]描述的动物免疫法制备的。
本发明应用的葡萄球菌A蛋白(Protein A)、链球菌G蛋白(Protein G)通过由J.萨姆布鲁克等[10]描述的原核表达克隆化基因法制备。
抗体(b)和抗体(c)为可发生特异性结合反应的一对抗原-抗体，如可以为羊IgG和抗羊IgG、兔IgG和抗兔IgG、鼠IgG和抗鼠IgG等等，为了便于阐述方便，在说明书和相应的具体实施例中，抗体(b)和抗体(c)为相应地为兔IgG和羊抗兔IgG。
可从市售途径购得各种合适的抗体，用作本发明的上述抗体。
所述结合垫包被的示踪标志物为胶体金颗粒与抗体的标记混合物，具体为普遍采用胶体金示踪物标记捕获抗体，然后用大分子惰性蛋白如牛血清白蛋白、酪蛋白等来封闭未结合的胶体金蛋白结合位点，减少检测的非特异性反应，然后通过离心来分离和纯化标记物。
本发明的检测抗原可以是环瓜氨酸肽，或采用分枝抗原肽(MAP)结构。MAP以多聚赖氨酸(Poly-Lys，PL)为核心基质，通过化学合成的方法在分枝上连接多条环瓜氨酸肽，而枝链环瓜氨酸肽可为最新研究发现的抗原决定族，随着科学发现相应的更新枝链上抗原决定族即环瓜氨酸肽，大大提高了检测特异性。这种MAP结构为树状结构，增大了分子量且能很好地模拟天然表位构象，从而提高了其对RA的检测灵敏度。MAP的抗原表位数量可以为2-10个，优选为2-8个，更优选为3-7个。
由于环瓜氨酸肽为小分子多肽，就有增加包被于膜上的环瓜氨酸肽的有效率和减少免疫反应的空间位阻的必要性，采用了环瓜氨酸肽与载体蛋白通过化学合成方法偶联得到环瓜氨酸肽-载体蛋白偶联物，并且不影响其环瓜氨酸肽的抗原决定族的免疫反应的发挥，实验表明的确增加了环瓜氨酸肽-载体蛋白偶联物的包被率，阳性信号大大增强。将此偶联物作为本检测系统的检测抗原。适合的载体蛋白有牛血清白蛋白、亲合素、链霉亲合素、甲状腺球蛋白、匙孔血蓝蛋白(KLH)、卵蛋白和人工合成的多聚赖氨酸。在优选的实施例中，所述载体是牛血清白蛋白、亲合素或链霉亲合素。
包被到结合垫上的抗体(a)和(b)的量可以为每种抗体0.5～4μl/cm，例如，该量可以为1-3μl/cm、1-2.5μl/cm、1-2μl/cm、0.5～2.5μl/cm等。包被到检测线上的检测抗原的量可以为1～10μl/cm，例如2～8μl/cm、3～7μl/cm、4～6μl/cm、1～3μl/cm等等。包被到质控线上的抗体(c)的量可以为1～10μl/cm，例如2～8μl/cm、3～7μl/cm、4～6μl/cm、1～3μl/cm等等。
本发明的抗体(a)和(b)是胶体金标记的。胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物，应用抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、单宁酸/柠檬酸钠和柠檬酸三钠等作用下(优选柠檬酸三钠还原剂)，聚合成特定大小的金颗粒，由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。胶体金标记，实质上是蛋白质高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理是胶体金颗粒表面的负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团因静电作用而形成牢固结合。这种球型的胶体金颗粒具有高电子密度，能够对多种生物高分子物质如葡萄球菌、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白等以非共价方式结合，使其成为免疫反应的优良标记物，因此广泛应用于各种物质的检测。可采用已知的胶体金标记技术标记本发明的抗体(a)和(b)。
因此，在本发明的一个优选实施例中，本发明的试纸条如图1所示，其中，在支撑胶板PVC(7)上沿垂直方向上顺次相互搭接地粘贴有硝酸纤维素膜(3)、结合垫(2)、样品垫(1)和吸水垫(6)。所述的结合垫(2)上包被有胶体金标记的抗体(a)和胶体金标记的抗体(b)。所述的硝酸纤维素膜(3)有检测线(4)和质控线(5)，检测线处(T)包被有检测抗原，质控线处(C)包被有抗体(c)，其中，检测抗原为MAP与载体蛋白的偶联物。“垂直方向”指图1中从下往上的方向。当然也可以改变各垫或膜在垂直方向上的位置，只要不影响样品基于毛细作用沿着各垫和膜泳动即可。这些都包括在本文“搭接”的范围中。
在本发明的另一优选实施例中，硝酸纤维素膜上的检测线检测抗原为1.0～2.5μl/cm的BSA-MAP偶联物、亲合素-生物素化MAP偶联物或链亲合素-生物素化MAP偶联物，质控线上的抗体(c)为1.0～3.0μl/cm的羊抗兔IgG。
在本发明另一优选实施例中，所述抗体(a)选自鼠抗人IgG、葡萄球A蛋白(SPA)、链球菌G蛋白或羊抗人IgG，抗体(b)是兔IgG，抗体(c)是羊抗兔IgG，抗原是BSA-MAP偶联物、亲合素-生物素化MAP偶联物或链亲合素-生物素化MAP偶联物；包被到结合垫上的抗体(a)和(b)的量为每种抗体0.5～4μl/cm，例如，该量可以为1-3μl/cm、1-2.5μl/cm、1-2μl/cm等；包被到检测线上的检测抗原的量为1～10μl/cm，例如2～8μl/cm、3～7μl/cm、4～6μl/cm、1.0～2.5μl/cm等等；包被到质控线上的抗体(c)的量可以为1～10μl/cm，例如2～8μl/cm、3～7μl/cm、4～6μl/cm、1.0～3.0μl/cm等等。
本发明第二方面提供一种制备本发明试纸条的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提供底板；
2)提供结合垫，并用金标抗体(a)和金标抗体(b)包被该结合垫；
3)提供硝酸纤维素膜，其中，所述硝酸纤维素膜有检测线和质控线，用可与抗环瓜氨酸肽抗体特异性结合的检测抗原包被该检测线，用质控抗体(c)包被该检测线；和
4)在所述底板上顺次相互搭接粘贴所述硝酸纤维素膜和结合垫，从而得到所述试纸条。
在一个优选实施例中，本发明方法还包括提供样品垫和/或吸水垫的步骤。
在一个实施例中，本发明提供样品垫的步骤还包括，用样品垫处理液处理该样品垫，该处理液含有0.5％～10％一种或几种大分子惰性蛋白，0.1％～3％离子盐缓冲液和0.01％～0.05％一种或几种表面活性剂。所述表面活性剂可为酸性、中性、碱性或两性活性剂。可根据工艺优化实验选择合适的试剂成分，将样品垫按30～50mL/片用处理液均匀洒在样品垫上，于37℃烘干后为备用样品垫。其中，所述大分子惰性蛋白优选为BSA、PEG20000、胆酸钠，离子盐缓冲液优选为Borax缓冲液，表面活性剂优选为TWEEN-20。在一优选实施例中，样品垫经如下处理液处理：用超纯水配制的0.05MBorax、0.1％Sodium Casein、1％PEG20000、2％BSA、0.05％Tween-20、0.05％NaN3。
在一实施例中，本发明提供结合垫的步骤还包括用处理液浸渍处理该结合垫，所述处理液含有0.5％～10％一种或几种大分子惰性蛋白，0.1％～3％离子盐缓冲液和0.1％～1％一种或几种表面活性剂。所述表面活性剂可为酸性、中性、碱性或两性活性剂。根据工艺优化实验选择合适的试剂成分，浸泡20～60分钟，37℃烘干。其中大分子惰性蛋白优选为PVA、BSA，离子盐缓冲液优选为磷酸钠盐，表面活性剂优选为Triton X-100。在一优选实施例中，结合垫经如下处理液处理：用超纯水配制的1％PVA、0.71％Na3PO4、1％BSA、0.05％NaN3、0.1％TritonX-100。在一优选实施例中，所述结合垫选自聚脂膜或玻璃纤维膜载体。
在一优选实施例中，经结合垫处理液处理的结合垫用BIO-Dot仪器将金标抗体(a)和金标抗体(b)混合物以0.5～4μl/cm喷涂于其上，25℃～30℃干燥，待干燥完毕之后，封袋，置2℃～8℃备用。金标抗体(a)和金标抗体(b)混合物可用如下稀释液稀释：溶于超纯水的约2.423-2.500g tris，10-12g BSA，0.2-0.4g NaN3，调PH至8.0，定容到1000mL。用稀释液将金标稀释到工作浓度后，加入20％Sucrose和5％海藻糖。
在一实施例中，所述金标抗体(a)和(b)如下制备：用0.05-0.2M、优选0.1-0.15的碳酸钾调节胶体金溶液的pH值至6.0～9.0，在每毫升胶体金溶液中缓慢加入4～25μg待标记抗体，搅拌10～30分钟，然后加入10％大分子物质的溶液至终浓度0.5～5％，继续搅拌10～30分钟，离心后弃去上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，用1/10的初始胶体金溶液体积的保存液将沉淀重悬，混匀后置4℃保存，备用。所述大分子物质选自葡萄球菌、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白(BSA)，优选BSA。
所述洗涤液可溶如下配制：2-3％BSA、0.05-0.08％NaN3、0.01-0.2M pH 7.2PBS，用超纯水配制，0.22μm膜滤过，置4℃备用。
可采用常规的方法制备胶体金。在一实施例中，将0.01-0.05％的HAuCl4溶液加热至沸腾，每100mL HAuCl4溶液加入1mL～2ml 1-3％柠檬酸三钠溶液，开始有些蓝色，然后浅蓝、黑色，红色，煮沸7～10min出现透明的橙红色。再用超滤或微孔滤膜(0.45μm)过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。质量好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，液面出现油状物和大量黑色颗粒状沉淀物时弃用。
在一实施例中，硝酸纤维素膜用质控抗体(c)和检测抗原包被，包括用包被膜缓冲液稀释抗原即MAP偶联物至浓度为0.2～2.5mg/mL，将抗体(c)稀释到0.3～3.0mg/mL，使用BIO-Dot点膜仪以1～10μl/cm喷量将抗原和质控抗体(c)分别喷涂于硝酸纤维素膜上，然后置于37℃烘箱内，烘干后备用。在一实施例中，所述包被缓冲液包括9-13g NaCl、1.15-1.3g Na2HPO4、0.23-0.25g NaH2PO4、10-12g蔗糖、0.5-0.7g EDTA溶于1L超纯水中。在一实施例中，可采用现有技术合成检测抗原，或者可从市场上购得。
在一实施例中，在完成上述步骤后，在PVC胶板上顺次相互搭接粘贴硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫及吸水垫，按照要求切割成不同宽度的试纸条，加入适量干燥剂，装入铝箔袋中进行真空包装。
在一实施例中，本发明方法还包括提供加样器和/或说明书，并将铝箔袋、加样器和/或说明书装入试剂盒外包装盒中。
因此，本发明也提供一种试剂盒，该试剂盒包括本发明的试纸条、加样器、和说明书。
在本发明一个优选实施例中，包被硝酸纤维素膜上的检测线的方法包括：用包被膜缓冲液稀释BSA-MAP偶联物至浓度为0.2～2.5mg/mL，或者用包被膜缓冲液稀释亲合素-生物素化MAP偶联物至浓度为1.0～1.5mg/mL，或者用包被膜缓冲液稀释链亲合素-生物素化MAP偶联物至浓度为1.2～1.5mg/mL，BIO-Dot点膜仪以1.0～2.5μl/cm的喷量喷涂于硝酸纤维素膜检测线处。在此实施例中，质控线上的抗体(c)为羊抗兔IgG，用包被膜缓冲液将该抗体稀释至浓度为1.0～1.5mg/mL，用BIO-Dot点膜仪以1.0～3.0μl/cm的喷量喷涂于硝酸纤维素膜质控线上，置37℃烘箱内烘干后备用。
在一个具体实施例中，本发明制备试纸条的方法包括：
1)提供底板；
2)提供样品垫；
3)提供结合垫，其中所述结合垫包被有金标抗体(a)和金标抗体(b)；
4)提供硝酸纤维素膜，其中，所述硝酸纤维素膜有检测线和质控线，检测线包被可与抗环瓜氨酸肽抗体特异性结合的抗原，质控线包被可与金标抗体特异性结合的质控抗体(c)；
5)提供吸水垫；
6)在所述底板上顺次相互搭接粘贴所述硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫及吸水垫，从而得到所述试纸条；
7)提供抗原：人工合成环瓜氨酸肽或MAP-载体蛋白偶联物，或从市场上购得；
8)包被膜的制备：用包被膜缓冲液稀释抗原(优选为MAP-载体蛋白偶联物)至浓度为0.2～2.5mg/mL，将抗体(c)稀释到0.3～3.0mg/mL，使用BIO-Dot点膜仪以1～10μl/cm喷量将抗原和质控抗体(c)分别喷涂于硝酸纤维素膜上，然后置于37℃烘箱内，烘干后备用；
9)金标抗体的制备：用0.1M碳酸钾调节胶体金溶液的pH值至6.0～9.0，在每毫升胶体金溶液中缓慢加入4～25μg待标记抗体，搅拌10～30分钟，然后加入10％BSA溶液至终浓度0.5～5％，继续搅拌10～30分钟，离心后弃去上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，用1/10的初始胶体金溶液体积的保存液将沉淀重悬，混匀后置4℃保存，备用；
10)将制备好的金标抗体溶液，使用BIO-Dot点膜仪以0.5～4μl/cm的喷量喷于预处理的聚脂膜上，置于37℃烘箱内干燥，待干燥完毕，装于密封袋中，置2～8℃保存，备组装粘板用；
11)在PVC胶板上顺次相互搭接粘贴硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫及吸水垫，按照要求切割成不同宽度的试纸条，加入适量干燥剂，装入铝箔袋中进行真空包装；和
12)将铝箔袋、加样器及说明书装入试剂盒外包装盒中即为抗环瓜氨酸肽抗体检测试纸条。
本发明引进了质控线，即胶体金标记抗体(b)随着毛细效应层析向前，与固定于质控线处(C)上的抗体(c)发生免疫反应形成免疫复合物而被截留，逐渐富集形成较深的紫红色条带。抗体(b)、抗体(c)与捕获抗体即胶体金抗体(a)和检测抗原即环瓜氨酸肽都不发生免疫反应，也不会产生免疫交叉反应。引入的质控线所呈现的紫红色条带(C)是判定是否有足够标本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。
本发明检测原理为选用环瓜氨酸肽检测抗原喷涂于检测线，金标抗体(a)和金标抗体(b)的胶体金标记混合物喷涂于结合垫，利用间接法来检测血清样品中是否含有抗环瓜氨酸肽抗体。检测时，样本随着层析泳动到结合垫，浸润覆盖在结合垫上的金标混合物，其中人IgG和金标抗体(a)结合形成人IgG-金标抗体(a)复合物，由于毛细效应，此混合物沿硝酸纤维素膜泳动向前，若血清样品中有抗环瓜氨酸肽抗体，此混合物与包被于硝酸纤维素膜上的检测抗原发生特异免疫反应，形成三联体复合物而被截留在检测线上，逐渐富集形成较深的紫红色条带；由于毛细效应继续泳动向前，与此同时，金标抗体(b)与包被于质控线上的抗体(c)发生特异的免疫反应被截留，逐渐富集于质控线上形成较深的紫红色条带，多余的未结合的物质继续层析到吸水垫上，因此在检测线和质控线都出现条带的判为阳性结果；若血清样品中不含有抗环瓜氨酸肽抗体，金标抗体(a)到达检测线时，不与包被在检测线上的检测抗原发生免疫反应，因此在检测线处没有出现紫红色条带，而金标抗体(b)继续泳动向前与包被在质控线处抗体(c)发生特异免疫反应而被截留，逐渐富集在质控线上形成紫红色条带，因此仅在质控上出现条带的判为阴性结果。
所述检测为定性测定血清样本中抗环瓜氨酸肽抗体，辅助诊断类风湿关节炎。
所述样本是指来自哺乳动物，更优选来自人，包括血清、血浆和全血。
应理解，本发明第一方面所描述的特征也适用于第二方面的技术方案，第二方面所描述的技术特征也可适用于第一方面的技术方案。两个方面中所描述的特征及其各范围的任意组合均在本发明的范围之内。以下将以具体实施方式的形式阐述本发明。应理解，这些实施例是阐述性的，而非限制性的。实施例中所使用的制剂均为常规制剂，其用量及计算单位也均为常规所用。此外，实施例12描述了本申请各具体实施例所使用的各种溶液，如包被缓冲液等。
实施例1：环瓜氨酸肽结构
不同的环瓜氨酸肽(CCP)有细微的差别，呈现出不同的抗原表位，其中之一的环瓜氨酸肽的氨基酸序列为：
其中“S---S”表示二硫键，X表示瓜氨酸，其他字母分别为常见氨基酸的单字母记号，即H表示组氨酸、Q表示谷氨酰胺、C表示半胱氨酸、E表示谷氨酸、S表示丝氨酸、T表示苏氨酸、G表示甘氨酸、R表示精氨酸。
环瓜氨酸肽的分枝抗原肽(MAP)结构是以多聚赖氨酸(poly-Lys，PL)为核心基质，一般采取2～8个分枝，这些分枝可以为各不相同的环瓜氨酸肽的抗原表位，根据最新研究进展相应的增加新的分枝抗原表位，提高检测性能。现以四个分枝为例，其结构大致如下：
Figure G2009100557245D00132
图中表示相同的四个CCP构成的抗原表位扩展图。以上人工合成的MAP结构，纯度要求HPLC方法大于95％。
由Invitrogen公司合成上述结构所示的MAP，其中的CCP结构如前所述，并用于本发明的下述实施例中。
实施例2：抗原偶联
1.载体为牛血清白蛋白(BSA)
采用碳化二亚胺法将牛血清白蛋白与MAP偶联，碳化二亚胺是一种化学性质非常活跃的双功能试剂，它们既可与半抗原上的羧基又可与半抗原上的氨基缩合。此法是将半抗原多肽的氨基与载体蛋白质牛血清白蛋白按一定分子比(本研究采用1∶1比例)混合在适当的溶液中，然后加入碳二亚胺，搅拌1～2h，置室温反应24h，最后透析除去未反应的半抗原和载体蛋白，即可得到MAP偶联物。然后采用紫外光谱测定其浓度进行定量。反应模式如下：
2.载体为亲合素
亲合素先用超纯水稀释至5～10mg/ml，再用0.01M PBS稀释到1～3mg/ml，然后与商品化的生物素化的MAP偶联物按摩尔比1∶4混合，4℃孵育过夜即成为亲合素-生物素化MAP偶联物。
3.载体为链霉亲合素
亲合素先用超纯水稀释至5～10mg/ml，再用0.01M PBS稀释到1～3mg/ml，然后与商品化的生物素化的MAP偶联物按摩尔比1∶4混合，4℃孵育过夜即为链亲合素-生物素化MAP偶联物。
实施例3：抗体制备
抗体(a)是通过纯化的人IgG为免疫原，免疫哺乳动物制备抗人IgG多克隆抗体或单克隆抗体，也可以通过克隆化基因原核表达葡萄球A蛋白(SPA)或链球菌G蛋白(Protein G)或购买商品化试剂(上海悦克生物科技有限公司)来实现试纸条制备。
抗体(b)和抗体(c)可发生免疫反应形成免疫复合物，可通过常规实验方法制备。或购买商品化试剂(上海悦克生物科技有限公司)。
实施例4：确定金标抗体混合物的方案一
1.质控抗体(c)和检测抗原的包被(检测抗原为MAP-BSA偶联物)
包被缓冲液将MAP-BSA偶联物稀释到0.2～2.5mg/mL，调整BIO-Dot仪器，喷量为2.2～2.5μl/cm距结合垫端约12mm的硝酸纤维素膜上作为检测线(T)；用包被缓冲液将羊抗兔IgG稀释到1.3～1.5mg/mL，喷量为1.0～3.0μl/cm喷距吸水垫约9mm为质控线(C)。两线距离约5～8mm，喷线应粗细均匀。37℃烘干，封装备用。
2.确定两金标比例的调试方法
以MAP-BSA偶联物为检测抗原，金标羊抗人IgG和兔IgG为例来说明比例的确定，其他抗体如鼠抗人IgG和兔IgG、葡萄球A蛋白和兔IgG、链球菌G蛋白和兔IgG也可据此方法来确定。
通过预实验基本确定金标兔IgG的OD20，用BIO-Dot喷量1μl/cm喷于结合垫上，用0.01MPBS为上样缓冲液，即能得到预期的颜色强度的条带，确定兔IgG的应用OD 20喷量为1μl。
随后将金标羊抗人IgG进行梯度稀释至终浓度OD 100、80、60、40、20，然后将金标兔IgG稀释到终浓度OD 20，用BIO-Dot将以上金标羊抗人IgG和金标兔IgG混合物喷量为3μl/cm喷于处理好的聚酯膜，将制备的硝酸纤维素膜、结合垫、样本垫、吸水垫依次粘贴于塑料底板上，用阳性血清、临界参考值血清、阴性血清为调试对象。判定依据：临界参考值血清检测，其检测线(T)处能出现条带，阴性血清检测时，其检测线(T)未出现条带的那个OD值即金标羊抗人IgG的应用量。通过本试验得出的结论OD60较为符合要求。
实施例5：确定金标抗体混合物的方案二
1.质控抗体(c)和检测抗原的包被(检测抗原为亲合素-生物素化MAP)
包被缓冲液将亲合素-生物素化MAP稀释至1.0～1.5mg/mL，调整BIO-Dot仪器，喷量为1.5～2.0μl/cm距结合垫端约12mm的硝酸纤维素膜上作为检测线(T)；用包被缓冲液将羊抗兔IgG稀释到1.0～1.5mg/mL，喷量为1.0～3.0μl/cm喷距吸水垫约9mm为质控线(C)。两线距离约5～8mm，喷线应粗细均匀。37℃烘干，封装备用。
2.确定两金标比例的调试方法
以亲合素-生物素化MAP为检测抗原，以金标羊抗人IgG和兔IgG为例来说明比例的确定，其他抗体如鼠抗人IgG和兔IgG、葡萄球A蛋白和兔IgG、链球菌G蛋白和兔IgG也可据此方法来确定。
通过预实验基本确定金标兔IgG的OD20，用BIO-Dot喷量1μl/cm喷于结合垫上，用0.01MPBS为上样缓冲液，即能得到预期的颜色强度的条带，确定兔IgG的应用OD 20喷量为1μl。
随后将金标羊抗人IgG进行梯度稀释至终浓度OD 100、80、60、40、20，然后将金标兔IgG稀释到终浓度OD 20，用BIO-Dot将以上金标羊抗人IgG和金标兔IgG混合物喷量为3μl/cm喷于处理好的聚酯膜，将制备的硝酸纤维素膜、结合垫、样本垫、吸水垫依次粘贴于塑料底板上，用阳性血清、临界参考值血清、阴性血清为调试对象。判定依据：临界参考值血清检测，其检测线(T)处能出现条带，阴性血清检测时，其检测线(T)未出现条带的那个OD值即金标羊抗人IgG的应用量。通过本试验得出的结论OD80较为符合要求。
实施例6：确定金标抗体混合物的方案三
1.质控抗体(c)和检测抗原的包被(检测抗原为链霉亲合素-生物素化MAP)
包被缓冲液将链霉亲合素-生物素化MAP稀释到1.2～1.5mg/mL，调整BIO-Dot仪器，喷量为1.5～2.0μl/cm距结合垫端约12mm的硝酸纤维素膜上作为检测线(T)；用包被缓冲液将羊抗兔IgG稀释到1.0～1.5mg/mL，喷量为1.0～3.0μl/cm喷距吸水垫约9mm为质控线(C)。两线距离约5～8mm，喷线应粗细均匀。37℃烘干，封装备用。
2.确定两金标比例的调试方法
以链霉亲合素-生物素化MAP为检测抗原，以金标羊抗人IgG和兔IgG为例来说明比例的确定，其他抗体如鼠抗人IgG和兔IgG、葡萄球A蛋白和兔IgG、链球菌G蛋白和兔IgG也可据此方法来确定。
通过预实验基本确定金标兔IgG的OD20，喷量1μl/cm，用BIO-Dot喷于结合垫上，用0.01MPBS为上样缓冲液，即能得到预期的颜色强度的条带，确定兔IgG的应用OD 20喷量为1μl。
随后将金标羊抗人IgG进行梯度稀释到终浓度OD 100、80、60、40、20，然后将金标兔IgG稀释到终浓度OD 20，用BIO-Dot将以上金标羊抗人IgG和金标兔IgG混合物喷量为3μl/cm喷于处理好的聚酯膜，将制备的硝酸纤维素膜、结合垫、样本垫、吸水垫依次粘贴于塑料底板上，用阳性血清、临界参考值血清、阴性血清为调试对象。判定依据：临界参考值血清检测，其检测线(T)处能出现条带，阴性血清检测时，其检测线(T)未出现条带的那个OD值即金标羊抗人IgG的应用量。通过本试验得出的结论OD60较为符合要求。
实施例7：试纸条的制备方法
本发明所述胶体金层析法检测样本中抗环瓜氨酸肽抗体的试纸条的制备方法如下
1.包被膜的制备
用包被缓冲液稀释检测抗原至0.2～2.5mg/mL，调整BIO-Dot仪器，喷涂检测线(T)0.8～2.5μl，距结合垫端约12mm；用包被缓冲液稀释羊抗兔IgG至1.0～1.5mg/mL，用BIO-Dot仪器喷涂羊抗兔IgG于质控线(C线)距吸水垫约9mm。两线距离约5～8mm，喷线应粗细均匀。37℃烘干，封装备用。
2.胶体金溶液制备
将0.01％的HAuCl4溶液加热至沸腾，每100mL HAuCl4溶液加入1mL～2ml 1％柠檬酸三钠溶液，开始有些蓝色，然后浅蓝、黑色，红色，煮沸7～10min出现透明的橙红色。再用超滤或微孔滤膜(0.45μm)过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。质量好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，液面出现油状物和大量黑色颗粒状沉淀物时弃用。
3.捕获抗体(a)的标记
用0.1M碳酸钾调胶体金的pH值至6.0～9.0，按每毫升胶体金溶液加入8～25μg抗体(a)，磁力搅拌10～30分钟，然后加入10％BSA至终浓度0.5～5％，继续搅拌10～30分钟。6000～10000g/min 4℃离心20～40min，弃上清，沉淀用洗涤液洗涤两次，末次用十分之一初始胶体金体积的洗涤液重悬，置4℃备用。
4.兔IgG(抗体(b))的标记
用0.1M碳酸钾调胶体金的pH值至7.0～8.0，按每毫升胶体金溶液加入10～12μg兔IgG，磁力搅拌10～30分钟，然后加入10％BSA至终浓度0.2～1％，继续搅拌10～30分钟。6000～10000g/min 4℃离心20～40min，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤两次，末次用十分之一初始胶体金体积的标记保存液重悬，置4℃备用。
5.结合垫的处理
将结合垫浸泡在结合垫处理液30分钟，37℃烘干。金标抗体混合物的应用OD和喷量的确定参考实施例4、实施例5、实施例6，用BIO-Dot将其喷于预处理的聚脂膜，37℃干燥，用铝箔袋封装，备用。
6.样品垫的处理
将样品垫按45mL/片用样品垫处理液均匀洒在样品垫上。于37℃烘干后，用铝箔袋封装，备用。
7.原材料预裁剪
1)玻璃纤维膜的裁切：用裁切机将玻璃纤维膜切成长28厘米，宽2.4厘米，置干燥房间备用。
2)吸水纸的裁切：用裁纸机将吸水纸切成长28厘米，宽3厘米，置干燥房间备用。
3)聚脂膜的裁切：根据喷膜的约长28厘米，宽1厘米来裁切，置干燥房备用。
4)将硝酸纤维素膜、聚脂膜、玻璃纤维膜、吸水纸按图1所显示依次层叠在PVC底板上，组成大板。组装车间温度应控制在25℃～37℃，湿度20％～30％。
8.切条
用切条机将大板切成单人份，每人份宽度按照一定要求切成2.5～4mm的宽度，随机抽检，灵敏度能检出室内质控样品(即临界值血清样本)，条带显色结果如图2b，且无非特异性条带，阴性样品检测结果如图2c，则产品通过其他质控要求即为合格产品。
9.组装、包装
将1人份已切好的试纸条组装在备好的试纸卡里，使加样窗对应试纸条的样品垫，结果显示窗对应检测区和控制区，组装车间温度应控制在25℃～37℃，湿度20％～30％。再与干燥剂、说明书、加样器封装在外包装袋里，于4～25℃避光保存。
实施例8：捕获抗体为鼠抗人IgG
此实施例所述的胶体金层析法检测血液抗环瓜氨酸肽抗体的试纸条的制备方法，与实施例7不同之处在于：
1.在步骤3中捕获抗体为鼠抗人IgG，具体标记方法为：
用0.1M碳酸钾调胶体金溶液的pH值至6.5～7.5，按每毫升胶体金溶液加入8～10μg鼠抗人IgG，磁力搅拌器搅拌混匀10～30分钟，然后加入10％BSA至终浓度0.2～2％，磁力搅拌器搅拌混匀10～30分钟。6000～10000g/min 4℃离心20～40min，弃上清，沉淀用洗涤液洗涤两次，末次用十分之一初始胶体金体积的保存液重悬，置4℃备用。
2.在步骤5中相应的金标抗体(a)为金标鼠抗人IgG，金标抗体(b)为金标兔IgG，其实验方法同步骤.具体为：结合垫预处理即在结合垫处理液浸渍30分钟，37℃烘干。将金标混合物用BIO-Dot以2-4μl/cm喷于预处理的聚脂膜，37℃干燥，用铝箔袋封装，备用。
实施例9：捕获抗体为葡萄球菌A蛋白(SPA)
此实施例所述的胶体金层析法检测血液抗环瓜氨酸肽抗体的试纸条的制备方法，与实施例7不同之处在于：
1.在步骤3中捕获抗体为葡萄球菌A蛋白
用0.1M碳酸钾调节胶体金溶液的pH值至5.0～6.5，按每毫升胶体金溶液加入8～15μg葡萄球菌A蛋白，磁力搅拌10～30分钟，然后加入10％BSA至终浓度0.2～3％，继续搅拌10～30分钟。6000～10000g/min 4℃离心20～40min，弃上清，沉淀用洗涤液洗涤两次，末次用十分之一初始胶体金体积的保存液重悬，置4℃备用。
2.在步骤5中相应的金标抗体(a)为金标葡萄球菌A蛋白，金标抗体(b)为金标兔IgG，其实验方法同步骤5具体为：结合垫预处理即在结合垫处理液浸渍30分钟，37℃烘干。将金标混合物用BIO-Dot以2-4μl/cm喷于预处理的聚脂膜，37℃干燥，用铝箔袋封装，备用。
实施例10：捕获抗体为链球菌G蛋白(Protein G)
此实施例所述的胶体金层析法检测血液抗环瓜氨酸肽抗体的试纸条的制备方法，与实施例7不同之处在于：
1.在步骤3中捕获抗体为链球菌G蛋白
用0.1M碳酸钾调节胶体金的pH值至6.5～7.5，按每毫升胶体金溶液加入9～14μg链球菌G蛋白，磁力搅拌10～30分钟，然后加入10％的BSA至终浓度0.2～1％，继续搅拌10～30分钟。6000～10000g/min 4℃离心20～40min，弃上清，沉淀用洗涤液洗涤两次，末次用十分之一初始胶体金体积的保存液重悬，置4℃备用。
2.在步骤5中相应的金标抗体(a)为金标链球菌G蛋白，金标抗体(b)为金标兔IgG，其实验方法同步骤5具体为：结合垫预处理即在结合垫处理液浸渍30分钟，37℃烘干。将金标混合物用BIO-Dot以2-4μl/cm喷于预处理的聚脂膜，37℃干燥，用铝箔袋封装，备用。
实施例11：捕获抗体为羊抗人IgG
此实施例所述的胶体金层析法检测血液抗环瓜氨酸肽抗体的试纸条的制备方法，与实施例7不同之处在于：
1.在步骤3中捕获抗体为羊抗人IgG
用0.1M碳酸钾调节胶体金溶液的pH值至8.0～9.0，按每毫升胶体金溶液加入8～12μg羊抗人IgG，磁力搅拌10～30分钟，然后加入10％BSA至终浓度0.2～2.5％，继续搅拌10～30分钟。6000～10000g/min 4℃离心20～40min，弃上清，沉淀用洗涤液洗涤两次，末次用十分之一初始胶体金体积的保存液重悬，置4℃备用。
2.在步骤5中相应的金标抗体(a)为金标羊抗人IgG，金标抗体(b)为金标兔IgG，其实验方法同步骤5具体为：结合垫预处理即在结合垫处理液浸渍30分钟，37℃烘干。将金标混合物用BIO-Dot以2-4μl/cm喷于预处理的聚脂膜，37℃干燥，用铝箔袋封装，备用。
实施例12：试纸条组成及试剂配制
本发明提供的一种胶体金层析法检测样本中的抗环瓜氨酸肽抗体的试纸条的组成：是在支撑胶板PVC(7)上顺次相互搭接地粘贴包被检测抗原和质控抗体的硝酸纤维素膜(3)、结合垫(2)、样品垫(1)、吸水垫(6)。所述的结合垫(2)上包被有金标抗体(a)和金标抗体(b)兔IgG。所述的硝酸纤维素膜(3)有检测线和质控线，检测线(T)包被有检测抗原，质控线(C)包被有羊抗兔IgG。
本发明所述的胶体金免疫层析法检测样本中抗环瓜氨酸肽抗体的试纸条，所用的试剂配制如下(使用的各成分可从市场上购得)：
1)包被缓冲液的配制：9g NaCl、1.15g Na2HPO4、0.23g NaH2PO4、10g蔗糖、0.5gEDTA溶于1L超纯水中，过滤置于4℃备用。
2)HAuCl4的配制：用超纯水溶解HAuCl4，配成1％溶液，置4℃备用，有效期四个月。1000mL 1％HAuCl4溶液配方：10g HAuCl4；超纯水定容至1000mL。
3)1％柠檬酸三钠的配制：用超纯水溶解柠檬酸三钠，配成1％溶液，0.22μm膜滤过，有效期1个月。
4)0.1M K2CO3的配制：用超纯水配制，0.22μm膜滤过，置4℃备用，有效期一个月。1000mL 0.1M K2CO3溶液配方：13.8g K2CO3；超纯水定容至1000mL。
5)10％BSA的配制：用超纯水配制，0.05％(NaN3)，0.22μm膜滤过，置4℃备用，有效期两周。1000mL 10％BSA溶液配方：100g BSA，0.5g NaN3；超纯水定容至1000mL。
6)洗涤液也即保存液的配制：2％BSA、0.05％NaN3、0.01M pH 7.2PBS，用超纯水配制，0.22μm膜滤过，置4℃备用，有效期两周。1000mL标记洗涤保存液配方：20g BSA、0.5g NaN3、0.01M pH 7.2PBS定容至1000mL。
7)结合垫处理液的配制：
1％PVA、0.71％Na3PO4、1％BSA、0.05％NaN3、0.1％TritonX-100，用超纯水配制，置4℃备用，有效期两周。1000ml所需试剂为：10g PVA、7.1g Na3PO4、10g BSA、0.5g NaN3、1ml TritonX-100。
8)金标稀释液的配制：
1000mL稀释液的配制：2.423g tris，10gBSA，0.2gNaN3溶于超纯水中，调PH至8.0，定容到1000mL。用稀释液将金标稀释到工作浓度后，加入20％Sucrose和5％海藻糖。
9)样品垫处理液的配制：
0.05MBorax、0.1％Sodium Casein、1％PEG20000、2％BSA、0.05％Tween-20、0.05％NaN3，用超纯水配制，置4℃备用，有效期两周。1000mL所需的试剂：19g Borax、1g Sodium Casein、10g PEG20000、20g BSA、0.5ml Tween-20、0.5g NaN3。
实施例13：样本处理及加样方式
静脉采血1-5ml，血清自然析出后，以3000g/min离心5～10分钟，取上清即得到待测样品溶液，至少有100μl以上待测样品溶液。
用微量加样器吸取以上血清50～70μl样本于样品垫，缓慢加样。或者用加样器将血清样本缓慢滴加3～5滴于样品垫上，5～10分钟观察结果，根据条带出现情况来判读阴阳性结果。
实施例14：试剂盒的检测和临床性能评估
1稳定性试验
1.137℃加速稳定性
将试纸条置于37℃进行加速实验，按1天、3天、7天、21天、1月、2月、3月、4月取出用室内质控品进行测试，通过阴阳性参考品(各10份)的阴阳性符合率的批内精密度来判断试纸条的稳定性。4个月后结果显示，质控品的检测结果符合预期，各个阴阳性参考品的阴阳性符合率为100％。阴阳性参考品为10份抗CCP抗体阳性血清和10份抗CCP抗体阴性血清。
1.24℃稳定性实验
将试纸条置于4℃进行常规稳定性实验，每月取出用室内质控品测试，同样通过阴阳性参考品(各10份)的阴阳性符合率的批内精密度来判断试纸条的稳定性。12个月后结果显示，质控品检测结果符合预期，各个阴阳性参考品的阴阳性符合率为100％。14个月后结果显示，各个阴阳性参考品的阴阳性符合率仍为100％。18个月后检测结果显示，出现一例假阴性。综合以上结果说明试纸条在2～8℃贮存，至少一年内是稳定的。
2.诊断灵敏度
从临床中收集到323份确诊为类风湿性关节炎(RA)病人的血清，用自制的胶体金试纸条按照说明书上的操作步骤对上面收集到的RA病人血清进行检测。5分钟后统计结果如下：
Figure G2009100557245D00221
根据上面统计的结果，根据对323份确认的RA病人血清的检测，可以发现有抗CCP抗体阳性的样本数量为229例，阴性样本数量为94例。因此通过计算得出：
诊断灵敏性(％)＝229/(229+94)×100％＝70.9％
3.诊断特异性
从临床中收集到健康献血者血清和非RA病人(包括其他风湿性疾病和骨关节疾病等)血清各300份，用自制的胶体金试纸条按照说明书上的操作步骤对上面收集的健康献血者和非RA病人的血清进行检测。5分钟后统计结果如下：
Figure G2009100557245D00222
根据对非RA病人和健康献血者各300份血清检测的统计结果，可以发现在健康献血者中测得抗CCP抗体阴性的样本数量为298例，而非RA病人血清的抗CCP抗体阴性的样本数量为296例。因此通过计算得出：
(健康献血者)诊断特异性(％)＝298/300×100％＝99.3％
(非RA病人血清)诊断特异性(％)＝296/300＝98.7％
600例对照组(包括健康献血者和非RA病人血清)
诊断特异性(％)＝594/600＝99.0％
4.诊断准确性
根据上面诊断特异性和诊断灵敏度的统计，得到下面这个总表：
测定结果   临床明确诊断RA患者   非RA患者和健康献血者 合计
  阳性   229   6   235
  阴性   94   594   688
  合计   323   600   923
根据上面的统计表，我们可以看到对于确认为RA的病人，检测到阳性样本数为229例，对600例健康献血者和非RA病人血清中，检测到阴性样本数为594例。
即：诊断准确性＝(229+594)/923＝89.2％
5.批内不精确度
选用生产的某一批试纸条，同时选择四种不同浓度的血清(高、中、低、阴性)各一份，每份血清做10个重复，5分钟后观察结果。
  不同血清   阴性结果数   阳性结果数
  强阳血清   0   10
  中阳血清   0   10
  弱阳血清   0   10
  阴性血清   10   0
根据上面的结果，用生产的同一批次的抗CCP抗体的胶体金试纸条，对四份不同的血清进行检测，每个检测做10次，均能够准确的区分出阴阳性，得到一致的阴阳性结果。
从以上结果，可以得出以下结论：抗CCP抗体胶体金检测试纸条没有存在批内不精密现象。
6.批间不精确度
选用生产的三批不同抗CCP抗体胶体金检测试纸条，同时选择四种不同浓度的血清(高、中、低、阴性)各一份，每份血清做10个重复，5分钟后观察结果。
Figure G2009100557245D00241
根据上面的结果，采用生产的不同批次的三批抗CCP抗体胶体金试纸条，对四份不同的血清进行检测，每个检测做10次，均能够准确的区分出阴阳性，得到一致的阴阳性结果。
从以上结果，可以得出以下结论：抗CCP抗体胶体金检测试纸条没有存在批间不精密现象。
7.与同类检测项目不同方法学的产品-德国欧蒙公司生产的抗CCP抗体检测试剂盒(ELISA法)的对比试验
从临床收集随机患者样本血清200份，分别用欧蒙的ELISA试剂盒和自制的抗CCP抗体胶体金试纸条进行检测，得到以下结果：
阳性符合率：137/139×100％＝98.6％
阴性符合率：60/61×100％＝98.4％
总的符合率：(137+60)/200＝98.5％
根据上面的统计，自制抗CCP抗体胶体金检测试剂和欧蒙的ELISA试剂盒总的符合率可以达到98.5％。
参考文献
1.Osikowicz G et al.One-step chromatographic immunoassay for qualitativedetermination of choricogonadotropin in urine.Clin Chem.1990，36：1583-1586。
2.Vallbracht I，Rieber J，Oppermann M.et al.Diagnostic and clinical value ofanti-cyclic citrullinated peptide antibodies compared with rheumatoid factor isotypes inrheumatoid arthritis.Ann Rheum Dis.2004(63)：1079-1084。
3.
Figure G2009100557245D00251
-Dahlqvist S，de Jong BA，Berglin E.et al.Antibodies against cycliccitrullinated peptide and IgA rheumatoid factor predict the development of rheumatoidarthritis.Arthritis Rheum.2003(48)：2741-2749。
4.Forslind K，Ahlmén M，Eberhardt K.et al.Prediction of radiological outcome inearly rheumatoid arthritis in clinical practice：role of antibodies to citrullinated peptides(anti-CCP).Ann Rheum Dis.2004(63)：1090-1095。
5.Meyer O，Nicaise-Roland P，Santos MD.Serial determination of cycliccitrullinated peptide autoantibodies predicted five-year radiological outcomes in aprospective cohort of patients with early rheumatoid arthritis.Arthritis Res Ther.2006，8(2)：R40。
6.G，Milstein C.Continuous cultures of fused cells secreting antibody ofpredefined specificity.Nature.1975(8)：495-497。
7.Clackson T，Hoogenboom HR，Griffiths AD.et al.Making antibody fragmentsusing phage display libraries.Nature.1991(15)：624-628。
8.Marks JD，Hoogenboom HR，Bonnert TP.et al.By-passing immunization Humanantibodies from V-gene libraries displayed on phage.J Mol Biol.1991(5)：581-597。
9.朱立平，陈学清.免疫学常用实验方法.人民军医出版社.2000，15-26。
10.J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞饵，分子克隆实验指南，第三版，2002：1228-1232。

Claims (2)

1.一种检测抗环瓜氨酸肽抗体的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括水平方向上依次相互搭接粘贴在底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，所述结合垫包被有金标抗体a和金标抗体b，所述硝酸纤维素膜有检测线和质控线，检测线包被可与抗环瓜氨酸肽抗体特异性结合的检测抗原，质控线包被质控抗体c；
其中，抗体a仅在与抗环瓜氨酸肽抗体结合的情况下与检测抗原结合；
其中，抗体b不与抗环瓜氨酸肽抗体以及检测抗原结合；
所述结合垫上金标抗体a和金标抗体b的OD比为1：1；
所述抗体a选自鼠抗人IgG、葡萄球菌A蛋白、链球菌G蛋白和羊抗人IgG；
所述抗体b选自兔IgG；质控线上的抗体c为1.0～3.0μl/cm的羊抗兔IgG，包被到结合垫上的抗体a和b的量为每种抗体0.5～4μl/cm；
所述检测抗原为1.0～2.5μl/cm的BSA-MAP偶联物、亲合素-生物素化MAP偶联物或链亲合素-生物素化MAP偶联物；其中BSA-MAP偶联物的制备方法是：将半抗原多肽的氨基与载体蛋白质牛血清白蛋白按分子比为1：1的比例混合在适当的溶液中，然后加入碳二亚胺，搅拌l～2h，置室温反应24h，最后透析除去未反应的半抗原和载体蛋白，即可得到BSA-MAP偶联物；
所述亲合素-生物素化MAP偶联物的制备方法是：亲合素先用超纯水稀释至5～10mg/ml，再用0.01M PBS稀释到1～3mg/ml，然后与商品化的生物素化的MAP偶联物按摩尔比1:4混合，4℃孵育过夜即成为亲合素-生物素化MAP偶联物；
所述链亲合素-生物素化MAP偶联物的制备方法是：链亲合素先用超纯水稀释至5～10mg/ml，再用0.01M PBS稀释到1～3mg/ml，然后与商品化的生物素化的MAP偶联物按摩尔比1:4混合，4℃孵育过夜即为链亲合素-生物素化MAP偶联物。
2.一种制备权利要求1中所述的试纸条的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1）提供底板；
2）提供结合垫，并用金标抗体a和金标抗体b包被该结合垫；
3）提供硝酸纤维素膜，其中，所述硝酸纤维素膜有检测线和质控线，用可与抗环瓜氨酸肽抗体特异性结合的检测抗原包被该检测线，用质控抗体c包被该质控线；和
4）在所述底板上顺次相互搭接粘贴所述硝酸纤维素膜和结合垫，从而得到所述试纸条。
CN200910055724.5A 2009-07-31 2009-07-31 检测血液抗环瓜氨酸多肽抗体的试纸条及制备方法 Active CN101988924B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200910055724.5A CN101988924B (zh) 2009-07-31 2009-07-31 检测血液抗环瓜氨酸多肽抗体的试纸条及制备方法
PCT/CN2010/075228 WO2011012053A1 (zh) 2009-07-31 2010-07-19 检测血液抗环瓜氨酸多肽抗体的试纸条及制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200910055724.5A CN101988924B (zh) 2009-07-31 2009-07-31 检测血液抗环瓜氨酸多肽抗体的试纸条及制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101988924A CN101988924A (zh) 2011-03-23
CN101988924B true CN101988924B (zh) 2014-06-11

Family

ID=43528764

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200910055724.5A Active CN101988924B (zh) 2009-07-31 2009-07-31 检测血液抗环瓜氨酸多肽抗体的试纸条及制备方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN101988924B (zh)
WO (1) WO2011012053A1 (zh)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102207507A (zh) * 2011-03-24 2011-10-05 武汉璟泓万方堂医药科技有限公司 心肌肌钙蛋白半定量检测试纸及制备方法
CN102297963A (zh) * 2011-05-30 2011-12-28 吉权 一种胎膜早破胶体金试纸反应缓冲液及其制备方法
CN102323402A (zh) * 2011-05-30 2012-01-18 上海精臻生物科技有限公司 抗环瓜氨酸肽抗体体外检测试剂盒及制备方法
CN103076447B (zh) * 2012-12-27 2015-04-08 上海市疾病预防控制中心 血吸虫虫卵粗抗原纯化方法、相关的纯化抗原和血吸虫抗体检测胶体金免疫试剂盒
CN104076139B (zh) * 2014-05-30 2015-11-25 广州万孚生物技术股份有限公司 用于免疫层析试纸条的固化液及其制备方法
CN104198731B (zh) * 2014-08-28 2015-12-09 宁波瑞源生物科技有限公司 一种c反应蛋白半定量检测试剂及应用该试剂的试纸
CN105891468A (zh) * 2016-04-08 2016-08-24 四川新健康成生物股份有限公司 一种样品释放垫处理液
CN107402298A (zh) * 2016-05-18 2017-11-28 上海新吉而生物科技有限公司 一种犬粪包虫病抗原快速检测试剂盒及其使用方法
CN108152511B (zh) * 2017-12-20 2019-01-04 广州瑞辉生物科技股份有限公司 柯萨奇A16病毒抗原多肽及其IgM抗体检测试剂盒
CN111089966A (zh) * 2019-12-31 2020-05-01 杭州南开日新生物技术有限公司 一种检测农兽药及非法添加物的胶体金试纸条及其制备方法
CN111398587B (zh) * 2020-04-02 2023-02-28 安徽科技学院 一种检测宫颈癌的胶体金侧向层析试纸条及其制备方法
CN111879933B (zh) * 2020-07-30 2023-10-03 广州德成生物科技有限公司 检测新型冠状病毒的免疫层析试纸
CN114280312B (zh) * 2020-09-27 2023-09-15 河北特温特生物科技发展有限公司 一种用于免疫荧光层析检测的全血分离膜及其制备方法和应用
CN112710832A (zh) * 2020-12-22 2021-04-27 扬州大学 一种基于Fiber2蛋白的检测血清4型禽腺病毒的试纸条
CN113063938B (zh) * 2021-03-13 2023-09-12 河南省农业科学院 一种高灵敏梯度半定量免疫层析检测试纸条及检测方法
CN113030456A (zh) * 2021-04-02 2021-06-25 山东康华生物医疗科技股份有限公司 一种抗环瓜氨酸肽抗体的检测试纸条、检测卡及试剂盒
CN113189331B (zh) * 2021-04-15 2023-07-18 中国农业科学院烟草研究所(中国烟草总公司青州烟草研究所) 一种烟草青枯病菌快速免疫检测试纸条及其制备方法和应用
CN114113615B (zh) * 2021-12-03 2024-03-05 河南省农业科学院 一种通用型单克隆抗体筛选的免疫层析检测试纸条及检测方法
CN114264827A (zh) * 2021-12-30 2022-04-01 苏州和锐生物科技有限公司 一种白介素生物制剂的抗体检测试剂盒及制备方法
CN114397458A (zh) * 2022-01-25 2022-04-26 山东康华生物医疗科技股份有限公司 一种用于肺炎支原体抗原检测的检测盒
CN116027035B (zh) * 2023-03-30 2023-06-13 济南玖方生物科技有限公司 一种用于提高hiv1/2尿液胶体金免疫层析检测准确率的试剂盒及制备方法
CN116819070B (zh) * 2023-07-10 2024-03-22 希莱乐检(郑州)生物科技有限公司 用于体液中目标物检测的试纸条、检测装置及检测方法
CN117110603B (zh) * 2023-07-14 2024-07-02 深圳市睿盟创新生物科技有限公司 联合检测抗mcv抗体、抗ccp抗体和rf的荧光免疫层析试纸条
CN117147885B (zh) * 2023-11-01 2024-01-12 广东省大湾区华南理工大学聚集诱导发光高等研究院 一种毛发中多项毒品联合测定试剂及其制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1746675A (zh) * 2004-09-07 2006-03-15 李人 免疫层析测试条及其制造方法
CN1796997A (zh) * 2004-12-22 2006-07-05 上海富纯中南生物技术有限公司 诊断ra的检测试剂盒、制备及完成质量检测标准的方法
CN101246177A (zh) * 2007-02-14 2008-08-20 北京华安佛医药研究中心有限公司 同型半胱氨酸免疫胶体金检测试纸条及其制备方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1882946B1 (en) * 2003-12-23 2010-02-17 Roche Diagnostics GmbH Method of assessing rheumatoid arthritis by measuring anti-CCP and interleukin 6
JP4411416B2 (ja) * 2004-11-09 2010-02-10 独立行政法人理化学研究所 関節リウマチ診断における抗シトルリン化コラーゲン・タイプｉコラーゲンの利用
US20070148704A1 (en) * 2005-10-06 2007-06-28 Ursula Klause Anti-CCPand antinuclear antibodies in diagnosis of rheumatoid arthritis
CN101025418A (zh) * 2006-02-23 2007-08-29 上海富纯中南生物技术有限公司 用于诊断ra的多联抗原膜片法检测试剂盒及其制作方法
CN101109753A (zh) * 2007-08-30 2008-01-23 上海交通大学 用胶体金免疫层析试验检测大肠杆菌志贺毒素的方法
EP2058663A1 (en) * 2007-11-12 2009-05-13 Euro-Diagnostica B.V. Method for the immobilization of an analyte on a solid support
CN101407541B (zh) * 2008-11-26 2012-12-26 上海精臻生物科技有限公司 变性变构型环瓜氨酸多肽、及其融合蛋白、抗体和试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1746675A (zh) * 2004-09-07 2006-03-15 李人 免疫层析测试条及其制造方法
CN1796997A (zh) * 2004-12-22 2006-07-05 上海富纯中南生物技术有限公司 诊断ra的检测试剂盒、制备及完成质量检测标准的方法
CN101246177A (zh) * 2007-02-14 2008-08-20 北京华安佛医药研究中心有限公司 同型半胱氨酸免疫胶体金检测试纸条及其制备方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
崔华东.抗环瓜氨酸多肽抗体检测早期诊断类风湿关节炎研究.《中国实用内科杂志》.2006,第26卷(第24期),
抗CCP抗体在类风湿关节炎诊断中的意义;钱龙 等;《安徽医学》;20040625;第25卷(第3期);第171-173页 *
抗CCP抗体斑点免疫印迹试验测定方法的建立与初步应用;虞伟;《中国实验诊断学》;20080625;第12卷(第6期);第710-713页 *
抗环瓜氨酸多肽抗体检测早期诊断类风湿关节炎研究;崔华东;《中国实用内科杂志》;20061215;第26卷(第24期);第1977-1978页 *
虞伟.抗CCP抗体斑点免疫印迹试验测定方法的建立与初步应用.《中国实验诊断学》.2008,第12卷(第6期),
钱龙 等.抗CCP抗体在类风湿关节炎诊断中的意义.《安徽医学》.2004,第25卷(第3期),

Also Published As

Publication number Publication date
WO2011012053A1 (zh) 2011-02-03
CN101988924A (zh) 2011-03-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101988924B (zh) 检测血液抗环瓜氨酸多肽抗体的试纸条及制备方法
CN102062777B (zh) 胶体金层析法原发性胆汁肝硬化检测试纸及其制备方法
KR100303525B1 (ko) 면역화학적간이반정량방법및장치
US4606855A (en) Monoclonal antibody to digoxin
CN109188000A (zh) 一种便携式检测人甲状旁腺激素的试纸条及其制备方法
CN108918851A (zh) 一种拉莫三嗪胶体金试纸条的制备方法
CN102621308A (zh) 胶体金层析法抗Jo-1抗体检测试纸及其制备方法
CN102621315B (zh) 胶体金层析法抗Ro52抗体检测试纸及其制备方法
US5583003A (en) Agglutination assay
CN102621311B (zh) 胶体金层析法抗ssb抗体检测试纸及其制备方法
AP156A (en) Agglutination assay.
CN104764881A (zh) 一种抗mpo-anca抗体免疫层析试纸的制备方法及应用
CN102621313B (zh) 胶体金层析法抗Sp100抗体检测试纸及其制备方法
CN104730250A (zh) 一种检测人肾损伤分子的酶联免疫试剂盒
CN202083693U (zh) 胶体金层析法抗核糖体p0抗体检测试纸
CN104297489A (zh) 一种抗pr3-anca抗体检测试纸的制备方法及用途
CN202083695U (zh) 胶体金层析法抗核小体抗体检测试纸
CN202141726U (zh) 胶体金层析法抗Jo-1抗体检测试纸
JPH07110879B2 (ja) モノクロナール抗体
CN102621316B (zh) 胶体金层析法抗核小体抗体检测试纸及其制备方法
CN102621310B (zh) 胶体金层析法抗u1-rnp抗体检测试纸及其制备方法
CN202083694U (zh) 胶体金层析法抗Cenp-B抗体检测试纸
CN102621314B (zh) 胶体金层析法抗Cenp-B抗体检测试纸及其制备方法
CN113238043B (zh) 一种基于sers免疫层析技术的呋喃丹试纸的制备方法及应用
CN102621309B (zh) 胶体金层析法抗核糖体p0抗体检测试纸及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant