KR100303525B1 - 면역화학적간이반정량방법및장치 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 분석 대상물의 정성분석전에 소정량의 분석 대상물에 대한 고정된 항체로, 고정된 항체의 양에 대응하는 일정량의 시료중 분석 대상물을 포착하고, 차기 면역화학적 정성 분석을 수행하기 위한 분석 대상물의 농도가 감소되는 것을 특징으로 하는, 크로마토그래피법에 따른 간이 면역화학적 반정량 분석방법에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]
면역화학적 간이 반정량방법 및 장치
[도면의 간단한 설명]
제1도는 분석 대상물이 완전 항원인 경우 본 발명의 반정량 분석 방법의 원리 (시료 첨가시)를 나타낸다.
제2도는 분석 대상물이 완전 항원인 경우 본 발명의 반정량 분석 방법의 원리 (분석 진행시)를 나타낸다.
제3도는 분석 대상물이 완전 항원인 경우 본 발명의 반정량 분석 방법의 원리 (분석 완료시)를 나타낸다.
제4도는 분석 대상물이 합텐인 경우 본 발명의 반정량 분석 방법의 원리 (시료 첨가시)를 나타낸다.
제5도는 분석 대상물이 합텐인 경우 본 발명의 반정량 분석 방법의 원리 (분석 진행시)를 나타낸다.
제6도는 분석 대상물이 합텐인 경우 본 발명의 반정량 분석 방법의 원리 (분석 완료시)를 나타낸다.
제7도는 분석 대상물이 합텐인 경우 본 발명의 반정량 분석 방법의 원리 (시료 첨가시)를 나타낸다.
제8도는 분석 대상물이 합텐인 경우 본 발명의 반정량 분석 방법의 원리 (분석 진행시)를 나타낸다.
제9도는 분석 대상물이 합텐인 경우 본 발명의 반정량 분석 방법의 원리 (분석 완료시)를 나타낸다.
제10도는 본 발명의 반정량 분석 장치의 기본적 구성을 나타낸다.
제11도는 본 발명의 반정량 분석 장치의 기본적 구성을 나타낸다.
제12도는 본 발명의 반정량 분석 장치의 구성을 나타낸다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 분석 대상물을 함유하는 시료를 희석시키지 않고 간이 반정량 분석을 수행하는 면역 화학적 방법, 및 그의 장치에 관한 것이다.
혈액 또는 뇨(尿)와 같은 생체시료에 함유되어진 미량 물질의 정성 또는 정량방법으로서, 감도가 높으므로 면역화학적 분석 방법이 일반적으로 사용된다. 상기 방법들중, 크로마토그래피를 이용하는 소위 면역크로마토그래피 방법이 예를 들어, 병원에서 임상 조사 및 실험실에서 검정 시험과 같은 많은 분야에서 널리 사용된다.
면역크로마토그래피 방법에 의한 분석 대상물의 검출방법으로서, 검출되는 분석 대상물(항원)과 다양하게 표식된 특이적 결합물질(항체)을 크로마토그래피 재질상에서 반응시켜 분석 대상물과 표식된 특이적 결합물질의 복합체(항원-항체 복합체)를 형성하고, 상기 복합체는 각종 수단에 의해 확인(검출) 된다. 표식은 방사성 동위원소, 발색단, 형광단, 효소 등을 포함한다. 검출 수단은 방사선 검출기, 분광 광도계 등 및 육안 확인을 포함한다.
일본국 공개 공보 제64-32169호에는, 크로마토그래피 이동 가능하고 육안으로 보이는 검출가능한 시그날인 콜로이드성 입자 표식된 특이적 결합물질(항체)을 이용하는 면역크로마토그래피 방법에 의한 정성분석법 및 그의 장치가 개시된다. 상기 공보는 육안으로 보이는 검출 가능한 한 방법을 개시한다.
상기 공보에 기재된 방법은 시료중의 물질(항원)의 존재 유무, 또는 그의 양을 측정하기 위한 방법이고, (a) 분석 대상물 (항원)을 함유하는 시료를 크로마토그래피 매체와 접촉시키고, (b) 를 크로마토그래피 매체상에 콜로이드성 입자 표식된 물질(표식된 항체)을 이동시켜, 콜로이드성 입자 표식된 물질(표식된 항체)의 적어도 일부가 반응 부위로 이동하도록하여 결합 반응을 유발하며, 및 (c) 시료중 분석 대상물(항원)의 존재 유무 및 그의 양을 표시하기 위한 반응 부위에서 콜로이드성 물질에 의해 유발된 검출가능한 반응의 확인을 포함한다.
일본국 PCT 공개 공보 제1-503174호에는 습윤 상태에서 크로마토그래피 매체상을 자유로이 이동할 수 있으며, 분석 대상물(항원)에 특이적으로 결합하는 표식된 제1항체(이하, '표식 제1항체"로 칭함), 및 분석 대상물(항원)에 특이적으로 결합하고 크로마토그래피 매체상에 고정되는 표식되지 않은 제2항체(제1항체와는 다른 항원 결합 부위를 갖는 제2항체)(이하, "무표식 제2항체"로 칭함)가 배치되고, 분석 대상물을 함유하는 액체 시료를 크로마토그래피 매체의 한쪽 끝에 첨가하여 액체 시료가 크로마토그래피 매체를 통해 이동하고, 표식 제1항체와 반응한 다음 무표식 제2항체와 반응함으로써 크로마토그래피 매체상의 검출 영역에서, 분석 대상물의 존재 유무를 확인할 수 있는 장치가 개시되어 있다. 상기 장치에서 이용되는 원리는 말하자면 (면역화학적) 샌드위치 방법이다.
종래, 시료중의 분석 대상물을 정량하기 위해, 분석 대상물을 함유하는 시료를 적절하게 희석시켜 일정한 감도를 갖는 측정 시약으로 정성반응을 수행하는데, 양성을 나타내는 최고 희석 비율에 감도를 곱하여 반-정량 분석치를 구하는 방법을 이용하거나, 또는 분석 대상물을 희석하지 않고 측정 감도가 다른 시약으로 정성반응을 행하여 분석 대상물이 양성을 나타내는 시약의 감도가 반정량 분석치로서 수득된다. 정량 분석 방법에는 마이크로타이터 웰과 같은 용기에서 수행되는 액상 분석방법 및 크로마토그래피 매체상에서 수행되는 고형상 분석방법이 포함된다. 상기 2개의 공보에 기재된 방법에서, 시료는 정량을 수행하기 위해 희석된다.
최근 출원 공개된, 특개평 4-351962 호에는, 시료를 희석하지 않고 반정량 분석을 수행하는 특이 반정량 분석을 수행하는 특이 결합 분석 방법 및 장치가 개시되어 있다.
상기 공보에 기재된 방법에서, 크로마토그래피법에 의해 시료중의 분석 대상 물질의 정성 또는 정량을 위해, 특정 물질을 측정계에 존재 시키고 분석 대상물의 지표로서 측정되는 표식된 물질의 양은 특정 물질로 인해 감소되므로, 결과적으로 분석 대상물을 함유하는 시료를 희석시켜 수득한 결과와 유사한 결과(이하, "희석 효과"라고 칭함)를 수득할 수 있다.
상기 공보에 기재된 전형적인 방법에서, 시료 첨가부에 첨가된 분석 대상물 (a) 을 크로마토그래피 재질상에 고정되지 않고 존재하는, 소정량 (농도)의 특정 물질 (b) 및 크로마토그래피 재질상에 고정되지 않고 존재하는, 소정량의 표식된 특이 결합 물질 (e)과 (특이 결합 물질이 존재하는 부위에서) 접촉시킨다. 일정량의 분석 대상물 (a) 이 특정 물질 (b)에 결합한다. 그러나, 특정 물질 (b) 에 대해 과다한 분석 대상물 (a) 이 존재하는 경우, 과량의 분석 대상물 (a) 이 특정 물질 (b) 에 결합할 수 있는 부위에 보유되어 있는 동안, 과량의 분석 대상물 (a)은 특이 결합 물질 (특정 물질 (b) 또는 분석 대상물의 특정 물질 (b)가 결합하는 부위에 결합할 수 있는 물질(g))이 크로마토그래피 재질에 고정되어 존재하는 부위(검출부)로 이동한다. 특정 물질 (b) 에 결합할 수 있는 부위가 존재하지 않거나, 또는 적어도 특정 물질 (b) 에 결합하는 분석 대상물 (a)은 검출부를 통과한다. 적어도 특정 물질 (b) 에 결합할 수 있는 부위를 갖는, 분석 대상물 (a) - 표식 특이 결합 물질 (e)의 복합체 (f) 만이 검출부에 고정되고, 상기 고정된 복합체 (f)는 각종 검출 수단에 의해서 검출된다.
시료중 분석 대상물을 반정량 분석하기 위해 시료를 희석하는 것이 일반적으로 필요하다. 또한, 시료의 희석이 필요하지 않고, 측정 감도가 다른 시약을 사용하는 방법은 각 측정 감도에 대한 반응의 강도가 다른 측정 감도에 대한 다른 반응의 강도와 다르므로 판정이 어려운 것과 같은 결점이 있으므로, 상기 방법은 거의 실용적으로 이용되지 않는다.
치료, 특히 임상조사 분야에서, 시료의 희석조작은 시험실시자가 피검시료인 혈액, 소변 등으로 부터 병원균에 감염될 수 있는 가능성이 증가한다. 더구나, 다량의 시료가 반정량 분석되는 경우, 희석 조작이 필요하지 않다면 조작 효율은 상당히 증진될 수 있다. 그러므로, 시료의 희석이 필요하지 않은 면역화학적 간이 반정량 방법 및 그의 장치를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
본 발명과 같이, 상기 기재된 특개평 4-351962호에는 시료의 희석을 필요로 하지 않는 발명이 개시되어 있다. 상기 공보의 방법에서, 많은 검체의 "희석 효과"의 조정에 관한 요인이 많고, 희석 효과를 조정하는 것이 어려우므로, 반정량치 폭은 좁게 설정되고 방법은 측정 정확도에 있어서 문제가 있다. "희석 효과"의 조정에 관한 요인의 수가 적어서 희석 효과가 용이하게 조정될 수 있고 감도가 증진될 수 있는, 다시 말해, 반정량 분석치 폭이 좁게 설정될 수 있는 면역화학적 간이 반정량 분석방법, 및 그의 장치를 제고하는 것이 본 발명의 또다른 목적이다.
[발명의 개시]
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명자들은 근면하게 연구하여, 분석 대상물의 정성 분석전에 분석 대상물에 대해 고정된 소정량의 항체로, 고정된 항체의 양에 상응하는 일정량의 시료중 분석 대상물을 포착(捕捉, trap)하고, 이에 의해 이후 면역화학적 정량 분석을 수행하기 위한 분석 대상물의 농도가 감소하는 것을 포함하는, 크로마토그래피에 따른 면역화학적 간이 반정량 분석방법, 및 분석 대상물을 함유하는 시료를 첨가하기 위한 시료 첨가부(A), 시료중 분석 대상물 일정량을 포착하기 위한 항체가 소정량으로 고정되어 존재하는 항체-고정부 (B), 시료중 분석대상의 존재 유무를 검출하기 위한 지표로서 표식된 물질이 크로마토그래피 이동 가능 상태에 존재하는 표식 물질 존재부 (C), 표식 물질을 검출하기 위한 검출용 물질이 고정되어 존재하는 검출부 (D), 및 첨가된 시료와 함께 분석 대상물의 검출에 관여하지 않은 표식 물질의 흡수 제거를 위한 흡수부(E)로 이루어진, 면역 크로마토그래피에 따른 면역화학적 간이 반정량 분석 장치에 의해서 상기 목적이 달성된다는 것을 발견하였다.
일련의 크로마토그래피 분석인, 본 발명의 반정량 분석방법, 및 장치에서, 시료중 일정량의 분석 대상물을 정성 분석전에 고정된 항체로 포착함으로써 정성 분석을 수행하기 위한 시료중의 분석 대상물의 양(농도)은 미리 감소되고, 이에 의해 분석 대상물을 함유하는 시료를 희석시킨 후 면역 크로마토그래피에 의한 정성 분석에 의해 나온 것과 동일한 효과 (희석 효과)를 수득할 수 있다.
즉, 포착용 항체의 고정량이 단계적으로 변하는 (각 유니트마다 희석 정도가 다른 시료) 수개의 유니트에 동일한 시료를 첨가하여 분석을 수행하고, 이에 의해, 공통 감도를 갖는 각 유니트에서의 차기 정성 분석에서, 시료중 분석 대상물의 반정량 분석치는 분석의 결과가 양성에서 음성으로 또는 음성에서 양성으로 변화하는, 유니트에 설정된 포착용 항체의 고정된 양의 기준으로 하여 결정될 수 있다.
[발명의 실현하기 위한 최량의 형태]
본 발명은 이하 상세하게 설명될 것이다.
본 발명에서 사용될 수 있는 분석 대상물은 크게 완전 항원 및 합텐(불완전 항원)으로 나뉜다.
상기 완전 항원은 그 자체가 항체 생산을 유도하는 능력(면역원성)이 있는 항원성 물질을 말하며, 주로 고분자량의 펩티드 호르몬이 포함된다. 상기 합텐(불안전 항원)은 항체에 결합할 수 있으나 그 자체로 항체 생산을 유도하는 능력이 없는 것을 의미하고, 비교적 분자량이 작은 (약 1,000 이하의 분자량) 펩티드가 포함된다. 합텐은 소혈청 알부민과 같은 단백질에 결합되는 경우 항체 생산 능력을 얻는다. 상기의 구체적인 예는 하기에 나타내며, 그들은 하기에 기재된 것에 한정되지 않는다.
완전 항원의 예
(1) 펩티드 호르몬의 예
1) 성장 호르몬(GH), 부신피질자극 호르몬(ACTH), 멜라닌세포 자극 호르몬(MSH), 프롤락틴, 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 황체형성 호르몬 (LH), 난포자극 호르몬(FSH) 및 옥시토신 과 같은 뇌하수체 호르몬.
2) 칼시토닌 및 부갑상선 호르몬과 같은 칼슘 대사조절 호르몬.
3) 인슐린, 프로인슐린 및 이자 호르몬.
4) 가스트린 및 세크레틴과 같은 소화관 호르몬.
5) 안지오텐신 및 브래디키닌과 같은 혈관에 작용하는 호르몬.
6) 사람 태반성 성산자극 호르몬(hCG) 및 사람 태반 최유 호르몬(hPL)과 같은 태반 호르몬.
(2) 다른 물질의 예
1) 전립선성 산성 포스파타제(PAP), 전립선 특이항원(PSA), 알칼리성 포스파타제, 트랜스아미나제, 유산탈수소효소(LDH), 트랜스아미나제, 트립신 및 펩시노겐과 같은 효소.
2) α-페토프로틴(AFP) 및 암 태아성 항원(CEA)와 같은 암 특이 물질.
3) 면역 글로불린 G(IgG), 피브린-피브리노겐 분해산물(FDP, D-이량체), 항트롬빈 III(ATIII) 및 트랜스페린과 같은 활청단백성분.
4) 류마토이드 인자, 세로토닌, 유로키나제, 페리틴 및 물질 P와 같은 물질.
다른 생체 성분 및 그의 대사물과 같은 많은 물질이 또한 포함된다.
합텐(불완전 항원) 의 예 :
(1) 스테로이드계 합텐
1) 에스트로겐, 에스트라디올, 에스트리올, 에스테트롤, 에퀼린 및 에퀼레닌과 같은 에스트로겐.
2) 프로게스테론, 프레그난디올, 프레그난트리올, 19-노르에티스테론 및 클로로마디논 아세테이트와 같은 천연 또는 합성 루테오호르몬.
3) 테스토스테론, 데히드로에피안드로스테론, 디히드로테스토스테론, 안드로스테론 및 에티오콜라노론과 같은 남성 호르몬.
4) 코르티솔, 코르티손, 데옥시코르티코스테론, 알도스테론 및 테트라히드로코르티솔과 같은 부신피질 호르몬.
5) 비타민 D, 콜레스테롤, 콜산, 데옥시콜산 및 케노콜산과 같은 담산, 및 강심성 스테로이드, 사포닌 및 사포게닌과 같은 다른 스테로이드.
(2) 생리활성 아민류
1) 에피네프린, 노르에피네프린, 도파민 및 에페드린과 같은 카테콜아민, 및 그의 대사산물.
2) 모르핀, 코데인, 헤로인, 모르핀 클로라이드, 코카인 메스칼린, 파파베린, 나르코틴, 요힘빈, 레세핀, 에르고타민 및 스트리키닌과 같은 생리활성 알칼로이드류.
3) LSD, 암페타민, 메탄페타민 및 메프로바메이트와 같은 아미노기 함유 향정신약류.
(3) 다른 예
1) TRH 및 LH-RH와 같은 항원성이 없는 저분자량 펩티드.
2) 디요오도티로닌, 트리요오도티로닌 및 티록신과 같은 갑상선 호르몬.
3) 프로스타글란딘 E2, 프로스타글란딘 E3 및 프로스타글란딘 F1α와 같은 프로스타글란딘.
4) 비타민 A, 비타민 B (비타민 B1,B2,B6 및 B12, 등), 비타민 E 및 비타민 K와 같은 비타민류.
5) 페니실린, 액티노마이신, 클로로미세틴 및 테트라사이클린과 같은 항생물질류.
6) 생체내에 존재하는 다른 성분, 및 생체내 투여되는 약물 및 대사 물질류.
본 발명에서 사용될 수 있는 시료(검체)는 상기 분석 대상물을 함유하는 임의 시료로 부터 선택될 수 있고, 이는 주로 뇨, 혈청, 형장, 혈액, 타액 및 양수와 같은 생체 물질을 포함한다.
분석 대상물의 존재 유무에 대한 지표로서 역할을 할 수 있는 표식은 직접 표식 및 간접 표식중 어느 하나일 수 있다. 직접 표식은 부가적인 처리 또는 공정이 필요없이 분석 결과를 육안으로 관찰할 수 있다는 점에서 바람직하다. 간접 표식은 분석 완료후 표식을 보기 위한 처리, 공정 또는 장치가 필요하다.
직접 표식으로서 사용될 수 있는 표식 물질은 금속 졸, 착색 라텍스 입자, 색 지시약, 리포솜에 함유된 착색 물질, 각종 염료 및 각종 안료 등과 같은 색소류; 탄소졸과 같은 비금속 졸; 루미놀 유도체 및 아크리디늄 에스테르와 같은 화학 발광 물질; 플루오레세인 및 로다민과 같은 형광 물질을 포함하며, 표식 물질은 이에 한정되지 않는다.
간접 표식으로서 사용될 수 있는 표식 물질은 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 알칼리성 포스파타제, 우레아제 및 글루코스옥시다제와 같은 각종 효소를 포함하며, 이에 한정되지는 않는다.
직접 표식이 사용되는 경우, 육안으로 색조관찰, 색농도, 발광강도, 형광강도 등의 측정에 의해 검출을 수행한다. 간접 표식이 사용되는 경우, 효소 기질 또는 크로모겐에서 사용된 효소에 의한 변화로 수득된 색농도 또는 발광강도를 측정하여 검출을 수행한다.
본 발명의 반정량 분석방법 및 반정량 분석 장치 각각을 이하 설명할 것이다.
본 발명의 반정량 분석방법은 하기와 같은 특징을 갖는데, 시료중의 분석 대상물을 분석하기 위해, 차기 면역화학적 정성 분석을 수행하기 위한(분석과 관계있는) 분석 대상물의 농도를 감소시키기 위해, 포착용 항체의 고정량(농도)에 대한 일정량의 시료중 분석 대상물을, 소정량 고정되어 존재하는 포착용 항체로 포착하고, 이에 의해 미리 희석시킨 농도를 갖는 분석 대상물을 사용하여 수득된 것과 동일한 효과를 수득하며, 반정량 분석은 시료를 희석하지 않고 정확하게 수행될 수 있다.
분석 대상물은 완전 항원 및 합텐으로 나뉘고, 본 발명의 반정량 분석방법은 이하 각각의 경우에서 더욱 상세하게 설명될 것이다.
I. 분석 대상물이 완전 항원인 경우.
상기 경우에서의 반정량 분석방법은, 경시적인 분석을 나타내는 제1도 내지 제3도를 근거로 하여 설명된다.
시료중 분석 대상물이 완전 항원인 경우, 면역화학적 샌드위치 반응의 원리를 토대로 구성된 반응계에서, 검출용 물질은 항체 (이하, "검출용 항체 III", 또는 간단히 "항체 III"라고 칭함)이고, 표식된 물질은 또한 표식된 항체(이하, "표식 항체 II" 또는 간단히 "항체 II"라고 칭함)이다. 항체 II 및 항체 III은 동일한 항원 (분석 대상물) 에 대해 다른 항원 결정기를 인식하는 항체를 필요로 한다.
분석 대상물을 포착하기 위한 포착용 항체 (이하, "포착용 항체 I", 또는 간단히 "항체I"라고 칭함)는 항체 II 및 항체 III가 인식하는 것과 같이 동일한 항원 결정기를 인식하거나, 또는 항체 II 및 항체 III이 인식하는 것과는 다른 항원 결정기를 인식하는 항체일 수 있다.
특정 농도의 분석 대상물을 함유하는 시료를 시료 첨가부 (A) 에 첨가하고 (제 1 도), 항체 고정부 (B)로 크로마토그래피 이동되어 분석 대상물이 거기에 고정되어 존재하는 포착용 항체 I과 반응하도록 하여 항체 I의 고정량에 따른 분석 대상물의 일정량이 포착된다. 이어서, 포착되지 않은 분석 대상물은 표식 항체 II가 크로마토그래피 이동 가능한 상태에서 표식 물질 존재부 (C)에 존재하는 표식 항체 II와 반응하여, 분석 대상물-표식 항체 II 복합체를 형성한다 (제 2 도). 복합체가, 검출용 항체 III가 고정되어 존재하는 검출부 (D)로 크로마토그래피 이동하여 항체 III-분석 대상물-표식 항체 II 샌드위치 복합체를 형성하며, 이는 검출부에 불용화되어 보유된다. 분석 대상물에 전혀 결합하지 않는 표식 항체 II 및 과잉의 분석 대상물은 검출부 (D)를 통과하고, 흡수부 (E)로 이동하여 반응계 밖으로 제거된다 (제 3 도).
분석 대상물의 존재 유무는, 지표로서, 검출부 (D)에 불용화되어 보유되는 항체 III-분석 대상물-표식 항체 II 샌드위치 복합체의 표식을 사용하여 알아낸다.
상기 방법에서, 분석 대상물에 대한 최소 검출 가능 농도 (검출 감도) 는 검출부 (D)에서의 검출용 항체 III의 양 및 표식 항체 II 의 양에 따라 확인한다. 시료중 분석 대상물 농도가 검출 감도 보다 높은 경우, 시료를 항체 고정부 (B)에서 항체 I의 고정량에 따른 일정량으로 분석 대상물을 포착하여 희석하고, 이에 의해 검출 감도에 대한 분석 대상물 농도를 감소시켜 수득한 것과 동일한 효과 (희석 효과)를 수득할 수 있고, 항체 - 고정부 (B)에서 항체 I의 양을 조정하여 적절한 농도 폭에서 반정량 분석을 수행할 수 있다.
각각의 상기 항체 I 및 항체 III는 폴리클론 항체 및 모노클론 항체중의 어느 하나일 수 있으나, 높은 감도를 갖는 모노클론 항체가 측정 감도에 있어서 바람직하다. 항체 II가 항원과 반응하여 응집반응을 유발한다면 크로마토그래피 이동을 방해할 수 있으므로, 항체 II는 동일한 항원에 있어서 항체 I 및 항체 III이 인식하는 항원 결정기와는 다른 항원 결정기를 인식하는 모노클론 항체일 필요가 있다. 폴리클론 항체 및 모노클론 항체는 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다. 폴리클론 항체에 대해서, 통상적인 방법에 따라서, 항원 (분석 대상물) 을 동물에 면역시켜 항혈청을 수득하고, 목적 항체를 항혈청으로 부터 분리한다. 모노클론 항체에 대해서는, 예를 들면, Kuhler 및 Milstein의 방법 [Nature 256 (1975) 495-497]에 따라서, 항원 (분석 대상물)으로 면역된 마우스 비장세포와 골수종 세포를 융합시켜, 목적 항체를 생산하는 융합된 세포를 선별하고, 융합된 세포에 의해 생산된 모노클론 항체를 수득한다.
II. 분석 대상물이 합텐이 경우.
반정량 분석방법을 측정 원리에 따라서 제4도 내지 제6도 및 제7도 내지 제9도를 근거로 설명한다.
분석 대상물이 합텐인 경우, 원리는 검출부(D)에 고정되어 존재하는 검출용 물질에 대한 경합 반응에 근거한다.
(1) 제4도 내지 제6도의 경우에서, 검출용 물질로서 합텐 황체(이하, "검출용 항체 V", 간단히 "항체 V"라고 칭함)를 검출부(D)에 고정시키고, 표식 물질로서 합텐 또는 그의 화학적 변성물이 화학적으로 결합되는, 표식된 합텐-담체 단백질 결합물 또는 표식된 카르복실기-함유 수용성 모노올레핀계 고분자 화합물 (이하, "표식-합텐-담체 결합물"이라고 칭함)은 표식-합텐-담체 결합물이 크로마토그래피 이동 가능한 상태에서 표식 물질 존재부 (C)에 보유되고, 합텐 항체 (이하, "포착용 항체 IV" 또는 간단히 "항체 IV"라고 칭함)를 분석 대상물을 포착하기 위한 항체로서 항체 고정부 (B)에 고정시킨다.
합텐 항체 IV 및 항체 V는 분석 대상물로서 합텐에 결합할 수 있다면 동일할 필요가 있다. 이것들은 분석 대상물인 합텐에 교차 반응함으로써 분석 대상물에 결합하는 것일 수 있다.
표식 물질의 성분인 합텐은 분석 대상물인 합텐일 수도 있고, 또는 분석 대상물인 합텐과 교차 반응함으로써 항체 V 에 결합된 합텐일 수도 있다.
일정 농도의 분석 대상물을 갖는 시료를 시료 첨가부(A)에 첨가하고 (제4도), 크로마토그래피 이동에 의해 항체 고정부 (B)로 이동하여 포착용 항체 IV와 반응하도록 한다. 분석 대상물은 포착용 항체 IV의 고정량에 따라 일정량이 포착된다(제 5 도). 이어서, 포착되지 않는 분석 대상물 및 크로마토그래피 이동 가능한 상태에서 표식 물질 존재부 (C)에 존재하는 표식-합텐-담체 결합물이 크로마토그래피 이동에 의해서 검출부(D)로 이동하고, 검출부 (D)에 고정되어 존재하는 검출용 항체 V와 경합 반응한다. 검출부에 결합하지 않은 것은 흡수부(E)로 크로마토그래피 이동하여 반응계 밖으로 제거된다(제 6 도).
상기 방법에도, 검출용 항체 V와 표식 물질(표식-합텐-담체 결합물)사이의 결합 반응을 경합 저지할 수 있는, 분석 대상물로서 합텐의 최소 농도 (검출 감도)는, 검출부에서의 검출용 항체 V의 양 및 표식 물질의 양에 따라 결정된다.
시료중 분석 대상물의 농도가 검출 감도보다 높은 경우, 분석 대상물로서 합텐은 검출 감도에 대한 시료중 분석 대상물로서 합텐의 농도를 감소시키기 위해 항체 고정부 (B)에서 포착용 항체 IV의 고정량에 따라 일정량이 포착되고, 이에 의해 희석된 시료를 이용하여 수득된 것과 동일한 효과 (희석 효과)를 수득할 수 있고, 반정량 분석은 포착용 항체 IV의 고정량을 조정하여 적절한 농도 폭에서 수행될 수 있다.
(2) 제7도 내지 제9도의 경우에서, 검출용 물질로서, 합텐 또는 그의 화학적 변성물이 화학적으로 결합되는 합텐-담체 결합물 또는 카르복실기-함유 수용성 모노올레핀계 고분자 화합물 (이하, "포착용 합텐-담체 결합물"로 칭함)을 검출부 (D)에 고정시킨다. 표식 물질로서 표식 합텐 항체 (이하, "표식 항체 VII", 또는 간단히 "항체 VII"라고 칭함)를 항체 VII가 크로마토그래피 이동 가능한 상태에서 표식 물질 존재부 (C)에 보유시킨다. 분석 대상물로서 포착용 합텐에 대한 항체 (이하, 포착용 항체 VI", 또는 간단히 "항체 VI"라고 칭함)를 항체-고정부 (B)에 고정시킨다.
항체 고정부 (B)의 포착용 항체 VI 및 표식 물질 존재부(C)의 표식 항체 VII가 분석 대상물로서 합텐에 결합할 수 있다면 동일할 필요는 없다. 그들은 교차 반응에 의해 분석 대상물로서 합텐에 결합하는 것일 수 있다.
검출부 (D)에 불용성인 검출용 합텐-담체 결합물의 구성 성분으로서 합텐은 분석 대상물로서 합텐일 수 있거나, 또는 분석 대상물인 합텐과의 교차 반응에 의해 표식 항체 VII에 결합할 수 있는 합텐일 수 있다.
분석 대상물인 어느 농도의 합텐을 함유하는 시료를 시료 첨가부 (A)에 첨가하고 (제7도), 크로마토그래피 이동에 의해 항체 고정부 (B)로 이동하여, 포착용 항체 VI 와 반응시킴으로써 포착용 항체의 고정량에 따른 양의 분석 대상물인 합텐을 포착한다. 여기에서 포착되지 않은, 분석 대상물인 합텐은 표식 물질 존재부 (C)로 이동하고 크로마토그래피 이동 가능 상태에 유지되는 표식 항체 VII와 반응하여, 분석 대상물 합텐-표식 항체 VII 복합체를 형성한다(제 8 도). 복합체 및 미반응 표식 항체 VII는 검출부(D)로 이동하고, 거기에 고정된 검출용 합텐-담체 결합물 및 미반응 표식 항체 VII는 서로 결합한다. 검출부 (D)에 결합하지 않은 것들은 흡수부 (E)로 크로마토그래피 이동하여 반응계의 밖으로 제거된다 (제 9 도).
상기 방법에서, 검출부 (D)에 존재하는 검출용 합텐-담체 결합물과 표식 물질 존재부 (C)에서의 표식 항체 VII 사이의 결합 반응을 경합 저지할 수 있는, 분석 대상물인 합텐의 최소 농도 (검출 감도)는, 검출용 합텐-담체 결합물의 합텐 양 및 표식 항체 VII의 양에 따라 결정된다.
시료중 분석 대상물 합텐의 농도가 검출 감도보다 높은 경우, 검출 감도에 대해서 시료를 희석시켜 수득한 것과 동일한 효과 (희석 효과)를 수득할 수 있도록, 분석 대상물인 합텐은 시료중 분석 대상물 농도를 감소시키기 위한 항체 고정부 (B)에서의 포착용 항체 IV의 양에 따른 일정량으로 포착되고, 적절한 폭의 반정량 분석은 항체 고정부 (B)에서의 포착용 항체 VI의 양을 조정함으로써 수행될 수 있다.
본 발명에서 사용된 상기 합테 항체는 통상적인 항체일 수 있거나, 또는 모노클론 항체일 수 있다. 상기 합텐 항체는 통상적인 방법에 의해서 생산될 수 있다. 합텐(분석 대상물) 또는 그의 화학적 변성물은 소 혈청 알부민(BSA)와 같은 항원성을 갖는 물질과 결합하여, 통상적인 방법에 따라서 그것으로 동물을 면역시켜 항혈청을 수득한다. 이어서, 합텐(분석 대상물) 만으로 반응성을 갖는 항체를 상기 수득한 항혈청으로 부터 분리시킨다.
모노클론 항체에 대해서, 상기 항원으로 면역시킨 마우스로 부터의 비세포와 골수 세포를 융합시키고, 목적 항체를 생산하는 융합 세포를 선별하고, 융합 세포에 의해 생산되는 모노클론 항체를 수득한다.
합텐 - 담체 단백질 결합물, 또는 합텐 또는 그의 화학적 변성물이 화학적으로 결합하는 카르복실기 - 함유 수용성 모노올레핀계 고분자 화합물의 구성 성분으로서의 합텐 또는 그의 화학적 변성물은 경합 반응에 참가한다. 담체 단백질 또는 카르복실기 - 함유 수용성 모노올레핀계 고분자 화합물은 크로마토그래피 재질 및 표식 물질과 결합하는 부위를 제공하고, 상응하는 합텐 항체와의 반응성을 증진시키기 위한 역할을 한다.
담체 단백질은 소 혈청 알부민(BSA), 토끼 혈청 알부민(RSA), 염소 혈청 알부민(GSA) 및 사람 혈청 알부민 (HSA)와 같은 혈청으로 부터 유래된 단백질, 및 난백(EA)으로부터 선택된다. 상기가 사용되는 경우, 상기 단백질 (예: BSA)은 항원성을 갖는 합텐을 제공하여 합텐항체를 생산하고, 이는 상기 단백질과 결합할 수 있는 임의 항체를 완전하게 흡수하여 제거하는 것을 필요로 한다.
합텐의 화학적 변성을 수행하여 합텐이 카르복실기 - 함유 수용성 모노올레핀계 고분자 화합물(이하, "스페이서"라고 칭함)의 관능기(예: 카르복실기 또는 히드록실기)에 화학적으로 결합할 수 있다. 화학적 변성은 공지된 방법, 특히 바람직하게는 카르복실기, 아미노기 및 히드록실기가 합텐으로 도입되는 화학적 변성 방법에 의해서 수행될 수 있다.
본 발명에서 사용된 스페이서는 생리적으로 불활성이고 일반적으로 항원성이 없는 물질이다. 스페이서는 카르복실기와 더불어 히드록실기를 가질 수 있고, 상기 관능기는 합텐 또는 그의 화학적 변성물에 대한 화학적 결합에 관여하는 것 뿐아니라 고분자 화합물인 스페이서에 수용성을 부여하는 역할을 한다. 스페이서 (카르복실기 - 함유 수용성 모노올레핀계 고분자 화합물) 의 "수용성"이란 용어는, 스페이서의 1 중량부 이상이 100 중량부의 증류수에 완전히 용해되어 투명한 용액을 형성함을 의미한다.
스페이서의 평균 분자량은 약 103∼107 이상일 수 있고, 약 수만 내지 수백만의 평균 분자량을 갖는 스페이서가 바람직하다.
스페이서의 구체적인 예에는 아크릴산 또는 메타크릴산의 호모-또는 공중합체; 말레산과 비닐 아세테이트의 공중합체 또는 그의 비누화물, , 및 비닐 알콜, 저급 알킬 비닐 에테르, 아크릴산 또는 그의 저급 알킬 에스테르와의 말레산 공중합체, 또는 그의 메타크릴산 또는 저급 알킬 에스테르, 또는 그의 가수분해물이 포함된다. 또한, 스페이서는, 예를 들어, 아크릴산 또는 메타크릴산의 공중합체, 및 예를 들어, 아크릴산의 β-히드록실에틸 에테르 또는 아크릴아미드일 수 있고, 또는 상기 단량체로 부터 구성 단위를 갖는 삼원 중합체일 수 있다.
합텐 또는 그의 화합적 변성물 및 스페이서는 아미드 결합 또는 에스테르 결합으로 화학적으로 결합되고, 아미드 결합이 바람직하다.
아미드 결합은, 예를 들어, 공지되어진 카르보디이미드법, 카르보닐 디이미다졸법, 혼합된 산 무수물법, 활성 에스테르법, 아지드법, 산 클로라이드법 및 디페닐 포스포릴 아지드(DPPA) 법에 의해서 형성된다. 카르보디이미드법 및 DPPA 법이 특히 바람직하다. 상기 방법들중 어느 하나를 사요할 수 있다. 그러나, 어느 방법에 있어서는, 스페이서가 합텐에 속하지만 스페이서와의 화학 결합에 관여하지 않는 관능기의 존재에 대하여 불안정하므로, 지나치게 격렬한 조건을 요구하는 반응은 모두 피하는 것이 바람직하다. 에스테르 결합의 형성에는, 합텐 또는 그의 화학적 변성물의 반응성 히드록실기, 및 스페이서의 카르복실기가 서로 결합되는 경우, 및 관능기가 역으로 제공되는 경우가 포함된다. 전자의 경우, 스페이서의 카르복실기는 반응성 유도체, 예를 들어, 산클로라이드로 전환되어, 합텐의 히드록실기와 반응하거나, 또는 스페이서가 예를 들어, 말레산 무수물을 함유하는 공중합체인 겨우, 합텐과 반응하도록 할 수 있다. 후자의 경우, 에스테르 결합의 형성에 대한 방법의 원리는 전자의 경우와 동일한 반면, 일부 합텐은 그의 카르복실기를 반응성 유도체, 예를 들어, 산 클로라이드로 전환시키는 것에 대해 충분한 안정성을 갖지 않고, 상기의 경우에서 에스테르 결합을 형성하는 것이 어렵다.
본 발명의 반정량 분석 장치는 이하 제10도, 제11도 및 제12도를 근거로 하여 설명될 것이다. 제10도 및 제11도는 본 발명의 반정량 분석 장치의 기본적인 구현예를 보여준다.
본 발명의 반정량 분석 장치는 시료 첨가부 (A), 항체 고정부 (B), 표식 물질 존재부(C), 검출부 (D) 및 흡수부(E)의 순으로 이루어진 크로마토그래피성 면역화학적 분석 장치이다.
제10도 및 제11도에서, 표식 물질 존재부(C)는, 검출부(D)가 위치하는 것과 같이 동일한 크로마토그래피 재질 (F)상에 위치될 수 있고, 상기 부분들은 다른 재질로 형성될 수 있다. 또한, 항체 고정부(B)는 표식 물질 존재부(C) 및/또는 검출부(D)가 제공되는 것과 같이 동일한 크로마토그래피 재질 (F)상에 위치할 수 있다.
제10(a)도는 4단계의 농도에서 반정량 분석을 수행하는 반정량 분성 장치를 나타내고, 제11(a)도는 6단계의 농도에서 반정량 분석을 수행하는 반정량 분석 장치를 나타내는데, 농도 단계의 수는 필요에 따라서 감소되거나 또는 증가될 수 있다. 예를 들면, 제10(a)도에서의 반정량 분석 장치는 4단계의 농도에 공통된 시료 첨가부 (A), 항체 고정부 (B), 표식 물질 존재부(C), 및 검출부 (D)와 같은 3개의 부분으로 각 유니트가 형성된 4개의 독립 유니트 및 공통의 흡수부(E)로 구성된다. 하나 유니트에서 표식 물질 존재부(C) 에서의 표식 물질의 양 및 검출부 (D)에서의 검출용 물질의 양은 다른 유니트와 동일하며, 항체 고정부 (B)의 포착용 고정량은 유니트들이 서로 다르다.
분석 대상물을 함유하는 시료를 각 유니트에 크로마토그래피적으로 균일하게 제공하기 위해 공통된 부분으로서 시료 첨가부 (A)를 형성하는 것은 필수적이다. 각 유니트에 대해 시료의 더 균일한 이동을 위해, 제12(e)도 및 제12(f)도에서 나타낸 구성 또는 배치가 바람직하다.
상기 경우에서, 흡수부 (E)가 각 유니트에 제공된다.
본 발명의 반정량 분석 장치에서, 부분 (A), (B), (C) 및 (D)를 구성하는 재질은 양면 접착 테잎을 사용하여, 플라스틱판, 유리판 또는 필름, 바람직하게는 플라스틱판 또는 유리판과 같은 지지체 (G) 상에 배열되어 , 근접한 부분이 서로 접촉하고 첨가된 시료가 모세관 현상에 의해 (B), (C) 및 (D)를 통해 (A) 로부터 균일하게 이동할 수 있도록 하거나, 혹은 제11(d)도에서 나타낸 바와 같이, 상기 재질은 검출부 (D) 및 항체 고정부 (B)를 포함하는 크로마토그래피 재질이 지지체 (G) 에 직접적으로 접촉하지 않도록 배열된다.
본 발명의 반정량 분석 장치의 각 부분의 구성은 하기에서 설명될 것이다.
[시료 첨가부(A)]
시료 첨가부(A)의 재질에는 셀룰로스 여과지, 유리 섬유, 폴리우레탄, 폴리아세테이트, 셀룰로스 아세테이트, 나일론 및 면섬유와 같은 균질성을 갖는 것들이 포함되는데, 재질은 이에 한정되지는 않는다.
시료 첨가부는 분석 대상물을 함유하는 첨가된 시료를 받아들인 뿐아니라, 시료중 불용성 입자를 여과시키는 기능을 갖는데, 셀룰로스 여과지 또는 유리 섬유 여과지와 같은 여과 성능을 갖는 재질이 바람직하다.
시료 첨가부를 형성하는 재질에 대해 시료중 분석 대상물의 비특이적 흡수로 인한 반정량 분석 정확도에 있어서의 감소를 방지하기 위해, 시료 첨가부의 재질을 미리 처리하여 비특이적 흡수를 방지해야 한다. 비특이적 흡수를 방지하기 위한 처리는, 예를 들면, 비활성 단백질로의 처리 또는 계면활성제로의 처리로써 수행된다. 비활성 단백질로의 처리는, 예를 들어, 재질을 0.1M 트리스 완충용액 (pH6∼9)을 함유하는 0.1∼10% 소 혈청 알부민 (BSA)의 용액, 0.1M 트리스 완충용액 (pH6∼9)을 함유하는 0.1∼10% 탈지분유 분말의 용액, 및 또는 0.1∼10% 카세인 용액중에 침적시키고, 37℃에서 1시간 동안, 또는 4℃에서 하루동안 방치시키고, 트리스 완충용액으로 세척 및 건조시켜 수행한다. 계면활성제로의 처리는, 예를 들면, 비이온성 계면활성제인 트윈 20 또는 트리톤 X100을 0.01∼1% 함유하는 용액에 재질을 침적시키고, 그대로 건조시켜 수행한다. 분석 대상물 및 시료의 종류에 의존한다해도, 비활성 단백질로의 처리 및 계면활성제의 처리 모두를 재질 사용전에 수행하는 것이 바람직하다.
[항체 고정부 (B)]
항체 고정부의 재질은 바람직하게는 균질성을 가지며, 포착용 항체의 고정량을 엄밀하게 규정할 수 있고 크기 및 두께를 용이하게 조작할 수 있다.
분석 대상물을 포착하기 위한 항체의 다량의 고정량(농도)을 사용하여 반정량 분석을 수행하고자 하는 경우, 바람직하게는, 활성화된 여과지 시트를 사용하고, 포착용 항체가 거기에 화학적으로 결합한다. 재질이 CNBr 활성화 셀룰로스인 경우, 활성화 셀룰로스 여과지 시트는 Ceska 및 Lundkvist 의 방법 [Immunochemistry, 9, 1021 (1972)], 및 Lehtone, Viljanen et al 의 방법 [J. Immunol. Methods, 36, 63 (1980) 및 동일 문헌, 34, 61 (1980)]과 같은 공지된 방법으로 용이하게 제조될 수 있다. 재질이 DBM 활성화 셀룰로스인 경우, Alwine의 방법 [Methods Enzymol., 68, 220(1979)]과 같은 공지된 방법으로 용이하게 제조될 수 있다. 또한, 시판되는 활성화 나일론 필름 (Pall Immunodyne)이 또한 사용될 수 있다.
상기 활성화 페이퍼 시트로의 포착용 항체의 화학적 결합은 공지된 방법 [LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, Volume 15, Edited by R. H. BURDON and P. H. Van KNIPPENBERG ELSEVIER AMSTERDAM: NEW YORK, OXFORD (1985) P. 318-322]에 의해 또한 수행될 수 있다. 또한, 포착용 항체는 제2물질(항체, 단백질, 등)을 통해 활성화 페이퍼 시트에 결합될 수 있다. 그 사이에 존재하는 제2물질이 항체 (이하, "제2항체"라고 칭함)인 경우, 및 예를 들어, 고정될 포착용 항체가 마우스로 부터 유래된 모노클론 항체인 경우, 과량의 항-마우스 γG(감마 글로블린) 헤테로-동물 항체가 결합된 다음 적당량의 포착용 항체를 면역 반응에 의해 결합되는 활성화 페이퍼 시트가 사용될 수 있다. 그 사이에 존재하는 물질이 단백질인 경우, 예를 들면, 과량의 단백질 A가 결합된 다음 적정량의 포착용 항체가 결합되는 활성 페이퍼 시트가 사용될 수 있다.
분석 대상물을 포착하기 위한 항체의 소량의 고정량 (농도)를 사용하여 반정량 분석을 수행하고자 하는 경우, 검출용 항체 (물질)을 검출부 (D)에 고정시키는 것과 동일한 방법으로 크로마토그래피 재질의 표식 물질 존재부 (C)의 상류부에 포착용 항체를 고정시킬 수 있다.
[표식 물질 존재부 (C)]
표식 물질 존재부는 이후 설명되는 검출부 (D)에 검출용 물질을 고정시키고, 분석 대상물 및 표식 물질에 대한 비특이적 흡수를 방지하기 위한 크로마토그래피 재질의 처리를 수행하고, 크로마토그래피 재질의 검출부의 상류부에 표식 물질을 적용시킴으로써, 또는 비특이적 흡수를 방지하기 위해 셀룰로스 여과지 시트, 유리 섬유 여과지 또는 부직포를 처리하고, 일정량의 표식 물질로 함침시켜 건조시킴으로써 생산된다.
본 발명의 반정량 분석방법에서, 표식 물질의 용해속도 및 그의 크로마토그래피 이동의 균일성은 어떤 경우에 있어서 측정 감도의 조절에 영향을 주고, 따라서 비특이적 흡수를 방지하기 위한 상기 처리 및 크로마토그래피 재질로의 표식 물질의 적용 또는 0.1∼10% 만니톨 또는 0.1∼30% 의 사카로스와 같은 당류의 존재하에 표식 물질로의 크로마토그래피 재질로의 함침을 수행하는 것이 바람직하다.
[검출부 (D)]
검출부는 크로마토그래피 재질로의 부분에 검출용 물질을 고정시켜 생산된다.
검출용 물질을 고정시키는 방법에는 검출용 물질이 물리적 또는 화학적 결합에 의해 크로마토그래피 재질의 부분에 직접적으로 고정시키는 방법, 및 검출용 물질이 라텍스 입자와 같은 미세 입자에 물리적 또는 화학적으로 결합하고 크로마토그래피 재질의 부분이 미세 입자가 고정되도록 미세 입자를 포착할 수 있는 간접 고정법이 포함된다. 상기 방법중 어느 하나가 사용될 수 있고, 불용화의 균일성 및 감도 조정에서의 용이성의 관점에서 직접 고정이 본 발명의 장치에서 바람직하다.
검출부를 구성하는 재질 (크로마토그래피 재질)을 다공성 니트로셀룰로스막, 다공성 셀룰로스필름, 나일론필름, 유리섬유, 부직포, 천 및 검출용 물질이 결합하는 활성기를 추가로 함유하는 상기 재질로 부터 선택하는 것이 바람직하다. 다공성 니트로셀룰로스막 및 활성화 나일론필름이 특히 바람직하다.
크로마토그래피 재질에 고정되는 검출용 물질의 형상은 구체적으로 한정되지는 않고, 어느 형상도 가능하며, 크로마토그래피 선단부에 대하여 표식 물질의 검출이 균일하도록 크로마토그래피 재질을 가로지르는 선형이 바람직하다.
검출용 물질의 고정 후 비특이적 흡수를 방지하기 위해 비활성 단백질로 처리된 크로마토그래피 재질을 사용하는 것이 바람직하다.
[흡수부(E)]
흡수부는 크로마토그래피 이동하는 첨가된 시료를 물리적으로 흡수하고, 또한 검출부 (D)에 용해되지 않는, 미반응 표식 물질 등을 흡수 제거하기 위한 것이고, 흡수부는 셀룰로스 여과지, 부직포, 천 또는 셀룰로스 아세테이트와 같은 흡수(吸水)성 재질로 부터 형성된다.
첨가된 시료의 크로마토그래피 선단부가 흡수부에 도달한 후 크로마토그래피 이동 속도는 흡수재의 재질 및 크기에 따라 다르고, 분석 대상물의 측정을 만족시키는 속도는 그의 선택에 따라 설정될 수 있다.
본 발명의 반정량 분석 장치의 각 부분의 구성이 상기 설명되었으나, 크로마토그래피 이동 속도(액체의 유량)은 각 부분의 재질, 크기, 두께와 같은 요인에 따라 다르다, 그러므로, 상기 요인은 반정량 분석이 분석 대상물의 종류에 따라서 가장 적합하게 수행될 수 있도록 필요에 따라 선정 및 설정될 수 있다.
본 장치의 측정 감도는 주로 검출부(D)에 고정된 검출용 물질의 양 및 표식 물질 존재부(C)에서의 표식 물질의 양에 근거하여 결정된다. 또한, 본 발명의 반정량 분석에 있어서 이른바 희석 효과는, 원칙적으로, 항체 고정부 (B)에서 포착용 항체의 고정량에 의존하며, 반정량 분석의 정확도는 시료 첨가부(A)에서 검출부(D)로인 시료 흐름 방향으로 크로마토그래피 재질의 길이 및 두께, 즉, 희석 효과를 유지하는 시료의 통과 액량에 의존한다. 특히, 시료 첨가부(A)로부터 항체 고정부(B)를 통과하는 액체의 양중, 항체 고정부(B)에서 희석 효과를 가지는 액체 시료량은, 용해된 표식 물질이 검출부(D)로 이동하도록 표식 물질 존재부(C)에서의 표식 물질을 완전 용해시키기에 충분하여야 하고, 이는 본 발명의 반정량 분석을 우수한 정확도로 수행하기 위해 가장 중요하다.
즉, 분석 대상물을 항체 고정부(B)에서 포착용 항체의 고정량에 따라 일정량으로 포착하는 희석 효과를 수득한 시료는, 검출부(D) 까지 표식 물질을 완전히 크로마토그래피 이동시킨다. 결과적으로, 크로마토그래피 이동 완료 후 포착용 항체가 포화되므로 분석 대상물의 원래 농도를 가지는 시료의 또다른 흐름이 검출부(D)에 도달한다해도, 검출부(D)에서의 반응은 표식 물질의 크로마토그래피 이동이 완료됨으로 인해 영향을 받지 않으므로, 분석 결과는 변하지 않는다.
그러므로, 항체 고정부(B)의 크기, 즉 시료가 희석 효과를 가지는 상태에서 항체 고정부(B)를 통과하는 시료액의 양은, 표식 물질이 검출부 (D)로 완전히 크로마토그래피 이동하기에 충분하여야 하고, 이는 희석 효과를 확실하게 하기 위해 필수적이다.
또한, 표식 물질이 존재부 (C)의 구성에 관한여 기재된 바와 같이, 표식 물질이 시료중에 용이하게 용해되고 이동되는 것은 정확도 향상을 위해 중요한 요인이다.
[실시예]
본 발명은 하기의 실시예들을 참고로 하여 보다 구체적으로 설명될 것이다.
[실시예 1] hCG (사람 태반성 성선자극호르몬)의 측정
1-a) 항 hCG 모노클론 항체의 제조
Balb/c 마우스에게 hCG(10,000 iu/mg) 및 프로인드 완전 보조액(Freund's complete adjuvant)을 함께 3주 간격으로 3회 복부에 피하 투여하고, 이어서 3주후 hCG를 마우스에게 복강내 투여한다. 최종 면역 3일후, 비장 세포 및 골수종 세포(NS-1)를 통상적인 방법으로 융합시키고, HAT 선별 후, 클로닝을 반복하여 hCG - 특이 항체를 분비하는 융합 세포 균주 및 hCG, hLH 및 hFSH 와 교차 반응하는 α-서브유니트를 인식하는 모노클론 항체를 분비하는 융합 세포 균주를 수득한다.
미리 프리스탄을 투여한 Balb/c 마우스에 복수종양을 형성하기 위해 각 세포 균주를 복강내 투여하고 복수를 수득한다. 상기 수득한 복수를 암모늄 술페이트 분획법, 및 아피겔(Affigel) -단백질 A MAPS 키트로 정제하고 냉동 건조시켜 모노클론 항체의 백색 분말을 수득한다.
상기 수득한 항 hCG -특이 모노클론 항체를 사용하여 항체 고정부 (B) 및 검출부 (D)를 제작하고, α-서브유니트를 인식하는 모노클론 항체를 표식 항체의 제작에 사용한다.
1-b) 착색 라텍스 - 표식된 항 hCG -특이 항체의 제조
1-a)에서 수득한 항 hCG -특이 모노클론 항체, 4mg의 양을 2ml의 글리신 완충용액(pH 8.2)에 용해시키고, 이어서 용액을 교반하면서, 1.0ml의 붉은 폴리스티렌 라텍스 [고형 성분 10%, Japan Synthetic Rubber Co., Ltd. 사제, 입자 직경 0.303 ㎛]를 용액에 적가하여 혼합한다. 혼합액을 실온에서 30 분간 및 56℃에서 30 분간 연속적으로 교반한다. 이어서, 혼합액을 냉각시키고 원심분리한다. 생성된 침전물을 10ml의 글리신 완충용액중에 현탁시키고, 원심분리를 2회 반복한다. 이어서, 침전물을 10ml의 1% BSA 함유 글리신 완충용액중에 현탁시키고, 현탁후 실온에서 1 시간 동안 교반하고, 현탁액을 원심분리한다. 글리신 완충용액으로 원심세정 공정을 3회 반복하고, 이어서, 침전물을 5% 사카로스, 2.5% 만니톨 및 0.1% BSA 를 함유하는 글리신 완충용액중에 현탁시켜 항 hCG -특이 모노클론 항체 - 감작 착색 라텍스를 제조한다.
1-c) 시료첨가부 (A)의 제조
크로마토그래피용 여과지 시트 [Advantec Toyo 사제, No 585, 두께 0.85 mm]를 절단하여 10 × 21mm의 여과지 조각을 제조하고, 이 조각들을 5% 탈지분유 [Zenkoku Rakuno Rengokai 사제; National Dairy Farming Association] 분말을 함유하는 0.1M 트리스 완충용액 (pH8.2)에 침적시켜 37℃에서 1 시간 동안 보온 배양한다. 이어서, 여과지 조각을 0.1M 트리스 완충용액 (pH8.2)로 1회 세척한 다음, 5% BSA[Biocell Laboratories 제] 함유 0.1M 트리스 완충용액 (pH8.2)에 침적시킨다. 여과지 조각을 37℃에서 1 시간 동안 보온 배양시킨 다음, 0.1M 트리스 완충용액 (pH8.2)으로 1회 세척, 배수, 0.05% 트윈 20을 함유하는 0.1M 트리스 완충용액에 침적, 배수한 다음, 실온에서 건조시킨다.
1-d) 항제 고정부 (B)의 제조
a) CNBr 활성화 셀룰로스 여과지의 제조
셀룰로스 여과지 시트 [Advantec Toyo 사제, No. 50]를 10 × 21mm의 여과지 조각으로 절단하고, 2g의 여과지 조각을 20ml의 정제수에 잠기도록 침적시킨다. 이어서, 60ml의 CNBr 용액(50ml 정제수중 2.0g CNBr 용액)을 첨가후 즉시 혼합물을 교반하에 1N NaOH으로 pH 10.5로 조정한다. 이어서, 혼합물을 1N NaOH를 가지고 pH 10.5로 30분간 유지시킨다. 반응후, 여과지 조각을 50ml의 NaHCO3으로 12회 세척시키고, 50ml 정제수로 2회, 50ml 20% 아세톤, 50ml 50% 아세톤, 70% 아세톤, 아세톤으로 각각 2회 세척시킨 다음 실온에서 건조시킨다. 상기 CNBr 활성화 셀룰로스 여과지를 항체의 고정을 위해 사용될 때까지 4℃로 보관한다.
b) 항 hCG -특이 모노클론 항체 고정 셀룰로스 여과지의 제조
1-a)로부터 제조된 항 hCG -특이 모노클론 항체와 커플링 완충 용액 (0.1M NaHCO3함유 0.5M NaCl, pH 8.3)을 사용하여 항 hCG -특이 모노클론 항체를 0, 0.1, 0.2 및 0.4mg/ml의 농도로 가지는 용액을 제조한다. 상기 a)에서 제조된 CNBr 활성화 셀룰로스 여과지를 5ml의 용액에 10장씩 각각 침적시키고, 용액을 천천히 교반하여 실온에서 3시간동안 반응을 수행한다.
반응후, 여과지 조각을 커플링 완충용액으로 2회 세척하고 5ml의 1M 에탄올 아민 용액에 용액당 10장씩 침적시키고, 용액을 실온에서 2시간 동안 천천히 교반하여 미반응 CNBr 활성기를 보호시킨다. 이어서 여과지 시트를 0.1M 아세트산 완충용액 (pH4.0) - 0.1M 트리스 완충용액 (pH8)으로 3회 세척하고, 실온에서 건조시켜 이용될 때까지 4℃에서 보관한다.
1-e) 검출부 (D)의 제조
니트로셀룰로스막[SartoriusAG 사제, 기공 직경 8㎛]을 30 × 50mm의 크기로 절단하고, 1-a)에서 제조된 항 hCG -특이 모노클론 항체 1mg/ml을 함유하는 용액(50㎍/ml BSA - 함유 50mM 트리스 완충용액(pH 8.2) 10㎕를, 분무된 용액이 선형이도록, 절단된 니트로셀룰로스막의 중앙 (15mm)에 Cammg Linomat IV로 분무하고, 이어서 절단된 니트로셀룰로스막을 25℃ 항온 및 80% 항습실내에서 25분간 방치시킨다. 이후, 생성된 막을 0.1M 아세트산 완충용액 (pH 8.2)중 5% 탈지분유 [Zenkoku Rakuno Rengokai 사제; National Dairy Farming Association] 분말의 용액 및 보호용 5% BSA 용액에 침적시킨 다음, 막을 1% 사카로스 및 1% 만니톨을 함유하는 0.1M 아세트산 완충용액으로 세척하고 실온에 방치하여 건조시킨다.
1-f) 표식 물질 존재부(C)의 제조
1-b)에서 제조된 착색 라텍스 - 표식 항 hCG -특이 모노클론 항체 20㎕의 양을 검출부(D)를 함유하는 니트로셀룰로스막상의 위치에 Cammg Linomat IV로 분무하고, 그곳은 선형으로 고정된 검출부에 평행하게 막의 말단부로부터 5mm에 위치하며, 막을 실온에서 건조시켜 사용될 때까지 4℃에서 보관한다.
1-g) 장치의 제조
1-f) 에서 제조된, 검출부(D) 및 표식 물질 존재부(C)를 함유하는 니트로셀룰로스막을 4mm 간격마다 50mm 폭으로 직각으로 절단하여 4×30mm 스트립을 제조한다. 또, 4×7mm 스트립이 또한, 1-d)에서의 항체 용액을 사용하여 생산된 항 hCG -특이 모노클론 항체가 고정된 셀룰로스 여과지 시트의 직각으로 부터 또한 제조된다.
검출부(D) 및 표식 물질 존재부(C)를 함유하는 니트로셀룰로스막중 4개의 스트립을, 제10(b)도에서 나타난 바와 같이 유리판상에 피복된 접착 테잎을 부착시킴으로써 제조된 지지체(G)에 제10(a)도에서 나타난 바와 같이 1mm 간격으로 서로 평행하게 부착시킨다. 그후, 항 hCG -특이 모노클론 항체가 고정된 셀룰로스 여과지의 스트립을 1mm 겹친 부분이 그들의 우단에 형성되도록 부착시키고, 또한, 1-c) 에서 제조된 시료 첨가부(A)를 1mm 겹친 부분이 그들의 우단에 형성되도록 부착시킨다. 한편, 크로마토그래피용 셀룰로스 여과지(Advantec Toyo 사제, No.585)로 부터 10×21mm 여과지 조각을 1mm 겹친 부분이 형성되어 이들이 확실하게 연결되도록 흡수부(E)로서 막의 좌단에 부착 시킨다. 상기 와 같은 방법으로 5개의 장치를 제조한다.
1-h) 측정
0, 10, 20, 30 또는 40 iu/l을 함유하는 뇨 시료를 사용한다. 하나의 시료, 200㎕의 양을 1-g)에서 제조된 장치의 한 시료 첨가부 (A)에 첨가하고, 다른 시료를 다른 시료 첨가부(A)에 첨가한다.
시료중 hCG를 포착용 항체의 양을 기준으로 일정량 항체 고정부(B)에 포착하고, 이어서, 남아있는 hCG를 착색 라텍스-표식 항체에 결합시키고, 크로마토그래피 이동하여 선형으로 검출부(D)에 고정된 항 hCG 특이 모노클론 항체에 결합시킨다. 미반응 표식 항체 및 시료 용액을 크로마토그래피 이동에 의해 흡수부(E)로 이동시키고, 그 후, 검출부(D)에서의 표식 물질로 부터 유래된 착색을 관찰한다.
본 장치의 검출 감도는 검출부(D)에 고정된 항 hCG 특이 모노클론 항체의 양 및 표식 물질 존재부 (C)에서의 착색 라텍스 표식 항체의 양을 기준으로 10 iu/l으로 설정하고, 분석량 폭은 항체 고정부 (B)의 크기 및 포착용 항체량을 기준으로 하여 설정된다.
시료가 첨가된 장치의 검출부(D)의 착색은 표1(a)에 나타낸다. 표1(b)는 적색 선형이 관찰되는 것을 "+"로, 적색 선형이 관찰되지 않는 것을 "-"로 표시한다.
[표 1]
표 1에 나타낸 바와 같이, 시료중 hCG 의 반정량 분석이 본 발명에 따른 10 iu/l 농도폭에서 양호한 정확도를 가지고 수행될 수 있다는 것을 발견하였다.
상기 증명된 바 없이, 미지 농도의 hCG를 가지는 시료의 반정량 분석에 대해서, 바람직하게는, 반정량 분석이, 우선 큰 폭으로, 예를 들어, 1,000, 200, 40 및 1iu/l의 4단계로, 고정된 항체의 양을 설정하고 , 이어서, 시료중 hCG의 농도가 0∼40 iu/l의 범위에서 발견되었다면 상기 실시예 1에 기재된 바와 동일 공정을 반복하여 수행한다. 또한, 시료가 다른 범위의 농도인 경우, 농도에 의존하여 반정량 분석을 수행하는 유니트를 제조하여 사용하는 것이 바람직하다.
[실시예 2]
hLH (사람 황체형성 호르몬)의 측정
2-a) 항 hLH 특이 모노클론 항체의 제조
hLH를 항원으로서 사용하고, 실시예 1-a)에서와 동일한 방법으로, Balb/c 마우스를 면역시키고, 그의 비장 세포를 사용하여 세포 융합을 수행하여, hLH 특이 모노클론 항체를 분비하는 융합 세포 균주 및 hCG, hLH 및 hFSH 와 교차 반응하는 α-서브유니트를 인식하는 모노클론 항체를 분비하는 융합 세포 균주를 수득한다. 미리 프리스탄(Puristane)을 투여한 Balb/c 마우스에 복수종양을 형성하기 위해 각 세포 균주를 복강내 투여하고 복수를 수득한다. 상기 수득한 복수를 암모늄 술페이트 분획법, 및 아피겔(Affigel) -단백질 A MAPS 키트로 정제하고 냉동 건조시켜 모노클론 항체의 백색 분말을 수득한다.
상기 수득한 항 hLH -특이 모노클론 항체를 사용하여 항체 고정부 (B) 및 검출부 (D)를 제작하고, α-서브유니트를 인식하는 모노클론 항체를 표식 항체의 제작에 사용한다.
2-b) 금 콜로이드 - 표식 항 hLH -특이 모노클론 항체의 제조
2-a)에서 제조된, hCG α-서브유니트를 인식하는 모노클론 항체를 10mM HEPES 완충용액(pH 7.4)에 용해시켜 200㎍/ml의 모노클론 항체를 함유하는 용액을 제조한다. 모노클론 항체 용액, 1.0ml의 양을 4.0ml의 금 콜로이드 용액(금 콜로이드 입자 직경 10nm, E-Y Laboratory 제)에 첨가하고, 혼합액을 실온에서 10 분간 교반한다. 이어서, 0.05% PEG 20000 및 0.1%BSA를 함유하는 10mM HEPES 완충용액(pH 7.4)을 0.25ml 첨가하고, 혼합액을 1 시간 동안 교반하여 10℃, 30분간 15,000rpm으로 원심분리시킨다. 0.05% PEG 20000, 0.1% BSA 및 0.3MD-만니톨을 함유하는 10mM HEPES 완충용액(pH 7.4), 4.0ml의 양을 생성된 침전물에 첨가하고, 침전물을 0mM HEPES 완충용액에 균일하게 현탁시킨다. 이어서, 혼합액을 10℃, 30분간 15,000rpm으로 더 원심분리하고, 1.0ml의 동일한 완충용액을 생성된 침전물에 첨가하여, 금 콜로이드-표식 항 hLH 항체를 수득한다. 상기 수득된 항체를 사용할 때 까지 4℃에서 보관한다.
2-c) 시료첨가부 (A)의 제조
크로마토그래피용 여과지 시트 [Advantec Toyo 사제, No 526]를 절단하여 10 × 25mm 여과지 조각을 제조하고, 실시예 1-c)에서와 동일한 방법으로 그로부터 시료 첨가부 (A)를 제조한다.
2-d) 항제 고정부 (B)의 제조
a) CNBr 활성화 셀룰로스 여과지의 제조
셀룰로스 여과지 시트 [Advantec Toyo 사제, No. 514A]를 10 ×20mm 조각으로 절단하고, 실시예 1-d)에서와 동일한 방법으로 CNBr 활성화 셀룰로스 여과지를 2g의 조각으로 부터 제조한다.
b) 항 hCG -특이 모노클론 항체 - 고정 셀룰로스 여과지의 제조
2-a)로부터 제조된 항 hLH 특이 모노클론 항체 및 커플링 완충 용액 (0.1M NaHCO3함유하는 0.5M NaCl, pH 8.3)을 사용하여 항 hCG 특이 모노클론 항체를 0, 10, 25, 40, 70 및 120㎍/ml의 농도로 함유하는 용액을 제조한다. 상기 a)에서 제조된 CNBr 활성화 셀룰로스 여과지를 5ml의 용액에 각각 용액당 50장씩 침적시키고, 용액을 천천히 교반하여 실온에서 약 3 시간동안 및 다음으로, 4℃ 에서 하룻밤 동안반응을 수행한다. 반응후, 미반응 활성기를 실시예 1-d)에서와 동일한 방법으로 보호시키고, 여과지를 0.1M 아세트산 완충용액(pH4.0) - 0.1M 트리스 완충용액 (pH8)으로 3회 세척하고, 실온에서 건조시켜 사용될 때까지 4℃에서 보관한다.
2-e) 검출부 (D)의 제조
니트로셀룰로스막[SartoriusAG 사제, 기공 직경 8㎛]을 30 × 50mm의 크기로 절단하고, 2-a)에서 제조된 200㎍/ml의 항 hLH 특이 모노클론 항체를 함유하는 용액(50㎍/ml BSA - 함유 50mM 트리스 완충용액(pH 8.2) 10㎕를 분무된 용액이 선형이도록, 절단된 니트로셀룰로스막의 중앙 (15mm의 위치)에 Cammg Linomat IV로 분무하고, 실시예 1-e)에서와 동일한 방법으로 보호 및 건조를 수행하여, 검출부 (D)를 함유하는 니트로셀룰로스막을 수득한다.
2-f) 표식 물질 존재부(C)의 제조
2-b)에서 제조된 금 콜로이드 - 표식 항 hLH 특이 모노클론 항체를 10% 사카로스 용액으로 2회 희석시키고, 실시예 1-f)에서와 동일한 방법으로, 그의 50㎕로 2-e)에서 선형으로 제조된 검출부(D)를 함유하는 니트로셀룰로스막상의 위치에 Cammg Linomat IV로 분무하고, 위치는 검출부에 평행하게 막의 말단부로부터 7mm에 위치하며, 막을 실온에서 건조시켜 사용될 때까지 4℃에서 (데시케이터에서) 보관한다.
2-g) 장치의 제조
2-f) 에서 제조된, 검출부(D) 및 표식 물질 존재부(C)를 함유하는 니트로셀룰로스막을 3mm 간격마다 50mm 폭으로 직각으로 절단하여 3 × 30mm 스트립을 제조한다. 또한, 2-d)에서의 항체 용액을 사용하여 생산된 각각의 항 hLH 특이 모노클론 항체가 고정된 셀룰로스 여과지 시트로부터 3 × 10mm 스트립이 또한 제조된다.
제11(d)도에서 나타난 돌기 a)∼e)가 있는 플라스틱판의 돌기 a), b), c) 및 e)의 각각의 상부에 양면 접착 테잎을 부착시키고, 검출부 (D) 및 표식 물질 존재부(C)를 함유하는 니트로셀룰로스막의 6개의 스트립을 제11(c)도에서 이 1mm 간격으로 평행하게 c)상에 접착 테잎으로 거기에 접착시킨다. 그후, 항 hLH 특이 모노클론 항체가 고정된 셀룰로스 여과지의 스트립을 1mm 겹친 부분이 그들의 우단에 형성되도록 부착시키고, 또한, 2-c) 에서 제조된 시료 첨가부(A)를 1mm 겹친 부분이 그들의 우단에 형성되도록 부착시킨다.
한편, 크로마토그래피용 셀룰로스 여과지(Advantec Toyo 사제, No.585)로 부터 10×25mm 여과지 조각을 2mm 겹친 부분이 막 (크로마토그래피 재질(F))상의 d)부분에 형성되도록 e)상에 흡수부(E)로서 막의 좌단에 부착시킨다.
막 ((크로마토그래피 재질(F)) 및 항체 고정부 (B)가 지지체에 직접적으로 접촉하지 않도록 상기 방법으로 7개의 장치를 생산한다.
2-h) 측정
0, 50, 75, 100, 150, 200 또는 300 miu/ml을 함유하는 뇨 시료를 사용한다. 하나의 시료, 250㎕의 양을 2-g)에서 제조된 장치의 한 시료 첨가부 (A)에 첨가하고, 다른 시료를 다른 시료 첨가부(A)에 첨가한다.
포착용 항체의 양을 기준으로 시료중 hLH를 항체 고정부(B)에 일정량 포착하고, 이어서, 남아있는 hCG를 금 콜로이드 표식 항체에 결합시키고, 크로마토그래피 이동하여 선형으로 검출부(D)에 고정된 특이 모노클론 항체에 결합시킨다. 미반응 금 콜로이드 표식 항체 및 시료 용액을 크로마토그래피 이동에 의해 흡수부(E)로 이동시키고, 그 후, 검출부(D)에서의 표식 물질로 부터 유래된 착색을 관찰한다.
본 장치의 검출 감도는 검출부(D)에 고정된 항 hCG 특이 모노클론 항체의 양 및 표식 물질 존재부 (C)에서의 금 콜로이드 표식 항체의 양을 기준으로 50 miu/ml으로 설정하고, 반정량 분석량 폭은 항체 고정부 (B)의 크기 및 포착용 항체량을 기준으로 하여 설정된다.
시료가 첨가된 장치의 검출부(D)의 착색은 표2(a)에 나타낸다. 표2(b)는 적색 선형이 관찰되는 것을 "+"로, 적색 선형이 관찰되지 않는 것을 "-"로 표시한다.
[표 2]
[실시예 3] 에스트로겐의 측정
3-a) 에스트리올-16-글루크로나이드-BSA의 제조
에스트리올-16-글루크로나이드, 40mg을 1.0ml의 디메틸포름아미드(DMF) 중에 용해시키고, 20.6㎕의 트리-n-부틸아민을 4℃ 이하에서 거기에 첨가한다. 이어서, 11.2㎕의 이소부틸 클로로카르보네이트를 첨가하고, 혼합액을 30분간 교반시킨다. 상기 혼합액을 117mg의 BsA(소 혈청 알부민)을 2.8ml의 수중에 용해시켜 미리 제조된 액체와 혼합시키고, 150㎕의 1 N NaOH 용액을 첨가한 다음, 2.0ml의 디메틸포름아미드를 첨가하여 혼합액을 8℃ 로 유지한다. 이어서, 생성된 혼합물을 8℃에서 교반시키고, 1 시간 후, 16.6㎕의 1 N NaOH 용액을 첨가한다. 혼합액을 3.5 시간 동안 더 교반시킨 다음, 미반응 에스트리올-16-글루크로나이드 및 트리-n-부틸아민 등과 같은 저분자량을 갖는 시약을 세파덱스 (Sephadex)G-25로 제거한다. 생성된 반응 혼합물을 투석(정제수로) 시킨 다음, 냉동 - 건조시켜 에스트리올-16-글루크로나이드-BSA를 수득한다. 상기 항원의 냉동 - 건조 분말의 코벨 반응(Kobel reaction)은 BSA의 몰 당 27∼30 몰의 에스트리올-16-글루크로나이드가 결합한다는 것을 나타낸다.
3-b) 항 에스트리올-16-글루크로나이드 항체의 제조
상기 3-a)에서 제조된 에스트리올-16-글루크로나이드-BSA, 2mg의 양을 1ml의 생리 식염수에 용해시키고, 동일량의 프로이드 완전 보조액을 유화시킨다. 유액을 성숙한 토끼의 발바닥 및 피하에 주사한다. 상기 주사는 1개월의 간격으로 수행하고, 항체가의 상승 후, 혈액 전체를 수합하여, 항혈청을 수득한다. 항혈청을 56℃에서 30분간 불활성화시키고, BSA로 흡수시킨 다음, 암모늄 술페이트로 염석 시키고, 세파덱스 G200에 의해 DEAE - 셀룰로스 크로마토그래피 및 겔 여과로 정제한 다음, 냉동 건조시켜 백색 불말인 항-E316G 항체를 수득한다.
3-c) 에스트리올-16-글루크로나이드-결합 폴리아크릴산
(E316G-PAA)의 제조
a) 에스트리올-16-글루크로나이드-헥사메틸렌디아민 유도체
93mg의 에스트리올-16-글루크로나이드, 및 25mg의 N-히드록시숙신산 이미드를 1.5ml의 DMF 중에 용해시키고, 혼합액을 빙냉하여 교반하는 동안, 41mg의 디시클로헥실카르보디이미드(DCC)를 첨가한다. 30 분 후, 1ml의 DMF 중 55mg의 모토벤질옥시카르보닐헥사메틸렌디아민 염산염 및 0.03ml의 트리에틸아민의 용액을 첨가하고, 혼하백을 빙냉하에 2 시간 동안 및 실온에서 12 시간 동안 교반한다. 반응 혼합액 전부를 감압 건조시켜 고형화시키고, 잔류물을 제조용 박막 크로마토그래피를 수행하여 82mg의 상기 정의된 목적 화합물 (이론 수율에 상대적인 수율, 55%)을 수득한다.
상기 생성물은 실리카겔 박막 크로마토그래피에서 Rf = 0.42 (클로로포름-메탄올 5:1)을 나타낸다.
b) 상기 a)서 수득한 에스트리올-16-글루크로나이드-헥사메틸렌디아민 유도체, 50mg을 3ml의 메탄올중에 용해시키고, 10mg의 팔라듐 블랙을 첨가하여, 혼합물을 대기압하 실온에서 수소기류중에서 교반시킨다. 반응을 2시간 후에 완료하고, 촉매를 여과하여 제거한다. 여액을 감압 농축시키고, 디에틸 에테르를 잔류물에 첨가하여, 카르보벤질옥시기가 제거된 목적 생성물 분말 35mg을 수득한다.
10mg의 상기 생성물을 100mg의 폴리아클리산과 함께 2ml의 DMF 중에 용해시키고, 4mg의 DCC를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 50시간 동안 방치한다. 반응액을 투석하고, 투석된 반응액을 여과하여 냉동 건조시킴으로써 95mg의 에스트리올-16-글루크로나이드가 결합된 폴리아크릴산 (E316G-PAA)를 백색 분말의 형태로 수득한다.
3-d) 착색 라텍스가 표식된 E316G-PAA 의 제조
N,N-디메틸포름아미드(DMF)ㆍ정제수(1:1)로부터 제조된 10% 트리에틸아민 용액, 12ml을 적색 아민화 폴리스티렌 라텍스 (고형 성분 10%, Japan Synthetic Co., Ltd. 사제, 입자 직경 0.37㎛)에 첨가하여 현탁시키고, 혼합물을 15분간 교반시킨 다음 원심분리한다. 침전물을 10ml의 DMFㆍ물(1:1)로 2회, 및 10ml의 정제수로 1회 원심 세척한 다음, 0.5ml의 정제수중에 현탁시키고, 3-a)에서 제조된 E316G-PAA 의 용액(1ml의 정제수중 2mg의 E316G-PAA의 용액)을 첨가하여 혼합시킨다. 이어서, 7.5mg의 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필)카르보디이미드 염산염을 첨가하고, 혼합물을 하룻밤 교반하면서 반응시킨다. 반응후, 반응 혼합물을 원심분리하고, 생성된 침전물을 10ml의 글리신 완충용액으로 3회 원심 세척하고, 30% 사카로스 및 0.1% GSA(염소 혈청 알부민)을 함유하는 10ml의 글리신 완충용액에 현탁시켜 E316G-PAA가 결합된 착색 라텍스를 수득한다.
3-e) 시료 첨가부 (A)의 제조
1장의 유리섬유 여과지 (Advantec Toyo 사 제, GA-100, 2.1Φcm)를 정제수중에 침적시켜 세척, 배수하고 2% 탈수 분유 분말 및 2.5% BSA를 함유하는 0.1M 트리스 완충용액(pH 8.2) 중에 침적시킨다. 시트를 4℃에서 하루 동안 방치시킨 다음 0.1M 트리스 완충용액으로 세척, 배수하여 실온에서 건조시킨다.
3-f) 항체 고정부(B)의 제조
a) CNBr 활성화 셀룰로스 여과지의 제조
1장의 셀룰로스 여과지 (Advantec Toyo 사 제, No. 526, 두께 0.70mm)을 10× 20mm 조각을 절단하고, 실시예 1-d)에서와 동일한 방법으로 2g의 조각으로 부터 CNBr 활성화 셀룰로스 여과지를 제조한다.
b) 항 E316G 항체가 고정된 셀룰로스 여과지의 제조
3-b)에서 제조된 항 E316G 항체 및 커플링 완충용액(0.1M NaHCO3함유 0.5 M NaCl, pH8.3)을 사용하여 0, 0.25, 0.5 및 1.0mg/ml의 농도로 E316G 항체를 함유하는 용액을 제조한다. 상기 a)에서 제조된 CNBr 활성화 셀룰로스 여과지를 5ml의 용액에 용액당 5장씩을 침적시키고, 용액을 천천히 교반하면서 실온에서 2시간 동안 반응을 수행한다. 반응후, 미반응 활성기를 실시예 1-d)에서와 동일한 방법으로 보호시키고, 여과지 시트를 0.1M 아세트산 완충용액(pH 4.0) - 0.1M 아세트산 완충용액(pH 8.0)으로 3회 세척하고, 실온에서 건조시킨 다음 사용할 때 까지 4℃에서 보관한다.
3-g) 검출부(D)의 제조
니트로셀룰로스막(Sartorius AG 사제, 기공 직경 5㎛)을 30 × 50mm 의 크기로 절단하고, 0.25mg/l의 항 E316G 항체(Teikoku Hormone MFG, CO., Ltd. 사제)를 함유하는 용액(50㎍/ml BSA 함유 50mM 트리스 완충용액(pH 8.2) 10㎕를, 분무 용액이 선형이 되도록 막 말단부로 부터 10mm 떨어진 부분에 Cammg Linomat IV로 분부하고, 막을 실시예 1-c)에서와 동일한 방법으로 처리하여, 검출부(D)를 함유하는 니트로셀룰로스막을 수득한다.
3-h) 표식 물질 존재부(C) 의 제조
폴리에스테르 부직포(10 × 4mm, 두께 0.5mm)를 0.1% 가용화 카세인 용액에 침적시키고, 37℃에서 1시간 동안 방치시킨다. 이어서, 부직포를 배수시키고, 3-d)에서 제조된 20㎕의 착색 라텍스 표식 E316G-PAA 현탁액에 함침시키고, 실온에서 건조시켜 사용될 때 까지 데시케이터에서 보관한다.
3-i) 장치의 제조
3-g) 에서 제조된 검출부(D)를 함유하는 니트로셀룰로스막을 4mm 간격 50mm 폭으로 직각으로 절단하여 4 × 30mm 스트립을 제조한다. 또한, 3-f) 에서의 항체 용액을 사용하여 생산된 각각의 항 E316G 항체가 고정된 셀룰로스 여과지 시트로부터 4 × 10mm 스트립이 또한 제조된다.
제12(f)도에서 나타낸 바와 같이, 양면 접착 테잎을 유리판 (지지체(G))에 부착시키고, 3-e)에서 제조된 시료 첨가부(A)를 그의 중앙에 부착시킨다음, 상기 용액으로부터 제조된 항 E316G 항체가 고정된 셀룰로스 여과지 시트의 스트립을 1mm 겹친 부분이 형성되도록 일정한 간격으로 (A)를 둘러 부착시킨다(좌측으로 수평하게 뻗은 것으로부터 항체 0, 0.25, 0.5 및 1.0mg/ml의 순). 3-h)에서 제조된 표식 물질 존재부 (C)를 2mm 겹친 부분이 형성되도록 그의 선단부에 부착시킨다. 마지막으로, 크로마토그래피용 셀룰로스 여과지 (Advantec Toyo 사제, No. 585)의 4 × 10mm 여과지 조각을 2mm 겹친 부분이 형성되어, 이들이 확실하게 연결되도록 흡수부(E)에 부착시킨다. 상기와 동일한 방법으로 5개의 장치를 제작한다.
3-j) 측정
0, 1, 2, 4 및 8㎍/ml을 함유하는 뇨 시료를 사용한다. 하나의 시료, 300㎕의 양을 3-i)에서 제조된 장치의 한 시료 첨가부 (A)에 첨가하고, 다른 시료를 다른 시료 첨가부(A)에 첨가한다.
포착용 항체의 양을 기준으로 시료중 에스트로겐을 항체 고정부(B)에 일정량 포착하고, 이어서, 포착되지 않은 에스트로겐을 착색 라텍스 표식 E316G-PAA 와 함께 검출부(D)로 크로마토그래피 이동하여 항 E316G 항체와 경합적으로 결합시킨다. 미반응 표식 물질을 크로마토그래피 이동에 의해 흡수부(E)로 이동시킨 후, 검출부(D)에서의 표식 물질로 부터 유래된 착색을 관찰한다.
본 장치의 검출 감도는 항체- E316G 모노클론 항체의 양 및 착색 라텍스 표식 E316G-PAA 의 양을 기준으로 1㎍/ml의 에스트로겐이 검출부(D)에 고정된 항체 - E316G 모노클론 항체와 표식 물질 존재부 (C)에서의 착색 라텍스 표식 E316G-PAA 사이의 반응을 억제시킬 수 있도록 설정되고, 반정량 분석 폭은 항체 고정부 (B)의 크기 및 포착용 항체량을 기준으로 하여 설정된다.
시료가 첨가된 장치의 검출부(D)의 착색은 표3(a)에 나타낸다. 표3(b)는 적색 선형이 관찰되는 것을 "+"로, 적색 선형이 관찰되지 않는 것을 "-"로 표시한다.
[표 3]
[발명의 효과]
본 발명은 시료를 희석할 필요가 없고, 희석 효과의 조정에 관한 용인이 적으므로 "희석효과"의 용이한 조정을 허용하며, 탁월한 감도, 즉, 반정량 분석치 폭을 좁게 설정하는, 간이 면역화학적 반정량 분석방법 및 그의 장치를 제공한다.

Claims (11)

  1. (정정) 크로마토그래피법에 따른 면역화학적 간이 반정량 분석방법에 있어서, 복수의 면역분석 유니트로 이루어진 면역성분 장치를 이용하고; 장치를 구성하는 각 유니트상에서 수행되는 차기 면역화학적 정성 분석 전에, 고정되어 존재하는 분석 대상물에 대한 항체 (이하, "포착용 항체"로 약칭)에 의해, 각 유니트에 고정된 포착용 항체의 양(단, 포착용 항체의 양은 각 유니트마다 다르고, 한 유니트에서는 포착용 항체의 양이 없고, 남아있는 유니트 각각에서의 포착용 항체의 양은 차기 정성 분석의 검출 감도에 대응하는 분석 대상물을 적어도 포착하기에 충분한 양이며, 남아있는 유니트에서 포착용 항체는 적절한 폭으로 순차 단계적 변화시킨 양으로 고정된다)에 대응하는 양의 시료중 분석 대상물을 포착하여, 각 유니트상에서 수행되는 차기 면역화학적 정성 분석을 수행하기 위한 분석 대상물 농도를 감소시키고, 시료중 분석 대상물을 포착용 항체로 포착한 결과, 분석 대상물의 농도가 검출 감도보다 적으므로, 장치를 구성하는 하나 이사의 유니트에서의 차기 면역화학적 정성 분석에서는 분석 대상물이 검출되지 않으며; 분석 대상물이 검출되는 한계 또는 분석 대상물이 더 이상 검출되지 않는 한계에서 나타나는 유니트에서의 포착용 항체의 양을 기준으로하여 반정량 분석치를 결정한다는 것을 특징으로 하는 면역화학적 간이 반정량 분석방법.
  2. (정정) 제1항에 있어서, 분석 대상물이 완전 항원 및 합텐으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. (정정) 제1항에 있어서, 분석 대상물이 hCG, hLH 또는 에스트로겐일 것을 특징으로 하는 방법.
  4. (정정) 복수의 유니트로 구성되는 크로마토그래피법에 따른 면역화학적 간이 반정량 분석 장치에 있어서, 각각의 유니트는, 시료중 분석 대상물의 일정량을 포착하기 위한 항체가 소정량 고정되어 존재하는 항체 고정부(B), 분석 대상물의 존재 유무를 검출하기 위한 지표로서 표식 물질이 크로마토그래피 이동 가능한 상태로 존재하는 표식 물질 존재부 (C), 및 표식 물질을 검출하기 위한 검출용 물질이 고정되어 존재하는 검출부(D)로 이루어지고, 장치는, 상기 복수의 유니트, 각 유니트에 공통인, 분석 대상물을 함유하는 시료를 첨가하는 시료 첨가부 (A), 및 각 유니트에 공통으로 또는 독립적으로 존재하는, 첨가된 시료와 함께, 분석 대상물의 검출에 관여하지 않은 표식 물질을 흡수 제거시키는 흡수부(E)로 구성되고; 그중, 각 유니트의 항체 고정부 (B)에 고정된 포착용 항체의 양은 유니트마다 다르고, 포착용 항체의 양은 적절한 폭으로 순차 단계적 변화하는 것을 특징으로 하는 장치.
  5. (정정) 제4항에 있어서, 분석 대상물이 완전 항원이고, 표식 물질이 항체 고정부 (B)에 고정된 분석 대상물 포착용 항체(이하, "포착용 항체I"로 약칭)와는 다른 분석 대상물상의 항원 결정기를 인식하는 표식 항체 (이하, "포착용 항체II"로 약칭)이고, 검출용 물질이 표식 항체 II와는 최소한 다른 분석 대상물상의 항원 결정기를 인식하는 항체 (이하, "검출용 항체III"로 약칭)인 것을 특징으로 하는 장치.
  6. (정정) 제4항에 있어서, 분석 대상물이 합텐이고, 항체 고정부 (B)에 고정된 분석 대상물 포착용 항체가 합텐 항체 (이하, "포착용 항체IV"로 약칭)이고, 검출용 물질이 분석 대상물에 결합할 수 있는 합텐 항체 (이하, "포착용 항체V"로 약칭)이며, 표식 물질이 검출용 항체 V에 분석 대상물과 경합적으로 결합할 수 있는 표식 물질인 것을 특징으로 하는 장치.
  7. (정정) 제4항에 있어서, 분석 대상물이 합텐이고, 항체 고정부 (B)에 고정된 분석 대상물 포착용 항체가 합텐 항체 (이하, "포착용 항체VI"로 약칭)이고, 표식 물질이 분석 대상물에 결합할 수 있는 표식된 합텐 항체 (이하, "포착용 항체VII"로 약칭)이며, 검출용 물질이 검출용 항체 VII에 대하여 분석 대상물인 합텐과 경합적으로 결합할 수 있는 표식 물질인 것을 특징으로 하는 장치.
  8. (정정) 제4항에 있어서, 분석 대상물이 hCG 또는hLH 인 것을 특징으로 하는 장치.
  9. (삭제)
  10. (정정) 제6항에 있어서, 분석 대상물이 에스트로겐인 것을 특징으로 하는 장치.
  11. (정정) 제4항에 있어서, 각각의 유니트가 흡수부(E)를 공통으로 갖는 것을 특징으로 하는 장치.
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