JP3005303B2

JP3005303B2 - 測定装置

Info

Publication number: JP3005303B2
Application number: JP3011161A
Authority: JP
Inventors: 秀一松岡; 雄一大久保; 幸子西田; 隆笹岡
Original assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1991-01-31
Filing date: 1991-01-31
Publication date: 2000-01-31
Anticipated expiration: 2015-01-31
Also published as: JPH055743A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗原・抗体反応を利用
して被検物質を測定するための装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】医学診断薬の分野での液体試料中に含ま
れる微量物質の測定法として、種々の分析法が開発され
ているが、特に高感度測定法として抗原抗体反応を利用
した免疫分析法が幅広く用いられている。臨床分野では
この測定原理を応用した装置を用いて分析している。こ
の免疫反応の原理は、例えば特開昭47-18597、同53-475
18、臨床検査 vol.121、NO.1,977等に記載されている。

【０００３】更に、医院や一般家庭でもこの免疫反応を
利用した簡易測定の必要性も高まり、その目的のための
簡易型測定装置の開発も進歩しつつある。これらの装
置、方法の中で、例えば特開昭62−501034、同62−5019
89、同63−118657、同64-463などで開示されている方
法、いわゆる「ステイック」法がある。一般にこの方法
は個体支持体上に固定化された抗体と試験試料とを反応
させた後、この個体支持体を取り出して洗浄し、標識試
薬と反応させ検出可能なシグナルを得る。標識が酵素の
場合は、さらに発色試薬と反応させる必要がある。もち
ろん標識試薬と試料中の被検物質とを反応させた後に個
体支持体上の抗体と反応させることもできる。しかしい
ずれの方法も複数の操作手順を必要とし、しかも少なく
とも１回の洗浄操作が必要である。

【０００４】この点を補うために洗浄操作を省いた装置
も考案された。例えば特開昭63−281053、特開平１−29
9464、同２−12061 、特表平２−500540等に記載されて
いる方法で、いわゆる「膜アッセイ」である。この方法
は多孔質膜に抗体を固定化し、この多孔質膜と吸収剤を
組み合わせて、試験試料、標識化試薬を順次加えて検出
可能なシグナルを得る方法である。この方法では洗浄操
作が省かれたものの、まだ数回の操作が必要とされてい
る。

【０００５】そのため、操作手順をより簡略化した方法
が望まれている。一方、例えば特開昭62-39770、特開平
１−123149等には、凝集法を利用した装置が記載されて
いるがこの方法には、複雑な操作手順が必要ないが検出
可能なシグナルを得るためには30分から60分の反応時間
を必要とし、かつ判定がむずかしい欠点を持つ。これら
の欠点を補う装置および方法として、米国特許第 4,23
5,601及び同 4,361,537に記載されている免疫クロマト
グラフィー装置、ならびに測定方法がある。

【０００６】この装置および方法は、抗体が固定化され
たセルロース濾紙担体に各試薬を予め塗布して置き、試
験試料を所定の位置に加える。毛細管現象により濾紙担
体上を試料が移動した後、所定の位置に結合した標識試
薬を計測する方法であって、抗原抗体反応に不可欠であ
った洗浄操作、すなわち、未反応物質の除去工程を省略
した装置である。その後この装置および方法を改良した
多くの公報がある。

【０００７】例えば特開昭60−133368には、抗体を固相
化し、さらに標識化試薬を保持させた不溶性担体を毛細
管へ充填、この毛細管を試験試料につけて試料を毛細管
現象で移動させることで測定する装置が記載されてい
る。又、特開昭61−145459には吸収性シートをキャリア
ーとした免疫クロマトグラフィー法が開示されている。
これら吸収性キャリアーを担体とした装置は、特開昭63
−159760、同63-96559等にも記載されている。これらの
装置の多くは抗体を固相化したクロマトグラフ物質と標
識化試薬および必要なら反応に預かるその他の試薬を一
体化して、操作手順を極力省いたものである。

【０００８】一方、これらの装置のキット化のためには
ハウジングを施すのが好ましく、例えば特開昭63−2690
59、同63−501595、同64-59069等にはハウジングについ
ての記載がある。又、例えば特開平１−503174には多孔
質キャリアー上のあるゾーンに抗体を固相化しついで他
のゾーンに移動可能な状態で標識化試薬を含ませて、さ
らに試料受容部をも設け、これをハウジングにより一体
化させた装置が考案されている。これを用いることによ
り、何等複雑な操作手順をふむことなく敏速に、かつ簡
便に試験試料中の被検物質を測定できるが、抗原抗体反
応が毛細管現象の流体中で起こるために測定感度におい
て十分な効果が得られない。

【０００９】また特開平１−244370では試料受容部に標
識試薬を含ませる装置が考案されている。この装置は液
体試料中の被検物質と標識化試薬との結合反応をインキ
ュベーションにより行うため高感度に測定することが出
来るが、しかし、液体試料が血液や尿、とくに尿の場
合、これに含まれる不溶物のための試料受容部位が目ず
まりを起こし毛管流が停止することがある。このため濾
過手段を設けることが好ましいが試料受容部の上部やク
ロマトグラフィー物質と試料受容部の間に設置してもそ
の効果は十分ではない。そのため、検出までの時間や測
定感度の点でさらに改良が必要とされる。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、分析試料中
の分析対象物質（単に、分析対象と言う場合がある）
を、抗原・抗体反応を用いて簡単に且つ短時間に測定す
ることができる装置を提供しようとするものである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
め、本発明は、フィルター、標識化試薬含有部材、及び
１又は複数の反応領域を有する多孔性担体を有する免疫
測定装置であって、該多孔性担体がその上流端において
該フィルターと該標識化試薬含有部材とにより挟まれて
おり、該反応領域が該フィルター及び該標識化試薬含有
部材から離れてその下流に位置し、該標識化試薬含有部
材が標識された試薬を含有しており、そして該反応領域
に捕捉試薬が固定されていることを特徴とする、特異的
反応を用いて分析対象を測定する測定装置を提供する。

【００１２】

【作用】本発明の装置においては、多孔性担体の一端
（上流端と称する）がフィルター及び標識化試薬含有部
材により挟まれており、該多孔性担体の下流側には狭い
領域に捕捉試薬が固定されている。この領域を反応領域
と称する。今、分析対象（例えば抗原）を含有する試料
溶液をフィルターに適用すれば、該溶液はフィルターを
通過して多孔性担体に移行し、さらに前記標識化試薬部
材に入る。この標識化試薬部材には標識された物質（例
えば前記抗原に対する抗体）が含まれており、前記分析
対象抗原と標識された抗体との免疫複合体が形成され
る。

【００１３】十分量の被検試料液をフィルターに適用す
ればこの溶液は多孔性担体を毛細管現象により移動し、
この際に前記の免疫複合体は該溶液により運搬され、こ
の免疫複合体が前記多孔性フィルター上の反応領域に達
すると、該領域に固定されている捕捉試薬（例えば、分
析対象抗原に対する第二抗体）と反応し、前記免疫複合
体は例えばサンドイッチ状複合体の形で捕捉試薬抗体に
捕捉され、こうして捕捉固定された標識が検出される。

【００１４】

【効果】本発明の装置を用いる場合、前記のごとく、免
疫複合体が反応領域に捕捉濃縮されるので、それに伴っ
て標識物質も濃縮され、分析対象を極めて高感度に、し
かも非常に簡単な方法で測定することができる。

【００１５】

【具体的な説明】本発明の装置の構造の一例を模式的に
図１に示す。図１においてＡは該装置の横から見た重層
構造を示しており、Ｂはその平面図である。図中１はフ
ィルターを示し、２は多孔性担体を示し、３は標識化試
薬含有部材を示し、そして４は反応領域を示す。また10
は場合によっては存在するポジティブコントロール用反
応領域を示す。

【００１６】多孔性担体（２）は、使用時においては通
常、細長いテープ状の形状を有している。多孔性担体
は、分析試料等の溶液を例えば毛細管現象等の作用によ
り移行させるための媒体として機能するものであり、こ
の様な作用をするものである限りその材質は特に制限さ
れない。この様な材料として、例えばガラス繊維濾紙
（例えば、GF/A、 Whatman製）、セルロース膜、ニトロ
セルロース膜、ナイロン膜等を用いることができる。

【００１７】多孔性担体の寸法は特に制限はないが、使
用時においては、例えば幅２mm〜10mm、長さ50mm〜 150
mm、厚さ20μｍ〜1000μｍのものが用いられる。多孔性
担体として幅広いシートを用意しており、使用前にテー
プに切断して使用することもできる。

【００１８】多孔性担体（２）には、前記フィルター
（１）及び標識化試薬含有部材（３）より下流であって
且つこれらから離れた位置に１個又は複数個の反応領域
が設けられており、これらの反応領域には捕捉試薬が固
定されている。なお、本発明において「上流」及び「下
流」とは、試料溶液等をフィルターに適用した場合に該
溶液が多孔性担体中を移行する場合の移動の方向を意味
する。

【００１９】多孔性担体（２）は１個又は複数個の反応
領域を有し、１個の反応領域を有する場合には定性試験
又は半定量試験に用いることができ、また複数個の反応
領域を有する場合には定量試験に用いることができる。

【００２０】１個の反応領域が存在する場合の該反応領
域とフィルター（及び標識化試薬含有部材）との間の距
離は特に臨界的ではないが５mm〜３cmであり、また複数
の反応領域が存在する場合の最上流の反応領域とフィル
ター（及び標識化試薬含有部材）との間の距離も同様で
ある。複数の反応領域が存在する場合、反応領域間の距
離は特に臨界的ではないが、例えば２mm〜10mmである。
反応領域の長さ（縦方向の長さ）は通常0.１mm〜10mmで
ある。

【００２１】反応領域に固定される捕捉試薬は、通常、
抗原又は抗体であり、これらを多孔性担体に固定化する
方法は当業界においてよく知られており、それらの既知
の方法を用いればよい。例えば、リン酸緩衝生理食塩水
に抗原又は抗体を溶解させ、多孔性担体に塗布する。塗
布後、25℃にて18時間乾燥させる。固定化の後、多孔性
担体が有する反応基をブロックするため、常用のブロッ
キング剤、例えばゼラチン、アルブミン等により多孔性
担体を処理するのが好ましい。

【００２２】多孔性担体の上流端に設けられるフィルタ
ーは、試料溶液中に不溶性物質が存在すればそれを除去
することを主たる目的としており、従って、溶液中の不
溶物を濾過・除去することができるものであれば、その
材質には特に制限がない。例えば、セルロース膜、ガラ
ス繊維濾紙、ニトロセルロース膜、布、ナイロン膜等を
使用することができる。フィルターの寸法は、通常、多
孔性担体（２）の幅より広い方が好ましく、例えばその
幅より２mm〜５mm程度広くした方がよい。また、長さは
10mm〜50mm程度が便利である。

【００２３】好ましい態様においては、フィルターには
pH緩衝剤を含有せしめる。こうすることにより、フィル
ターを通過する試料溶液のpHをその後の抗原・抗体反応
のために都合のよいpHに調整することができる。緩衝剤
の種類及びpHは、分析試料の種類、そのpH、分析対象の
種類、分析に用いる反応試薬（例えば抗原、抗体、標識
物質等）により異るが、例えばTris緩衝剤、ジエタノー
ル緩衝剤、リン酸緩衝剤、等、常用の緩衝剤を用いるこ
とができる。

【００２４】フィルターに緩衝剤を付加するには、例え
ば緩衝液、 100mM〜１Ｍ濃度の緩衝液によりフィルター
を含浸し、これを常法に従って乾燥すればよい。フィル
ター（１）と多孔性担体（２）との接着は、例えば物理
的に接触させる、例えば機械的に押し付ける、等により
行うことができる。

【００２５】標識化試薬含有部材は標識された試薬を収
容し、且つ試料溶液を適用した場合に該試料溶液中の分
析対象と該標識された試薬との反応の場を提供するもの
である。この場合、標識された試薬は、標識化試薬含有
部材に「固定化」されておらず、試料溶液が適用された
場合に該溶液に溶解し、標識化試薬含有部材から「遊
離」していなければならない。

【００２６】従ってこの様な要件を満たすように、標識
化試薬含有部材用材料への標識された試薬の適用条件及
び標識化試薬含有部材用材料の種類を選択する必要があ
る。例えば、標識化された試薬の溶液を標識化試薬含有
部材用の材料に適用し、これを凍結乾燥する場合、標識
化試薬含有部材用の材料としてセルロース膜、ガラス繊
維濾紙、ニトロセルロース膜、ナイロン膜等を使用する
ことができ、セルロース膜が好ましい。

【００２７】標識化試薬含有部材（３）の寸法は、前記
フィルター（１）の幅と同じ幅を有し、その長さは10mm
〜50mmが適当である。標識化試薬含有部材（３）と多孔
性担体（２）との接着は、例えば、物理的に接触させる
ことにより、例えば機械的に押し付けること、等により
行うことができる。

【００２８】本発明においては、分析試料として種々の
溶液が用いられ、好ましくは生物由来の液体試料、例え
ば血液、血漿、血清、唾液、尿等が用いられる。これら
に含有されており、本発明の装置により分析される分析
対象としては、それに対して特異的に結合する物質が存
在するものであればよく、例えばポリペプチド、蛋白
質、複合蛋白質、多糖類、脂質、複合脂質、ホルモン
類、核酸等が例示される。ここで、特異的に結合する物
質とは抗原に対する抗体、及び抗体に対する抗原、並び
に種々の生理活性物質に対するそのレセプター、等が例
示される。

【００２９】分析対象のさらに具体的な例としては、被
検物質の例としては、卵胞刺激ホルモン、黄体刺激ホル
モン、胎盤性ゴナドトロピン、甲状腺ホルモン、リポ蛋
白、アポリポ蛋白、アルブミン、ヘモグロビン、プロゲ
ステロン、エストラジオール、等が挙げられるがこれら
に限定されるものではない。

【００３０】本発明の装置は、特異的反応を用いる、種
々の原理に基く測定に使用することができ、その最も典
型的な例として、抗原・抗体反応を用いる、いわゆるサ
ンドイッチ法、競合法等が挙げられる。

【００３１】サンドイッチ法においては、標識された試
薬として、分析対象とは結合するが捕捉試薬とは直接結
合しない物質を用い、捕捉試薬として分析対象と結合す
る物質を用いる。

【００３２】例えば、測定対象が抗原である場合、標識
された試薬として測定対象に対する第一の抗体を用い、
そして捕捉試薬として該測定対象に対する第二の抗体を
用いる。この場合、第一の抗体及び第二の抗体は測定対
象抗原上の異る抗原決定基を認識するものである。

【００３３】この方法においては、測定対象抗原が標識
された第一抗体と結合して免疫複合体を形成し、この免
疫複合体は、試料溶液が多孔性担体中を移動するに従っ
て移動し、第二抗体が固定されている反応領域に対した
時、前記標識された第一抗体／分析対象抗原−免疫複合
体中の分析対象抗原がその他方の抗原決定基により第二
抗体と結合し、この結果、標識された第一抗体／分析対
象抗原／固定された第二抗体−三元免疫複合体（いわゆ
るサンドイッチ）が反応領域において形成される。従っ
て、このようにして固定（捕捉）された標識物質を検出
することにより分析対象抗原の存否又は量を知ることが
できる。

【００３４】サンドイッチ法の第二の態様として、測定
対象が抗体である場合、標識された試薬として該測定対
象抗体に対する抗体を用い、そして捕捉試薬として該測
定対象抗体に対する抗原を用いることができる。また、
これとは逆に標識された試薬として測定対象抗体に対応
する抗原を用い、そして捕捉試薬として測定対象抗体に
対する抗体を用いることもできる。

【００３５】さらに、競争的方法においては、分析対象
及び標識された試薬の再者が捕捉試薬に競争的に結合す
るように、標識された試薬及び捕捉試薬を選択すること
ができる。

【００３６】この具体例として、捕捉試薬として抗原を
用い、分析対象及び標識された試薬は該抗原に競争的に
結合する同一の又は異る抗体である。この結果、分析試
料溶液中に存在する分析対象抗体と、標識化試薬含有部
材中に収容されていた標識された抗体とは相互に結合す
ることなく、試料溶液の移動と共に多孔性担体上の反応
領域に輸送される。

【００３７】そして、この反応領域に固定されている捕
捉抗原との結合に関して前記分析対象抗体と標識された
抗体とが競争し、捕捉固定された標識物質の量を測定す
ることにより試料溶液中に存在した分析対象抗体の量を
決定することができる。

【００３８】また、上記の方法とは逆に、捕捉試薬とし
抗体を用い、そして測定対象及び標識された試薬が該捕
捉抗体に競争的に結合するように、捕捉物質及び標識さ
れた試薬を選択することもできる。

【００３９】以上のごとく、本発明の装置においては、
多孔性担体上の結合領域に、分析対象、分析原理等に応
じて種々の捕捉試薬を固定化して用いるが、本発明の好
ましい態様においては「ポジティブコントロール」とし
ての追加の反応領域を、好ましくは前記の分析用反応領
域よりも下流に設ける（図１において10）。

【００４０】このポジティブコントロール用反応領域に
は、分析対象の不存在下でも標識された試薬を捕捉する
ことができる物質、すなわち標識された試薬と直接結合
する物質、を固定化する。この様な物質として、標識さ
れた物質がある動物からの抗体である場合、その動物の
抗体に対する他の動物由来の抗体を用いることができ
る。例えば、標識された物質がマウス抗体である場合、
ポジティブコントロール反応領域用捕捉試薬としてマウ
ス抗体に対するウサギ由来の抗体を用いることができ
る。

【００４１】本発明の標識物質としては、当業界におい
て知られている常用の標識物質を用いることができ、ま
たその検出手段としても対応する常用の手段を用いるこ
とができる。例えば、標識物質として、それ自体が色を
有し、直接目視できる物質、それ自体発光性を有する物
質、更なる反応により検出可能なシグナルを発生する物
質等を用いることができる。

【００４２】しかしながら、本発明の装置は、分析対象
を極めて簡単に、且つ短時間に測定することができるこ
とを１つの特徴としており、この特徴を発揮するために
は、標識物質として直接目視可能な物質、又はそれ自体
発光性を有する物質を用いることができる。

【００４３】直接目視可能な物質としては、例えば、着
色粒子、コロイド状粒子、染料粒子（分散染料）等を挙
げることができ、コロイド状金粒子、染料粒子（分散染
料、染料ゾル）等が特に好ましい。また、それ自体発光
性を有する物質としては蛍光発色団、例えばフルオレッ
セイン等を用いることができる。また放射性同位元素を
用いることができる。

【００４４】更なる反応により検出可能なシグナルを発
生することができる物質としては、例えば酵素、酵素等
を収容したリポゾーム等を用いることができる。酵素と
しては例えばカルカリホスファターゼ、ワサビパーオキ
シダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等を用いることがで
き、これらの検出方法は当業界においてよく知られてい
る。

【００４５】上記の種々の標識物質はいずれも当業界に
おいて知られており、そしてそれらを反応試薬、例えば
抗原、抗体等に結合させる（後者を標識する）方法も当
業界においてよく知られている。

【００４６】前記のごとく、本発明の装置により分析対
象物を定量するためには、図１のＣに示すように、複数
の反応領域（ポジティブコントロール用反応領域のほか
に）を設けるのが好ましい。また効率よく、精度よくま
た広範囲にわたる量（濃度）の分析対象物を定量しよう
とする場合、反応領域が下流に位置するに従って多くの
捕捉試薬を固定しておく必要がある。

【００４７】この場合、例えば試料中の分析対象の量が
非常に少ない場合、分析対象物と標識物質および捕捉試
薬との反応効率によって、捕捉試薬が最も多く固定化さ
れた反応領域（最下流）においてのみ分析対象物が捕捉
可能となり、シグナル（例えは発色）が得られ、従って
１個のシグナル（発色）をもたらす。

【００４８】しかし、分析対象の量が多くなればなるほ
ど、捕捉試薬の量が少ない反応領域でも分析対象物が捕
捉され、シグナル（発色）をもたらす。こうして、分析
対象の量（濃度）に応じた数のシグナル（発色）が得ら
れる。

【００４９】本発明の他の態様においては、分析試料中
の複数種類の分析対象に対応して複数の標識された試薬
を標識化試薬含有領域に収容せしめ、それに対応して複
数の反応領域を設けることができる。こうすることによ
り、１つの分析試料中に存在する複数の種類の分析対象
を、１個の装置を用いる１回の操作により同時に測定す
ることができる。

【００５０】本発明の装置の他の態様においては、装置
の小部分又は大部分をカバー部材により覆うことができ
る。この場合、カバーの少なくともフィルターに対応す
る部分に試料適用のための窓を設ける必要がある。さら
に分析結果を目視する方式の装置においては、カバーの
少なくとも反応領域に対応する部分には観察用の窓を設
けるか、又は透明部材により構成するか、あるいはカバ
ーが存在しないようにする必要がある。この構成によ
り、分析に際して装置の上流端を全体的に分析用試料溶
液中に浸漬するか、又は該上流端に分析用試料溶液を注
びかけることにより極めて簡単に試料を適用することが
できる。

【００５１】次に、このカバー付き装置の具体例を図４
及び図５により説明する。図４はこの装置の構造を模式
的に示すものであり、図５はこの装置を部材に分解して
示すものである。この装置は、装置全体に強度を与え、
且つ装置のカバーとして機能するＺ形に曲げられた長い
部材（Ｚ形部材)(20）を有し、これは標識化試薬含有部
材支持部（21）及び多孔性担体支持部（22）並びに垂直
部（23）を有する。さらに、その下流端が曲げられ、多
孔性担体固定部（24）が構成されている。このＺ形部材
はさらにその垂直部（23）に貫通孔（25）を有する。

【００５２】多孔性担体（２）は、前記貫通孔（25）を
通してＺ部材（20）にそって配置され、そして多孔性担
体固定部（24）により固定される。標識化試薬含有部材
（３）は、前記標識化試薬含有部材支持部（22）と多孔
性担体（２）との間に挿入される。また、フィルター１
は多孔性担体（２）の上であって標識化試薬含有部材
（３）に対応する位置に配置される。

【００５３】Ｚ形部材（20）の標識化試薬含有部材支持
部（21）、標識化試薬含有部材（３）、多孔性担体
（２）及びフィルター（１）は、留具（30）により機械
的に押付けられ一体化される。こうしてフィルター
（１）、多孔性担体（２）及び標識化試薬含有部材
（３）が相互に接触する。

【００５４】留具（30）は、その上面31に開口部、すな
わち窓32を有し、この窓を通して試薬溶液がフィルター
（１）に適用される。留具（30）はつめ（33）を有し、
その曲った先端34部が標識化試薬含有部材支持部（21）
を背部から抱え込むことにより関連各部材が一体化され
る。

【００５５】この構造において、Ｚ形部材（20）の材質
は特に限定されないが、例えば合成樹脂板を用いるのが
便利である。Ｚ形部材が透明である場合、多孔性担体上
に現われる測定結果は図４の矢印26及び27のいずれの方
向からでも観察することができる。これに対して、Ｚ形
部材が不透明な材料から作られている場合、測定結果は
カバーとしてのＺ形部材が存在しないか又は窓を形成し
ている側（図４における矢印27）から観察される。

【００５６】留具（30）の材質も特に限定されず、例え
ば金属、合成樹脂板等が使用される。なお、１つの態様
においては、標識化試薬含有部材支持部（21）の上面で
あって長手方向の縁部に２本の線状の凸部を形成し、こ
の間に標識化試薬含有部材（３）を配列することにより
該部材動きを防止し、同時に分析用試料溶液の横からの
侵入を防止することもできる。また、標識化試薬含有部
材支持部（21）に貫通孔を設けて、標識化試薬含有部材
（３）に分析用試料溶液が入る場合に脱気を促進するこ
ともでき、またこの孔を通して、分析用試料溶液の一部
が標識化試薬含有部材（３）に入るようにすることもで
きる。

【００５７】次に、実施例により本発明をさらに具体的
に説明する。実施例1. hCG のイムノクロマトグラフィーアッセイａ）金コロイド標識化マウス抗 hCG抗体の調製金コロイド標識化方法については、Journal of Immunoa
ssay 1(1), 77-91, 1980に記載されている方法に準じて
行うことが出来る。例えば、金コロイドＧ30（粒径30n
m、Amersham International plc. から供給される。）2
0mlに0.２ＮのK₂CO₃３mlを加えpH７に調製した。一
方、２mM硼砂緩衝液pH９で透析したマウス抗hCG抗体
（１mg／ml）を 100,000ｇ、１時間遠心後、その上清２
／３をとり２mM硼砂緩衝液pH９で40μｇ／mlに希釈し
た。

【００５８】金コロイド液（pH７）20mlを攪拌しながら
抗体溶液２mlを加え、２分間攪拌する。次いで１％ PEG
20,000ml 、10％ BSA（１Ｎ NaCl でpH９に調製されて
いる）２mlを加える。この反応液を12,000ｇで遠心し得
られた沈査を１％ BSA、0.05％ PEG 20,000 を含む20mM
トリス塩酸緩衝液（pH8.２）に再浮遊させ、再度遠心し
た。

【００５９】この操作を３回繰り返し最終的に得られた
沈査を１％ BSA、0.05％ PEG 20,000 を含む20mMトリス
塩酸緩衝液（pH8.２）で再浮遊させ、波長 520nmでの吸
光度が6.０になるように調製する。得られた金コロイド
標識化抗体液を５％BSA、0.05％ PEC 20,000 、0.３Ｍ
NaCl を含む20mMトリス塩酸緩衝液（pH8.２）で２倍希
釈し、最終調製液とした。

【００６０】ｂ）染料ゾル標識化マウス抗 hCG抗体の調
製染料ゾル標識化方法については、特開昭56−160655明細
書に記載されている。例えば、ルミナスRed(BASF社から
供給される) 2.５ｇを50mlの蒸留水に懸濁させ、45分間
室温で攪拌する。これを 125ｇ、30分間遠心後、沈査を
50mlの蒸留水で再浮遊させた。この操作を３回繰り返し
洗浄した。得られた沈査を25mlの蒸留水で再浮遊させた
後、同レベルの量のガラスビーズ（直径３mm：４mm＝
１：２に混合したもの）を加え５日間振盪した。この染
料ゾル液を回収し 300ｇ、30分間遠心した後、 1,000
ｇ、30分間さらに遠心し下層部を採取した。

【００６１】ついで波長 520nmの吸光度を5.０に調整し
た。一方、マウス抗 hCG抗体溶液を５mM NaCl(pH７に0.
１Na₂CO₃で調整されている）で透析後１mg／mlに調整し
た。この抗体溶液0.１mlをルミナス Red液５mlに加え、
室温で１時間反応させる。さらに30％ BSA、0.01％チメ
ロザールを含む５mM NaCl(pH７) で波長 520nmでの吸光
度を8.０に調整した。

【００６２】ｃ）多孔性担体の調製マウス抗 hCG抗体を１mg／mlの濃度に10mMリン酸緩衝液
生理食塩水（pH7.２）で調整する。ガラス繊維濾紙（GF
/A、 Whatman社製、20cm×12cm）上にこの抗体溶液を直
線状に塗布した。塗布はアクリル棒に抗体溶液をしみ込
ませて、直線を引いた。さらにポジティブコントロール
としてウサギ抗マウス抗体を同様に抗 hCG抗体塗布線の
下流側に塗布した。この多孔性抗体を25℃で18時間乾燥
した。次に１％ゼラチン液に１時間、浸した後10mMリン
酸緩衝液生理食塩水（pH7.２）で３回洗浄した。これを
陰圧乾燥機で乾燥後、抗体の塗布線に垂直に５mm幅で切
断し、５mm×12cmの多孔性担体を作製した。

【００６３】ｄ）標識化試薬含有部材の調製粘稠性濾紙(NO.60、Toyo Roshi社製）５mm×30mmに実施
例1.ａ）又はｂ）項に記載の方法で調製した標識化試薬
を75μｌ加え、凍結乾燥した。

【００６４】ｅ）フィルターの調製ガラス繊維濾紙 (GF/A、 Whatman社製）８mm×30mmに 2
00mMトリス塩酸緩衝液（pH10）をしみ込ませて凍結乾燥
した。

【００６５】ｆ）定量分析用多孔性担体の調製マウス抗 hCG抗体溶液を２，１，0.５，0.25、及び 0.1
25mg／mlの各濃度に10mMリン酸緩衝液生理食塩水（pH7.
２）で調整した。この抗体溶液を実施例1.ｃ）項に記載
の方法で上流側から下流側に向かって薄い濃度の抗体溶
液から、段階状に塗布した。これを定量用多孔性担体と
した。

【００６６】ｇ）hCG の測定実施例1.のａ），ｃ），ｄ），ｅ）に記載の方法で調製
した多孔性担体、金コロイド標識化抗体含有パッドおよ
びフィルターを用いて、図１Ａ及び図２に示す装置を組
み立てた。図１は本発明の装置を示し、図２ａおよびｂ
は比較対照として用いた装置を示す。尚、各装置の金コ
ロイド標識化抗体の量は同量とした。hCG ０, 10, 25,
50、又は 100IU／ｌをそれぞれ含む0.２％ BSA−リン酸
緩衝生理食塩水を試験試料とし、この各試験試料をフィ
ルターへ適用した。経時的、可視的に観察しバンドの呈
色が確認された時間と10分後の呈色バンドの強さを記録
した。結果を表１に示す。

【００６７】

【表１】

【００６８】ｈ）濾過膜の効果の確認尿を試験試料として用いた場合の本発明の装置の効果を
確認するためにhCG(０, 25、又は50IU／ｌ）を含んだ尿
試料を準備し、本発明の装置へ適用した。対照として、
フィルターを除いた同様な装置を用いた。観察は実施例
1.ｇ）項に記載の方法に準じた。観察された結果を以下
の表２に示す。

【００６９】

【表２】

【００７０】ｉ）フィルターへの緩衝液添加の効果の確
認フィルターへのトリス塩酸緩衝液あるいはジエタノール
アミン緩衝液添加の効果について検討した。尿を試験試
料とする場合、一般的に尿のpHは５〜８（平均６）であ
り、特に酸性尿の場合はpH４になるといわれる。そこで
尿のpHを４に調整し、本発明の装置へ適用した。また対
照として緩衝液を含まないフィルターを用いた。観察さ
れた結果は次のとおりである。尚、 hCGは含まない尿を
試料とした。結果を表３に示す。

【００７１】

【表３】

【００７２】ｊ）hCG の定量分析免疫クロマトグラフィー法で定量分析を行うために実施
例1.ｆ）項に記載の方法で調製した多孔性担体を用いて
本発明の装置を組み立てて、hCG(０, 10, 50,100, 500I
U／ｌ）試験試料を適用した。観察された結果を以下に
示す。 hCGの濃度が増すに連れて、確認される呈色バン
ドの数が据えた。結果を表４に示す。

【００７３】

【表４】

【００７４】この結果で得られた呈色バンドの発色強度
を数値で表せば検量線が得られる。例えば、ＴＬＣスキ
ャナー（島津社製）を用いて波長 530nmの吸光度を求め
て各ピークの高さを積算する。この結果を図示すれば検
量線が得られる。結果を表５に示す。

【００７５】

【表５】

【００７６】実施例2. 図１に示す本発明の装置と図４に示す市販の装置（商品
Ａ及び商品Ｂ）とを hCGの測定において比較した。市販
の装置は図４に示すように、多孔性担体の一端に試料適
用部位が存在し、その下流に抗hCG 標識化抗体が含浸さ
れており、さらに下流に抗hCG 固定化抗体（反応領域）
及びポジティブコントロール用反応領域を有する。hCG
0, 10, 25, 50, 100IU／ｌをそれぞれ含む、0.２％ BSA
−リン酸緩衝生理食塩水を試験試料とし、この試料を各
装置の用法用量に従って適用した。経時的、可視的に観
察しバンドの呈色が確認された時間と10分後のバンドの
強さを記録した。結果を表６に示す。

【００７７】

【表６】上記のごとく、本発明の装置は従来の装置に比べて非常
に鋭敏である。

【図面の簡単な説明】

【図１】この図のＡは本発明の装置の１態様を横から見
た略面であり、ＢはＡの装置の平面図であり、そしてＣ
は本発明の装置の、多数の反応領域を有する態様を示
す。

【図２】この図のａ及びｂはいずれも従来技術の装置を
模式的に示したものである。

【図３】本発明の装置の他の態様であって、図１に示す
装置が、フィルターに対応する部分に窓を有する透明な
不透水性カバーにより覆われている。

【図４】本発明の装置の一例を模式的に示すものであ
る。

【図５】図４に示す装置を構成部材に分けて示す。

【図６】従来技術の装置を示す。

【符号の説明】

１…フィルター２…多孔性担体３…標識化試薬含有部材４…反応領域 10…ポジティブコントロール用反応領域 11…不透水性透明カバー 12…試料適用のための窓

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者笹岡隆広島県高田郡甲田町下甲立1624 湧永製薬株式会社内 (56)参考文献特開平１−244370（ＪＰ，Ａ) 特開昭61−145459（ＪＰ，Ａ) 特表平１−503174（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/543

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】検体溶液中の目的物質を定量するための
多孔性担体からなる装置であって、多孔性担体に検体溶
液が直接又は間接的に接触可能な該多孔性担体の部位
と、その下流に検体溶液中の分析対象と親和性を有する
標識された試薬が移動可能な状態で保存された部位と、
その下流に反応領域が複数存在し、これらの反応領域に
上流から下流に向けて増加する量の捕捉試薬が固定化さ
れており、発色した反応領域の数により分析対象を定量
することができる測定装置。
【請求項２】フィルター、標識化試薬含有部材、及び
複数の反応領域を有する多孔性担体を有する免疫測定装
置であって、該多孔性担体がその上流端において該フィ
ルターと該標識化試薬含有部材とにより挟まれており、
該反応領域が該フィルター及び該標識化試薬含有部材か
ら離れてその下流に位置し、該標識化試薬含有部材が標
識された試薬を含有しており、そして該反応領域に捕捉
試薬が固定されていることを特徴とする、特異的反応を
用いて分析対象を測定する請求項１に記載の測定装置。
【請求項３】前記標識された試薬が、前記分析対象と
は結合するが前記捕捉試薬とは直接結合しない物質であ
る、請求項１又は２に記載の装置。
【請求項４】前記測定対象が抗原であり、前記標識さ
れた試薬が測定対象抗原に対する第一の抗体であり、前
記捕捉試薬が該測定対象に対する第二の抗体であり、そ
して該第一の抗体及び該第二の抗体は該測定対象抗原上
の異なる抗原決定基を認識するものである、請求項１〜
３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５】前記測定対象が抗体であり、前記標識さ
れた試薬が該測定対象抗体に対する抗体であり、そして
前記捕捉試薬が該測定対象抗体に対する抗原である、請
求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項６】前記測定対象が抗体であり、前記標識さ
れた試薬が該測定対象抗体に対する抗原であり、そして
前記捕捉試薬が該抗体に対する抗体である、請求項１〜
３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項７】前記分析対象及び前記標識された試薬の
両者が前記捕捉試薬に競争的に結合する物質である、請
求項１に記載の装置。
【請求項８】前記捕捉試薬が抗原であり、そして前記
測定対象及び前記標識された試薬が該捕捉抗原に競争的
に結合する同一の又は異なる抗体である、請求項７に記
載の装置。
【請求項９】前記捕捉試薬が抗体であり、そして前記
測定対象及び前記標識された試薬が該捕捉抗体に競争的
に結合する抗原である、請求項７に記載の装置。
【請求項１０】前記フィルターがpH緩衝剤を含有す
る、請求項１〜９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１１】装置の少なくとも部分が不透水性カバ
ーで覆われており、該カバーは装置のフィルターに対応
する部分に試料適用のための窓を用し、さらに装置の多
孔性担体上の反応領域に対応する部分に観察用窓を有す
るか又は少なくともカバーのこの部分が透明部材により
作られているか又はこの部分にカバーが存在しない、請
求項１〜10のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１２】前記多孔性担体がポジティブコントロ
ール用反応領域を有する、請求項１〜11のいずれか１項
に記載の装置。
【請求項１３】標識化試薬含有部材が、複数種類の分
析対象に対応する複数種類の標識された試薬を収容して
おり、さらに多孔性部材が対応する複数の反応領域を有
し、同時に複数の分析対象の測定が可能な、請求項１〜
12のいずれか１項に記載の装置。