DE60028976T2

DE60028976T2 - Analyseverfahren und vorrichtung

Info

Publication number: DE60028976T2
Application number: DE60028976T
Authority: DE
Inventors: Jan Carlsson; Maria LÖNNBERG
Original assignee: Phadia AB
Current assignee: Maiia Uppsala Se AB
Priority date: 1999-08-06
Filing date: 2000-07-21
Publication date: 2007-01-18
Anticipated expiration: 2020-07-22
Also published as: CA2383436C; JP4580131B2; ATE331219T1; AU770488B2; ES2265957T3; CA2383436A1; JP2003506717A; EP1198710B1; DE60028976D1; EP1198710A1; US6528322B1; WO2001011363A1; AU6331200A

Description

ANALYSEVERFAHREN UND VORRICHTUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Bestimmen von Analyten in einer Probe, insbesondere ein Verfahren und eine Vorrichtung, worin die Analyten vor der Bestimmung getrennt werden.
Hintergrund der Erfindung
Biomoleküle können in verschiedenen Heteroformen vorhanden sein, wie z.B. Isoformen, worin kleine Veränderungen in der Molekülstruktur große Veränderungen in der Wirkung des Moleküls verursachen können. Solche kleinen strukturellen Unterschiede können jedoch sogar mit Methoden mit hoher Spezifität, wie z.B. Immunoassays, schwierig spezifisch zu bestimmen sein, weil die Verbindungen üblicherweise zur Bindung an einen spezifischen Antikörper konkurrieren. In unserer ebenfalls anhängigen internationalen PCT-Anmeldung WO 99/60402 werden solche strukturellen Veränderungen diskutiert, und ein Verfahren zur Bestimmung einiger der Heteroformen, z.B. solcher mit der höchsten positiven oder negativen Ladung, beschrieben. Das in Frage stehende Verfahren verwendet eine Fließmatrix mit einer Applikationszone für die Probe, und, stromabwärts davon, eine Bestimmungszone mit einem immobilisierten Reagens, das den Analyten bindet, und wo der gebundene Analyt bestimmt wird. Zwischen der Probenapplikationszone und der Bestimmungszone ist eine Trennzone vorgesehen. In der Trennzone werden störende Komponenten oder nicht zu bestimmende Komponenten gebunden oder verzögert und daran gehindert, die Bestimmungszone mit dem Analyten zu erreichen. Wenn z.B. der Analyt einer der zwei Heteroformen ist, wird die andere Heteroform, die nicht zu bestimmen ist, aber mit dem Analyten um die Bindung in der Bindungszone konkurrieren würde, in der Trennzone verzögert, um eine selektive Bestimmung des Analyten zu ermöglichen. Es können jedoch oft mehr als zwei Heteroformen vorliegen. Transferrin kann z.B. in mindestens neun verschiedenen Isoformen vorliegen, wobei einige der Isoformen primär Disialo-Transferrin, aber auch Asialo-Transferrin, für die Bestimmung von Alkoholmissbrauch von Bedeutung sind. Um alle diese Isoformen in einer komplexen Mischung bestimmen zu können, war es bisher notwendig, die Isoformen durch Säulenchromatographie zu trennen, und dann jede Fraktion auf die Gegenwart einer Isoform mittels spektrophotometrischer oder Immunoassay-Bestimmung, abhängig von den Konzentrationen der zu bestimmenden Analyten, zu bestimmen.
WO 99/30145 beschreibt eine zweidimensionale Gelelektrophorese zur qualitativen Bestimmung von Nucleinsäuren, Proteinen, Kohlehydraten oder Lipiden in einer Probe. Das Gel enthält ein Trenngel mit einer Probenauftragszone und ist mit einem Spalt innerhalb des Trenngels versehen, ein Bestimmungsgel, das eine immobilisierte Sonde für ein oder mehrere Zielmoleküle aufweist. Nach elektrophoretischer Trennung im Trenngel in einer ersten Dimension wird das Gel um 90° rotiert, und die Elektrophorese in einer zweiten Dimension durchgeführt, um das Zielmolekül an die Bestimmungszone zu transportieren, wo ein Binden des Zielmoleküls an die immobilisierte Sonde bestimmt wird. In WO 99/30145 findet sich kein Hinweis darauf, dass Heteroformen bestimmt werden können. Elektrophorese-Systeme sind außer dem im allgemeinen ziemlich mühsam und oft teuer, insbesondere wenn das Elektrophorese-System eine zusätzliche Bestimmungszone aufweisen soll.
US-A-4 469 601 beschreibt ein Verfahren und ein System zur mehrdimensionalen Chromatographie an einer Dünnschicht-Chromatographieplatte, worin eine Probe in eine Reihe von Bestandteilen getrennt wird. Diese Bestandteile werden dann durch Pumpen eines Fluids durch die Platte in einer Richtung, die die Reihe kreuzt, in Unterbestandteile getrennt, und die Unterbestandteile werden bestimmt, wenn sie in dieser zweiten Richtung über fixierte Positionen fließen. Dünnschicht-Chromatographie ist jedoch auf die Trennung von kleinen Molekülen (d.h., mit niedrigem Molekulargewicht) beschränkt und erlaubt z.B. nicht die Trennung von Biomolekülen, wie z.B. Proteinen.
Pristoupil, T. I., Chromatog. Rev., 12 (1970), 109–125, beschreibt die Verwendung von Nitrocellulose-Filtern bei der Chromatographie und Elektrophorese. Die Chromatographie in wässeriger Lösung wurde mit einer Nitrocellulosemembran in horizontaler Position in einer Plexiglaskammer durchgeführt. Proteine wurden bestimmt, indem man die Membran in eine Anfärbelösung eintauchte, und andere Substanzen wurden durch übliche Sprüh- oder Sandwich-Techniken bestimmt. An der intakten Membran wurden Proteine mit einem Molekulargewicht in der Größenordnung von 10⁵ und höher fest an die Membran adsorbiert, während Peptide, Aminosäuren und andere niedermolekulare Substanzen mit hydrophilem Charakter mit der Front der Entwicklungslösung wanderten. Für die Elektrophorese war es notwendig, die Membran mit neutralen Detergenzien zu imprägnieren, um die hohe Adsorption von Proteinen zu verhindern. Auch die Immunochromatographie von Kaninchen-anti-Rinderserum und immunochemisch inaktivem normalem Kaninchenserum auf einer Membran, an die Rinderserum adsorbiert war, wird beschrieben. Der Antigen-Antikörper-Komplex ergab beim Start einen deutlichen Fleck, während die immunochemisch inaktiven Proteine ohne irgendeine markierte Adsorption wanderten. Somit scheint es, dass eine "echte" Chromatographie der Komponenten weder in der intakten (oder reinen) Membran noch in der Antikörper-beschichteten Membran erhalten wurde, sondern vielmehr entweder eine feste Bindung oder überhaupt keine Bindung.
Es besteht deshalb ein Bedürfnis für eine Analysenmethode und eine Vorrichtung, die die Bestimmung von Heteroformen von Biomolekülen ermöglichen, und durch die Bestimmungen rascher und leichter als nach den Verfahren und Vorrichtungen des Standes der Technik durchgeführt werden können.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein Bestimmungsverfahren bereitzustellen, das die Nachteile der Verfahren des Standes der Technik überwindet, und das leicht eine rasche und verlässliche Bestimmung aller Heteroformen von Biomolekülen, wie z.B. Isoformen, sogar in einer komplexen Probe ermöglicht. Eine weitere Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Bestimmungsverfahrens, das an einer einzigen Platte, Folie oder einem Chip durchgeführt werden kann. Eine weitere Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer einfachen und leicht zu verwendenden Vorrichtung vom Platten-, Folien- oder Chip-Typ zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Erfindungsgemäß werden die obigen und andere Aufgabenstellungen und Vorteile erhalten durch ein Verfahren, worin Analyten (wie z.B. Isoformen) in einer wässerigen Probe in einer Fließmatrix getrennt werden, die einen durch Kapillarkräfte unterstützten Fluidstrom hindurch ermöglicht, insbesondere in einer ebenen Fließmatrix, wie z.B. einer chromatographischen Membran (z.B. einer Ionenaustauschermembran). Um die getrennten Analyten zu bestimmen, und das ist das Wesen der Erfindung, werden die getrennten Analyten aus der Trennzone der Fließmatrix in einer Richtung eluiert, die im wesentlichen transversal zur Trennrichtung ist, um zu einer Einfangzone (Bestimmungszone) mit immobilisiertem Reagens (wie z.B. einem einzigen immobilisierten Antikörper, der allen Analyten gemeinsam ist), üblicherweise in Form einer Linie oder eines Bandes, zu wandern, wo die eluierten Analyten eingefangen werden. Die Analyten können dort festgestellt und durch Zugabe eines Bestimmungsreagens, das dazu fähig ist, an die eingefangenen Analyten zu binden, bestimmt werden. Das Bestimmungsreagens kann z.B. ein auf die Isoform gerichteter geeignet markierter Antikörper sein, wie z.B. ein durch ein schwarz gefärbtes Teilchen markierter Antikörper. Im letzteren Fall kann z.B. die variierende Farbintensität entlang der Bestimmungslinie oder -bande leicht festgestellt und mittels eines Abtastgeräts quantifiziert werden.
In den Trennungs- und Elutionsstufen werden im wesentlichen wässerige Systeme verwendet. "Im wesentlichen wässerig" bedeutet hier, dass das System entweder vollständig wässerig ist oder eine kleine Menge, nicht mehr als ca. 3%, eines oder mehrerer anderer Lösungsmittel enthalten kann. Vorzugsweise sind ca. 99%, insbesondere ca. 99,5%, und üblicherweise mindestens ca. 99,9%, des im wesentlichen wässerigen Systems Wasser.
Die vorliegende Erfindung stellt deshalb in einem Aspekt ein Verfahren zur qualitativen, halb-quantitativen oder quantitativen Bestimmung von mindestens zwei Analyten in einer wässerigen Probe, die die Analyten enthält oder enthalten könnte, bereit, wobei das Verfahren die Stufen aufweist:

(i) Bereitstellen einer Fließmatrix, die eine Trennzone aufweist, die in einer ersten Dimension davon verläuft, und eine Bestimmungszone, die in der ersten Dimension in einem parallel beabstandeten Verhältnis zur Trennzone verläuft, wobei die Bestimmungszone ein immobilisiertes Reagens aufweist, das dazu fähig ist, die Analyten durch biospezifische Wechselwirkung damit einzufangen,
(ii) Applizieren der Probe auf die Fließmatrix an oder stromaufwärts von der Trennzone,
(iii) Initiieren eines ersten im wesentlichen wässerigen Fluidstroms in der Fließmatrix entlang der Trennzone in der ersten Dimension, um die Analyten durch die Trennzone zu transportieren, um sie darin zu trennen,
(iv) Unterbrechen des ersten Fluidstroms und Initiieren eines zweiten im wesentlichen wässerigen Fluidstroms in einer zweiten Dimension der Fließmatrix im wesentlichen transversal zur ersten Dimension gegen die Bestimmungszone, um die getrennten Analyten zur Bestimmungszone zu transportieren, um sie darin durch das immobilisierte Reagens einzufangen, und
(v) Bestimmen der Analyten in der Bestimmungszone.

In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bereit, wobei die Vorrichtung aufweist:

(i) eine Fließmatrix mit einer Trennzone und einer Bestimmungszone, die in einem beabstandeten parallelen Verhältnis in einer ersten Dimension der Fließmatrix verlaufen, worin die Bestimmungszone immobilisiertes Reagens aufweist, das dazu fähig ist, die Analyten durch biospezifische Wechselwirkung damit zu binden,
(ii) Mittel zum Initiieren eines ersten im wesentlichen wässerigen Fluidstsroms in der Fließmatrix entlang der Trennzone in der ersten Dimension der Fließmatrix,
(iii) Mittel zum Initiieren eines zweiten im wesentlichen wässerigen Fluidstroms in einer zweiten Dimension der Fließmatrix, die im wesentlichen transversal zur ersten Dimension ist, gegen die Bestimmungszone,

Vorzugsweise ist die Fließmatrix im wesentlichen eben.
Die Trennzone und die Bestimmungszone (die integral sein oder aus zwei getrennten aneinander gebundenen Teilen bestehen kann) kann entweder in der gleichen Ebene der Fließmatrix angeordnet sein, oder über einander. Im letzteren Fall müssen die zwei Zonen daran gehindert werden, mit einander zu kontaktieren, z.B. durch ein entfernbares Teilungselement, wenn die Trennphase des Verfahrens der Erfindung durchgeführt wird. Ein solches Trennelement kann ein Film oder dergleichen sein, der vor Durchführung der obigen Stufen (iv) und (v) entfernt wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Planansicht einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
2A, 2B und 2C sind schematische Planansichten der Vorrichtung in 1, wobei jede eine verschiedene Stufe in dem erfindungsgemäßen Verfahren zeigt.
3 ist ein Diagramm, das die bestimmten Intensitätskurven für durch das erfindungsgemäße Verfahren analysierte Transferrin-Isoformen zeigt.
4 ist ein Diagramm, das vier überlagerte Intensitätskurven für festgestellte Transferrin-Isoformen aus getrennten Analysen mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Wie vorstehend beschrieben, ist das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere zur Bestimmung von Heteroformen von Biomolekülen, d.h., eng verwandten biomolekularen Analyten, die durch einen spezifischen Liganden oder Rezeptor, wie z.B. einen Antikörper, nicht unterschieden werden können, geeignet. Beispielhafte Heteroformen umfassen Isoformen von Proteinen, z.B. verschieden glykosylierte Proteine (Glykoproteine), worin kleine Variationen in der Kohlehydrat-Struktur Isoformen mit verschiedenen isoelektrischen Punkten, Isoenzyme usw. ergeben können. Der Ausdruck Heteroformen umfasst u.a. auch verschiedene Formen von Bioaffinitätskomplexen, worin ein Teil des Komplexes zum isoformen Protein gehört, z.B. freien und Antikörper-gebundenen Molekülen. Ein sogenannter Inhibierungstest kann ver wendet werden, um zu bestimmen, ob zwei Verbindungen Heteroformen zu einander sind. Reagieren lassen des Liganden mit einem oder beiden der vermuteten Isoformen und Vergleichen des Ergebnisses macht es möglich, zu entscheiden, ob die Moleküle Isoformen sind.
Glykoproteine, wie z.B. Transferrin, FSH, LH und TSH, sind Beispiele für Analyten, die in einer Vielzahl von Isoformen auftreten, wobei ihr relatives Auftreten von klinischer Bedeutung ist, wobei es auch üblicherweise nicht möglich ist, durch Immunoassays zu differenzieren, weil sie vom immunochemischen Standpunkt aus sehr ähnlich sind. Andere Beispiele von Interesse sind sogenannte Herzmarker (z.B. Kreatinkinasen), die in verschiedenen Isoformen mit verschiedenen Ladungen als Ergebnis eines protolytischen Abbaus im extrazellulären Milieu auftreten.
Transferrin und seine interessierenden Isoformen sind in einen ziemlich hohen Konzentration im Blut vorhanden und können durch spektrophotometrische Online-Bestimmung (Jeppsson, J.-O., Clin. Chem. 39/10, 2115–2120 (1993)) direkt nach Säulentrennung bestimmt werden, wenn eine genügende Menge der Probe auf die Säule aufgegeben wird. Andere Moleküle, wie z.B. die Hormone FSH, LH und TSH, sind in niedrigen Konzentrationen vorhanden, die eine Immunoassay-Bestimmung erfordern (Wide, L., Acta Endocrinologica 1985, 109: 181–189).
Im erfindungsgemäßen Verfahren kann die Trennung von Analyten, wie z.B. von Isoformen, durchgeführt werden durch Applizieren der die Isoformen enthaltenden Probe auf eine ebene Fließmatrix, insbesondere eine Membran, Trennen der Isoformen durch einen ersten Flüssigkeitsfluss in einem Trennbereich der Fließmatrix, und dann Eluieren der getrennten Isoformen durch einen zum ersten Flüssigkeitsfluss transversalen zweiten Flüssigkeitsfluss, so, dass die Isoformen aus der Trennzone entfernt werden und eine ein immobilisiertes Einfangreagens enthaltende Bestimmungszone passieren, üblicherweise als Linie oder Band, um dadurch eingefangen zu werden. Die eingefangenen Isoformen können dann bestimmt werden durch Applikation eines Bestimmungsreagens, z.B. eines markierten Antikörpers gegen die Isoform, das z.B. über einen dritten Fluidfluss in der gleichen, entgegengesetzten oder transversalen Richtung zu der des vorstehend genannten zweiten Stroms, zugegeben werden kann.
In einer (zur Zeit weniger bevorzugten) Ausführungsform können die Trennzone und die Bestimmungszone auf zwei getrennten Fließmatrix-Elementen, die über einander angeordnet sind, und über einen entfernbaren Film oder dergleichen getrennt sind, der vor Elution der getrennten Analyten und ihren Transport zur Bestimmungszone entfernt wird, bereitgestellt werden.
Eine ebene Fließmatrix, wie z.B. eine Membran, die für einen solche Analyse ausgestaltet ist, umfasst eine Trennzone, und parallel und beabstandet dazu eine Bestimmungszone, die eine oder mehrere Linien oder Banden von immobilisiertem Einfangreagens, die entlang der Bestimmungszone verlaufen, umfasst.
Wie dies aus den vorstehenden Ausführungen leicht ersichtlich ist, und aus der folgenden Beschreibung besser verstanden wird, offeriert die vorliegende Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung zur raschen Analyse von Isoformen von Proteinen und anderen Heteroformen, was bisher nicht erreicht werden konnte.
Fließmatrix
Das Material für die Fließmatrix (einschließlich der Trennzone und der Bestimmungszone) kann von der gleichen Art sein wie das früher in sogenannten immunographischen Bestimmungsmethoden verwendete und definiert den Raum, in dem Probenkomponente (einschließlich Analyten) und Reaktanten transportiert werden, natürlich vorausgesetzt, dass das Material ein Fließen in verschiedene Richtungen ermöglicht. Die innere Oberfläche der Matrix, d.h., die Oberfläche der Fließkanäle in der Matrix, sollte ausreichend hydrophil sein, um es einem wässerigen Medium, wie z.B. einem Puffer, Serum, Plasma, Blut, Speichel usw., zu ermöglichen, durch die Matrix transportiert zu werden. Dieser Transport kann erreicht oder unterstützt werden durch Kapillarkräfte, entweder durch Kapillarkräfte in der Matrix selbst, oder in einem Hilfsmittel, wie z.B. einem absorbierenden Element (z.B. einem Saugkissen aus Cellulose oder dergleichen), das in Kontakt mit der Matrix gebracht wird. Der Kapillarfluss kann ferner gegebenenfalls durch mittels einer Pumpenvorrichtung applizierten Druck oder Saugen unterstützt werden. Die kleinste Innendimension (für runde Kanäle als Durchmesser gemessen) sollte ausreichend groß sein, um einen Transport von Analyt und zugegebenen Reaktanten durch die Matrix zu ermöglichen. Typischerweise können geeignete Matrices ausgewählt werden aus solchen, die Fließkanäle der kleinsten Innendimension im Bereich von 0,01 bis 1000 μm aufweisen, bevorzugt von 0,4 bis 100 μm, wenn die Matrix ein System kommunizierender Fließkanäle aufweist. Fließkanäle, die ihre kleinste Dimension im oberen Teil des breiten Bereichs (bis zu 1000 μm) aufweisen, sind insbesondere für durch extern applizierten Druck/Saugen angetriebene Ströme geeignet.
Zur Zeit ist es bevorzugt, dass die Fließmatrix in Form einer Membran vorliegt, üblicherweise mit einer Dicke von weniger als ca. 500 μm, z.B. im Bereich von ca. 25 μm bis ca. 500 μm, und vorzugsweise von weniger als ca. 150 μm, z.B. im Bereich von ca. 75 bis ca. 150 μm. Andere Matrixarten können jedoch ebenfalls in Betracht gezogen werden, wie z.B. eine Gel- oder eine Silicium-(oder Glas-)platte oder Chip mit eingeätzten verbundenen Kanälen usw., wie dies auf diesem Gebiet an sich allgemein bekannt ist.
Geeignete Matrices sind oft aus einem Polymer aufgebaut, z.B. Nitrocellulose, Polyester, Polyethersulfon, Nylon, Cellulosenitrat/Acetat, Cellulose, regenerierte Cellulose. Vorteilhafterweise können Membranen aus solchen Materialien mit einer dichten Rückseite oder Unterlage aus z.B. Polyester versehen sein.
Die Homogenität des Fließmatrixmaterials beeinflusst ihre chromatographische Qualität und kann deshalb als theoretische Plattenhöhe angegeben werden. Je niedriger die Höhe der theoretischen Platte ist, desto besser ist das Material. Eine Membran zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sollte z.B. vorzugsweise eine Höhe der theoretischen Platte (HETP) von weniger als 500 μm, insbesondere weniger als ca. 100 μm, aufweisen.
Trennzone
Die Trennzone und die Bestimmungszone können integrale Teile ein und derselben Fließmatrix sein, oder können ein Zusammenbau getrennter Teile sein. Die Trennzone, die gegebenenfalls zwei oder mehrere Unterzonen umfassen kann, kann auf verschiedenen Prinzipien beruhen, die es erlauben, im wesentlichen wässerige Systeme zu verwenden, einschließlich von Ionenaustauschchromatographie, Chromato fokussierung, Gelfiltration (Größentrennung) (z.B. unter Verwendung eines Gels oder einer dichten Membran), Affinität (z.B. mit einer moderaten Bindungskonstante von < 10⁶, insbesondere von 10³ bis 10⁶), einschließlich von z.B. IMAC (immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie) und hydrophober Wechselwirkungs-Chromatographie (HIC).
Die Trennzone zeigt einen Liganden/Struktur, die eine bestimmte Bindungsfähigkeit für die gewünschten Probenkomponenten (Analyten und verwandte Heteroformen) aufweist. Die Wahl des Liganden oder der Struktur, insbesondere im Hinblick auf die Spezifität, Bindungsstärke (Affinität) und Kinetik, um den Zwecken der vorliegenden Erfindung zu entsprechen, sind für einen Fachmann auf diesem Gebiet leicht erkennbar. Liganden, die eine Trennung in der Trennzone möglich machen, können somit geladen (anionisch, kationisch, amphoter = Ionenaustausch-Liganden), amphoter/amphiphil, bioaffin, chelatisierend, Schwefel-enthaltend (insbesondere Thioether für sogenannte thiophile Affinität), oder auf π-π-Wechselwirkung basierend, hydrophob usw. sein. Unter biospezifischen Affinitätsliganden sind insbesondere sogenannte Immunoliganden zu nennen, das sind Antikörper und Antigen-bindende Fragmente davon.
Die in Frage stehenden Liganden/Strukturen können Strukturen sein, die im Herstellungsverfahren in die Matrix physikalisch eingeführt wurden, oder können an die Trennzone verankert sein, entweder durch kovalente Bindung an die Matrix, oder über eine physikalische Adsorption. Die Verankerung der Liganden/Strukturen an die Matrix kann stattfinden über ein Polymer oder einen anderen Substituenten, der wieder kovalent, physikalisch-adsorptiv oder biospezifisch gebundene Liganden trägt, die in der Trennung verwendet werden. Eine andere Möglichkeit ist die Abscheidung von Polymerteilchen, die eine gewünschte Liganden-Art zeigen. Die Teilchen können hydrophilen oder hydrophoben Charakter aufweisen, und die Ligandenstruktur kann durch eine an die Teilchen adsorbierte oder kovalent gebundene Verbindung ausgebildet sein. Was die Technik des Bindens eines trennenden Liganden an eine Matrix betrifft, kann z.B. auf unsere früher angemeldeten internationalen (PCT-)Anmeldungen WO 89/36780, WO 99/36776 und WO 99/36777 verwiesen werden (deren Offenbarung durch Bezugnahme darauf Bestandteil dieser Beschreibung ist). In diesem Zusammenhang kann erwähnt werden, dass es im Handel erhältliche Membranen gibt, die kovalent gebundene Liganden aufweisen, z.B. DEAE-Cellulosepapier (Diethylaminoethyl) (DE81, Whatman International Ltd., England).
Die Ligandendichte (der Substitutionsgrad) wird so ausgewählt, um die gewünschte isokratische Trennung zu erhalten. Gegebenenfalls kann die Trennzone verschiedene Ligandendichten oder einen Ligandendichten-Gradienten entlang der Trennrichtung aufweisen.
Beispiele für Ionenaustausch-funktionelle Gruppen umfassen Anionenaustauscher, wie z.B. Diethylaminoethyl (DEAE), Trimethylhydroxypropyl (QA), quaternäres Aminoethyl (QAE), quaternäres Aminomethyl (Q), Diethyl-(2-hydroxypropyl)aminoethyl, Triethylaminomethyl (TEAE), Triethylaminopropyl (TEAP), Polyethylenimin (PEI), und Kationenaustauscher, wie z.B. Methacrylat, Carboxymethyl (CM), Orthophosphat (P), Sulfonat (S), Sulfoethyl (SE), Sulfopropyl (SP).
Nach der Ligandenbeschichtung wird die Membran üblicherweise mit einem Detergens oder anderem geeigneten Agens behandelt, um Störfaktoren oder unspezifische Adsorptionseffekte der Membranmatrix wesentlich zu reduzieren oder zu eliminieren, wie dies auf diesem Gebiet an sich bekannt ist.
Die die Analyten enthaltende Probe kann direkt auf die Fließmatrixoberfläche gegeben werden, wird aber üblicherweise auf eine getrennte Probenapplikationsmembran oder ein Kissen in flüssigem Kontakt mit der Membran, entweder in Kante-zu-Kante-Kontakt damit oder, vorzugsweise, auf der Oberseite der Fließmatrix montiert, gegeben.
Die Bedingungen der Trennung der Analyten in der Trennzone werden abhängig vom verwendeten Trennprinzip gewählt, im allgemeinen sind die Bedingungen aber isokratisch oder mit stufenweiser oder mit stufenweiser oder kontinuierlich veränderter Ionenstärke. Die transversale Elution der Analyten aus der Trennzone wird andererseits üblicherweise unter isokratischen Bedingungen durchgeführt. In der Gelfiltration können so der Trennpuffer und der Elutionspuffer gleich sein, während es bei der Ionenaustauschchromatographie normalerweise notwendig ist, einen Elutionspuffer hoher Ionenstärke für eine effiziente Elution der getrennten Analyten zu verwenden.
Bestimmungszone
In der Bestimmungszone kann der Analyteinfang auf verschiedenen Prinzipien beruhen, wie z.B. einem biospezifischen Einfang, vorzugsweise immunochemischen, oder gruppenspezifischen Einfang, z.B. Binden von Proteinen auf der Basis des Vorhandenseins von hydrophoben Gruppen. Gegenwärtig ist der biospezifische Einfang bevorzugt, wobei dann eine Bindungskonstante von K > 10⁸ wünschenswert ist.
Das an den oder in dem Bestimmungsteil der Fließmatrix gebundene oder immobilisierte Einfangreagens ist auf diesem Gebiet allgemein bekannt, z.B. auf die gleiche Weise wie vorstehend für die Liganden in der Trennzone beschrieben.
Wie vorstehend erwähnt, umfasst die Bestimmungszone vorzugsweise eine kontinuierliche Linie oder Bande des Einfangreagens. Im Falle einer hohen Konzentration von einem oder mehreren der Analyten kann es notwendig sein, zwei oder gelegentlich sogar mehrere Bestimmungslinien oder -banden zu verwenden. Die Ligandendichte in der Bestimmungszone kann, abhängig von den gegenseitigen Konzentrationen der verschiedenen Analyten, entsprechend variiert sein.
Die Bestimmungszone sollte selbstverständlich von der Trennzone ausreichend beabstandet sein, damit der Analyt sich nicht in die Bestimmungszone ausbreitet, bevor die Trennung vollständig ist.
Obwohl es erwünscht ist, dass die Freisetzung und der Transport des Analyten aus der Trennzone zur Bestimmungszone im wesentlichen vollständig ist, ist dies für die Bindung in der Bestimmungszone nicht notwendig, vorausgesetzt, dass alle Analyten mit dem gleichen Grad in der Bestimmungszone binden.
Abhängig von der Art der verwendeten Fließmatrix kann der Elutionsstrom aus der Trennzone zur Bestimmungszone durch geeignete Begrenzungen, wie z.B. Wachsbegrenzungen, lasergefertigte Rinnen usw., geführt werden.
Die Trennzone und die Bestimmungszone können zur Ausbildung einer kombinierten Fließmatrix zusammengefügte getrennte Teile aus verschiedenen Materialien sein, aber die zwei Zonen können auch auf einer integralen Matrix, wie z.B. einer Membran oder einem Chip, durch ihre geeignete chemische/physikalische Modifizierung, wie dies auf diesem Gebiet an sich bekannt ist, bereitgestellt werden.
Bestimmungsmethoden und Regeantien
Die Bestimmung und Quantifizierung der in der Bestimmungszone eingefangenen Analyten kann auf verschiedene Weise stattfinden. Wenn die eingefangenen Analyten enzymatisch aktiv sind, können sie durch ihre Wirkung auf ein geeignetes Substrat, z.B. eine Farbänderung, bestimmt werden. Üblicherweise wird jedoch ein bestimmbares Reagens zugegeben. Ein solches Substrat oder Reagens kann z.B. über einen Fließstrom in der Matrix zugegeben werden, entweder (i) von einer der zur Trennrichtung transversalen Seiten der Fließmatrix (üblicherweise eine Längsseite), vorzugsweise in entgegengesetzter Richtung zum Elutionsstrom, oder (ii) von einer der Seiten, die in Trennrichtung der Fließmatrix verlaufen (üblicherweise eine kurze Seite), oder (iii) auf der Oberseite der Matrix, üblicherweise in der Nähe der Bestimmungszone, über ein Kissen oder einen faltbaren Teil der Matrix so zugegeben werden, dass das Substrat oder die Reagentien durch einen Fluidstrom in die Bestimmungszone transportiert werden können. Im zuletzt erwähnten Fall kann ein diffuses Bestimmungsreagens gegebenenfalls in dem Kissen oder dem faltbaren Teil bereits abgelagert sein. Eine solche vorherige Ablagerung und Faltstrukturen sind auf diesem Gebiet an sich allgemein bekannt. Ein Überschuss an Substrat oder Reagentien wird durch einen Pufferstrom entfernt.
Das bestimmbare Reagens ist üblicherweise ein biospezifischer Affinitätsreaktant, der mit einer analytisch bestimmbaren Gruppe, wie z.B. einer enzymatisch aktiven Gruppe (z.B. Farbbildung bei Einwirkung auf ein Substrat), fluoreszierender Gruppe, chromogener Gruppe, Hapten, Biotin, Radiomarkierung (Autoradiographie), Teilchen usw. markiert ist. Eine übliche Form eines analytisch markierten Reaktants ist ein markierter Antikörper.
Markierte Antikörper können verwendet werden in (i) nicht-konkurrierenden Verfahren, wie z.B. einem Sandwich-Verfahren, in dem der Fänger ein Antikörper ist, der gegen das gleiche Antigen (= Analyt) wie der markierte Antikörper gerichtet ist, oder ein Antigen/Hapten oder (ii) konkurrierende Verfahren, in denen eine Konkurrenz zwischen Analyt und Festphasen-gebundenem Analyt-Analogon für eine begrenzte Menge von Anti-Analyt-Antikörper stattfindet.
Eine besonders geeignete Markierungsgruppe sind Teilchen, z.B. schwarz gefärbte Kohleteilchen, die direkt gemessen werden können, z.B. mit einem konventionellen Abtastgerät. Optional enthalten die Teilchen eine der vorstehend erwähnten bestimmbaren Gruppen, wie z.B. fluorophore Gruppen oder chromogene Gruppen (fluoreszierende bzw. gefärbte Teilchen). Geeignete Teilchen weisen oft eine Größe im Bereich 0,001 bis 5 μm auf und vorzugsweise im Bereich von 0,05 bis 5 μm. Die Teilchen können kolloidale Dimensionen, als sogenanntes Sol (d.h., üblicherweise kugelförmig und monodispers mit einer Größe im Bereich von 0,001 bis 1 μm) aufweisen. Insbesondere können erwähnt werden Metallteilchen (z.B. Goldsol), Nicht-Metallteilchen (z.B. SiO₂, Kohlenstoff, Latex und abgetötete Erythrozyten und Bakterien). Auch Teilchen nicht-kolloidaler Dimensionen sind verwendet worden. Diese waren mehr oder weniger irregulär und mehr oder weniger polydispers (z.B. Kohleteilchen < 1 μm; siehe z.B. unsere WO 96/22532).
Wenn Teilchen die Markierungsgruppe sind, können in der Bestimmungszone geformte Komplexe oft visuell bestimmt werden oder durch eine optische Messeinrichtung (z.B. eine mit einem Computer mit spezieller Software zur Bildanalyse gekuppelte CCD-Kamera oder einen Laserscanner).
Für Teilchen als Markierungsgruppe kann außerdem Bezug genommen werden auf z.B. WO 88/08534 (Unilever); US-A-5 120 643 (Abbott Labs.); EP-A-284 232 (Becton Dickinson).
Die Erfindung zielt primär auf biologische Proben ab, z.B. Blut, Serum, Plasma, Vollblut), Speichel, Tränenflüssigkeit, Urin, Zerebrospinalflüssigkeit, Schweiß usw. Die Erfindung ist auch auf andere Proben anwendbar, wie z.B. Gärlösungen, Reaktionsmischungen usw.
Veranschaulichende Ausführungsform
Um das Verständnis der vorliegenden Erfindung zu erleichtern, wird nun eine Ausführungsform davon detaillierter, nur als ein Beispiel, unter Bezugnahme auf die 1 und 2A bis 2C der Zeichnungen, beschrieben.
Die 1 veranschaulicht schematisch eine Membran, die für die Analyse von z.B. Isoformen von Proteinen oder anderen Heteroformen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann. Die Membran besteht im veranschaulichten Fall aus zwei kombinierten Teilen aus verschiedenen Materialien, einem Trennteil 1 und einem Bestimmungsteil 2, die durch ein Stück Klebeband (nicht gezeigt) auf der Rückseite der kombinierten Membran verbunden sind, und in Flüssigkeitskontakt mit einander durch ein dünnes Membranband 3 als Überlappung stehen. Dieses Membranband 3 wird an die Trenn-/Bestimmungsmembran durch ein Stück Klebeband 4 gehalten. Der Trennteil definiert eine Trennzone auf der kombinierten Membran. Der Bestimmungsteil 2 weist eine Bestimmungszone in Form einer Linie 5 aus immobilisiertem Einfangreagens für Analyten auf und weist z.B. eine Breite von ca. 1 mm auf. Das Bezugszeichen 6 zeigt eine optionale zusätzliche Bestimmungslinie, um den Messbereich zu erhöhen. Die kurzen Seiten der Membran sind in 1 mit a und c bezeichnet, und die langen Seiten mit b bzw. d. Die Membran kann unter Bezugnahme auf die 2A bis 2C wie folgt benützt werden. Nach Benetzen der Membran wird bei 7 eine zu analysierende zwei Analyten enthaltende Probe (nachstehend als Analyten 1 und 2 bezeichnet) auf der Trennzone 1 aufgebracht (2A). Ein Kissen 8, das einen Trennpuffer enthält, wird an der kurzen Seite a der Membran appliziert, und ein Saugkissen 9 an der gegenüberliegenden kurzen Seite c. Dies verursacht einen Pufferstrom in der Richtung des Pfeils in der 2A, der die zwei Analyten, bei den in 2A gezeigten Punkten 10 (Analyt 1) und 11 (Analyt 2) trennt.
Bezugnehmend auf 2B werden die Kissen 8 und 9 dann entfernt und ein Eluens enthaltendes Kissen 12 auf der Längsseite d angebracht, und ein Saugkissen 13 auf der Längsseite b angebracht. Dies verursacht einen Eluensstrom in Richtung des Pfeils in 2B, der die getrennten Analyten 1 und 2 zur Bestimmungszone transportiert, wo sie durch die immobilisierte Reagenslinie an den Positionen 14 bzw. 15 entlang der Linie eingefangen werden.
Bezugnehmend auf 2C werden die Kissen 12 und 13 dann entfernt und durch ein Saugkissen 16 an der Längsseite d ersetzt, und einen Behälter 17 mit einer Lösung oder Suspension des markierten Reaktanten an der Längsseite b. Dadurch wird der markierte Reaktant in Richtung des Pfeils wandern, und die eingefangenen Analyten 1 und 2 an 18 und 19 in 2C binden. Die markierten Komplexe und damit die entsprechenden Analyten 1 und 2 können dann durch Ablesen der Intensität der Signale vom Marker entlang der Bestimmungslinie und Berechnen der entsprechenden Mengen bestimmt und quantifiziert werden. Für den Fall, dass der Marker ein Kohleteilchen ist, können die Messungen vorzugsweise mit einem Abtastgerät durchgeführt werden.
Die vorstehend beschriebene manuelle Initiierung und das Stoppen der Ströme sind natürlich nur für den Zweck der Veranschaulichung angegeben, und für den Fachmann auf diesem Gebiet sind hochentwickeltere Mittel dafür leicht erkennbar, wie z.B. sogenannte aufgeprägte Flüssigkeitskreisläufe (siehe z.B. WO 93/10457) usw.
Nachstehend wird ein spezifisches Beispiel beschrieben, in dem das erfindungsgemäße Verfahren zur Analyse von Isoformen von Transferrinen verwendet wird.
BEISPIEL 1: Bestimmung von Isoformen von Transferrin
(i) Herstellung einer Trennmembran mit Anionenaustausch-Eigenschaften
Eine Nitrocellulosemembranfolie (3 μm, Nitrocellulose auf Polyester-Unterlage, Whatman International Ltd., England) wurde in eine Lösung von 0,03% Polyethylenimin (PEI, Sigma, St. Louise, MO, USA) gegeben. Die Mischung wurde 3 Stunden lang geschüttelt und die Membran wurde dann in 0,1% Tween 20 für 30 Minuten gegeben, in Luft getrocknet und dann in einem Plastiksack bei +4°C gelagert.
(ii) Herstellung der Bestimmungsmembran
Anti-Transferrin-monoklonaler Antikörper, 3 mg/ml, wurde auf Streifen (29 cm × 4 cm) von Nitrocellulosemembranen (5 μm, auf Polyesterunterlage, Whatman International Ltd., England) in zwei 1 mm breiten Linien im Zentrum des Streifens aufgesprüht, durch 2 mm getrennt und parallel mit der Längsseite des Streifens. Das Sprühgerät (IVEK Linear Striper IVEK Corporation, Vermont, USA) lieferte 1 μl/cm. Die Membranen wurden bei Raumtemperatur getrocknet und in einem Plastiksack bei +4°C gelagert.
(iii) Herstellung einer Kombinationsmembran
Die Trennmembran wurde auf 1,5 × 5 cm zugeschnitten und die Bestimmungsmembran wurde auf 2 × 5 cm zugeschnitten, so dass die zwei Antikörper-Linien auf der Membran zentral lokalisiert und mit der Längsseite parallel waren. Die zwei Membranen wurden längs der Längsseiten dicht zusammengesetzt und mittels eines Klebebands an der Unterseite verbunden. Ein Stück Nitrocellulosemembran (0,2 cm × 5 cm, 8 μm, A99, Schleicher und Shuell, Dassel, Deutschland) wurde auf die Oberseite der zwei Membranen als Überlappung gegeben. Diese Membran wurde mittels eines 1 × 4 cm-selbstklebenden Polyesterfilms (Gelman adhesive polyester film, 3 mil) so platziert befestigt, dass 0,5 cm am kurzseitigen Ende der gebildeten kombinierten Trenn-Bestimmungsmembran unbedeckt blieben. Nachstehend werden die zwei kurzen Seiten der Kombinationsmembran als a bzw. c bezeichnet, und die zwei langen Seiten als b bzw. d (siehe 1).
(iv) Kohleteilchen-Konjugat
Kohleteilchen-Suspension (Vorratslösung): 3 g Kohleteilchen (sp 4, Degussa, Deutschland) wurden in 250 ml 5 mM Boratpuffer, pH 8,4, suspendiert und in einem Eisbad 4 × 5 Minuten bei 100% Amplitude und 5 + 5 Sekunden Puls beschallt (VibraCell 600 W, 1,5 cm-Sonde).
Kohleteilchen-Konjugat: 75 μg/ml eines Anti-Transferrin-monoklonalen Antikörpers und Kohle-Suspension (250 μg/ml) wurden 3 Stunden lang gemischt. Rinderserumalbumin (BSA), entsprechend 1% Endkonzentration, wurde zugegeben, und die Teilchen wurden zusätzliche 30 Minuten lang gemischt und dann mittels Zentrifugation und Abdekantieren in 0,1 M Boratpuffer, pH 8,5 (1% BSA und 0,05% NaN₃ enthaltend) gewaschen und auf 3,7 mg Kohle/ml mit Waschpuffer verdünnt. Das fertige Kohleteilchen-Konjugat wurde bei +4°C in Waschpuffer aufbewahrt.
(v) Probenmaterialien
Tetrasialo-Transferrin, Trisialo-Transferrin und Disialo-Transferrin: Diese Isotransferrine wurden aus einem Eisen-gesättigten Transferrin-Präparat (Sigma, St. Louis, MO, USA) mittels Ionenaustauschchromatographie an Mono Q (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden) isoliert.
Asialo-Transferrin: Ein Eisen-gesättigtes Präparat von Transferrin (Sigma, St. Louis, MO, USA) wurde mit Neuraminidase (Behring ORKD, Deutschland) behandelt und Asialo-Transferrin wurde dann mittels Ionenaustauschchromatographie an Mono Q (Amersham Pharmacia Biotech AB, Schweden) isoliert.
Die verschiedenen Isoformen wurden in 0,2% BSA, 0,1% Rindergammaglobulin, 0,1% Tween 20, 0,1 mM Fe³⁺-Citrat, 1 mM NaHCO₃ und 0,05% NaN₃ auf die Konzentrationen 2 bis 6,5 μg Transferrin/ml verdünnt.
Isoelektrische Punkte (pI): Die pI für das entsprechende Isoformpräparat wurden mittels wiederholtem isoelektrischen Fokussieren im Phast System (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden) bestimmt. Asialo-Transferrin pI = 5,66; Disialo-Transferrin pI = 5,56; Trisialo-Transferrin pI = 5,46; Tetrasialo-Transferrin pI = 5,32 und Pentasialo-Transferrin pI = 5,21. Zur Kalibrierung wurde Amersham Pharmacia Calibration Kit, 17-0472-01, 2,5–6,5, verwendet.
Transferrin-Standard: Wie vorstehend hergestelltes Asialo-Transferrin wurde in 20 mM Bis-Tris, pH 6,37, enthaltend 0,2% BSA, 0,1% Tween 20, 0,1 mM Fe³⁺-Citrat, 1 mM NaHCO₃ und 0,05% NaN₃, auf die Konzentrationen 0,07 bis 16,6 μg Transferrin/ml verdünnt und als Standard verwendet.
(vi) Standardprotokoll für die kombinierte Trennung und immunochemische Bestimmung
Stufe 1. Benetzen der Membran von der kurzen Seite a zur kurzen Seite c
Die Kombinationsmembran wird durch Zugeben von Elutionspuffer zu einem 1 × 3,5 × 0,5 cm-PVA-Schwamm (PVA D, 60 μm, Kanebo Ltd., Japan) befeuchtet, und dann wird der Schwamm längs der kurzen Seite a des Kissens platziert. Auf die gegenüberliegende kurze Seite c der Membran wird ein 2 × 3,5 cm-Cellulose-Saugkissen (GB 004, Schleicher and Schuell) montiert. Wenn die Elutionspufferfront das Cellulosekissen erreicht hat, wird der PVA-Schwamm entfernt. Für die nachfolgende Analyse (a) war der Elutionspuffer 20 mM Bis-Tris, 0,1% Tween 20, 5 mM NaCl, pH 6,12; und für die nachstehende Analyse (b) war der Elutionspuffer 20 mM Bis-Tris, 0,1% Tween 20, 15 mM NaCl, pH 6,32.
Stufe 2. Probenapplikation und Elution von der kurzen Seite a zur kurzen Seite c
0,5 ml Probe (2 bis 6,5 μg/ml) werden auf die Mitte der Trennmembran, 0,5 cm von der kurzen Seite a entfernt, platziert. Der PVA-Schwamm mit dem Elutionspuffer wird zugegeben und die Elution wird 4 Minuten lang fortgesetzt. Dann werden der PVA-Schwamm und der Saugschwamm entfernt.
Stufe 3. Elution von der Längsseite d (Trennmembran) zur Längsseite b (Bestimmungsmembran)
Entlang der Längsseite b (Bestimmungsmembran) wird ein 2 × 5 cm-Cellulosekissen (GB 004, Schleicher und Schuell) montiert und entlang der Längsseite d wird ein 1 × 5 × 0,5 cm-PVA-Schwamm (PVA D, 60 μm, Kanebo Ltd., Japan), benetzt mit dem Elutionspuffer (20 mM Bis-Tris, 200 mM NaCl, 0,1% Tween 20, pH 6,29), platziert. Die Elution wird 4 Minuten lang fortgesetzt, und der Strom wird durch Entfernen des PVA-Schwamms und des Saugschwamms gestoppt.
Stufe 4. Reaktion mit Kohle-anti-Transferrin
Ein 2 × 5 cm-Cellulose-Saugkissen (GB 004, Schleicher und Schuell) wird entlang der Längsseite d (Trennmembran-Teil) montiert und dann wird die Längsseite b in einen Behälter mit Kohle-anti-Transferrin, 0,25 mg Kohle/ml in 40% Trehalose, 1% Tween 20, 1% Rinderalbumin, 0,1 M Boratpuffer, pH 8,5, 0,05% NaN₃ gegeben. Dem Kohleteilchen-Konjugat wird es ermöglicht, die Bestimmungslinien 2 Minuten lang zu passieren, und die Kombinationsmembran wird dann aus dem Behälter entfernt, das Saugkissen entfernt und die Kombinationsmembran trocknen gelassen.
Stufe 5. Bestimmung der Schwärzung und Berechnung der Transferrin-Konzentration
Die Membran wird in ein Abtastgerät (Agfa Acus II Scanner) zur Messung der Grauskala entlang der Bestimmungslinien gegeben. Die Grauskala wird mit 12 Bits Grauskala-Auflösung (4096 Levels) und 600 Punkten pro Inch (ppi) optischer Auflösung abgelesen. Das erhaltene Bild wird digitalisiert und die Intensitätswerte werden mittels Microsoft Excel verarbeitet. Der Mittelwert der Intensität entlang der kurzen Seite der Bestimmungslinie (1 mm = 23 Grauskalenwerte) wird berechnet, und das Chromatogramm für 4 cm entlang der Bestimmungslinie kann graphisch dargestellt werden.
Für die Berechnung der Konzentration an Transferrin wird eine Verdünnungsserie von Asialo-Transferrin verwendet, wobei 0,5 μl Probe auf die Trennmembran abgegeben und dann direkt eluiert wurden (Stufen 3–5). Die Spitzenintensität des entsprechender Standardpunkts wird gemessen, eine Standardkurve mittels eines Kurvenprogramms (GraphPad Prism^® nicht-lineare Anpassung) konstruiert und für die Chromatogramme kann die Transferrin-Konzentration berechnet werden.
(vi) Analysen

a) Eine Asialo-Transferrin, Disialo-Transferrin, Trisialo-Transferrin und Tetrasialo-Transferrin enthaltende zubereitete Probe wurde gemäß dem obigen Standardprotokoll analysiert, und die erhaltenen Signalintensitätskurven sind in 3 gezeigt. Im Diagramm bedeutet die Ziffer 1 den Peak für Tetrasialo-Transferrin, 2 ist Trisialo-Transferrin, 3 ist Disialo-Transferrin und 4 ist Asialo-Transferrin.
b) (i) Asialo-Transferrin, (ii) Diasialo- + Trisialo-Transferrin, (iii) Trisialo- + Tetrasialo-Transferrin und (iv) Tetrasialo- + Pentasialo-Transferrin enthaltende zubereitete Proben wurden gemäß dem obigen Standardprotokoll analysiert, und die Ergebnisse sind in 4 dargestellt. Die verschiedenen Peaks sind in der oberen rechten Ecke des Diagramms identifiziert. Auch die Werte des isoelektrischen Punkts der Peaks ist angegeben.

Wie durch die 3 und 4 gezeigt, erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren eine hervorragende Trennung und Quantifizierung von Isoformen in einer Probe. Wie in 4 gezeigt, wird z.B. eine Auflösung von 0,1 pI-Einheit leicht erreicht.

Claims

Verfahren zur qualitativen, halb-quantitativen oder quantitativen Bestimmung von mindestens zwei Analyten in einer wässerigen Probe, die die Analyten enthält oder enthalten könnte, wobei das Verfahren die Stufen aufweist: (vi) Bereitstellen einer Fließmatrix, die eine Trennzone aufweist, die in einer ersten Dimension davon verläuft, und eine Bestimmungszone, die in der ersten Dimension in einem parallel beabstandeten Verhältnis zur Trennzone verläuft, wobei die Bestimmungszone ein immobilisiertes Reagens aufweist, das dazu fähig ist, die Analyten durch biospezifische Wechselwirkung damit einzufangen, (vii) Applizieren der Probe auf die Fließmatrix an oder stromaufwärts von der Trennzone, (viii) Initiieren eines ersten im wesentlichen wässerigen Fluidstroms in der Fließmatrix entlang der Trennzone in der ersten Dimension, um die Analyten durch die Trennzone zu transportieren, um sie darin zu trennen, (ix) Unterbrechen des ersten Fluidstroms und Initiieren eines zweiten im wesentlichen wässerigen Fluidstroms in einer zweiten Dimension der Fließmatrix im wesentlichen transversal zur ersten Dimension gegen die Bestimmungszone, um die getrennten Analyten zur Bestimmungszone zu transportieren, um sie darin durch das immobilisierte Reagens einzufangen, und (x) Bestimmen der Analyten in der Bestimmungszone.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Fluidströme in der Matrix durch Kapillarkräfte unterstützt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Fließmatrix zumindest im wesentlichen eben ist.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin die Trennzone und die Bestimmungszone in der gleichen Ebene angeordnet sind, und die ersten und zweiten Fluidströme Lateralströme sind.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin die Trennzone und die Bestimmungszone über einander angeordnet sind, und der erste Fluidstrom lateral ist und der zweite Fluidstrom im Inneren der Fließmatrix ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin der Fluidtransport in der Fließmatrix zumindest teilweise durch Kapillarkräfte in der Matrix selbst bewirkt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin der Fluidtransport in der Fließmatrix zumindest durch ein Absorptionsmittel unterstützt wird, das getrennt von oder integral mit der Fließmatrix vorliegen kann.
Verfahren nach Anspruch 7, worin die Fließmatrix vor dem Starten der Analyse mit einem im wesentlichen wässerigen Fluid benetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin die Bestimmungsstufe (v) in Anspruch 1 das Reagieren lassen der eingefangenen Analyten mit einem bestimmbaren Reagens umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, worin das bestimmbare Reagens ein immunochemisches Reagens ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin die Bestimmungsstufe (v) in Anspruch 1 das Reagieren lassen von unumgesetztem immobilisierten Reagens in der Matrix mit dem bestimmbaren Analyten oder einem bestimmbaren Analyt-Analogon umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, 10 oder 11, worin das bestimmbare Reagens, der Analyt oder das Analyt-Analogon einen bestimmbaren Marker aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, worin das bestimmbare Reagens, der Analyt oder das Analyt-Analogon durch einen dritten Fluidstrom eingeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 13, worin der dritte Fluidstrom ein von einer Seite der Fließmatrix applizierter Lateralstrom ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin die Trennung in der Trennzone auf Chromatographie basiert.
Verfahren nach Anspruch 15, worin die Chromatographie ausgewählt ist aus Ionenaustauschchromatographie, Chromatofokussieren, Größenausschlusschromatographie, Affinitätschromatographie und hydrophober Wechselwirkungschromatographie.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, worin die Trennzone im Hinblick auf die Trennfähigkeit in der ersten Richtung einen Gradienten aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, worin die Analyten Heteroformen eines Biomoleküls sind.
Verfahren nach Anspruch 18, worin die Heteroformen verschiedene Ladungen aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, worin die Analyten Glykoproteine sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, worin die Fließmatrix eine Membran aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, worin die Matrix eine Membran mit darin abgelagerten Teilchen aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, worin die Bestimmungszone mindestens zwei parallele Bestimmungslinien oder -banden, die immobilisiertes Reagens enthalten, aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, worin die Bindung des Analyten in der Bestimmungszone durch eine immunochemische Wechselwirkung erfolgt.
Vorrichtung zum Bestimmen von Analyten in einer Probe, wobei die Vorrichtung aufweist: (iv) eine Fließmatrix mit einer Trennzone und einer Bestimmungszone, die in einem beabstandeten parallelen Verhältnis in einer ersten Dimension der Fließmatrix verlaufen, worin die Bestimmungszone immobilisiertes Reagens aufweist, das dazu fähig ist, die Analyten durch biospezifische Wechselwirkung damit zu binden, (v) Mittel zum Initiieren eines ersten im wesentlichen wässerigen Fluidstsroms in der Fließmatrix entlang der Trennzone in der ersten Dimension der Fließmatrix, (vi) Mittel zum Initiieren eines zweiten im wesentlichen wässerigen Fluidstroms in einer zweiten Dimension der Fließmatrix, die im wesentlichen transversal zur ersten Dimension ist, gegen die Bestimmungszone, damit, wenn eine Probe, die die Analyten enthält, in die Trennzone eingeführt wird, die Analyten in der Trennzone durch den ersten Fluidstrom durch die Trennzone getrennt werden können und durch den zweiten Fluidstrom zur Bestimmungszone transportiert werden, wo die Analyten an das immobilisierte Reagens gebunden werden, um bestimmt zu werden.
Vorrichtung nach Anspruch 25, worin die Fließmatrix einen durch Kapillarkräfte unterstützen Fluidstrom durch sie erlaubt.
Vorrichtung nach Anspruch 25 oder 26, worin die Fließmatrix zumindest im wesentlichen eben ist.
Vorrichtung nach Anspruch 25, 26 oder 27, worin die Trennzone und die Bestimmungszone in der gleichen Ebene angeordnet sind, und die ersten und zweiten Fluidströme Lateralströme sind.
Vorrichtung nach Anspruch 25, 26 oder 27, worin die Trennzone und die Bestimmungszone über einander angeordnet sind, und der erste Fluidstrom lateral ist, und der zweite Fluidstrom im Inneren der Fließmatrix ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 25 bis 29, worin die Trennzone eine solche ist, wie sie in einem der Ansprüche 15 bis 17 definiert ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 25 bis 30, worin die Fließmatrix eine solche ist, sie wie in Anspruch 21 oder 22 definiert ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 25 bis 31, worin die Bestimmungszone mindestens parallele Bestimmungslinien oder -banden aufweist, die immobilisiertes Reagens enthalten.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 25 bis 32, wobei die Vorrichtung Mittel zum Ausbilden einer Flüssigkeitsansaugung in der Fließmatrix aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 33, worin das Mittel zum Ausbilden einer Flüssigkeitsansaugung ein Absorptionsmittel am stromabwärtigen Ende der Fließmatrix aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 25 bis 34, wobei die Vorrichtung Mittel zum Zuführen von Strömungsflüssigkeit zur Fließmatrix aufweist.