ES2265957T3 - Un metodo y un aparato para determinar analitos. - Google Patents
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Abstract
Un método para la determinación cualitativa, semicuantitiva o cuantitativa de al menos dos analitos en una muestra acuosa que contiene o que se sospecha que contiene los analitos, comprendiendo dicho método las etapas de: (i) la provisión de una matriz de flujo que contiene una zona de separación que se extiende en una primera dimensión de la misma, y una zona de detección que se extiende en dicha primera dimensión en una relación separada paralela con la zona de separación, conteniendo dicha zona de detección un reactivo inmovilizado capaz de capturar dichos analitos a través de una interacción bioespecífica con los mismos, (ii) la aplicación de dicha muestra a la matriz de flujo en o corriente arriba de la zona de separación, (iii) el inicio de un primer flujo de fluido esencialmente acuoso en la matriz de flujo a lo largo de la zona de separación en dicha primera dimensión, para transportar los analitos a través de la zona de separación con el fin de que sean separados en la misma, (iv)la interrupción de dicho primer flujo de fluido y el inicio de un segundo flujo de fluido esencialmente acuoso en una segunda dimensión de la matriz de flujo, sustancialmente transversal a dicha primera dimensión, hacia la zona de detección, con el fin de transportar dichos analitos separados a la zona de detección para ser capturados en la misma por dicho reactivo inmovilizado, y (v) la determinación de los analitos en la zona de detección.
Description
Un método y un aparato para determinar
analitos.
La presente invención se refiere a un método y a
un aparato para determinar analitos en una muestra y, más
particularmente, a un método y a un aparato en los que los analitos
son separados antes de la detección.
Las biomoléculas pueden estar presentes en
varias heteroformas, tales como isoformas, en las cuales pequeños
cambios de la estructura molecular pueden causar grandes cambios en
el efecto de la molécula. Tales pequeños cambios estructurales
pueden ser, sin embargo, difíciles de medir específicamente, incluso
con métodos de alta especificidad tales como inmunoensayos, ya que
los compuestos competirán normalmente por la unión a un anticuerpo
específico. En nuestra solicitud internacional copendiente (PCT) WO
99/60402, se discuten tales cambios estructurales y se describe un
método para medir algunas de las heteroformas, por ejemplo las que
tienen la mayor carga positiva o negativa. El método en cuestión
utiliza una matriz de flujo que tiene una zona de aplicación de la
muestra y, corriente abajo de la misma, una zona de detección con un
reactivo inmovilizado que se une al analito y en la que se detecta
el analito unido. Se proporciona una zona de separación entre la
zona de aplicación de la muestra y la zona de detección. En la zona
de separación, los componentes que molestan o los componentes que no
van a ser determinados son unidos o retrasados y se impide que los
mismos alcancen la zona de detección con el analito. Si, por
ejemplo, el analito es una de dos heteroformas, la otra heteroforma
que no va a ser determinada pero que competiría con el analito para
unirse en la zona de unión, es retrasada en la zona de separación
para permitir la detección selectiva del analito. A menudo, puede
haber, sin embargo, más de dos heteroformas. Por ejemplo, la
transferrina puede existir en al menos nueve isoformas diferentes,
de las cuales unas cuantas, principalmente la disialo transferrina
pero también la asialo transferrina, son importantes para ser
medidas en el análisis del abuso de alcohol. Para poder medir todas
las isoformas en una mezcla compleja, ha sido hasta ahora necesario
separar las isoformas mediante cromatografía en columna y analizar
posteriormente cada fracción para detectar la presencia de una
isoforma mediante detección espectrofotométrica o mediante un
inmunoensayo, dependiendo de las concentraciones de los analitos a
medir.
WO 99/30145 describe una electroforesis en gel
de 2 dimensiones para la determinación cualitativa de ácidos
nucleicos, proteínas, carbohidratos o lípidos en una muestra. El gel
contiene un gel de separación con una zona de carga de la muestra y,
proporcionado en una ranura en el gel de separación, un gel de
detección que tiene una sonda inmovilizada para una o más moléculas
diana. Después de la separación electroforética en el gel de
separación en una primera dimensión, el gel es rotado noventa grados
y se realiza una electroforesis en una segunda dimensión con el fin
de transportar la molécula diana a la zona de detección en la que se
detecta la unión de la molécula diana a la sonda inmovilizada. No
hay ninguna sugerencia en WO 99/30145 de que pudieran determinarse
heteroformas. Además, los sistemas electroforéticos son generalmente
bastante laboriosos y a menudo caros, especialmente cuando tiene que
incluirse en el sistema electroforético una etapa de detección
adicional.
US-A-4.469.601
describe un método y un sistema de cromatografía multidimensional en
una placa cromatográfica de capa fina en los cuales una muestra es
separada en una serie de constituyentes. Estos constituyentes son
separados posteriormente en una segunda serie de subconstituyentes
mediante el bombeo de un fluido a través de la placa en una
dirección que atraviesa la serie, y los subconstituyentes son
detectados a medida que fluyen pasando por posiciones fijadas en
esta segunda dirección. La cromatografía en capa fina está limitada,
sin embargo, a la separación de moléculas pequeñas (esto es, de
bajo peso molecular), y no permite la separación de biomoléculas
tales como, por ejemplo, proteínas.
Pristoupil, T.I., Chromatog. Rev., 12 (1970)
109-125 describe la utilización de filtros de
nitrocelulosa en cromatografía y en electroforesis. Se llevó a cabo
cromatografía en solución acuosa con una membrana de nitrocelulosa
en posición horizontal en una cámara de plexiglás. Las proteínas
fueron detectadas sumergiendo la membrana en una solución de
tinción, y otras sustancias fueron detectadas mediante las técnicas
usuales de pulverización o sándwich. En la membrana intacta, las
proteínas que tenían un peso molecular del orden de 10^{5} o mayor
fueron adsorbidas firmemente sobre la membrana mientras que los
péptidos, los aminoácidos y otras sustancias de bajo peso molecular
de carácter hidrofílico migraban con el frente de la solución de
revelado. Para la electroforesis, era necesario impregnar la
membrana con detergentes neutros con el fin de impedir una elevada
adsorción de proteínas. Se describe también inmunocromatografía de
antisuero bovino producido en conejo y de suero de conejo normal
inmunoquímicamente inactivo sobre una membrana con suero bovino
adsorbido a la misma. El complejo
antígeno-anticuerpo producía una mancha distinta al
comienzo, mientras que las proteínas inmunoquímicamente inactivas
migraban sin producirse una adsorción notable. Por tanto, parece no
haberse obtenido una "auténtica" cromatografía de los
componentes ni en la membrana intacta (o simple) ni en la membrana
revestida con el anticuerpo, sino que más bien se obtuvo una unión
firme o ninguna unión en absoluto.
Existe por tanto la necesidad de un método
analítico y de un aparato que permitan la determinación de
heteroformas de biomoléculas y mediante los cuales puedan realizarse
ensayos más rápidamente y más fácilmente que con los métodos y
aparatos de la técnica anterior, respectivamente.
Por consiguiente, es un objeto de la presente
invención proporcionar un método de determinación que supere los
inconvenientes de los métodos de la técnica anterior y que permita
fácilmente la determinación rápida y fiable de todas las
heteroformas de biomoléculas, tales como isoformas, incluso en una
muestra compleja. Es un objeto adicional de la presente invención
proporcionar un método de determinación que pueda ser realizado en
una única placa, membrana o chip. Otro objeto más de la presente
invención es proporcionar un aparato sencillo y fácil de utilizar de
tipo placa, membrana o chip para realizar el método de la presente
invención.
De acuerdo con la presente invención, los
objetos anteriores y otros objetos y ventajas se obtienen mediante
un método en el que los analitos (tales como isoformas) de una
muestra acuosa son separados en una matriz de flujo que permite el
flujo de fluido estimulado por una fuerza capilar a través de la
misma, especialmente una matriz de flujo plana tal como una membrana
cromatográfica (por ejemplo una membrana de intercambio iónico).
Para determinar los analitos separados, siendo ésta la parte
esencial de la invención, los analitos separados son eluidos desde
el área de separación de la matriz de flujo en una dirección
sustancialmente transversal a la dirección de separación con el fin
de que migren hacia una zona de captura con un reactivo inmovilizado
(tal como un único anticuerpo inmovilizado común a todos los
analitos), normalmente en forma de línea o banda, en la cual son
capturados los analitos eluidos. Allí, los analitos pueden ser
detectados y determinados por la adición de un reactivo de detección
capaz de unirse a los analitos capturados. El reactivo de detección
puede ser, por ejemplo, un anticuerpo idóneamente marcado dirigido
hacia la isoforma, tal como un anticuerpo marcado con una partícula
de color negro. En este último caso, por ejemplo, la variación de la
intensidad del color a lo largo de la línea o banda de detección
puede ser fácilmente detectada y cuantificada por medio de un
escáner.
En las etapas de separación y elución se
utilizan sistemas esencialmente acuosos. "Esencialmente acuoso"
significa en la presente que el sistema es completamente acuoso o
bien puede contener una pequeña cantidad, no más del 3%
aproximadamente, de uno o más de otros solventes. Preferiblemente,
un 99% aproximadamente, más preferiblemente un 99,5%
aproximadamente, normalmente al menos un 99,9% aproximadamente del
sistema esencialmente acuoso es agua.
Por tanto, en un aspecto la presente invención
proporciona un método para la determinación cualitativa,
semicuantitiva o cuantitativa de al menos dos analitos en una
muestra acuosa que contiene o es sospechosa de contener dichos
analitos, comprendiendo dicho método las etapas de:
- (i)
- la provisión de una matriz de flujo que contiene una zona de separación que se extiende en una primera dimensión de la misma, y una zona de detección que se extiende en dicha primera dimensión en una relación separada paralela con la zona de separación, conteniendo dicha zona de detección un reactivo inmovilizado capaz de capturar dichos analitos mediante una interacción bioespecífica con los mis- mos,
- (ii)
- la aplicación de dicha muestra a la matriz de flujo en o corriente arriba de dicha zona de separación,
- (iii)
- el inicio de un primer flujo de un fluido esencialmente acuoso en la matriz de flujo a lo largo de la zona de separación en dicha primera dimensión para transportar dichos analitos a través de dicha zona de separación con el fin de que sean separados en la misma,
- (iv)
- la interrupción de dicho primer flujo de fluido y el inicio de un segundo flujo de fluido esencialmente acuoso en una segunda dimensión de la matriz de flujo, sustancialmente transversal a dicha primera dimensión, hacia la zona de detección, con el fin de transportar dichos analitos separados a la zona de detección para ser capturados en la misma por dicho reactivo inmovilizado, y
- (v)
- la determinación de dichos analitos en dicha zona de detección.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un aparato para llevar a cabo el método de la invención,
aparato que comprende:
- (i)
- una matriz de flujo que tiene una zona de separación y una zona de detección que se extiende en una relación paralela separada en una primera dimensión de la matriz de flujo, en la que la zona de detección contiene un reactivo inmovilizado capaz de unirse a los analitos mediante una interacción específica con los mismos,
- (ii)
- un medio para iniciar un primer flujo de fluido esencialmente acuoso en la matriz de flujo a lo largo de la zona de separación en dicha primera dimensión de la matriz de flujo,
- (iii)
- un medio para iniciar un segundo flujo de fluido esencialmente acuoso en una segunda dimensión de dicha matriz de flujo, sustancialmente transversal a dicha primera dimensión, hacia la zona de detección,
de tal manera que cuando una
muestra conteniendo los analitos sea introducida en la zona de
separación, los analitos puedan ser separados en la zona de
separación por dicho primer flujo de fluido a través de la zona de
separación y transportados por dicho segundo flujo de fluido hacia
la zona de detección en la cual los analitos se unen al reactivo
inmovilizado para ser
determinados.
Preferiblemente, la matriz de flujo es al menos
sustancialmente plana.
La zona de separación y la zona de detección
(que pueden ser de una pieza o bien dos partes separadas unidas
entre sí) pueden estar dispuestas en el mismo plano de la matriz de
flujo, o pueden estar dispuestas una encima de la otra. En este
último caso, debe impedirse que las dos zonas entren en contacto una
con la otra tal como mediante un elemento separador extraíble cuando
se realice la fase de separación del método de la invención. Tal
elemento separador puede ser una película o similar que es extraída
antes de la realización de las etapas (iv) y (v) anteriores.
La Figura 1 es una proyección horizontal
esquemática de una realización de un aparato de acuerdo con la
presente invención.
Las Figuras 2A, 2B y 2C son proyecciones
horizontales esquemáticas del aparato de la Figura 1, ilustrando
cada una de ellas una etapa diferente del método de la presente
invención.
La Figura 3 es un diagrama que muestra las
curvas de intensidad detectada para isoformas de transferrina
analizadas mediante el método de la presente invención.
La Figura 4 es un diagrama que muestra cuatro
curvas de intensidad superpuestas para isoformas de transferrina
detectadas procedentes de análisis separados mediante el método de
la presente invención.
Según se mencionó anteriormente, el método de la
presente invención es particularmente útil para la determinación de
heteroformas de biomoléculas, esto es de analitos biomoleculares
estrechamente relacionados, que pueden no ser distinguidas por un
ligando o receptor específico, tal como un anticuerpo. Ejemplos de
heteroformas incluyen isoformas de proteínas, por ejemplo proteínas
glicosiladas de manera diferente (glicoproteínas) en las que
pequeñas variaciones en la estructura del carbohidrato pueden dan
lugar a isoformas con diferentes puntos isoeléctricos, isoenzimas,
etc. El término heteroformas incluye también inter alia
diferentes formas de complejos bioafines, en los que una parte del
complejo pertenece a la proteína isoforma, por ejemplo moléculas
libres y unidas a un anticuerpo. Un ensayo denominado de inhibición
puede ser utilizado para determinar si dos compuestos son
heteroformas uno del otro. La reacción del ligando con una o con las
dos isoformas sospechadas y la comparación del resultado, hace
posible decidir si las moléculas son isoformas.
Glicoproteínas tales como transferrina, FSH, LH
y TSH son ejemplos de analitos que se presentan en una variedad de
isoformas cuya abundancia relativa tiene importancia clínica, pero
que normalmente no son posibles de diferenciar por inmunoensayos ya
que son muy similares desde un punto de vista inmunoquímico. Otros
ejemplos de interés actual son los denominados marcadores cardíacos
(por ejemplo creatina quinasas) que se presentan en diferentes
isoformas con diferentes cargas como resultado de la degradación
proteolítica en el medio extracelular.
La transferrina y sus isoformas de interés están
presentes en concentraciones bastante elevadas en la sangre y pueden
ser analizadas mediante detección espectrofotométrica en línea
(Jeppsson, J.-O., Clin. Chem. 39/10, 2115-2120
(1993)) directamente después de separación en columna, si se aplica
a la columna suficiente cantidad de muestra. Otras moléculas tales
como las hormonas FSH, LH y TSH están presentes en bajas
concentraciones que requieren la detección mediante inmunoensayo
(Wide, L., Acta Endocrinologica 1985, 109,
181-189).
En el método de la invención, la separación de
analitos tales como isoformas puede ser realizada aplicando la
muestra que contiene las isoformas sobre una matriz de flujo plana,
especialmente una membrana, separando las isoformas mediante un
primer flujo de líquido en un área de separación de la matriz de
flujo, y eluyendo posteriormente las isoformas separadas a través de
un segundo flujo de líquido transversal al primer flujo de líquido,
de tal manera que las isoformas son extraídas del área de separación
y pasan a un área de detección que contiene un reactivo de captura
inmovilizado, normalmente como una línea o una banda, con el fin de
ser capturadas por el mismo. Las isoformas capturadas pueden ser
luego detectadas por la aplicación de un reactivo de detección, por
ejemplo un anticuerpo hacia la isoforma marcado, que puede ser
añadido, por ejemplo, a través de un tercer flujo de fluido en la
misma dirección, en dirección opuesta o en dirección transversal a
la del segundo flujo anteriormente mencionado.
En una realización (actualmente menos
preferida), la zona de separación y la zona de detección pueden ser
proporcionadas en dos miembros separados de la matriz de flujo
colocados uno encima del otro y separados por una película extraíble
o similar que es retirada antes de la elución de los analitos
separados y del transporte de los mismos hacia la zona de
detección.
Una matriz de flujo plana, tal como una
membrana, diseñada para tal análisis comprende una zona de
separación y en paralelo a la misma y separada de ella, una zona de
detección que contiene una o más líneas o bandas de reactivo de
captura inmovilizado que se extienden a lo largo de la zona de
detección.
Como se puede deducir fácilmente de lo anterior,
y como se comprenderá mejor a partir de la descripción siguiente, la
presente invención ofrece un método y un aparato para analizar
rápidamente isoformas de proteínas y otras heteroformas, lo cual no
había sido posible conseguir anteriormente.
El material de la matriz de flujo (incluyendo la
zona de separación y la zona de detección) puede ser del mismo tipo
que el utilizado previamente en los denominados métodos de
determinación inmunocromatográficos y define el lugar en el cual los
componentes de la muestra (incluyendo los analitos) y los reactivos
son transportados, siempre que, por supuesto, el material permita
flujos en diferentes direcciones. La superficie interna de la
matriz, esto es la superficie de los canales de flujo de la matriz,
debe ser suficientemente hidrofílica para permitir que medios
acuosos tales como tampones, suero, plasma, sangre, saliva, etc.,
sean transportados a través de la matriz. Este transporte puede ser
conseguido o estimulado por fuerzas capilares, ya sea por fuerzas
capilares en la propia matriz o en un medio auxiliar, tal como un
elemento absorbente (por ejemplo una almohadilla succionadora de
celulosa o similar) puesto en contacto con la matriz. El flujo
capilar puede ser opcionalmente estimulado de manera adicional por
presión o succión aplicada mediante un dispositivo de bombeo. La
dimensión interna más pequeña (para los canales redondos medida como
diámetro) debe ser suficientemente grande para permitir el
transporte a través de la matriz del analito y de los reactivos
añadidos. Típicamente, las matrices adecuadas pueden ser
seleccionadas de entre aquéllas que tienen canales de flujo con una
dimensión interna mínima en el rango de 0,01-1000
\mum, con preferencia por 0,4-100 \mum si la
matriz tiene un sistema de canales de flujo comunicantes. Los
canales de flujo que tienen su dimensión más pequeña en la parte
superior del amplio rango (hasta 1000 \mum) son útiles
principalmente para flujos dirigidos por presión/succión aplicada
externamente.
Actualmente, se prefiere que la matriz de flujo
esté en forma de una membrana, normalmente con un espesor menor de
500 \mum aproximadamente, por ejemplo en el rango de 25 \mum
aproximadamente a 500 \mum aproximadamente, y preferiblemente
menor de 150 \mum aproximadamente, por ejemplo en el rango de 75 a
150 \mum aproximadamente. Pueden contemplarse también, sin
embargo, otros tipos de matriz tal como un gel o una placa o chip de
silicio (o vidrio) con canales interconectados grabados, etc., como
es per se bien conocido en la técnica.
Las matrices adecuadas son producidas a menudo a
partir de un polímero, por ejemplo nitrocelulosa, poliéster,
poliétersulfona, nailon, nitrato/acetato de celulosa, celulosa,
celulosa regenerada. De manera ventajosa, las membranas de tales
materiales pueden ser proporcionadas con un revés o parte posterior
rígida de, por ejemplo, poliéster.
La homogeneidad del material de la matriz de
flujo influye sobre su calidad cromatográfica y puede ser reflejada
por tanto en términos de altura de la placa teórica. Cuanto menor
sea la altura de la placa teórica, mejor será el material. Por
ejemplo, una membrana para ser utilizada en la presente invención
tendrá preferiblemente una altura de la placa teórica (HETP) menor
de 500 \mum aproximadamente, especialmente menor de 100 \mum
aproximadamente.
La zona de separación y la zona de detección
pueden ser partes integrantes de una y de la misma matriz de flujo o
pueden ser un ensamblaje de partes separadas. La zona de separación,
que opcionalmente puede contener dos o más subzonas, puede estar
basada en varios principios, que permitan la utilización de sistemas
esencialmente acuosos, incluyendo cromatografía de intercambio
iónico, cromatoenfoque, filtración en gel (separación por tamaños)
(utilizando por ejemplo un gel o una membrana densa), afinidad
(preferiblemente una constante de unión moderada de <10^{6},
especialmente 10^{3}-10^{6}), incluyendo por
ejemplo IMAC (cromatografía de afinidad con quelatos de metales
inmovilizados) y cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC).
La zona de separación presenta un
ligando/estructura que tiene cierta capacidad para unirse a los
componentes deseados de la muestra (analitos y heteroformas
relacionadas). La elección del ligando o de la estructura,
especialmente con respecto a la especificidad, la potencia de unión
(afinidad) y la cinética, para satisfacer los fines de la presente
invención es inmediata para una persona con experiencia en la
técnica. Los ligandos que hacen posible la separación en la zona de
separación pueden por tanto estar cargados (aniónicos, catiónicos,
anfóteros = ligandos de intercambio iónico), anfóteros/anfifílicos,
bioafines, quelantes, conteniendo azufre (principalmente un tioéter
para la denominada afinidad tiofílica) o estar basados en una
interacción \pi-\pi, hidrofóbicos, etc. Entre
los ligandos de afinidad bioespecíficos, se señalan principalmente
los denominados inmunoligandos, por ejemplo anticuerpos y fragmentos
de unión al antígeno de los mismos.
Los ligandos/estructuras en cuestión pueden ser
estructuras introducidas físicamente en la matriz en el proceso de
fabricación, o pueden estar anclados a la zona de separación, ya sea
mediante unión covalente a la matriz o mediante adsorción física. El
anclaje de los ligandos/estructuras a la matriz puede tener lugar a
través de un polímero o de otro sustituyente que lleve a su vez los
ligandos que son utilizados en la separación unidos covalentemente,
adsorbidos físicamente o unidos bioespecíficamente. Otra posibilidad
es el depósito de partículas poliméricas que presenten un tipo
deseado de ligando. Las partículas pueden ser de carácter
hidrofílico o hidrofóbico, y el ligando/estructura puede estar
presentado por un compuesto adsorbido o unido covalentemente a las
partículas. En cuanto a la técnica para unir un ligando de
separación a la matriz, puede hacerse referencia, por ejemplo, a
nuestras Solicitudes Internacionales (PCT) previamente registradas
WO 99/36780, WO 99/36776 y WO 99/36777 (cuyas descripciones se
incorporan a la presente por referencia). A este respecto, puede
mencionarse que existen membranas disponibles comercialmente que
tienen ligandos unidos covalentemente, por ejemplo papel de DEAE
(dietil aminoetil) celulosa (DE81, Whatman International Ltd.,
Inglaterra).
La densidad del ligando (grado de sustitución)
es seleccionada para obtener la separación isocrática deseada.
Opcionalmente, la zona de separación puede tener diferentes
densidades de ligando o un gradiente de densidades de ligando a lo
largo de la dirección de separación.
Ejemplos de grupos funcionales de intercambio
iónico incluyen intercambiadores aniónicos tales como dietil
aminoetilo (DEAE), trimetil hidroxipropilo (QA), aminoetil
cuaternario (QAE), aminometil cuaternario (Q),
dietil-(2-hidroxipropil)-aminoetilo,
trietil aminometilo (TEAE), trietil aminopropilo (TEAP),
polietilenimina (PEI) e intercambiadores catiónicos tales como
metacrilato, carboximetilo (CM), ortofosfato (P), sulfonato (S),
sulfoetilo (SE), sulfopropilo (SP).
Después del revestimiento con el ligando, la
membrana es tratada normalmente con un detergente o con otro agente
adecuado para reducir sustancialmente o eliminar el fondo no deseado
o los efectos de la adsorción no específica de la matriz membranal
como es conocido per se en la técnica.
La muestra conteniendo los analitos puede ser
añadida directamente sobre la superficie de la matriz de flujo, pero
normalmente es añadida a una membrana o almohadilla de aplicación de
la muestra separada en contacto líquido con la membrana, ya sea en
contacto borde a borde con la misma o, preferiblemente, montada
sobre la parte superior de la matriz de flujo.
Las condiciones para la separación de los
analitos en la zona de separación son seleccionadas dependiendo del
principio de separación utilizado, pero generalmente las condiciones
son isocráticas o con una fuerza iónica cambiada gradualmente o
continuamente. Por otra parte, la elución transversal de los
analitos desde la zona de separación se realiza normalmente en
condiciones isocráticas. Así, por ejemplo, en la filtración en gel,
el tampón de separación y el tampón de elución pueden ser el mismo,
mientras que en la cromatografía de intercambio iónico es necesario
normalmente utilizar un tampón de elución de fuerza iónica elevada
para la elución eficaz de los analitos
separados.
separados.
En la zona de detección, la captura del analito
puede estar basada en diferentes principios tales como captura
bioespecífica, preferiblemente inmunoquímica, o captura específica
de un grupo, por ejemplo la unión de proteínas basada en la
presencia de grupos hidrofóbicos. Actualmente, se prefiere la
captura bioespecífica, siendo entonces deseable una constante de
unión de K > 10^{8}.
El reactivo de captura puede estar unido a, o
inmovilizado en, la parte de detección de la matriz de flujo como es
bien conocido en la técnica, por ejemplo de la misma forma que la
descrita anteriormente para los ligandos en la zona de
separación.
Según se mencionó anteriormente, la zona de
detección contiene preferiblemente una línea o banda continua de
reactivo de captura. En el caso de una concentración elevada de uno
o más de los analitos, puede ser necesario utilizar dos, u
ocasionalmente incluso más, líneas o bandas de detección. De manera
análoga, la densidad del ligando en la zona de detección puede
variar dependiendo de las concentraciones mutuas de los diferentes
analitos.
La zona de detección debe estar, por supuesto,
suficientemente alejada de la zona de separación para que el analito
no se propague hasta la zona de detección antes de que la separación
sea completa.
Aunque se desea que la liberación y el
transporte del analito desde la zona de separación hasta la zona de
detección sean sustancialmente completos, esto no es necesario para
la unión en la zona de detección, siempre que todos los analitos se
unan en el mismo grado en la zona de detección.
Dependiendo del tipo de matriz de flujo
utilizada, el flujo de elución procedente de la zona de separación
puede ser guiado hacia la zona de detección mediante delimitadores
adecuados tales como delimitadores de cera, surcos producidos con un
láser, etc.
La zona de separación y la zona de detección
pueden ser partes separadas de diferentes materiales unidos para
formar una matriz de flujo combinada, pero las dos zonas pueden ser
también proporcionadas, sin embargo, en una matriz integral, tal
como una membrana o un chip, mediante una modificación
química/física adecuada de la misma como es conocido per se
en la técnica.
La detección y la cuantificación de los analitos
capturados en la zona de detección pueden tener lugar de varias
formas. Si los analitos capturados son enzimáticamente activos,
pueden ser detectados por su acción sobre un sustrato adecuado, por
ejemplo un cambio de color. Normalmente, sin embargo, se añade un
reactivo detectable. Tal sustrato o tales reactivos pueden ser
añadidos mediante un flujo de fluido en la matriz, ya sea (i) desde
uno de los lados transversales a la dirección de separación de la
matriz de flujo (normalmente un lado largo), preferiblemente en
dirección opuesta al flujo de elución, o (ii) desde uno de los lados
que se extienden en la dirección de separación de la matriz de
flujo (normalmente un lado corto), o (iii) sobre la parte superior
de la matriz, normalmente cerca de la zona de detección, a través de
una almohadilla o de una parte plegable de la matriz de tal manera
que el sustrato o los reactivos puedan ser transportados mediante un
flujo de fluido a la zona de detección. En el último caso
mencionado, un reactivo de detección difundible puede ser
predepositado opcionalmente en la almohadilla o en la parte
plegable. Tales estructuras de predepósito y plegables son bien
conocidas per se en la técnica. El exceso de sustrato o de
reactivos será eliminado por un flujo de tampón.
El reactivo detectable es normalmente un
reactivo de afinidad bioespecífico que está marcado con un grupo
detectable analíticamente, tal como un grupo enzimáticamente activo
(por ejemplo formación de color tras la acción sobre un sustrato),
un grupo fluorescente, un grupo cromogénico, un hapteno, biotina,
una radiomarca (autorradiografía), partículas, etc. Una forma
habitual de reactivos marcados analíticamente es un anticuerpo
marcado.
El anticuerpo marcado puede ser utilizado en (i)
técnicas no competitivas, tal como la técnica de sándwich, en la
cual el capturador es un anticuerpo que puede estar dirigido contra
el mismo antígeno (= analito) que el anticuerpo marcado, o un
antígeno/hapteno, o bien (ii) técnicas competitivas en las cuales la
competición tiene lugar entre el analito y un análogo del analito
unido a un fase sólida para una cantidad limitante de anticuerpo
anti-analito.
Un grupo de marcaje particularmente útil es un
grupo de partículas, por ejemplo partículas de carbón de color negro
que pueden ser medidas directamente, por ejemplo, con un escáner de
tipo convencional. Opcionalmente, las partículas contienen uno de
los grupos detectables mencionados anteriormente, tal como un grupo
fluoróforo o un grupo cromogénico (partículas fluorescentes y
coloreadas, respectivamente). Las partículas útiles tienen a menudo
un tamaño en el rango de 0,001 a 5 \mum, con preferencia por el
rango de 0,05 a 5 \mum. Las partículas pueden ser de dimensiones
coloidales, denominadas sol (esto es, normalmente esféricas y
monodispersas con un tamaño en el rango de 0,001 a 1 \mum).
Pueden mencionarse especialmente partículas metálicas (por ejemplo,
sol de oro), partículas no metálicas (por ejemplo SiO_{2}, carbón,
látex y eritrocitos y bacterias destruidos). Se han utilizado
también partículas de dimensiones no coloidales. Éstas han sido más
o menos irregulares y más o menos polidispersas (por ejemplo,
partículas de carbón < 1 \mum; véase por ejemplo nuestra WO
96/22532).
Cuando el grupo de marcaje está constituido por
partículas, los complejos formados en la zona de detección pueden
ser a menudo detectados visualmente o mediante un equipo de medición
óptico (por ejemplo una cámara CCD acoplada a un ordenador con un
programa especial para análisis de imagen o un escáner con
láser).
Para partículas como grupo de marcaje, puede
hacerse referencia adicional a, por ejemplo, WO 88/08534 (Unilever);
US-A-5.120.643 (Abbott Labs.);
EP-A-284.232 (Becton Dickinson).
La invención está destinada principalmente para
muestras biológicas, por ejemplo, sangre (suero, plasma, sangre
completa), saliva, fluido lacrimal, orina, fluido cerebroespinal,
sudor, etc. La invención es también aplicable a otras muestras tales
como soluciones de fermentación, mezclas de reacción, etc.
Con el fin de facilitar la comprensión de la
presente invención, una realización de la misma será descrita a
continuación con más detalle, a manera de ejemplo únicamente, con
referencia a las Figuras 1 y 2A a 2C de los dibujos.
La Figura 1 ilustra esquemáticamente una
membrana que puede ser utilizada para el análisis de, por ejemplo,
isoformas de proteínas o de otras heteroformas de acuerdo con el
método de la invención. La membrana consta en el caso ilustrado de
dos partes combinadas de diferentes materiales, una parte de
separación 1 y una parte de detección 2, unidas por un fragmento de
cinta adhesiva (no mostrada) en la parte posterior de la membrana
combinada y en contacto una con otra recibiendo líquido mediante una
fina banda de membrana 3 como un solapamiento. Esta banda de
membrana 3 está fijada a la membrana de separación/detección por un
fragmento de cinta adhesiva 4. La parte de separación define una
zona de separación en la membrana combinada. La parte de detección 2
tiene una zona de detección en forma de una línea 5 de reactivo de
captura inmovilizado para los analitos, teniendo por ejemplo una
anchura de 1 mm aproximadamente. El número de referencia 6 indica
una línea de detección adicional opcional para incrementar el rango
de medida. Los lados cortos de la membrana están indicados en la
Fig. 1 por a y c y los lados largos por b y
d, respectivamente.
La membrana puede ser utilizada según sigue con
referencia a las Figs. 2A a 2C. Después de humedecer la membrana,
una muestra que contiene dos analitos para ser analizados (referidos
más adelante como analitos 1 y 2) es aplicada en 7 sobre la zona de
separación 1 (Fig. 2A). Una almohadilla 8 que contiene tampón de
separación es aplicada en el lado corto a de la membrana y
una almohadilla succionadora 9 en el lado corto opuesto c.
Esto producirá un flujo de tampón en la dirección de la flecha de la
Fig. 2A, separando los dos analitos según está indicado por los
puntos en 10 (analito 1) y 11 (analito 2) en la Fig. 2A.
Con referencia a la Fig. 2B, las almohadillas 8
y 9 son retiradas posteriormente y se monta una almohadilla que
contiene eluyente 12 en el lado largo d, y se monta una
almohadilla succionadora 13 en el lado largo b. Esto origina
un flujo de eluyente en la dirección de la flecha de la Fig. 2B, que
transporta los analitos 1 y 2 separados a la zona de detección donde
son capturados por la línea de reactivo inmovilizado en las
posiciones 14 y 15, respectivamente, a lo largo de la línea.
Posteriormente, con referencia a la Fig. 2C, las
almohadillas 12 y 13 son retiradas y sustituidas por una almohadilla
succionadora 16 en el lado largo d, y por un recipiente 17
con una solución o suspensión de reactivo marcado en el lado largo
b. De este modo, el reactivo marcado migrará en la dirección
de la flecha y se unirá a los analitos capturados 1 y 2 en 18 y 19
de la Fig. 2C. Los complejos marcados, y de este modo los analitos 1
y 2 correspondientes, pueden ser detectados y cuantificados
posteriormente leyendo la intensidad de las señales procedentes de
la marca a lo largo de la línea de detección y calculando las
cantidades respectivas. En el caso de que la marca sean partículas
de carbón, las medidas pueden ser realizadas de manera ventajosa con
un escáner.
El inicio y la parada manuales de los flujos
anteriormente descritos se presentan únicamente, por supuesto, con
fines ilustrativos, y medios más sofisticados para ello serán
inmediatamente obvios para una persona con experiencia en la
técnica, tales como, por ejemplo, los denominados circuitos de
líquidos impresos (ver, por ejemplo, WO 93/10457), etc.
Se describe a continuación un ejemplo específico
en el que se utiliza el método de la presente invención para el
análisis de isoformas de transferrina.
Una lámina de membrana de nitrocelulosa (3
\mum, nitrocelulosa sobre un soporte de poliéster, Whatman
International Ltd, Inglaterra) fue colocada en una solución de
polietilenimina (PEI, Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) al 0,03%. La
mezcla fue agitada durante tres horas y la membrana fue colocada
posteriormente en Tween 20 al 0,1% durante 30 minutos, secada al
aire y almacenada posteriormente en una bolsa de plástico a
+4ºC.
Un anticuerpo monoclonal
anti-transferrina, 3 mg/ml, fue pulverizado sobre
tiras (29 cm x 4 cm) de membranas de nitrocelulosa (5 \mum, sobre
un soporte de poliéster, Whatman International Ltd, Inglaterra) en
dos líneas anchas de 1 mm en el centro de la tira, separadas por 2
mm y en paralelo con el lado largo de la tira. El equipo de
pulverización (IVEK Linear Striper, IVEK Corporation, Vermont,
EE.UU.) administraba 1 \mul/cm. Las membranas fueron secadas a
temperatura ambiente y almacenadas en una bolsa de plástico a
+4ºC.
La membrana de separación fue cortada a 1,5 x 5
cm y la membrana de detección fue cortada a 2 x 5 cm, de tal manera
que las dos líneas de anticuerpo estuvieran situadas en el centro de
la membrana y en paralelo con el lado largo. Las dos membranas
fueron puestas bien juntas a lo largo de los lados largos y unidas
por medio de cinta adhesiva en la parte inferior. Un fragmento de
membrana de nitrocelulosa (0,2 cm x 5 cm, 8 \mum, A99, Schleicher
y Shuell, Dassel, Alemania) fue colocado en la parte superior de las
dos membranas como un solapamiento. Esta membrana fue fijada por
medio de una película de poliéster autoadhesiva de 1 x 4 cm
(película adhesiva de poliéster Gelman, 3 mil) colocada de tal
manera que 0,5 cm en el extremo del lado corto de la membrana
combinada de separación/detección formada permanecieran sin cubrir.
Más adelante, los dos lados cortos de la membrana combinada son
referidos como a y c, respectivamente, y los dos lados
largos como b y d, respectivamente (ver la Fig.
1).
Suspensión de partículas de carbón (solución
madre): se suspendieron 3 g de partículas de carbón (sp 4,
Degussa, Alemania) en 250 ml de tampón borato 5 mM, pH 8,4, y se
sonicaron (VibraCell 600 W, sonda de 1,5 cm) en un baño de hielo
durante 4 x 5 minutos a una amplitud del 100% y con un pulso de 5 +
5 segundos.
Conjugado con partículas de carbón: se
mezclaron durante 3 horas 75 \mug/ml de anticuerpo monoclonal
anti-transferrina y la suspensión de carbón (250
\mug/ml). Se añadió seroalbúmina bovina (BSA), correspondiente a
una concentración final del 1%, y las partículas fueron mezcladas
durante 30 minutos adicionales y posteriormente lavadas por medio de
centrifugación y decantación en tampón borato 0,1 M, pH 8,5
(conteniendo BSA 1% y NaN_{3} 0,05%) y diluidas hasta 3,7 mg de
carbón/ml con tampón de lavado. El conjugado de partículas de carbón
listo fue almacenado a +4ºC en tampón de lavado.
Tetrasialo transferrina, trisialo
transferrina y disialo transferrina: Estas isotransferrinas
fueron aisladas de una preparación de transferrina saturada con
hierro (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) mediante cromatografía de
intercambio iónico en Mono Q (Amersham Pharmacia Biotech AB,
Uppsala, Suecia).
Asialo transferrina: Una preparación de
transferrina saturada con hierro (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) fue
tratada con neuraminidasa (Behring ORKD, Alemania) y la asialo
transferrina fue aislada posteriormente mediante cromatografía de
intercambio iónico en Mono Q (Amersham Pharmacia Biotech AB,
Suecia).
Las diferentes isoformas fueron diluidas en BSA
0,2%, gammaglobulina bovina 0,1%, Tween 20 0,1%,
Fe^{3+}-citrato 0,1 mM, NaHCO_{3} 1 mM y
NaN_{3} 0,05% a las concentraciones de 2-6,5
\mug de transferrina/ml.
Puntos isoeléctricos (pI): Los pIs fueron
determinados para la preparación de la isoforma respectiva mediante
enfoque isoeléctrico repetido en Phast System (Amersham Pharmacia
Biotech AB, Uppsala, Suecia). El pI de la asialo transferrina =
5,66; pI de la disialo transferrina = 5,56; pI de la trisialo
transferrina = 5,46; pI de la tetrasialo transferrina = 5,32 y pI de
la pentasialo transferrina = 5,21. Para calibración se utilizó el
Kit de Calibración de Amersham Pharmacia,
17-0472-01,
2,5-6,5.
Estándar de transferrina: Asialo
transferrina preparada según se describió anteriormente fue diluida
en Bis-Tris 20 mM, pH 6,37, conteniendo BSA 0,2%,
Tween 20 0,1%, Fe^{3+}-citrato 0,1 mM, NaHCO_{3}
1 mM y NaN_{3} 0,05% a las concentraciones de
0,07-16,6 \mug de transferrina/ml y se utilizó
como estándar.
Etapa
1
La membrana combinada es humedecida mediante la
adición de tampón de elución a una esponja de PVA de 1 x 3,5 x 0,5
cm (PVA D, 60 \mum, Kanebo Ltd, Japón) y la colocación posterior
de la esponja a lo largo del lado corto a de la almohadilla.
En el lado corto c opuesto de la membrana se monta una
almohadilla de celulosa succionadora de 2 x 3,5 cm (GB 004,
Schlecher y Schuell). Cuando el frente del tampón de elución ha
alcanzado la almohadilla de celulosa, se retira la esponja de PVA.
Para el análisis (a) posterior, el tampón de elución era
Bis-Tris 20 mM, Tween 20 0,1%, NaCl 5 mM, pH 6,12; y
para el análisis (b) posterior, el tampón de elución era
Bis-Tris 20 mM, Tween 20 0,1%, NaCl 15 mM, pH
6,32.
Etapa
2
Se colocan 0,5 \mul de muestra
(2-6,5 \mug/ml) en el centro de la membrana de
separación, a 0,5 cm del lado corto a. Se añade la esponja de
PVA con el tampón de elución y se continua la elución durante 4
minutos. Posteriormente se retiran la esponja de PVA y la
almohadilla succionadora.
Etapa
3
A lo largo del lado largo b (membrana de
detección) se monta una almohadilla de celulosa de 2 x 5 cm (GB 004,
Schlecher y Schuell), y a lo largo del lado largo d se coloca
una esponja de PVA de 1 x 5 x 0,5 cm (PVA D, 60 \mum, Kanebo Ltd,
Japón) humedecida con tampón de elución (Bis-Tris 20
mM, NaCl 200 mM, Tween 20 0,1%, pH 6,29). Se continua la elución
durante 4 minutos y se detiene el flujo mediante la retirada de la
esponja de PVA y de la almohadilla succionadora.
Etapa
4
Se monta una almohadilla de celulosa
succionadora de 2 x 5 cm (GB 004, Schlecher y Schuell) a lo largo
del lado largo d (parte de la membrana de separación), y
posteriormente el lado largo b es colocado en un recipiente
con carbón-anti-transferrina, 0,25
mg de carbón/ml en trehalosa 40%, Tween 20 1%, albúmina bovina 1%,
tampón Borato 0,1 M, pH 8,5, NaN_{3} 0,05%. Se deja pasar el
conjugado con partículas de carbono a través de las líneas de
detección durante 2 minutos y se retira luego la membrana combinada
del recipiente, se retira la almohadilla succionadora y se deja
secar la membrana combinada.
Etapa
5
La membrana es colocada en un escáner (Agfa Acus
II Scanner) para la medida de una escala de grises a lo largo de las
líneas de detección. La escala de grises es leída con una resolución
de escala de grises de 12 bits (4096 niveles) y con una resolución
óptica de 600 puntos por pulgada (ppi). La imagen obtenida es
digitalizada y los valores de la intensidad son procesados por medio
de Microsoft Excel. Se calcula el valor medio de la intensidad a lo
largo del lado corto de la línea de detección (1 mm = 23 valores en
la escala de grises) y el cromatograma para 4 cm a lo largo de la
línea de detección puede ser ilustrado gráficamente.
Para el cálculo de la concentración de
transferrina, se utiliza una serie de diluciones de asialo
transferrina de las cuales se han dispensado 0,5 \mul de muestra
en la membrana de separación y posteriormente se han eluido
directamente (etapas 3-5). Se mide la intensidad
máxima del punto del estándar respectivo, se construye una curva
estándar por medio de un programa de ajuste de curvas (GraphPad
Prism®, ajuste no lineal) y puede calcularse la concentración de
transferrina para los cromatogramas.
a) Una muestra preparada conteniendo asialo
transferrina, disialo transferrina, trisialo transferrina y
tetrasialo transferrina fue analizada de acuerdo con el protocolo
estándar anterior, y las curvas de intensidad de la señal obtenidas
están mostradas en la Fig. 3. En el diagrama, el número 1 indica el
pico de la tetrasialo transferrina, 2 es trisialo transferrina, 3 es
disialo transferrina y 4 es asialo transferrina.
b) Muestras preparadas conteniendo (i) asialo
transferrina, (ii) disialo + trisialo transferrina, (iii) trisialo +
tetrasialo transferrina y (iv) tetrasialo + pentasialo transferrina,
respectivamente, fueron analizadas de acuerdo con el protocolo
estándar anterior, y los resultados están mostrados en la Fig. 4.
Los diferentes picos están identificados en la esquina superior
derecha del diagrama. Están indicados también los valores del punto
isoeléctrico de los picos.
Según está demostrado por las Figs. 3 y 4, el
método de la invención permite una excelente separación y
cuantificación de isoformas en una muestra. Por ejemplo, se consigue
fácilmente una resolución de 0,1 unidades del pI, según se muestra
en la Fig. 4.
Claims (35)
1. Un método para la determinación cualitativa,
semicuantitiva o cuantitativa de al menos dos analitos en una
muestra acuosa que contiene o que se sospecha que contiene los
analitos, comprendiendo dicho método las etapas
de:
de:
- (i)
- la provisión de una matriz de flujo que contiene una zona de separación que se extiende en una primera dimensión de la misma, y una zona de detección que se extiende en dicha primera dimensión en una relación separada paralela con la zona de separación, conteniendo dicha zona de detección un reactivo inmovilizado capaz de capturar dichos analitos a través de una interacción bioespecífica con los mismos,
- (ii)
- la aplicación de dicha muestra a la matriz de flujo en o corriente arriba de la zona de separación,
- (iii)
- el inicio de un primer flujo de fluido esencialmente acuoso en la matriz de flujo a lo largo de la zona de separación en dicha primera dimensión, para transportar los analitos a través de la zona de separación con el fin de que sean separados en la misma,
- (iv)
- la interrupción de dicho primer flujo de fluido y el inicio de un segundo flujo de fluido esencialmente acuoso en una segunda dimensión de la matriz de flujo, sustancialmente transversal a dicha primera dimensión, hacia la zona de detección, con el fin de transportar dichos analitos separados a la zona de detección para ser capturados en la misma por dicho reactivo inmovilizado, y
- (v)
- la determinación de los analitos en la zona de detección.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que dichos flujos de fluido en dicha matriz son estimulados
por fuerzas capilares.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1
ó 2, en el que la matriz de flujo es al menos sustancialmente
plana.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
2 ó 3, en el que la zona de separación y la zona de detección están
dispuestas en el mismo plano y dichos primer flujo y segundo flujo
de fluido son flujos laterales.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
2 ó 3, en el que la zona de separación y la zona de detección están
dispuestas una sobre la otra y dicho primer flujo de fluido es
lateral y dicho segundo flujo de fluido es en profundidad en la
matriz de flujo.
6. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el transporte de fluido en la
matriz de flujo se lleva a cabo al menos parcialmente mediante
fuerzas capilares en la propia matriz.
7. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el transporte de fluido en la
matriz de flujo está estimulado al menos por un elemento absorbente
que puede estar separado o ser una parte integrante de la matriz de
flujo.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7,
en el que la matriz de flujo es humedecida por un fluido
esencialmente acuoso antes del comienzo del ensayo.
9. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que la etapa de detección (v) de la
reivindicación 1 comprende la reacción de dichos analitos capturados
con un reactivo detectable.
10. El método de acuerdo con la reivindicación
9, en el que el reactivo detectable es un reactivo
inmunoquímico.
11. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que la etapa de detección (v) de la
reivindicación 1 comprende la reacción del reactivo inmovilizado no
reaccionado en la matriz con un analito detectable o con un análogo
del analito detectable.
12. El método de acuerdo con la reivindicación
9, 10 ó 11, en el que dicho reactivo detectable, dicho analito
detectable o dicho análogo del analito detectable contienen una
marca detectable.
13. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 12, en el que dicho reactivo detectable, dicho
analito detectable o dicho análogo del analito detectable son
introducidos mediante un tercer flujo de fluido.
14. El método de acuerdo con la reivindicación
13, en el que dicho tercer flujo de fluido es un flujo lateral
aplicado desde un lado de dicha matriz de flujo.
15. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en el que la separación en dicha zona de
separación está basada en cromatografía.
16. El método de acuerdo con la reivindicación
15, en el que dicha cromatografía es seleccionada de entre
cromatografía de intercambio iónico, cromatoenfoque, cromatografía
de exclusión de tamaños, cromatografía de afinidad y cromatografía
de interacción hidrofóbica.
17. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, en el que dicha zona de separación contiene
un gradiente en dicha primera dirección con respecto a la capacidad
de separación.
18. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, en el que dichos analitos son heteroformas
de una biomolécula.
19. El método de acuerdo con la reivindicación
18, en el que dichas heteroformas tienen cargas diferentes.
20. El método de acuerdo con la reivindicación
18 ó 19, en el que dichos analitos son glicoproteínas.
21. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 20, en el que dicha matriz de flujo comprende
una membrana.
22. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 21, en el que dicha matriz comprende una
membrana que tiene partículas depositadas en la misma.
23. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 22, en el que dicha zona de detección comprende
al menos dos líneas o bandas de detección paralelas que contienen un
reactivo inmovilizado.
24. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 23, en el que la unión del analito en la zona
de detección es por una interacción inmunoquímica.
25. Un aparato para determinar analitos en una
muestra, aparato que comprende:
- (i)
- una matriz de flujo que tiene una zona de separación y una zona de detección que se extienden en una relación paralela separada en una primera dimensión de la matriz de flujo, en la que la zona de detección contiene un reactivo inmovilizado capaz de unirse a los analitos a través de una interacción bioespecífica con los mismos,
- (ii)
- un medio para iniciar un primer flujo de fluido esencialmente acuoso en la matriz de flujo a lo largo de la zona de separación en dicha primera dimensión de la matriz de flujo,
- (iii)
- un medio para iniciar un segundo flujo de fluido esencialmente acuoso en una segunda dimensión de dicha matriz de flujo sustancialmente transversal a dicha primera dimensión hacia la zona de detección,
de tal manera que cuando una
muestra conteniendo los analitos sea introducida en la zona de
separación, los analitos puedan ser separados en la zona de
separación por dicho primer flujo de fluido a través de la zona de
separación y transportados por dicho segundo flujo de fluido hacia
la zona de detección en la que los analitos se unen al reactivo
inmovilizado para ser
determinados.
26. El aparato de acuerdo con la reivindicación
25, en el que la matriz de flujo permite a través de la misma un
flujo de fluido estimulado por fuerzas capilares.
27. El aparato de acuerdo con la reivindicación
25 ó 26, en el que la matriz de flujo es al menos sustancialmente
plana.
28. El aparato de acuerdo con la reivindicación
25, 26 ó 27, en el que zona de separación y la zona de detección
están dispuestas en el mismo plano y dichos primer flujo y segundo
flujo de fluido son flujos laterales.
29. El aparato de acuerdo con la reivindicación
25, 26 ó 27, en el que la zona de separación y la zona de detección
están dispuestas una sobre la otra y dicho primer flujo de fluido es
lateral y dicho segundo flujo de fluido es en profundidad en la
matriz de flujo.
30. El aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 25 a 29, en el que la zona de separación es como la
definida en cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17.
31. El aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 25 a 30, en el que la matriz de flujo es como la
definida en la reivindicación 21 ó 22.
32. El aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 25 a 31, en el que la zona de detección comprende
al menos dos líneas o bandas de detección paralelas que contienen un
reactivo inmovilizado.
33. El aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 25 a 32, aparato que comprende un medio para crear
una succión de líquido en la matriz de flujo.
34. El aparato de acuerdo con la reivindicación
33, en el que dicho medio para crear una succión de líquido
comprende un miembro absorbente en el extremo corriente abajo de la
matriz de flujo.
35. El aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 25 a 34, aparato que contiene un medio para
suministrar un flujo de líquido a la matriz de flujo.
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