JP2003525426A

JP2003525426A - 分析方法及びデバイス

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Publication number: JP2003525426A
Application number: JP2001515960A
Authority: JP
Inventors: カールソン，ヤン; レーンベリイ，マリア
Original assignee: フアルマシア・ダイアグノステイクス・アー・ベー
Priority date: 1999-08-06
Filing date: 2000-07-21
Publication date: 2003-08-26
Also published as: CA2381137A1; AU770715B2; EP1210594A1; AU6331300A; WO2001011355A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ａ）毛管力を利用して流体をフローマトリックス中を水平方向に流すことができ、少なくとも一部はイオン交換機能を有する膜型フローマトリックスを液体不浸透性裏材に取り付けて準備するステップ、ｂ）前記フローマトリックスを処理して、該フローマトリックスの非特異的吸着特性を低下または排除するステップ、ｃ）前記フローマトリックスに対して少なくとも２つの成分を含有するサンプルを適用するステップ、ｄ）水性流体の第１水平方向流れを開始して、サンプルをフローマトリックス中を移動させ、サンプル中の成分を分離するステップ、ｅ）前記水平方向流れを中断するステップ、及びｆ１）流れを中断したときに各成分が到達した位置でフローマトリックス上で分離成分の少なくとも１つを検出するステップ、またはｆ２ａ）水性流体の第２流れを開始して、前記成分を第１水平方向流れの方向を実質的に横断する方向に移動させるステップ、ｆ２ｂ）前記の第２水平方向流れを中断するステップ、及びｆ２ｃ）流れを中断したときに各成分が到達した位置でフローマトリックス上で分離成分の少なくとも１つを検出するステップを含む分析クロマトグラフ方法に関する。本発明はまた、液体不浸透性裏材に取り付けた膜型フローマトリックスを含むクロマトグラフデバイスであって、前記膜により流体を毛管力を利用して該膜を介して水平方向に流すことができ、前記膜はイオン交換機能を支持するように改質されている前記デバイスに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の技術分野）本発明は、サンプル中の１つ以上の成分を測定前にクロマトグラフィーにより
分離する前記成分を測定する方法に関する。本発明はまたそのためのデバイスに
関する。

【０００２】（発明の背景）生体分子の多成分混合物の分析は一般的にクロマトグラフまたは電気泳動ステ
ップを含み、通常退屈で、時間及びコストがかかる。しばしば、多成分混合物を
分析するには選択的抽出とクロマトグラフ分離を実施しなければならない。

【０００３】生体分子の多成分混合物を分析するために広く使用されている市販の分析シス
テムは、予備調製したゲル上での電気泳動に基づく分析システムであるＰｈａｓ
ｔＳｙｓｔｅｍ（商標）（スウェーデン国のＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃ
ｉａＢｉｏｔｅｃｈＡＢ）である。このシステムは分析作業者に対する労働
及び時間を大きく緩和するが、それでもかなりの労働とコストがかかる。

【０００４】米国特許第４，４６９，６０１号明細書は、薄層クロマトグラフプレートにお
ける多次元クロマトグラフィーのための方法及びシステムを開示しており、サン
プルを成分のアレーに分離している。その後、前記アレーを交差する方向で流体
をプレート中を圧送することにより前記成分をサブ成分の第２アレーに分離し、
このサブ成分が第２の方向で固定位置を越えて流れるときサブ成分を検出する。
しかしながら、前記薄層クロマトグラフィーは小さい（すなわち、低分子量）の
分離に限定され、生体分子（例えば、タンパク質）を分離させることはできない
。

【０００５】Ｐｒｉｓｔｏｕｐｉｌ，Ｔ．Ｉ．，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．Ｒｅｖ．，１２：１
０９−１２５（１９７０）は、クロマトグラフィー及び電気泳動におけるニトロ
セルロースフィルターの使用を記載している。水溶液のクロマトグラフィーをプ
レキシグラスチャンバー中の水平位置のニトロセルロース膜を用いて実施した。
膜を染色溶液中に浸漬することによりタンパク質を検出し、他の物質を通常のス
プレーまたはサンドイッチ技術により検出した。無傷の膜上に、１０^５以上のオ
ーダーの分子量を有するタンパク質はしっかりと吸着されたのに対して、ペプチ
ド、アミノ酸及び親水性を有する他の低分子量物質は展開液の先端と共に泳動し
た。電気泳動の場合、タンパク質の高吸着を防止するために膜を中性洗剤で含浸
させる必要があった。また、ウシ血清を吸着させた膜での家兎抗−ウシ血清及び
免疫化学的に不活性な正常な家兎血清のイムノクロマトグラフィーをも記載して
いる。抗原−抗体複合体はスタート時に明確なスポットを示したが、免疫化学的
に不活性なタンパク質は十分に吸着することなく泳動した。従って、成分の「真
の」クロマトグラフィーは無傷の（または、プレーンな）膜でも抗体コート膜で
も得られないが、むしろしっかりした結合または非結合で得られるようである。

【０００６】（発明の要旨）本発明の目的は、従来方法よりも簡単で、迅速で且つ安価である、成分を測定
するため、特に多成分混合物中の１つ以上の生体分子を測定するための分析方法
を提供することである。

【０００７】驚くことに、本発明によれば、例えばニトロセルロース製の薄膜がイオン交換
機能を支持するように改質されているならば上記目的、他の目的及び作用効果が
前記膜でのクロマトグラフィーにより達成され得ることを今回知見した。薄膜で
純粋なイオン交換クロマトグラフを得ることができることは、上記Ｐｒｉｓｔｏ
ｕｐｉｌ，Ｔ．Ｉ．（タンパク質の強い非特異的吸着またはタンパク質吸着の洗
浄剤による除去）が示した結果から予想し得なかった。分離された成分は膜上で
直接検出され得、或いはイオン交換機能を持たない膜の平行区画かまたは前記膜
に接合させた別の膜へ液体を交差させて流すことにより移動させた後検出され得
る。

【０００８】従って、１つの態様で、本発明は定性、半定量または定量分析のためのクロマ
トグラフアッセイ方法を提供し、その方法は、ａ）毛管力を利用して流体をフローマトリックス中を水平方向に流すことができ
、少なくとも一部はイオン交換機能を有する膜型フローマトリックスを液体不浸
透性裏材に取り付けて準備するステップ、ｂ）前記フローマトリックスを処理して、該フローマトリックスの非特異的吸着
特性を低下または排除するステップ、ｃ）前記フローマトリックスに対して少なくとも２つの成分を含有するサンプル
を適用するステップ、ｄ）水性流体の第１水平方向流れを開始して、サンプルをフローマトリックスを
介して移動させ、サンプル中の成分を分離するステップ、ｅ）前記水平方向流れを中断するステップ、及びｆ１）流れを中断したときに各成分が到達した位置でフローマトリックス上で分
離成分の少なくとも１つを検出するステップ、またはｆ２ａ）水性流体の第２流れを開始して、前記成分を第１水平方向流れの方向を
実質的に横断する方向に移動させるステップ、ｆ２ｂ）前記の第２水平方向流れを中断するステップ、及びｆ２ｃ）流れを中断したときに各成分が到達した位置でフローマトリックス上で
分離成分の少なくとも１つを検出するステップを含む。

【０００９】別の態様で、本発明は、液体不浸透性裏材を取り付けた膜型マトリックスを含
むクロマトグラフデバイスを提供し、前記膜により毛管力を利用して流体を膜中
を水平方向に流すことがてき、前記膜の一部はイオン交換機能を支持するように
改質されている。

【００１０】更に別の態様で、本発明は、上記したクロマトグラフデバイス及び膜を介する
液体流を開始及び維持するための手段を含むサンプル中の成分を測定するための
装置を提供する。

【００１１】（発明の詳細な説明）上記したように、本発明は、液密性裏材を有する薄膜でのサンプルのイオン交
換クロマトグラフィー、前記サンプルの分離成分の１つ以上の前記膜上での直接
検出、または任意に液体を横断させた後の、前記膜の別の部分または前記膜に接
合しているがイオン交換機能を持たない別の膜への成分の移動に基づく。サンプ
ルが数個（２以上）の成分を含む場合、分離された成分の１つまたは幾つかを検
出及び測定することが時には重要である。

【００１２】膜膜は細かい泡様構造及び孔径の標準化された狭い分布（典型的には０．０１〜
１００μｍの範囲、好ましくは０．０１〜２０μｍの範囲）を有していなければ
ならない。膜のフローチャネルまたは孔の内表面は勿論、緩衝液、血清、血漿、
血液、唾液等のような水性媒体がマトリックス中を移動できるように十分に親水
性でなければならない。この移動はマトリックスそれ自体の毛管力により達成さ
れ得るが、通常補助手段、例えばセルロースの吸収パッド等により達成される。
膜材料は通常ポリマーであり、ポリマーの例はニトロセルロース、ポリエステル
、ポリエーテルスルホン、ナイロン、硝酸セルロース及び再生セルロースである
。膜の厚さは通常約５００μｍ未満（例えば、約２５〜約５００μｍの範囲）、
好ましくは約１５０μｍ未満（例えば、約７５〜約１５０μｍの範囲）である。

【００１３】クロマトグラフ材料の均質性はそのクロマトグラフ品質に影響を与え、よって
理論段相当高さで表され得る。理論段相当高さが低くなるほど材料は優れている
。本発明で使用する膜は約５００μｍ未満、好ましくは約１００μｍ未満の理論
段相当高さ（ＨＥＴＰ）を有するべきである。

【００１４】膜におけるクロマトグラフ分離を可能にするイオン交換リガンドはアニオン性
、カチオン性または両性であり得、製造過程でマトリックスに物理的に導入され
得るか、または膜に対する共有結合によるかまたは物理的吸着により膜に固定さ
れ得る。イオン交換リガンドの膜への固定は、共有結合、物理的吸着による結合
または生物特異的結合するリガンドを有するポリマーまたは他の置換物を用いて
実施され得る。別の方法として、所望のタイプのイオン交換リガンドを示すポリ
マー粒子を堆積させてもよい。前記粒子は親水性でも疎水性でもよく、リガンド
構造は粒子に吸着または共有結合する化合物により発揮され得る。イオン交換リ
ガンドのマトリックスへの結合方法については、例えばいずれも援用により本明
細書に含まれるとする本出願人の国際特許出願公開第９３／３６７８０号パンフ
レット、同第９９／３６７７６号パンフレット及び同第９９／３６７７７号パン
フレットを参照することができる。

【００１５】リガンド密度（置換度）は所望の無勾配分離が行われるように選択される。場
合により、膜は異なるリガンド密度を有していたり、または分離方向に沿ってリ
ガンド密度の勾配を有していてもよい。ポリ緩衝液をイオン交換膜と一緒に使用
すると、ｐＨ勾配が膜に形成されたクロマトフォーカッシングにより分離するこ
とができる。

【００１６】イオン交換官能基の例には、アニオン交換体、例えばジエチルアミノエチル（
ＤＥＡＥ）、トリメチルヒドロキシプロピル（ＱＡ）、第４級アミノエチル（Ｑ
ＡＥ）、第４級アミノメチル（Ｑ）、ジエチル−（２−ヒドロキシプロピル）−
アミノエチル、トリエチルアミノメチル（ＴＥＡＥ）、トリエチルアミノプロピ
ル（ＴＥＡＰ）及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）；並びにカチオン交換体、例
えばメタクリレート、カルボキシメチル（ＣＭ）、ｏ−ホスフェート（Ｐ）、ス
ルホネート（Ｓ）、スルホエチル（ＳＥ）及びスルホプロピル（ＳＰ）が含まれ
る。

【００１７】リガンドコーティング後、膜の望ましくないバックグラウンドまたは非特異的
吸着効果を実質的に低下または排除するために膜を当業界でそれ自体公知のよう
に洗浄剤または他の好適な物質で処理する。

【００１８】測定すべきアナライトを含有するサンプルを前記膜表面上に直接適用してもよ
いが、通常は独立のサンプル適用膜または前記膜と液体接触するパッドに適用す
る。パッドは縁−縁接触によって膜に接触してもよいが、好ましくは前記膜の上
部に取りつけられる。

【００１９】膜での成分の分離条件は通常無勾配であるか、またはイオン強度を段階的もし
くは連続的に変化させる。

【００２０】検出分離された成分の検出ゾーンでの検出及び定量化は各種方法で実施され得る。
測定しようとする分離成分が酵素的に活性であるならば、前記成分は適当な基質
に対するその作用（例えば、色変化）により直接検出され得る。しかしながら、
通常、検出はタンパク質染色、脂質染色、炭水化物染色またはＤＮＡ染色により
、または生物特異的に検出可能な試薬を用いて実施する。前記基質及び試薬はマ
トリックスを介する流体流を介して、（ｉ）膜の分離方向を横断する膜の一方の
サイドから、（ｉｉ）膜の分離方向に延びる一方のサイドから、または（ｉｉｉ
）膜の上部に添加し得る。過剰の基質または試薬を緩衝液流により除去する。或
いは、膜を基質または試薬の溶液又は懸濁液中でインキュベートすることにより
前記基質または試薬を添加し、その後過剰の基質または試薬を洗い流す。或いは
、基質または試薬を膜に対して噴霧する。

【００２１】通常、検出する前に、分離された成分をそれ自体当業界で公知のように膜に固
定化する。例えば、グルタルアルデヒドのような架橋剤により化学的に固定化す
る。他の固定化手段は、例えば加熱による変性または有機溶媒への暴露である。

【００２２】酵素的検出は、例えば「電気泳動ゲルを用いる酵素の検出：ハンドブック(Det
ection of Enzymes on Electrophoresis Gels: A Handbook)」，ＣＲＣＰｒｅ
ｓｓＩｎｃ．（１９９４年）発行；「酵素の電気泳動：実験室方法(Electroph
oresis of Enzymes: Laboratory methods)」，Ｇ．Ｍ．Ｒｏｔｈｅ編，ニューヨ
ークに所在のＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ（１９９４年）発行；及び「遺伝
子研究のための実際的タンパク質電気泳動(Practical Protein Electrophoresis
for Genetic Research)」，ＴｉｍｂｅｒＰｒｅｓｓＩｎｃ．（１９９２年
）発行に記載されているような慣用方法により実施され得る。

【００２３】タンパク質の染色は、例えばＫ．Ｗ．Ｌｉら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
１８２：４４−４７（１９８９）に記載されているようなＡｕｒｏＤｙｅまたは
ＩｎｄｉａＩｎｋを用いる慣用方法により実施され得る。

【００２４】脂質の染色は、例えばＧ．Ｂｉｔｔｏｌｏ−Ｂｏｎ及びＧ．Ｃａｚｚａｌａｔ
ｏ，Ｊ．ＬｉｐｉｄＲｅｓ．，４０：１７０−１７６（１９９９）；Ｏ．Ｇａ
ａｌら，「生体マクロ分子の分離における電気泳動(Electrophoresis in the Se
paration of Biological Macromolecules)」，ｐ．３２７−３３５，Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８０年）発行に記載されているようなＯｉｌ
ＲｅｄＯ、ＳｕｄａｎＢｌａｃｋＢまたはＦａｔＲｅｄ７ｂを用いる
慣用方法により実施され得る。

【００２５】炭水化物の染色は、例えばＡ．Ｈ．Ｗａｒｄｉ及びＧ．Ａ．Ｍｉｃｈｏｓ，Ａ
ｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４９：６０７−６０９（１９７２）；Ｇ．Ｄｕｂｒ
ａｙ及びＧ．Ｂｅｚａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９：３２５−３
２９（１９８２）に記載されているような慣用方法により実施され得る。

【００２６】生物特異的に検出可能な試薬は、分析的検出可能な基、例えば（基質上で作用
すると発色する）酵素的に活性な基、蛍光基、色素源基、ハプテン、ビオチン、
放射標識（オートラジオグラフィー）、粒子等で標識した生物特異的アフィニテ
ィー反応物質であり得る。分析的標識反応物質の通常形態は標識抗体である。

【００２７】特に有用な標識基は粒子、例えば慣用タイプのスキャナーを用いて直接測定し
得る黒に着色したカーボン粒子である。場合により、前記粒子は上記した検出可
能基の１つ、例えば蛍光基または色素源基（それぞれ、蛍光及び着色粒子）を含
む。多くの場合、有用な粒子は０．００１〜５μｍ、好ましくは０．０５〜５μ
ｍの範囲のサイズを有する。粒子が所謂ゾル（すなわち、０．００１〜１μｍの
サイズを有する球形及び単分散）のコロイド寸法を有していてもよい。特に、金
属粒子（例えば、金ゾル）、非金属粒子（例えば、ＳｉＯ_２、カーボン、ラテッ
クス、及び死滅赤血球及び細菌）が挙げられ得る。また、非コロイド寸法を有す
る粒子も使用されている。これらの粒子は多少不規則で、多少多分散である（例
えば、カーボン粒子＜１μｍ；本出願人の国際特許出願公開第９６／２２５３２
号パンフレット参照）。

【００２８】粒子が標識基である場合、検出ゾーンで形成される複合体は多くの場合肉眼で
、または光学測定機器（例えば、イメージ分析のための特殊ソフトウェアを備え
たコンピュータに接続させたＣＣＤカメラまたはレーザースキャナー）により検
出され得る。

【００２９】標識基としての粒子については、例えば国際特許出願公開第８８／０８５３４
号パンフレット（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）、米国特許第５，１２０，６４３号明細書
（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｓ．）、欧州特許出願公開第２８４，２３２号明細書（
ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を更に参照されたい。

【００３０】イオン交換膜は、（例えば、粒状イオン交換基のために）その膜上で直接検出
できないこともある。この場合、平行する別のまたは非改質膜区画または前記膜
に接合させた別の膜を準備する必要があり、分離成分はイオン交換膜で完全に分
離した後に開始される横断方向液体流により強制的に前記区画または別の膜に泳
動され得る。前記検出方法は下記する態様及び具体例に記載されている。

【００３１】サンプル本発明の分析方法は生体サンプル、例えば血清、血漿や全血のような血液、唾
液、涙、尿、脳脊髄液、汗等の分析のために非常に適している。本発明は他の種
類のサンプル、例えば発酵溶液、反応混合物等にも適用可能である。測定したい
サンプル成分は通常高分子量成分、例えばタンパク質、ペプチド、核酸またはポ
リヌクレオチドである。

【００３２】上記したように膜との非特異的相互作用を低下または排除するために膜を処理
するために、そのような相互作用を更に低下させるべく１つ以上の物質をサンプ
ルに添加することが有利であり、場合により必要であることもある。しかしなが
ら、前記物質の量は、該物質が膜のイオン交換特性を妨害するほど高くてはなら
ない。

【００３３】例示実施形態本発明の理解を助けるために、本発明の実施形態を図１及び図２Ａ〜２Ｃを参
照しながらより詳細に説明する。

【００３４】図１は、本発明の方法に従って例えばタンパク質を分析するために使用され得
る膜を概略的に示す。例示されている膜は異なる材料製の２つの複合部分、すな
わち分離部分１及び検出部分２から構成されており、これらの部分は複合膜の裏
面上で接着テープ（図示せず）で接合されており、オーバーラップとしての薄膜
バンド３により相互に液体受容状態で接触している。この膜バンド３は接着テー
プ４により分離／検出膜に固定されている。分離部分は複合膜上の分離ゾーンを
規定している。また、検出部分は複合膜上の検出ゾーンを規定している。図１で
は、膜の短辺をそれぞれａ及びｃ、長辺をｂ及びｄで示す。

【００３５】前記膜は図２Ａ〜２Ｃを参照して以下のように使用し得る。膜を湿らした後、
分析すべき２成分（以下、アナライト１及び２と呼ぶ）を含有するサンプルを分
離ゾーン１の５に適用する（図２Ａ）。分離緩衝液を含有するパッド６を膜の短
辺ａに置き、吸引パッド７を対向する短辺ｃに置く。こうすると、緩衝液は図２
Ａの矢印の方向に流れ、２つのアナライトは図２Ａの点８（アナライト１）及び
点９（アナライト２）に示すように分離される。

【００３６】次に、図２Ｂを参照すると、その後図２Ａのパッド６及び７を外し、溶離液含
有パッド１０を長辺ｄに載せ、吸引パッドを長辺ｂに載せる。こうすると、溶離
液は図２Ｂの矢印の方向に流れ、分離されたアナライトは検出ゾーンの位置１２
及び１３に移動し、場合によりアナライトを例えば化学架橋により検出ゾーンに
固定化する。

【００３７】次に、図２Ｃを参照すると、（図２Ｂ中の）パッド１０及び１１を外し、その
代わりに長辺ｄに吸引パッド１４、長辺ｂに標識反応物質の溶液または懸濁液を
収容している容器１５を置く。こうすると、標識反応物質は矢印の方向に泳動し
、図２Ｃの１６及び１７で固定化アナライトに結合する。その後、検出ゾーンの
標識からの信号の強度を読み、各量を計算することにより標識された複合体、よ
って対応するアナライトを検出し、定量化することができる。標識がカーボン粒
子の場合、測定をスキャナーを用いて実施することが有利であり得る。

【００３８】上記した手動による流れの開始及び停止は単に例示にすぎず、より精巧な手段
、例えば所謂インプリント液体回路（例えば、国際特許出願公開第９３／１０４
５７号パンフレット参照）等は当業者に自明である。

【００３９】本発明の方法をアシアロトランスフェリン及びウシアルブミンの分析のために
使用する特定実施例を以下に説明する。

【００４０】（実施例）アニオン交換特性を有する分離膜の作成ニトロセルロース膜のシート（３μｍ，ポリエステル裏材上のニトロセルロー
ス，英国のＷｈａｔｍａｎｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＬｔｄ．）を０．１
％ポリエチレンイミン（ＰＥＩ，米国ミズーリ州セントルイスに所在のＳｉｇ
ｍａ）の溶液中に置いた。混合物を３時間振盪し、その後膜を０．１％ツイーン
２０中に３０分間置き、風乾し、＋４℃でプラスチック袋中に保存した。

【００４１】複合膜の作成分離膜を１．５×１．５ｃｍに切断し、プレーンニトロセルロース膜を３．５
×５ｃｍに切断した。２つの膜を長辺に沿ってしっかりと合わせ、裏面上で接着
テープを用いて接合した。ニトロセルロース膜（０．３ｃｍ×５ｃｍ，ＡＥ９９
，ドイツ国のダッセルに所在のＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄＳｃｈｕｅｌｌ
）を２つの膜の上面にオーバーラップとして載せた。この膜を、形成した複合分
離／プレーンニトロセルロース膜の短辺側０．５ｃｍが未被覆のままであるよう
に置いた自己接着性ポリエステルフィルム（１×４ｃｍ，Ｇｅｌｍａｎ接着性ポ
リエステルフィルム，３ミル）を用いて固定した。以下、複合膜の短辺をそれぞ
れａ及びｃと呼び、２つの長辺をそれぞれｂ及びｄと呼ぶ（図１参照）。

【００４２】カーボンブラックの調製カーボンブラックストック溶液：カーボンブラック粒子（ｓｐ５，ドイツ国の
Ｄｅｇｕｓｓａ）１．５ｇを５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．４）１５０ｍｌに
懸濁し、プラスチックビーカーにおいて１００％振幅及び５＋５秒パルスで５分
間音波処理（ＶｉｂｒａＣｅｌｌ６００Ｗ，１．５ｃｍプローブ）した。ツイ
ーン２０（米国ミズーリ州セントルイスに所在のＳｉｇｍａ）１．５ｍｌを添
加し、溶液を１００％振幅及び５＋５秒パルスで５分間音波処理した。

【００４３】カーボンブラック作業溶液：カーボンブラックストック溶液（１０ｍｇ／ｍｌ
）４ｍｌを５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．４）３５ｍｌで希釈し、ツイーン２
０１．２ｍｌを添加した。溶液を３０％振幅及び５＋５秒パルスで５分間音波
処理（ＶｉｂｒａＣｅｌｌ６００Ｗ，マイクロプローブ）した。

【００４４】サンプル物質アシアロトランスフェリン：トランスフェリンの鉄飽和調製物（米国ミズーリ
州セントルイスに所在のＳｉｇｍａ）をノイラミニダーゼ（ドイツ国のＢｅｈｒ
ｉｎｇＯＲＫＤ）で処理し、その後アシアロトランスフェリンをＭｏｎｏＱ
（スウェーデン国のＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ
ＡＢ）でのイオン交換クロマトグラフィーにより単離した。

【００４５】ウシアルブミン：ウシアルブミン（米国ニューヨーク州パーチャスに所在のＩ
ｎｔｅｒｇｅｎｃｏｍｐａｎｙ）をＭｏｎｏＱ（スウェーデン国のＡｍｅｒ
ｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈＡＢ）でのイオン交換クロマ
トグラフィーにより精製した。前記物質の最も負に耐電している部分を単離した
。

【００４６】分離及びタンパク質測定の組合せの標準プロトコルステップ１：短辺ａから短辺ｃへの膜の湿潤１×５×０．５ｃｍＰＶＡスポンジ（ＰＶＡＤ，６０μｍ，日本国のカネ
ボウ（株））に溶離緩衝液を添加した後スポンジを膜の短辺ａに置くことにより
、複合膜を湿らす。膜の対向する短辺ｃに、２×５ｃｍ吸引セルロース膜（Ｇ
Ｂ００４，ＳｃｈｌｅｃｈｅｒａｎｄＳｃｈｕｅｌｌ）を載せる。溶離緩
衝液の先端がセルロース膜に達した時にＰＶＡスポンジを外す。溶離液は２０ｍ
Ｍビス−トリス、０．１％ツイーン２０及び１０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ６．
３１）である。

【００４７】ステップ２：サンプルの適用及び短辺ａから短辺ｃへの溶離サンプル（０．３〜０．７ｍｇ／ｍｌ）０．５μｌを分離膜の中央の短辺ａか
ら１ｃｍの所に置く。溶離緩衝液を含むＰＶＡスポンジを当て、溶離を４分間続
ける。次いで、ＰＶＡスポンジ及び吸引膜を外す。図２Ａ参照。

【００４８】ステップ３：長辺ｄ（分離膜）から長辺ｂ（検出膜）への溶離長辺ｂ（プレーンニトロセルロース膜）に２×５ｃｍセルロース膜（ＧＢ
００４，ＳｃｈｌｅｃｈｅｒａｎｄＳｃｈｕｅｌｌ）を載せ、長辺ｄに溶離
緩衝液（２０ｍＭビス−トリス、１０００ｍＭＮａＣｌ、０．１％ツイー
ン２０（ｐＨ６．３０））で湿らした１×５×０．５ｃｍＰＶＡスポンジ（Ｐ
ＶＡＤ，６０μｍ，日本国のカネボウ（株））を置く。溶離を５分間続け、Ｐ
ＶＡスポンジ及び吸引膜を外すことにより流れを止める。図２Ｂ参照。

【００４９】ステップ４：タンパク質の固定化複合膜をヘアドライヤーを用いて約１〜２分間乾燥させる。次いで、膜に１２
．５％グルタルアルデヒド（Ｍｅｒｃｋ）を噴霧し、過剰分を拭き取り、反応を
４分間続ける。

【００５０】ステップ５：カーボンブラックとの反応長辺ｄ（分離膜部分）に２×５ｃｍ吸引セルロース膜（ＧＢ００４，Ｓｃ
ｈｌｅｃｈｅｒａｎｄＳｃｈｕｌｅｌｌ）を置き、長辺ｂに３％ツイーン２
０中１ｍｇ／ｍｌカーボンブラックで濡らした１×５×０．５ｃｍＰＶＡス
ポンジ（ＰＶＡＤ，６０μｍ，日本国のカネボウ（株））を置く。カーボンブ
ラック粒子を固定化タンパク質に７分間通した後、ＰＶＡスポンジを溶離緩衝液
（ステップ１参照）を満たした同一のＰＶＡスポンジと取り替える。この洗浄を
１０分間続けた後、ＰＶＡスポンジ及び吸引膜を外し、複合膜を乾燥させる。

【００５１】ステップ６：黒色化の検出タンパク質が固定化され、カーボンブラックで着色されているプレーンニトロ
セルロース膜に沿った１ｃｍ幅ラインのグレースケールを測定するために膜をス
キャナー（ＡｇｆａＡｃｕｓＩＩスキャナー）に置く。グレースケールを１
２ビットグレースケール分解能（４０９６レベル）及び６００ｐｐｉ光学分解能
で読む。得られたイメージをデジタル化し、強度値をマイクロソフト社エクセル
を用いて処理する。検出ライン（１０ｍｍ＝２３０グレースケール値）の短辺に
沿ったプレーンニトロセルロース膜１ｃｍのピクセル強度の総和を計算し、検出
ラインに沿った４ｃｍあたりのクロマトグラムをグラフで示す。

【００５２】分析０．７ｍｇ／ｍｌのアシアロトランスフェリン（ｐＩ５．６６）（図３）を含
有するサンプル、０．３３ｍｇ／ｍｌのウシアルブミン（ｐＩ４．８）（図４）
を含有するサンプル、または０．５ｍｇ／ｍｌのアシアロトランスフェリン及び
０．３３ｍｇ／ｍｌのウシアルブミンを含有する調製サンプル（図５）を上記し
た標準プロトコルに従って分析し、得られた信号強度曲線をそれぞれ図３、４及
び５に示す。

【００５３】これらの図に示すように、本発明の方法により異なる等電点を有するタンパク
質をうまく分離できる。

【００５４】膜材料のクロマトグラフ品質テストクロマトグラフ材料の品質を理論段の概念により評価し得る。理論段相当高さ
（ＨＥＴＰ）が低いほど材料は優れている。上で使用したニトロセルース膜（ポ
リエステル裏材上３μｍニトロセルロース，英国のＷｈａｔｍａｎｎｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌＬｔｄ．）を、膜上に置いたブロモフェノールブルーの薄
いラインを用いて試験し、溶離を開始した後デジタルカメラ（Ａｇｆａ１２８
０）で写真を撮った。２．８〜４．７ｍｍの泳動の間の写真を撮った。写真をス
キャンし（ＡｇｆａＡｒｃｕｓＩＩスキャーナー）、デジタル化し、処理し
た（マイクロソフト社エクセル）。

【００５５】ピークの幅を半高（ｗ_１／２）で測定し、理論段の数（Ｎ）を式Ｉ：式ＩＮ＝５．５５×（Ｖ_ｒ／ｗ_１／２）^２（Ｖ_ｒ＝泳動距離）により計算した。理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）を式２：式２ＨＥＴＰ＝Ｌ／Ｎ（Ｌ＝泳動距離）により計算した。理論段相当高さは、下表に示すにように泳動
距離に依存する。

【００５６】

【表１】

【００５７】上表から、約４０ｍｍの泳動の場合ＨＥＴＰは約２５μｍであることが分かる
。泳動速度は０．６５ｃｍ／分であった。これらの結果はカラムクロマトグラフ
ィーにより得られ得る結果とほぼ同等またはそれ以上である。

【００５８】本発明をその適切な具体例を参照しながら説明してきたが、当業者は理解する
ように本発明の趣旨を逸脱することなく各種変更、修飾、置換及び省略をなし得
る。従って、本発明は請求の範囲の均等物を包含すると意図される。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法に従って例えばタンパク質を分析するために使用され得る膜を概
略的に示す。

【図２Ａ】本発明の分析方法の標準プロトコルの１段階を示す。

【図２Ｂ】本発明の分析方法の標準プロトコルの１段階を示す。

【図２Ｃ】本発明の分析方法の標準プロトコルの１段階を示す。

【図３】アシアロトランスフェリンを含有するサンプルの分析結果を示す。

【図４】ウシアルブミンを含有するサンプルの分析結果を示す。

【図５】アシアロトランスフェリン及びウシアルブミンを含有するサンプルの分析結果
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号９９０３９７０−３ (32)優先日平成11年11月１日(1999．11．1) (33)優先権主張国スウェーデン（ＳＥ） (31)優先権主張番号６０／１６４，１４７ (32)優先日平成11年11月８日(1999．11．8) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ）毛管力を利用して流体をフローマトリックス中を水平方向に流すことができ
、少なくとも一部はイオン交換機能を有する膜型フローマトリックスを液体不浸
透性裏材に取り付けて準備するステップ、ｂ）前記フローマトリックスを処理して、該フローマトリックスの非特異的吸着
特性を低下または排除するステップ、ｃ）前記フローマトリックスに対して少なくとも２つの成分を含有するサンプル
を適用するステップ、ｄ）水性流体の第１水平方向流れを開始して、サンプルをフローマトリックス中
を移動させ、サンプル中の成分を分離するステップ、ｅ）前記水平方向流れを中断するステップ、及びｆ１）流れを中断したときに各成分が到達した位置でフローマトリックス上で分
離成分の少なくとも１つを検出するステップ、またはｆ２ａ）水性流体の第２流れを開始して、前記成分を第１水平方向流れの方向を
実質的に横断する方向に移動させるステップ、ｆ２ｂ）前記の第２水平方向流れを中断するステップ、及びｆ２ｃ）流れを中断したときに各成分が到達した位置でフローマトリックス上で
分離成分の少なくとも１つを検出するステップを含むことを特徴とするクロマトグラフアッセイ方法。
【請求項２】少なくとも１つの成分を検出する前に、分離成分を分離され
た位置でフローマトリックス上に固定化することを特徴とする請求の範囲第１項
に記載の方法。
【請求項３】分離成分をフローマトリックス上に化学的に固定化すること
を特徴とする請求の範囲第２項に記載の方法。
【請求項４】フローマトリックスを染色方法にかけて、１つ以上の成分を
検出することを特徴とする請求の範囲第２項または第３項に記載の方法。
【請求項５】染色方法がタンパク質染色、脂質染色、炭水化物染色及びＤ
ＮＡ染色から選択されることを特徴とする請求の範囲第４項に記載の方法。
【請求項６】少なくとも１つの成分に特異的に結合し得る標識反応物質を
該成分の検出のために膜に添加することを特徴とする請求の範囲第２項または第
３項に記載の方法。
【請求項７】膜型フローマトリックスを、裏材と接触する平らな支持体面
上に配置することを特徴とする請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載
の方法。
【請求項８】液体不浸透性裏材に取り付けた膜型フローマトリックスを含
むクロマトグラフデバイスであって、前記膜により流体を毛管力を利用して水平
方向に流すことができ、前記膜はイオン交換機能を支持するように改質されてい
ることを特徴とする前記デバイス。
【請求項９】請求の範囲第８項に記載のクロマトグラフデバイス及び該膜
を介する液体流れを開始及び維持するための手段を含むことを特徴とするサンプ
ル中の成分の測定用装置。
【請求項１０】更に、前記デバイスで分離された１つ以上のサンプル成分
を検出するための試薬、及び任意に検出前にデバイスにおいて分離成分を化学的
に固定化するための試薬をも含むことを特徴とする請求の範囲第９項に記載の装
置。