JPH08178928A - イムノアッセイ要素及びイムノアッセイ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 有機溶剤を使用しないて調製される安定なロ
イコ色素塗布組成物を含むイムノアッセイ要素を提供す
ること。 【解決手段】 （ａ）乾重量５５〜８０％のトリアリー
ルイミダゾール系ロイコ色素、（ｂ）乾重量７〜４０％
の酸化防止剤、（ｃ）乾重量６〜２０％のポリ〔ポリ
（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（プロピレンオ
キシド）〕系非イオン性ブロックコポリマー及び（ｄ）
乾重量１〜１６％のアルキルアリールオキシポリ（アル
キレンオキシド）系非イオン性界面活性剤を含むロイコ
色素塗布組成物を含有する層を少なくとも１層含むイム
ノアッセイ要素。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は臨床化学分野に関す
る。より詳細には、本発明は、ロイコ色素塗膜を含有す
るイムノアッセイ要素及びこのような要素の使用方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｋｏｄａｋ社製Ｅｋｔａｃｈｅｍ Ｃｌ
ｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙスライドなど、様々
な乾式分析アッセイ要素が市販されており、周知の乾式
多層イムノアッセイ要素の中にはロイコ色素が含まれる
層を含有するものがある。試料中の特定のアナライトを
検定する際に、ロイコ色素は、過酸化水素とペルオキシ
ダーゼ活性を有する物質との存在下で酸化されて着色形
となる。周知のように、その色の反射濃度は試料中のア
ナライト濃度に比例する。反射濃度は反射率計を用いて
測定することができる。この技術に関する詳細及び他の
文献については、米国特許第４，６７０，３８５号、同
第４，０８９，７４７号、同第５，０２４，９３５号及
び同第４，２５８，００１号明細書を参照されたい。

【０００３】この目的に用いられる典型的なロイコ色素
は、水溶液として溶解、そして付着又は塗布することが
できない芳香族性の高いロイコ色素である。このような
ロイコ色素に、米国特許第４，６７０，３８５号明細書
に記載のジアリールメタンやトリアリールメタン、並び
に米国特許第４，０８９，７４７号及び同第５，０２
４，９３５号明細書に記載のジアリールイミダゾールや
トリアリールイミダゾール系の色素がある。このような
色素は、有機溶剤（メタノールやジメチルスルホキシ
ド）に色素を溶解させ、そしてポリマー水溶液中で再沈
殿させてポリマー溶液中で色素の塗布組成物を得るか、
或いは色素を「カプラー溶剤」（ジエチルラウラミド）
に溶解させ、そしてそのカプラー溶剤溶液を水溶液中に
再分散させることによって、分散液として塗布されてい
る。

【０００４】このような色素塗布組成物の別の製造方法
は、色素をその良好な溶剤（ジメチルスルホキシド）に
溶解させ、そしてその色素を水性塗布組成物において再
沈殿させる方法である。この方法では、塗布組成物にお
ける色素の粒径を最適化するため沈殿プロセスの制御を
非常に慎重に行う必要がある。しかし、このプロセスは
色素溶液の攪拌速度や添加速度に敏感であるため制御が
難しく、こうして大きな粒子が形成されてしまい、結果
としてアッセイにおける発色を十分なものとするため必
要量以上の色素を使用しなければならなくなる。さら
に、このプロセスは予想できないほどに再現性に欠け
る。というのは、上記の理由の他、色素が凝集し易いこ
とや、塗布組成物の保存寿命に限りがあることのためで
ある。また、ＤＭＳＯの使用を回避できれば望ましいこ
とである。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】有機溶剤を使用しなく
ても形成され、色素使用量が半分以下で済み、再現性が
あり、そして厳密なプロセス制御操作を必要としない安
定なロイコ色素塗布組成物を含むイムノアッセイ要素に
対するニーズは大きい。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、（ａ）乾重量
５５〜８０％のトリアリールイミダゾール系ロイコ色
素、（ｂ）乾重量７〜４０％の酸化防止剤、（ｃ）乾重
量６〜２０％のポリ〔ポリ（エチレンオキシド）−ブロ
ック−ポリ（プロピレンオキシド）〕系非イオン性ブロ
ックコポリマー及び（ｄ）乾重量１〜１６％のアルキル
アリールオキシポリ（アルキレンオキシド）系非イオン
性界面活性剤を含むロイコ色素塗布組成物を含有する層
を少なくとも１層含むイムノアッセイ要素を提供するも
のである。

【０００７】本発明はまた、水性液体試料中の免疫学的
反応性リガンドを検定する方法をも提供する。この方法
は、 Ａ．標識されたリガンドが酵素標識リガンドである本発
明による乾式イムノアッセイ分析要素を提供する工程； Ｂ．前記酵素標識リガンドを含む層の有限領域に前記液
体試料を接触させることにより（１）固定化されたリガ
ンド−レセプター複合体及び（２）固定化された酵素標
識リガンド−レセプター複合体の少なくとも一方を形成
する工程； Ｃ．前記酵素標識リガンドを含む層の有限領域に基質溶
液を接触させることにより発色を触媒する工程；並びに Ｄ．前記リガンドの濃度を比色測定する工程を含む。

【０００８】本発明の方法によると、安定で再現性のあ
るトリアリールイミダゾール系ロイコ色素の塗布組成物
を製造することができる。この方法では、該色素を何ら
かの有機溶剤に溶解させる必要がない。この方法は、
（１）一方がアルキレンオキシドブロックコポリマーで
ある２種の非イオン性界面活性剤の組合せと、（２）色
素を保護するための酸化防止剤と、（３）適当な粉砕媒
体との存在下で実施される。

【０００９】より詳細には、この新規プロセスは下記の
３工程を含む。 Ａ．（ａ）湿重量４〜６％、乾重量５５〜８０％（好ま
しくは湿重量約５％、乾重量約６６．４％）のトリアリ
ールイミダゾール系ロイコ色素、（ｂ）湿重量１〜１．
５％、乾重量７〜４０％（好ましくは湿重量約１．２５
％、乾重量約１６．７％）の酸化防止剤（好ましくはジ
メドン）、（ｃ）湿重量０．７〜１．１％、乾重量６〜
２０％（好ましくは湿重量約０．９０％、乾重量約１
２．０％）のポリ〔ポリ（エチレンオキシド）−ブロッ
ク−ポリ（プロピレンオキシド）〕系非イオン性ブロッ
クコポリマー界面活性剤、（ｄ）湿重量０．３〜０．４
５％、乾重量１〜１６％（好ましくは湿重量約０．３７
％、乾重量約４．９％）のアルキルアリールオキシポリ
（アルキレンオキシド）系非イオン性界面活性剤及び
（ｅ）湿重量残部（好ましくは湿重量約９２．４７％）
の水を含む混合物を配合する工程。

【００１０】Ｂ．工程Ａで調製された混合物の水性スラ
リーを、微粉砕媒体並びに常用の微粉砕装置及び手順、
例えばボールミル、媒体ミル、アトリッターミル又は振
動ミル、によって微粉砕する工程。微粉砕される混合物
と微粉砕媒体との体積／体積比は約３：１〜１：３、好
ましくは１：１付近である。微粉砕媒体の平均直径は約
４ｍｍ未満、好ましくは約０．３〜２．０ｍｍである。
微粉砕工程は、ロイコ色素の平均粒径が約０．０１〜
４．０μｍ、より好ましくは約０．０１〜２．０μｍ、
最も好ましくは約０．０５〜０．５μｍになるまで微粉
砕を継続する。微粉砕時間は、ボールミルや振動ミルを
用いるような低エネルギー微粉砕法では１〜２０日を要
する場合もあるが、エネルギーの高い媒体ミルやアトリ
ッターミルが要する処理時間は短くなる。これらによる
と、ボールミルで１〜２０日かけて得られる量に匹敵す
る寸法減少量を、わずか数分〜数時間で達成することが
できる。

【００１１】Ｃ．得られた色素塗布組成物と微粉砕媒体
とを、好ましくは約０．１〜０．２ｍｍの開口部を有す
るスクリーンで篩分けする方法で分離する工程。上記の
方法によると、乾式多層分析要素に有用な新規乾式塗布
組成物が得られる。この塗布組成物は、（ａ）乾重量５
５〜８０％のトリアリールイミダゾール系ロイコ色素、
（ｂ）乾重量７〜４０％の酸化防止剤、（ｃ）乾重量６
〜２０％のポリ〔ポリ（エチレンオキシド）−ブロック
−ポリ（プロピレンオキシド）〕系非イオン性ブロック
コポリマー及び（ｄ）乾重量１〜１６％のアルキルアリ
ールオキシポリ（アルキレンオキシド）系非イオン性界
面活性剤を含む。上記重量％は、記載された成分にのみ
関する。これらの塗布組成物はまた、ゼラチンなどのベ
ヒクルや硬化剤、さらには必要に応じて緩衝剤や他の界
面活性剤などその他常用の添加物を含む場合もある。

【００１２】微粉砕工程は、得られる水性塗布組成物を
安定化する２種の非イオン性界面活性剤の組合せを使用
して水中で実施される分断化プロセスである。用いられ
る界面活性剤／安定化剤成分は、色素及び酸化防止剤の
両方の沈降や凝集から塗布組成物を安定に維持し、各分
散成分を凝集、凝結させることなく塗布組成物においえ
離散した粒子として存在させるものである。

【００１３】界面活性剤の一方は、２種のポリ（アルキ
レンオキシド）のブロック、好ましくはポリ（エチレン
オキシド）のような直鎖ポリ（アルキレンオキシド）の
ブロック及びポリ（プロピレンオキシド）のような分岐
鎖ポリ（アルキレンオキシド）のブロックを含む非イオ
ン性ブロックコポリマーであり、最も好ましくはポリ
〔ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（プロピ
レンオキシド）〕コポリマーである。この界面活性剤
は、微粉砕工程においても塗布組成物においてもロイコ
色素をコロイド状で安定化するために必須である。この
ようなポリマーは市販されているが、例えば、ＢＡＳＦ
社から「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ」や「Ｔｅｔｒｏｎｉｃ」の
商標で、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ社から「Ａｎｔａ
ｒｏｘ」の商標で、Ｗｉｔｃｏ社から「Ａｒｎｏｘ Ｂ
Ｆ−Ｓｅｒｉｅｓ」の商標で、ＰＰＧＩｎｄｕｓｔｒｉ
ｅｓ社から「Ｍａｃｏｌ」の商標で、Ｏｌｉｎ社から
「Ｐｏｌｙ−Ｔｅｒｇｅｎｔ」の商標で市販されてい
る。好ましいブロックコポリマーは、ＢＡＳＦ社から市
販されている商標Ｔｅｔｒｏｎｉｃ−９０８のポリ〔ポ
リ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（プロピレン
オキシド）〕コポリマーである。

【００１４】他方の界面活性剤は非イオン性アルキルア
リールオキシポリ（アルキレンオキシド）である。ここ
で、各アルキル基は炭素原子を６〜１６個有し（オクチ
ル、イソオクチル、ノニル又はイソノニル）、アリール
基は、フェニル又はさらに別のアルキル置換基を１個若
しくは２個有するアルキル置換フェニルである。この界
面活性剤は、微粉砕中の組成物及び塗布組成物において
酸化防止剤をコロイド状で安定化するために必須であ
る。関連するアルキル基は１〜１６個の炭素原子を有す
る。アルキレンオキシドポリマーのアルキレン部は、炭
素原子数２〜４個の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基であ
る。アルキレンはヒドロキシル基で置換されていてもよ
い。１分子当たりの重合したアルキレンオキシド基の数
は、平均して約５〜３０個、好ましくは５〜１５個、最
も好ましくは約１０個である。好ましい界面活性剤は、
Ｏｌｉｎ Ｃｈｅｍ社から商標「Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ
１０Ｇ」で市販されている約１０個の重合グリシドー
ル反復単位を有するイソノニルフェノキシポリ（グリシ
ドール）である。その他の好適な材料が、例えば、Ｕｎ
ｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ社から「Ｔｒｉｔｏｎ」の商標
で、Ｗｉｔｃｏ社から「Ａｒｎｕｌ」及び「Ｄｅｓｏｎ
ｉｃ」の商標で、Ｔｅｘａｃｏ Ｃｈｅｍ社から「Ｓｕ
ｒｆｏｎｉｃ」の商標で市販されている。

【００１５】本発明の色素塗布組成物には、微粉砕工程
中及び微粉砕工程後並びに分析要素完成品の保存中に色
素の酸化（望ましくない発色）を防止するために、酸化
防止剤を存在させる。好ましい酸化防止剤はジメドンで
ある。その他の好適な酸化防止剤は、４’−ヒドロキシ
アセトアニリド及びその３’位、５’位又は３’位と
５’位に電子求引性基を有する誘導体、それらのナフタ
レン類似体、ヒドロキノン類並びにアミノフェノール類
である。

【００１６】分断化(fragmentation) は、ボールミル、
媒体ミル、アトリッターミル及び振動ミルのような常用
の粉砕プロセスにおいて粉砕媒体を使用して行われる。
一般に粉砕媒体は平均直径が約４ｍｍ未満、好ましくは
約０．３〜約２．０ｍｍの球形粒子である。好適な微粉
砕媒体として、ガラス、セラミック（例、チタニア、ジ
ルコニア及びアルミナ）、プラスチック、金属（例、ス
チール、窒化ケイ素及び炭化タングステン）、砂、その
他当該技術分野で知られている物質の粒子が挙げられ
る。ガラスビーズやセラミックビーズが好ましい。酸化
ジルコニウムが有用である。

【００１７】ボールミル微粉砕は、円筒形容器の体積の
約半分をビーズで満たすに十分量の粉砕媒体を円筒形容
器に装填することにより行われる。その容器に色素混合
物のスラリーを加えて、スラリー容積の２５〜１００％
が粉砕媒体の隙間に入るようにする。スラリー容積の約
７５％が媒体空隙に存在し、約２５％が粉砕媒体の上部
に「上澄み液」として存在することが好ましい。容器を
閉鎖し、そしてその軸を中心として「臨界速度」の約１
０〜９０％の速度で同心回転させる。臨界速度１００％
とは、粉砕媒体が容器壁に対して遠心分離し始め、容器
回転時に自由に瀑落することができなくなる回転速度で
ある。一般に、臨界速度の約４０〜７０％の回転速度で
粉砕効率が最高になるので、これが好ましい速度であ
る。

【００１８】微粉砕工程は所望の粒径が得られた時点で
終了する。粒径の測定は、試料を抜き取り、色素塗布組
成物を粉砕媒体から分離し、そしてロイコ色素の平均粒
径を光散乱測定やディスク遠心分離法などの常用の寸法
測定法で測定することによって行われる。微粉砕媒体と
色素塗布組成物との分離は、粉砕ビーズを保持し且つ色
素と酸化防止剤の色素塗布組成物を収集することができ
る常用の篩分け法によって行われる。

【００１９】上記したように、この塗布組成物は多層乾
式分析要素、とりわけイムノアッセイ要素に有用であ
る。この要素は、単層若しくは多層又はこのような層内
に複数の帯域を有する層の組合せであることができる。
一般に、こうした要素は輻射線透過性支持体、一層又は
二層以上の試薬層、粒状展開層、そして態様によっては
試薬層と展開層の間にレセプター層を含むことができ
る。レセプター層又は展開層は、表面に抗体が固定化さ
れているレセプタービーズを含有する。

【００２０】これらの層は、当該技術分野に周知の塗布
技法を用いて塗布することができる。例えば、米国特許
第２，７６１，４１７号明細書に記載されているタイプ
のスライド押出式ホッパーは、少なくとも一層が固定化
抗体ビーズを担持する高分子粒子を含む複数の層を同時
に塗布するのに有利である場合が多い。より具体的に
は、ビーズを含有する塗布組成物をスライド押出式ホッ
パーの押出スロットを介して方向付けし、同時に第二の
塗布組成物（所望により同様にビーズを含有することが
できる）の層をスライド押出式ホッパーのスライド表面
の下方へ流動させることによって多層要素を塗布するこ
とができる。

【００２１】抗体が固定化されている粒状層は多孔質で
ある。このような層に用いられる材料は乾式分析要素の
製造技術分野では周知である。好ましい粒状層はビーズ
展開層（ＢＳＬ）である。この層は、希釈された又は未
希釈の試験試料（例、１〜１００μＬ）を収容するため
の本発明の要素に適した多孔性を有するように容易に構
築することができる。展開層の気孔は等方性であること
が好ましく、この特性は帯域を構成する粒子間の連続空
間によって生まれる。等方性多孔質とは、展開層が、ア
プライされた流体を層全体に放射状に均一展開すること
を意味する。

【００２２】ビーズ展開層をはじめとする有用な粒状展
開層が米国特許第４，６７０，３８１号、同第４，２５
８，００１号及び同第４，４３０，４３６号明細書に記
載されている。

【００２３】この要素の粒状層は適当な支持体上に担持
されている。このような支持体は、適当な寸法安定性の
あるものであればいずれのものであってもよいが、好ま
しくは波長約２００〜約９００ｎｍの電磁輻射線を透過
する透明（すなわち輻射線透過性）且つ非孔質の材料で
ある。特定の要素に対する支持体の選定は、所期の検出
様式（反射、透過又は蛍光分光分析法）に適合すべきで
ある。有用な支持体として、ポリスチレン、ポリエステ
ル〔例、ポリ（エチレンテレフタレート）〕、ポリカー
ボネート、セルロースエステル（例、酢酸セルロー
ス）、等が挙げられる。

【００２４】この要素は、さらに別の層、例えば、分離
して或いは組み合わされている試薬／展開層及び他の必
要な添加剤、結合性酵素、等を含有するゼラチン／緩衝
剤層を１層又は２層以上含むことができる。

【００２５】この要素のゼラチン／緩衝剤層又は試薬層
又は展開層は、ゼラチン、又は他の天然コロイド、ホモ
ポリマー及びコポリマー、例えば、ポリ（アクリルアミ
ド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（Ｎ−イソプロ
ピルアクリルアミド）、ポリ（アクリルアミド−コ−Ｎ
−ビニル−２−ピロリドン）及び同様のコポリマー、等
の合成又は天然バインダー物質の１種又は２種以上に分
散された１種又は２種以上の試薬を含むインジケーター
組成物を含有することができる。

【００２６】所望であれば、その他の任意の層、例え
ば、下塗層、輻射線遮断層、等を含めることができる。
要素の層はすべて互いに液絡している。すなわち、流体
及び流体中の試薬や複合化されていない反応生成物は隣
接層の重畳領域間を通過することができる。

【００２７】この要素の層は、その他の望ましい（しか
し任意である）各種成分、すなわち界面活性剤、増粘
剤、緩衝剤、硬化剤、酸化防止剤、カプラー溶剤、その
他当該技術分野で周知の物質、等を含有することができ
る。これら成分の量については当業者であれば設定する
ことができる。

【００２８】これらの要素を使用することで、生物学的
流体（例、全血、血清、血漿、尿、脊髄流体、ヒト又は
動物細胞の懸濁液、糞、唾液、リンパ流体、等）のよう
な液体中に低濃度で含まれる免疫学的反応性リガンドを
測定することができる。これらのリガンドは、約１０
^-11 モル程度の低濃度で測定されることができるが、一
般には約１０^-10 〜約１０^-4モルの濃度で測定されるこ
とができる。

【００２９】このように（定量的又は定性的に）測定で
きるリガンドには、治療薬（例、フェノバルビタール、
ジゴキシン、ジギトキシン、テオフィリン、ゲンタマイ
シン、キニジン、フェニトイン、プロパノロール、カル
バマゼピン、トブラマイシン、リドカイン、プロカイン
アミド、等）、天然又は合成ステロイド（例、コルチゾ
ル、アルドステロン、テストステロン、プロゲステロ
ン、エストリオール、等）、ホルモン（例、チロイドホ
ルモン、ペプチドホルモン、インスリン、等）、タンパ
ク質（例、アルブミン、ＩｇＧ、ＩｇＭ、フェリチン、
血液凝固因子、Ｃ−反応タンパク質、イソ酵素、アポリ
ポタンパク質、等）、抗原、モノクローナル抗体をはじ
めとする抗体、その他レセプターと自然に反応する種、
が含まれる。本発明は、ジゴキシン、フェニトイン、テ
オフィリン又はフェノバルビタールのような治療薬及び
チロキシン又はトリヨードチロニンのようなホルモンの
測定に特に有用である。

【００３０】アッセイは競争アッセイであってもサンド
イッチアッセイであってもよい。アナライト誘導体又は
（サンドイッチアッセイで用いられる）抗体に結合する
ことができる適当ないずれの標識を使用してもアッセイ
を行うことができる。有用な標識には、放射性標識、色
素、蛍光体、酵素、酵素基質、酵素インヒビター、アロ
ステリック作働子、コファクター、及びその他周知の酵
素モジュレーターが含まれる。好ましい標識は酵素、例
えば、グルコースオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシ
ダーゼやアミン富化西洋ワサビペルオキシダーゼのよう
なペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ並びに
ガラクトシダーゼである。

【００３１】酵素標識を使用する場合、その酵素の基質
を、分析要素中に存在させるか、或いは展開液の中に添
加する。基質は、液体試料の添加前又は添加と同時に、
或いは結合反応完了後に、分析要素へ添加することがで
きる。特定の標識に対して好適な基質を決定すること
は、臨床化学分野の当業者であれば容易になしうる事項
である。基質は、酵素標識によって直接的に作用を受け
る物質であっても、また該標識の酵素反応を含む一連の
反応に関与する物質であってもよい。例えば、酵素標識
がペルオキシダーゼである場合、基質は過酸化水素であ
る。一例としてグルコースペルオキシダーゼを使用する
場合、基質のグルコースは、一般に試薬層の中に存在さ
せるか又は展開液中に添加し、約０．０１モル／ｍ² 、
好ましくは約０．００１〜約０．１モル／ｍ² が得られ
るようにする。当業者であれば、アッセイに用いられる
酵素標識量に対して特定の基質の量を調整する方法につ
いては周知である。

【００３２】このインジケーター組成物は、本発明によ
って提供されるロイコ色素塗布組成物を含む。すなわ
ち、この組成物はロイコ色素を含み、そして該組成物に
はペルオキシダーゼ又は、例えばグルコースオキシダー
ゼがグルコースをグルコン酸に転化した時に発生する過
酸化水素の結果として検出可能な色素を生成する他の適
当な過酸化性化合物が含まれるか又はアッセイの際に供
給される。

【００３３】イムノアッセイは手動式であっても自動式
であってもよい。一般に、液体中のリガンドの定量は、
供給ロール、チップパケット又は他の出所から分析要素
を取り出し、そして展開層の有限領域に液体試料（例、
１〜１００ｍＬ）を物理接触させることにより行われ
る。この接触を受ける有限領域は一般に約１５０ｍｍ²
以下である。

【００３４】リガンドの量は、複合化したリガンド類似
体を直接に検出するか或いは酵素標識と基質の酵素反応
の結果生成した検出可能な種を検出するための適当な装
置の中を分析要素を通過させることにより測定される。
例えば、これらの種は、一般に知られた手順を用いて適
当な分光光度測定装置で検出することができる。酵素反
応の場合には、試験試料が接触した有限領域内の反射濃
度又は透過濃度の変化速度を測定することによって、得
られた生成物を定量することができる。測定される面積
は一般に約５〜２５ｍｍ² である。液体試料中のリガン
ド量は、有限領域内で測定された標識量に反比例する。
一般には、基質溶液を適用した後に標識を測定する。

【００３５】特に有用なイムノアッセイ要素がＳｕｔｔ
ｏｎらにより１９９４年６月１６日に出願された米国特
許出願第０８／２６０，９３９号明細書に記載されてい
る。本明細書ではこの米国特許出願明細書を参照するこ
とにより取り入れたものとする。この明細書は、リガン
ドを検定するための乾式イムノアッセイ分析要素であっ
て、順に（ａ）標識されたリガンドを含有する層、
（ｂ）ビーズ展開層、（ｃ）架橋された親水性ポリマー
層及び（ｄ）支持体を含み、（１）（ｂ）層と（ｃ）層
との界面における帯域（レセプターゾーン）に、前記標
識されたリガンドに対する固定化レセプターが一定濃度
で配置されており、そして（２）前記レセプターは、前
記（ｂ）層におけるビーズよりも小さな高分子ビーズに
共有結合されることによって固定化されている乾式イム
ノアッセイ分析要素について記載している。

【００３６】本発明によって提供される乾式ロイコ色素
塗布組成物は、上記分析要素のレセプターゾーン又は展
開層に内蔵されると特に有用である。標識されたリガン
ドをグラビア塗布することで、（１）標識されたリガン
ド塗布組成物の湿被覆量を最小限に抑えて標識されたリ
ガンドがレセプターと予め接触しないようにすると同時
に標識されたリガンドが均一に被覆されるに十分な湿潤
性を維持し、且つ（２）（ａ）実質的にすべての塗布溶
剤を除去し、（ｂ）展開層の多孔性及び展開時間に悪影
響が及ばないようにし、そして（ｃ）十分な酵素活性を
維持するように、迅速な乾燥を達成する。

【００３７】予め起こる結合を最小限に抑えるには、抗
体と標識リガンドの互いの相対親和性も重要な因子であ
る。この因子は、当業者には周知であるように、抗体を
慎重に選定すると共に標識リガンドの構造を操作するこ
とによって制御される。

【００３８】一般に、要素内で必要とされる標識リガン
ドの塗被量は、以下の手順に従い各々特定のイムノアッ
セイについて実験的に求められる。 １．試料と同時に標識リガンドと分析要素とを接触させ
てイムノアッセイを実施した場合に許容できるイミノア
ッセイ性能を達成するのに必要な標識リガンド濃度を決
める。（ａ）アッセイを２０分未満で実施することがで
き、（ｂ）アッセイのダイナミックレンジが、検出可能
なリガンドの最低濃度と最高濃度が臨床的に有用な濃度
範囲をカバーするような範囲にあり、そして（ｃ）その
ダイナミックレンジにわたり臨床的に意義のあるリガン
ド濃度が検出できる場合に、許容できるアッセイ性能が
達成される。

【００３９】２．下記Ａ〜Ｄによって、上記の許容でき
るアッセイ性能を達成するため同じ分析要素に必要とさ
れる標識リガンド塗被量を実験的に求める。 Ａ）標識リガンドの最適スポット付着量を確立するため
に用いられる要素の粒状レセプターゾーンの上に直接、
上記１において標識リガンドをスポット付着する際に用
いられた標識リガンド濃度の何分の一か、何倍か、又は
等濃度の塗被量（ｇ／ｍ² ）で標識リガンドを塗布す
る。 Ｂ）既知濃度のリガンドを含有する試験試料を用いて一
連のアッセイを行う。 Ｃ）既知濃度のリガンドによるアッセイの結果を比較す
る。そして Ｄ）工程２Ｃで得られた結果により標識リガンド塗被量
を変更して工程Ｂと工程Ｃを必要なだけ繰り返し、標識
リガンドの必要な塗被量を決める。

【００４０】標識されたリガンドによっては、分析要素
上に標識リガンドを直接スポット付着して同じアッセイ
を実施する場合に必要な標識リガンド濃度よりも、標識
リガンド塗被量が少なくなる場合、同等となる場合、又
は数倍（２×、３×、４×、等）多くなる場合がある。

【００４１】上記のガイドラインに沿って、慎重に制御
したグラビア塗布手順を以下の塗布及び乾燥プロトコル
を用いて首尾よく実施する。本発明の要素における標識
リガンドのコーティングはグラビア装置（日本のヤスイ
製）で調製した。乾燥条件は、第一乾燥セクションの
み、一般に約１２０°Ｆ（４９℃）とした。第二セクシ
ョンは使用しなかった。使用した典型的なグラビアシリ
ンダーは１インチ当たり２９５個のセル（１ｍ² 当たり
１．３４４×１０⁸ 個のセル）を含有した。セルの深さ
は１９μｍ、幅は７２μｍ、そしてセル間のランド幅は
１２μｍであった。このシリンダーは、塗布装置速度５
０ｆｔ／分（１５．２４ｍ／分）の直接グラビア法によ
り標識リガンドを含有する塗布組成物約４．３ｇ／ｍ²
をビーズ展開層へ送ることができる。塗布溶液約２．５
〜６．８ｇ／ｍ² を送ることができる別のグラビアシリ
ンダーもある。当業者であれば、どのグラビア塗布装置
にも容易に上記の手順を適合させることができる。標識
リガンドの塗布組成を以下に記載する。

【００４２】湿塗被量４．３ｇ／ｍ² を基準とした標識リガンド塗布組成 成分 乾燥塗被量ｇ／ｍ² ＭＯＰＳ緩衝剤 ０．００４５ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン） ０．０００２１５ ポリ（アクリルアミド） ０．００１０８ ４’−ヒドロキシアセトアニリド ０．０００３２５ ＊標識リガンド ０．００００１６ ＊標識リガンドは４〜６４μｇ／ｍ² の範囲内で塗布された

【００４３】分析要素の残りの層は、当該技術分野で周
知の塗布技法によって塗布することができる。しかしな
がら、各層は別々に塗布し、そして乾燥してから次の層
を適用する。

【００４４】以下の実施例で使用する分析要素を形成す
る層を以下の手順で調製した。各層を乾燥してからその
上に別の層をオーバーコートした。 １．下塗済のポリ（エチレンテレフタレート）支持体上
に架橋ゼラチン層を塗布する。この塗布組成物はゼラチ
ン、電子移動剤〔例えば、４’−ヒドロキシアセトアニ
リド（４’−ＨＡ）〕、緩衝剤、界面活性剤及びゼラチ
ン硬化剤を含有する。

【００４５】２．レセプターゾーンを塗布する。このゾ
ーンの塗布組成物は、（ａ）ポリマー中の０．１〜５μ
ｍのポリマービーズ表面に固定化された、アナライト
（リガンド）に対する抗体と（ｂ）本発明によって提供
されるロイコ色素塗布組成物とを含有する。必要に応じ
て、ロイコ色素を代わりにビーズ展開層に内蔵させるこ
ともできる。 ３．乾燥後のレセプターゾーンの上にビーズ展開層を塗
布する。この塗布組成物は、大きな（２０〜３５μｍ）
ポリマー粒子又はビーズ〔典型的には、ポリ（ビニルト
ルエン−コ−メタクリル酸）（重量比９８：２）ビー
ズ〕をラテックスポリマー接着剤、好ましくはポリ（メ
チルアクリレート−コ−２−アクリルアミド−２−メチ
ルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−２−アセトアセ
トキシエチルメタクリレート）（重量比９０：４：６）
で接着させたものを含む。この層はロイコ色素、電子移
動剤、ジメドン、緩衝剤、ウシ血清アルブミン及び界面
活性剤を含むことができる。

【００４６】４．ビーズ展開層の最上部に、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ（通常はアミン富化西洋ワサビペルオ
キシダーゼ）標識アナライト組成物をグラビア塗布す
る。この組成物は、必要に応じて、電子移動剤（４’−
ＨＡ）、緩衝剤（ＭＯＰＳ）、ウシ血清アルブミン及び
親水性ポリマーベヒクル（例、ポリアクリルアミド）を
含むことができる。

【００４７】レセプターゾーンには、グループ（１）、
（２）、（３）、（４）、（５）及び（６）に従うポリ
マーを塗布しなければならない。しかしながら、要素完
成品におけるゾーンは本質的にポリマーを含まない場合
もある。ビーズ展開層（ｂ）をレセプターゾーンコーテ
ィングの上に塗布した場合には、層（ｂ）の中にポリマ
ーの一部が移行する場合、まったく移行しない場合、ま
た本質的にすべてが移行する場合がある。

【００４８】レセプターゾーンには、下記のグループ
（１）、（２）、（３）、（４）、（５）及び（６）か
ら成る群より選ばれたポリマーを塗布しなければならな
い。 （１）重合したＮ−アルキル置換アクリルアミドモノマ
ー約３０〜９７重量％、架橋性モノマー１分子当たり付
加重合性基を２個以上有する重合した架橋性モノマー約
３〜２５重量％及び他の重合した親水性モノマー０〜６
０重量％を含む架橋したポリマー； （２）ポリ（ビニルアルコール）； （３）ウシ血清アルブミン； （４）アラビアゴム； （５）分子量８０００〜４００，０００のポリ−Ｎ−ビ
ニルピロリドンホモポリマー；並びに （６）アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−アルキ
ル置換アクリルアミド、Ｎ−アルキル置換メタクリルア
ミド、１−ビニルイミダゾール、２−アルキル置換−１
−ビニルイミダゾール、２−ヒドロキシアルキル置換−
１−ビニルイミダゾール、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒド
ロキシアルキルアクリレート、ヒドロキシアルキルメタ
クリレート、アクリル酸、スルホアルキルアクリレー
ト、スルファトアルキルアクリレート、スルホアルキル
メタクリレート、スルファトアルキルメタクリレート、
Ｎ−スルホアルキルアクリルアミド、Ｎ−スルファトア
ルキルアクリルアミド、Ｎ−スルホアルキルメタクリル
アミド、Ｎ−スルファトアルキルメタクリルアミド、エ
チレンスルホン酸及びスルホ置換スチレンから成る群よ
り選ばれた２種以上のモノマーを有する水溶性ビニル付
加コポリマー。グループ（６）には、スルファト部分及
びスルホ部分を含有するモノマーのアルカリ金属（ナト
リウム、リチウム及びカリウム）塩並びにアンモニウム
塩も含まれる。 グループ（１）〜（６）のモノマーに含まれるアルキル
基は、いずれも１〜６個の炭素原子を含むものである。

【００４９】レセプターゾーンには、グループ（１）、
（２）、（３）、（４）、（５）及び（６）に従うポリ
マーを塗布しなければならない。しかしながら、要素完
成品におけるゾーンは本質的にポリマーを含まない場合
もある。ビーズ展開層（ｂ）をレセプターゾーンコーテ
ィングの上に塗布した場合には、層（ｂ）の中にポリマ
ーの一部が移行する場合、まったく移行しない場合、ま
た本質的にすべてが移行する場合がある。

【００５０】グループ（１）とグループ（６）のポリマ
ーとして有用なＮ−アルキル置換アクリルアミドには、
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−ブチルアク
リルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド及びＮ−
ｎ−プロピルアクリルアミドが含まれる。これにはＮ−
イソプロピルアクリルアミドのようなＮ−アルキル置換
アクリルアミド重合体を約３０〜９７重量％含む架橋ポ
リマーが含まれる。実施例では、Ｎ−イソプロピルアク
リルアミド重合体を６０〜９７重量％含むポリマーを使
用してグループ（１）のポリマーの有用性を明らかにす
る。

【００５１】グループ（１）のポリマーはまた、１分子
当たり２個以上の付加重合性基を有する１種又は２種以
上の架橋性モノマー重合体を約３〜２５重量％含む。一
般に、これらの架橋性モノマーは当該技術分野では周知
である。好ましい架橋性モノマーは、Ｎ−アルキル置換
アクリルアミドとの重合を促進するためにアクリルアミ
ド基又はメタクリルアミド基を含有する。

【００５２】グループ（１）のポリマーに有用な架橋性
モノマーの例を以下に挙げる。Ｎ，Ｎ’−メチレンビス
アクリルアミド；Ｎ，Ｎ’−メチレンビスメタクリルア
ミド；エチレンジメタクリレート；２，２−ジメチル−
１，３−プロピレンジアクリレート；ジビニルベンゼ
ン；モノ〔２，３−ビス（メタクリロイルオキシ）プロ
ピル〕ホスフェート；Ｎ，Ｎ’−ビス（メタクリロイル
オキシ）ウレア；トリアリルシアヌレート；アリルアク
リレート；アリルメタクリレート；Ｎ−アリルメタクリ
ルアミド；４，４’−イソプロピリデンジフェニレンジ
アクリレート；１，３−ブチレンジアクリレート；１，
４−シクロヘキシレンジメチレンジメタクリレート；
２，２’−オキシジエチレンジメタクリレート；ジビニ
ルオキシメタン；エチレンジアクリレート；エチリデン
ジアクリレート；プロピリデンジメタクリレート；１，
６−ジアクリルアミドヘキサン；１，６−ヘキサメチレ
ンジアクリレート；１，６−ヘキサメチレンジメタクリ
レート；フェニルエチレンジメタクリレート；テトラメ
チレンジメタクリレート；２，２，２−トリクロロエチ
リデンジメタクリレート；エチレンビス（オキシエチレ
ン）ジアクリレート；エチレンビス（オキシエチレン）
ジメタクリレート；エチリジントリメタクリレート；プ
ロピリジントリアクリレート；ビニルアリルオキシアセ
テート；１−ビニルオキシ−２−アリルオキシエタン；
２−クロトノイルオキシエチルメタクリレート；ジアリ
ルフタレート；及び２−（５−フェニル−２，４−ペン
タジエノイルオキシ）エチルメタクリレート。

【００５３】グループ（１）のポリマーは、重合した親
水性モノマーを０〜６０重量％含むことができる。５〜
３５重量％の量もまた有用である。詳細には、このよう
なモノマーは、ヒドロキシ、ピロリドン、アミン、アミ
ド、カルボキシ、スルホ、カルボン酸塩、スルホン酸塩
及び硫酸塩から選ばれた１種又は２種以上の基を有す
る。一般に、これら塩基の対イオンはアルカリ金属又は
アンモニウムである。有用な親水性モノマーとして、ア
クリル酸及びメタクリル酸並びにその塩、２−アクリル
アミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム、２
−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチ
ルメタクリレート、２−ヒドロキシプロピルアクリレー
ト、２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、ｏ−及び
ｐ−スチレンスルホン酸、カリウム塩；ｐ−スチレンス
ルホン酸、カリウム塩；ｐ−スチレンスルホン酸、ナト
リウム塩；エチレンスルホン酸、ナトリウム塩；２−ス
ルホエチルメタクリレート、３−アクリロイルオキシプ
ロパン−１−スルホン酸、ナトリウム塩；２−スルホブ
チルメタクリレート、ナトリウム塩；４−スルホブチル
メタクリレート、ナトリウム塩；Ｎ−（２−メタクリロ
イルオキシ）エチルスルフェート並びにグリセリルメタ
クリレートが挙げられる。

【００５４】グループ（１）の代表的ポリマーとして、 １．ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−２−
アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリ
ウム−コ−Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）
（重量比８０：１０：１０）； ２．ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−メタ
クリル酸−コ−Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミ
ド）（重量比８０：１０：１０）； ３．ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−２−
ヒドロキシエチルメタクリレート−コ−Ｎ，Ｎ’−メチ
レンビスアクリルアミド）（重量比８５：５：１０）； ４．ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−２−
ヒドロキシエチルメタクリレート−コ−２−アクリルア
ミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−
Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）（重量比８
０：５：５：１０）； ５．ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−２−
ヒドロキシエチルメタクリレート−コ−２−アクリルア
ミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−
Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）（重量比８
３：５：２．５：９．５）； ６．ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−２−
ヒドロキシエチルメタクリレート−コ−２−アクリルア
ミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−
Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）（重量比８
４．５：５：０．５：１０）； ７．ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−２−
ヒドロキシエチルメタクリレート−コ−２−アクリルア
ミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−
Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）（重量比８
３：５：２：１０）； ８．ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−２−
ヒドロキシエチルメタクリレート−コ−２−アクリルア
ミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−
Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）（重量比８
０．９：４．８：４．８：９．５）。

【００５５】スルホン酸塩基を有するグループ（１）の
ポリマーの利点は、アッセイ要素に塗被される酵素及び
／又は抗体の活性を損なう恐れのある界面活性剤を存在
させずに調製することができる十分な親水性を有する点
である。界面活性剤を重合工程において使用する場合に
は、重合混合物中に最大約９％まで存在させることがで
きる。

【００５６】グループ（６）の水溶性ビニル付加コポリ
マーを形成する代表的モノマーは、２−アクリルアミド
−２−メチルプロパンスルホン酸、ナトリウム塩；ｏ−
及びｐ−スチレンスルホン酸、カリウム塩；ｐ−スチレ
ンスルホン酸、カリウム塩；ｐ−スチレンスルホン酸、
ナトリウム塩；エチレンスルホン酸、ナトリウム塩；２
−スルホエチルメタクリレート、ナトリウム塩；２−ス
ルホエチルメタクリレート；３−アクリロイルオキシプ
ロパン−１−スルホン酸、ナトリウム塩、３−メタクリ
ロイルオキシプロパン−１−スルホン酸、ナトリウム
塩；３−スルホブチルメタクリレート、ナトリウム塩；
４−スルホブチルメタクリレート、ナトリウム塩；Ｎ−
（２−スルホ−１，１−ジメチルエチル）アクリルアミ
ド、カリウム塩；並びに２−メタクリロイルオキシエチ
ル硫酸ナトリウムから成る群より選ばれる。ポリ（Ｎ−
イソプロピルアクリルアミド−コ−２−アクリルアミド
−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム）（重量比
８５：１５）が特に有用である。

【００５７】支持体は、適当な寸法安定性を示すもので
あればいずれのものであってもよいが、好ましくは波長
約２００〜約９００ｎｍの電磁輻射線を透過する透明
（すなわち輻射線透過性）且つ非孔質の材料である。特
定の要素に対する支持体の選定は、所期の検出様式（反
射、透過又は蛍光分光分析法）に適合すべきである。有
用な支持体として、ポリスチレン、ポリエステル〔例、
ポリ（エチレンテレフタレート）〕、ポリカーボネー
ト、セルロースエステル（例、酢酸セルロース）、等が
挙げられる。

【００５８】以下の実施例で使用する分析要素を形成す
る層を以下の手順で調製した。各層を乾燥してからその
上に別の層をオーバーコートした。 １．下塗済のポリ（エチレンテレフタレート）支持体上
に架橋ゼラチン層を塗布する。この塗布組成物はゼラチ
ン、電子移動剤〔例えば、４’−ヒドロキシアセトアニ
リド（４’−ＨＡ）〕、緩衝剤、界面活性剤及びゼラチ
ン硬化剤を含有する。

【００５９】２．レセプターゾーンを塗布する。このゾ
ーンの塗布組成物は、ポリマー中の０．１〜５μｍのポ
リマービーズ表面に固定化された、アナライト（リガン
ド）に対する抗体を含有する。場合によって、このゾー
ンは色素、緩衝剤及び界面活性剤を含む。 ３．乾燥後のレセプターゾーンの上にビーズ展開層を塗
布する。この塗布組成物は、大きな（２０〜３５μｍ）
ポリマー粒子又はビーズ〔典型的には、ポリ（ビニルト
ルエン−コ−メタクリル酸）（重量比９８：２）ビー
ズ〕をラテックスポリマー接着剤、好ましくはポリ（メ
チルアクリレート−コ−２−アクリルアミド−２−メチ
ルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−２−アセトアセ
トキシエチルメタクリレート）（重量比９０：４：６）
で接着させたものを含む。この層はロイコ色素、電子移
動剤、ジメドン、緩衝剤、ウシ血清アルブミン及び界面
活性剤を含むことができる。

【００６０】４．ビーズ展開層の最上部に、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ（通常はアミン富化西洋ワサビペルオ
キシダーゼ）標識アナライト組成物をグラビア塗布す
る。この組成物は、必要に応じて、電子移動剤（４’−
ＨＡ）、緩衝剤（ＭＯＰＳ）、ウシ血清アルブミン及び
親水性ポリマーベヒクル（例、ポリアクリルアミド）を
含むことができる。

【００６１】

【実施例】本発明の実施について以下の実施例で説明す
る。実施例１：ロイコ色素／酸化防止剤を含む安定な塗布組
成物の調製 第１部：粉砕媒体の予備状態調整 ４．０Ｌのガラス瓶に、平均直径１ｍｍの酸化ジルコニ
ウム粉砕球体（Ｚｉｒｃｏａ社より市販されているＺｉ
ｒｂｅａｄｓ ＸＲ）２２００ｃｃと１Ｎ硫酸１６００
ｃｃとを装填し、蓋をし、そして臨界速度の５０％で１
２時間回転させた。保持スクリーンを用いて酸性溶液と
粉砕ビーズとを分離し、そして振動させたスクリーン上
でビーズに水を連続噴霧して洗浄し、残留する酸及び寸
法不足の媒体フラグメントを除去した後、対流炉内で乾
燥して湿分を除去した。

【００６２】第２部：微粉砕すべきスラリーの調製 以下の組成の混合物を調製した。４，５−ビス（４−ジ
メチルアミノフェニル）−２−（３，５−ジメトキシ−
４−ヒドロキシフェニル）イミダゾールロイコ色素〔重
量４９．５０、湿（％）４．８、乾（％）６８〕；ジメ
ドン（５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオ
ン）酸化防止剤〔重量１２．３８、湿（％）１．２、乾
（％）１７〕；Ｔｅｔｒｏｎｉｃ ９０８（活性８３
％）〔重量８．９５、湿（％）０．７３、乾（％）１
０〕；Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ １０Ｇ（１０％水溶液）
〔重量３７．１２（乾燥３．７１２）、湿（％）０．０
０４、乾（％）５〕；水〔重量８８２．０５、湿（％）
残部〕。

【００６３】第３部：微粉砕工程 ２．５Ｌのガラス瓶に、第１部で調製した状態調整され
た乾燥ビーズ１３７５ｃｃと第２部で調製したスラリー
とを装填し、次いで窒素ガスでパージして容器をガスシ
ールし且つ色素の空気酸化を最小限に抑え、蓋をし、そ
して常用のローラーミルに配置した。ローラーの駆動速
度は、容器の臨界速度（常用のタコメーターで測定して
７０．４ｒｐｍ）の６０％の回転速度が得られるように
設定した。５日後、微粉砕を停止し、そして平均直径
０．２ｍｍの開口部を有するスクリーンを介して組成物
を注入することによって媒体を分離した。集めた安定な
色素／酸化防止剤の塗布組成物を保存のため窒素で再度
ガスシールしてから最終の塗布組成物を配合した。粒子
の主要部分は、Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅ
Ａｎａｌｙｚｅｒによる光散乱測定で約３００〜６０
０ｎｍの塗布組成物中の固体の粒径であった。

【００６４】実施例２ この実施例では、従来技術のロイコ色素塗布組成物と本
発明により調製した塗布組成物とを比較した。この比較
は、ジゴキシンのアッセイにおいて多層乾式イムノアッ
セイ要素を用いて行った。本発明により調製したロイコ
色素塗布組成物を、要素の展開層と架橋親水性層との界
面に配置したレセプターゾーンに含有させた。従来技術
の塗布組成物は、下記の対照要素の展開層中に内蔵させ
た。要素の図式を以下に示す。手順 ：２組の要素を製造した。第一は、ジメチルスルホ
キシドを用いた常用の手順によって展開層中にロイコ色
素を内蔵させた対照要素である。第二は、実施例１に記
載したように調製した色素塗布組成物を上記レセプター
ゾーン内にレセプターと共に塗布した要素である。塗布
組成物は微粉砕時には以下の濃度であった。 ロイコ色素（実施例１と同じ） ５％ ジメドン １．２５％ Ｔｅｔｒｏｎｉｃ ９０８（活性８３％） ０．５０％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ １０Ｇ ０．２５％

【００６５】得られた微粉砕色素塗布組成物を、レセプ
ター層の他の成分を含む水性塗布組成物に加えた。ビー
ズ展開層は別の新たなジメドンを含有した。色素（９．
７６％）及びジメドン（２．４４％）をジメチルスルホ
キシドに溶解し、その溶液を、別の新たなジメドンをさ
らに含むビーズ展開層の残りの成分を含む十分に攪拌さ
れている水性塗布組成物へ加えて、色素を析出させ水性
色素塗布組成物を形成させた。

【００６６】上記のＤＭＳＯ／色素／ジメドン溶液をレ
セプターゾーン内へ含有させようとすると、凝集した塗
布することのできないレセプター層塗布組成物になっ
た。この塗布組成物は対照の展開層中に含有させる他な
かった。対照用及び実験用の塗布組成物を、それぞれビ
ーズ展開層及び別のレセプター層として塗布し、試験要
素のその他必要な層はジゴキシン検定用に設計した。最
終要素の配置及び塗布組成は、図式１（対照）及び図式
２（実験）に示した通りである。これらの要素を切断し
て処理用のスライドマウントに取り付けた。

【００６７】製造した対照要素と本発明の要素の配置及
び成分濃度を以下の図式１と図式２に示す。図式１：対照（実施例２） 湿塗被量 乾塗被量層 (g/m²) 成分 (g/m²) 標識 4.3 DI水 リガンド ジゴキシン-HRP 0.000012 層 MOPS, pH 7.0 0.0045 ウシ血清アルブミン 0.000215 ポリアクリルアミド 0.00108 4'- ヒドロキシアセトアニリド 0.000325 マゼンタ色素 0.0269 ビーズ 270 DI水 展開層 TES, pH 7.0 0.219 ジメドン 0.50 トリアリールイミダゾールロイコ色素 0.2 ジメチルスルホキシド 1.8 4'- ヒドロキシアセトアニリド 0.45 ウシ血清アルブミン 1.0 マンニトール 1.0 グリセロール 2.0 接着性ポリマー 2.583 ポリマービーズ (30μｍ) 130 レセプター 45 DI水 ゾーン ポリマーバインダー 0.60 TES, pH 7.0 0.1 TX-100 0.02 抗体ポリマーＡ粒子(0.5μｍ) 0.015 ゼラチン 100 DI水 層 ゼラチン 10 TES, pH 7.0 4.58 4'- ヒドロキシアセトアニリド 0.30 TX-100 0.02 硬化剤 0.15 ポリ（エチレンテレフタレート）支持体

【００６８】図式２：本発明（実施例２）：レセプターに色素塗布組成物を含む 湿塗被量 乾塗被量層 (g/m²) 成分 (g/m²) 標識 4.3 DI水 リガンド ジゴキシン-HRP 0.000012 層 MOPS, pH 7.0 0.0045 ウシ血清アルブミン 0.000215 ポリアクリルアミド 0.00108 4'- ヒドロキシアセトアニリド 0.000325 マゼンタ色素 0.0269 ビーズ 270 DI水 展開層 TES, pH 7.0 0.219 ジメドン 0.45 4'- ヒドロキシアセトアニリド 0.45 ウシ血清アルブミン 1.0 マンニトール 1.0 グリセロール 2.0 接着性ポリマー 2.583 ポリマービーズ (30μｍ) 130 レセプター 45 DI水 ゾーン ポリマーバインダー 0.45 トリアリールイミダゾールロイコ色素 0.2 ジメドン 0.05 Tetronic 908 0.02 Surfactant 10G 0.01 TES, pH 7.0 0.1 TX-100 0.02 抗体ポリマーＡ粒子(0.5μｍ) 0.015 ゼラチン 100 DI水 層 ゼラチン 10 TES, pH 7.0 4.58 4'- ヒドロキシアセトアニリド 0.30 TX-100 0.02 硬化剤 0.15 ポリ（エチレンテレフタレート）支持体

【００６９】図式１及び図式２の要素並びに後記図式３
の要素における名称、略称は以下を表すものである。ＤＭＳＯ ：ジメチルスルホキシドＤＩ水 ：蒸留脱イオン水ジゴキシン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ） ：
ジゴキシンと西洋ワサビペルオキシダーゼの複合体ＭＯＰＳ ：３−モルフォリノプロパンスルホン酸緩衝剤ＴＥＳ ：Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−
２−アミノエタンスルホン酸緩衝剤ジメドン ：５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサン
ジオントリアリールイミダゾールロイコ色素 ：４，５−ビス
（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（３，５−ジメ
トキシ−４−ヒドロキシフェニル）イミダゾール青発色
性ロイコ色素Ｚｏｎｙｌ ＦＳＮ ：ＤｕＰｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕ
ｒｓ製の非イオン性フッ素化界面活性剤ポリマー接着剤 ：ポリ（メチルアクリレート−コ−２−
アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリ
ウム−コ−２−アセトアセトキシエチルメタクリレー
ト）ポリマービーズ ：ポリ（ｍ−、ｐ−ビニルトルエン−コ
−メタクリル酸）抗体ポリマーＡ粒子 ：抗体が共有結合されているポリ
〔スチレン−コ−ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメ
チル）スチレン〕ポリマー粒子抗体ポリマーＢ粒子 ：抗体が共有結合されているポリ
〔スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロ
パン酸〕ポリマー粒子硬化剤 ：ビス（ビニルスルホニルメチル）エーテルゼラ
チン硬化剤ＴＸ−１００ ：Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｒｏｈｍ
ａｎｄ Ｈａａｓ社製のオクチルフェノキシポリエトキ
シエタノール非イオン性界面活性剤Ｔｅｔｒｏｎｉｃ ９０８ ：ＢＡＳＦ社製のポリ〔ポリ
（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（プロピレンオ
キシド）〕ブロックコポリマーＳｕｒｆａｃｔａｎｔ １０Ｇ ：Ｏｌｉｎ Ｃｈｅｍ社
製の重合したグリシドール単位を約１０個有するイソノ
ニルフェノキシポリグリシドール界面活性剤マゼンタ色素 ：４，５−ジヒドロキシ−３−（６，８−
ジスルホ−２−ナフチルアゾ）−２，７−ナフタレンジ
スルホン酸、ナトリウム塩ポリマーバインダー ：ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリル
アミド−コ−メタクリル酸−コ−Ｎ，Ｎ’−メチレンビ
スアクリルアミド）（重量比８０／１０／１０）

【００７０】各要素に、ジゴキシンを含有しない血清又
は６ｎｇ／ｍＬ含有する血清を１１ｍＬスポット付着
し、その後３７℃で５分間インキュベートした。これら
の要素をインキュベーターから取り出し、そして下記組
成を有する洗浄流体１２μＬで洗浄した。 過酸化水素（ＨＲＰ） ０．０３％ ４’−ヒドロキシアセトアニリド（４’−ＨＡ） ５ｍＭ ジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ） １０μＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．８） ０．０１Ｍ 塩化ヘキサデシルピリジニウム ０．１％

【００７１】洗浄後、再び要素を３７℃のインキュベー
ターに入れ、そしてロイコ色素の酸化速度を反射率濃度
計によって６７０ｎｍで測定した。表１に記載した結果
は、感度の向上と不正確さの減少を示している。すなわ
ち、レートレンジとはジゴキシンを含まない場合と６ｎ
ｇ／ｍＬのジゴキシンを含む場合とにおける速度の差を
表し、このレンジが幅広いほど感度は高くなる。不正確
さは変動係数％として測定し、変動が少ないほど不正確
さも小さくなる。Ｎは反復回数である（レートレンジと
不正確さはこの反復回数の平均である）。

【００７２】表１ 色素組成物 レートレンジ（感度） 不正確さ（％ＣＶ） Ｎ 対照 0.0603 0.00162 10 本発明 0.0807 0.00128 10 変化率％ 34％増加 21％減少

【００７３】比較例３：ジゴキシンアッセイ要素におけ
る色素塗布組成物法の比較 実施例１と同様に別の色素塗布組成物を調製したが、但
し、本発明の界面活性剤の組合せ、すなわちＴｅｔｒｏ
ｎｉｃ ９０８とＳｕｒｆａｃｔａｎｔ １０Ｇの代わ
りに、ＤｕＰｏｎｔ Ｃｈｅｍ社製のアルキルナフタレ
ンスルホン酸ナトリウムアニオン界面活性剤Ａｌｋａｎ
ｏｌ ＸＣを０．９５２％使用した。塗布組成物を、実
施例２で対照を製造するのに使用した同じ技法により対
照用ジゴキシンアッセイ要素の展開層に含有させた。こ
のビーズ展開層はレセプター層でもあった。さらに、Ｄ
ＭＳＯ溶液を用いて実施例２に記載したものと同様の対
照要素も製造した。これら両方の配置と塗布組成を図式
３に記載する。これらのコーティングで製造した要素を
実施例２に記載したように製作して試験し、それらの結
果を表２に記載した。実施例２に記載したように、微粉
砕された塗布組成物から製造された本発明の試験要素
は、ＤＭＳＯ系塗布組成物から製造された要素よりも高
い感度及び低い不正確さを示したが、微粉砕された（本
発明の界面活性剤／安定化剤の組合せを含まない）塗布
組成物は、調製後すぐに塗被したが、不安定であり、そ
して約２４時間で沈降してしまった。これでは、生産規
模の製造には適したものとはならない。対照的に、実施
例２で調製された本発明の塗布組成物は２週間にわたり
安定であった。

【００７４】表２ 色素組成物 レートレンジ（感度） 不正確さ（％ＣＶ） Ｎ 対照 0.037 0.00127 10 本発明 0.045 0.000816 10 変化率％ 22％増加 36％減少

【００７５】図式３：実施例３の要素 乾塗被量 (g/m²) 湿塗被量 色素塗布組成物層 (g/m²) 成分 ＤＭＳＯ 本発明 標識 4.3 DI水 リガンド ジゴキシン-HRP 0.000012 0.000012 層 MOPS, pH 7.0 0.0045 0.0045 ウシ血清アルブミン 0.000215 0.000215 ポリアクリルアミド 0.00108 0.00108 4'- ヒドロキシ− アセトアニリド 0.000325 0.000325 ビーズ 270 DI水 展開層 TES, pH 7.0 0.219 0.219 ジメドン 0.5 0.5 トリアリールイミダ ゾールロイコ色素 0.2 0.2 Alkanol XC 0.0 0.038 ジメチルスルホキシド 1.8 0 4'- ヒドロキシ− アセトアニリド 0.15 0.15 Zonyl FSN 0.054 0.057 ポリマー接着剤 2.583 2.583 ポリマービーズ (30μｍ) 130 130 リン酸カリウム、pH 7.0 0.039 0.039 抗体ポリマーＢ粒子 0.010 0.010 ゼラチン 100 DI水 層 ゼラチン 10 10 TES, pH 7.0 4.58 4.58 4'- ヒドロキシ− アセトアニリド 0.30 0.15 TX-100 0.02 0.02 硬化剤 0.15 0.15 ポリ（エチレンテレフタレート）支持体

【００７６】本発明をその好ましい実施態様を特に参照
しながら詳細に説明してきたが、本発明の精神及び範囲
内での変更、改変が可能であることを理解されたい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リンダ エー．モーク アメリカ合衆国，ニューヨーク 14610, ロチェスター，クロイデン ロード 184

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）乾重量５５〜８０％のトリアリー
   ルイミダゾール系ロイコ色素、（ｂ）乾重量７〜４０％
   の酸化防止剤、（ｃ）乾重量６〜２０％のポリ〔ポリ
   （エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（プロピレンオ
   キシド）〕系非イオン性ブロックコポリマー及び（ｄ）
   乾重量１〜１６％のアルキルアリールオキシポリ（アル
   キレンオキシド）系非イオン性界面活性剤を含むロイコ
   色素塗布組成物を含有する層を少なくとも１層含むイム
   ノアッセイ要素。
2. 【請求項２】 順に（Ａ）標識されたリガンドを含有す
   る層、（Ｂ）ビーズ展開層、（Ｃ）架橋された親水性ポ
   リマー層及び（Ｄ）支持体を含む、リガンドを検定する
   ための乾式イムノアッセイ分析要素であって、 （１）前記（Ｂ）層と（Ｃ）層との界面における帯域
   （レセプターゾーン）に、前記標識されたリガンドに対
   する固定化レセプターが一定濃度で配置されており、 （２）前記レセプターは、前記（Ｂ）層におけるビーズ
   よりも小さな高分子ビーズに共有結合されることによっ
   て固定化されており、そして （３）前記帯域はさらに、（ａ）乾重量５５〜８０％の
   トリアリールイミダゾール系ロイコ色素、（ｂ）乾重量
   ７〜４０％の酸化防止剤、（ｃ）乾重量６〜２０％のポ
   リ〔ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（プロ
   ピレンオキシド）〕系非イオン性ブロックコポリマー及
   び（ｄ）乾重量１〜１６％のアルキルアリールオキシポ
   リ（アルキレンオキシド）系非イオン性界面活性剤を含
   むロイコ色素塗布組成物を含む乾式イムノアッセイ分析
   要素。
3. 【請求項３】 順に（Ａ）標識されたリガンドを含有す
   る層、（Ｂ）ビーズ展開層、（Ｃ）架橋された親水性ポ
   リマー層及び（Ｄ）支持体を含む、リガンドを検定する
   ための乾式イムノアッセイ分析要素であって、 前記ビーズ展開層が、 （１）粒径２０〜３５μｍのビーズを含有し、 （２）前記標識されたリガンドに対するレセプターを一
   定濃度で含有し、 （３）前記レセプターは、前記（１）におけるビーズよ
   りも小さな高分子ビーズに共有結合されることによって
   固定化されており、そして （４）（ａ）乾重量５５〜８０％のトリアリールイミダ
   ゾール系ロイコ色素、（ｂ）乾重量７〜４０％の酸化防
   止剤、（ｃ）乾重量６〜２０％のポリ〔ポリ（エチレン
   オキシド）−ブロック−ポリ（プロピレンオキシド）〕
   系非イオン性ブロックコポリマー及び（ｄ）乾重量１〜
   １６％のアルキルアリールオキシポリ（アルキレンオキ
   シド）系非イオン性界面活性剤を含むロイコ色素塗布組
   成物を含む乾式イムノアッセイ分析要素。
4. 【請求項４】 前記ロイコ色素が４，５−ビス（４−ジ
   メチルアミノフェニル）−２−（３，５−ジメトキシ−
   ４−ヒドロキシフェニル）イミダゾールである、請求項
   １〜３のいずれか一項に記載の要素。
5. 【請求項５】 ジメドン、ポリ〔ポリ（エチレンオキシ
   ド）−ブロック−ポリ（プロピレンオキシド）〕コポリ
   マー及び約１０個の重合グリシドール反復単位を有する
   イソノニルフェノキシポリ（グリシドール）を含む、請
   求項１〜３のいずれか一項に記載の要素。
6. 【請求項６】 ４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェ
   ニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフ
   ェニル）イミダゾール、ジメドン、ポリ〔ポリ（エチレ
   ンオキシド）−ブロック−ポリ（プロピレンオキシ
   ド）〕コポリマー及び約１０個の重合グリシドール反復
   単位を有するイソノニルフェノキシポリ（グリシドー
   ル）を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の要
   素。
7. 【請求項７】 水性液体試料中の免疫学的反応性リガン
   ドを検定する方法であって、 Ａ．標識されたリガンドが酵素標識リガンドである請求
   項１〜３のいずれか一項に記載のリガンドを検定するた
   めの乾式イムノアッセイ分析要素を提供する工程； Ｂ．前記酵素標識リガンドを含む層の有限領域に前記液
   体試料を接触させることにより（１）固定化されたリガ
   ンド−レセプター複合体及び（２）固定化された酵素標
   識リガンド−レセプター複合体の少なくとも一方を形成
   する工程； Ｃ．前記酵素標識リガンドを含む層の有限領域に前記リ
   ガンドに対する基質の溶液を接触させることにより発色
   を触媒する工程；並びに Ｄ．前記リガンドの濃度を比色測定する工程を含む検定
   方法。