FI113090B - Immunoanalyysielementtejä, joilla on stabiileja leukoväripäällysteitä - Google Patents

Description

113090

Immunoanalyysielementtejä, joilla on stabiileja leukoväri-päällysteitä

Keksinnön ala 5 Tämän keksinnön ala on kliininen kemia. Tarkemmin ottaen se koskee leukoväriaineella päällystettyjä im-muunimäärityselementtejä ja tapoja tällaisten elementtien käyttämiseksi.

Keksinnön tausta 10 Erilaisia kuiva-analyyttisiä määrityselementtejä on kaupan, esim. Kodakin Ektachem Clinical Chemistry -levyt, ja eräisiin tunnettuihin monikerroksisiin kuivaimmuunimää-rityselementteihin sisältyy leukoväriaineen käsittävä kerros. Määritettäessä analyysin kohteena oleva aine näyttees-15 ta hapettuu leukoväriaine värilliseksi vetyperoksidin ja peroksidaasiaktiivisuuden omaavan materiaalin läsnä ollessa. On tunnettua, että värin heijastustiheys on verrannollinen näytteestä määritettävän aineen konsentraatioon. Hei-jastustiheys voidaan mitata reflektometrillä. US-20 patenteista 4 670 385, 4 089 747, 5 024 935, 4 089 747 ja 4 258 001 löytyy tarkempia tietoja ja viitteitä muuhun ko. alaa kuvaavaan kirjallisuuteen.

*. , * Tähän tarkoitukseen tyypillisiä leukoväriaineita ·’ ovat voimakkaasti aromaattiset leukoväriaineet, joita ei ;* 25 voida liuottaa ja saostaa tai joilla ei voida päällystää • vesiliuoksena. Tällaisia leukoväriaineita ovat US-patentin « · . * 4 670 385 diaryyli- ja triaryylimetaanit ja US-patentin 4 089 747 ja US-patentin 5 024 935 diaryyli- ja triaryylii- ;· ·( midatsoliväriaineet. On päällystetty tällaisten väriainei- » · ! 30 den dispersioilla liuottamalla väriaine orgaaniseen liuot- t » 7 teeseen (metanoliin tai dimetyylisulfoksidiin) ja saosta- > j maila takaisin polymeerivesiliuoksessa väriaineen päällys- tyskoostumukseksi polymeeriliuoksessa, tai liuottamalla vä- , _ ; riaine "kytkentäaineliuotteeseen" (dietyylilauramidiin) ja > · 35 dispergoimalla kytkentäaineliuoteliuos uudelleen vesiliuok-“ seen.

2 113090

Toinen menetelmä tällaisten väriainepäällystyskoos-tumusten valmistamiseksi on väriaineen liuottaminen väriaineen hyvään liuotteeseen (dimetyylisulfoksidiin) ja väriaineen saostaminen takaisin vesipitoisessa päällystyskoostu-5 muksessa. Tämä edellyttää saostusprosessin hyvin huolellista säätöä väriaineen hiukkaskoon optimoimiseksi päällystys-koostumuksessa. Tämä on hankala suorittaa, koska prosessi on herkkä sekoitusnopeudelle ja väriaineliuoksen lisäysno-peudelle ja syntyykin suuria hiukkasia ja joudutaan käyttä-10 mään tarpeettoman paljon väriainetta asianmukaisen värin kehittämiseksi määrityksen aikana. Prosessin toistettavuus ei lisäksi ole ennakoitavissa, koska väriaine pyrkii yllä kuvattujen seikkojen lisäksi koaguloitumaan ja päällystys-koostumuksen varastointiaika on rajallinen. On myös eduksi 15 välttää DMSO:n käyttöä.

On olemassa suuri tarve saada käyttöön immuunimää-rityselementtejä, jotka käsittävät stabiileja leukovä-riainepäällystyskoostumuksia, joilla voidaan välttää orgaanisten liuotteiden käyttö, jotka mahdollistavat jopa 20 puolta pienemmän väriainemäärän käytön, jotka ovat toistettavissa ja jotka eivät vaadi tiukkoja prosessinsäätöoperaa-*-.· tioita.

Keksinnön yhteenveto * * · Käsiteltävänä oleva keksintö tarjoaa immuunimääri-• 25 tyselementin, joka käsittää vähintään yhden kerroksen, joka ; sisältää leukoväriainepäällystyskoostumusta, joka käsittää ! · *

Komponentti_Kuivapainosuhde (alue) a) Triaryyli-imidatsolileuko- ; 30 väriaine 55 - 80 b) Hapettumisen estoaine 7-40 ·· c) Poly [poly (eteenioksidi) blokki- poly(propeenioksidi) ] - ioniton blokki- ’ ; kopolymeeri 6 20 * · 35 d) Alkyyliaryylioksipoly (aikeeni- oksidi)- ioniton pinta-aktiivinen aine 1-16 3

11309C

Käsiteltävänä oleva keksintö tarjoaa myös menetelmän immunologisesti reaktiokykyisen ligandin määrittämiseksi vesipitoisesta nestenäytteestä.

Menetelmä käsittää vaiheet, joissa 5 A. otetaan patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen kuivaimmuunimääritysanalyysielementti, jossa merkitty li-gandi on entsyymillä merkitty, B. saatetaan rajallinen alue kerroksesta, joka käsittää entsyymillä merkityn ligandin, kosketukseen neste- 10 mäisestä näytteestä otetun näytteen kanssa siten, että muodostuu joko (i) immobilisoitu ligandi/reseptori-kompleksi tai (ii) immobilisoitu, entsyymillä merkitty li-gandi/reseptorikompleksi, C. saatetaan rajallinen alue kerroksesta, joka kä-15 sittää entsyymillä merkityn ligandin, kosketukseen sub- straattiliuoksen kanssa värin kehittymisen katalysoimisek-si, ja D. määritetään ligandin konsentraatio kolorimetri- sesti.

20 Keksinnön yksityiskohtia Tämän keksinnön menetelmän avulla voidaan valmisti. taa triaryyli-imidatsolileukoväriaineista stabiileja, V · toistettavissa olevia päällystyskoostumuksia. Menetelmä ei ' : edellytä väriaineen liuottamista orgaanisiin liuotteisiin.

·,· 25 Menetelmä toteutetaan (1) kahden ionittoman pinta- • ; ; aktiivisen aineen yhdistelmän, joista toinen on alkeeniok-

< < * I

sidiblokkikopolymeeri, (2) väriainetta suojaavan hapettu misen estoaineen ja (3) sopivan jauhatusväliaineen läsnä ollessa.

! 30 Uusi menetelmä käsittää tarkemmin ottaen vaiheet, joissa » j 1. sekoitetaan seos, jossa on I · »

11309C

4

Komponentti Likimääräinen Alue (%) edullinen määrä (%) Härkä Kuiva Härkä Kuiva 5 a) Triaryyli-imidatsolileukoväri- 5 66,4 4-6 55-80 ainetta b) Hapettumisen estoainetta 1,25 16,7 1-1,5 6-20 (edullisesti dimedoni) c) Poly[poly(eteenioksidi)blokki- 0,90 12,0 0,7 - 1,1 6-20 10 polypropeenioksidi] -ioniton blokkikokopolymeeristä muodostuvaa pinta-aktiivista ainetta d) Alkyyliaryylioksipolyalkeeni- 0,37 4,9 0,3 - 0,45 1 - 16 oksidista muodostuvaa ionittuma- 15 tonta pinta-aktiivista ainetta e) Vettä 92,47 - loput 2. Jauhetaan vesiliete, joka on valmistettu vaiheen 1 seoksesta ja jauhatusväliaineesta, käyttäen tavan-20 omaista jauhatuslaitetta ja jauhatusmenetelmiä, kuten kuu-lamyllyjauhatusta, jauhatusta väliaineessa, kiekkomylly-• * jauhatusta tai tärymyllyjauhatusta. Jauhettavan seoksen ja v/ jauhavan väliaineen tilavuus/tilavuussuhde on alueella : : noin 3:1 - 1:3, edullisesti lähellä suhdetta 1:1. Jauha- 25 tusväliaineen keskimääräinen läpimitta on alle noin 4 mm, ; edullisesti noin 0,3 - 2,0 mm. Jauhatusta jatketaan, kun- , nes leukoväriaineen keskimääräinen hiukkaskoko on pienen tynyt arvoon noin 0,01 - 4,0 μτη, edullisemmin noin 0,01 - 2,0 Mm ja edullisimmin noin 0,05 - 0,5 μπι.

30 Pienienergisissä jauhatusmenetelmissä, kuten kuu- ;·* lamyllyjauhatuksessa ja tärymyllyj auhatuksessa, jauhatus- : aika voi olla 1-20 vrk, mutta aika lyhenee käytettäessä • · enemmän energiaa tuottavaa jauhatusta väliaineessa ja ‘ . kiekkomyllyjauhatusta. Niillä voidaan saavuttaa sama koon 35 pieneneminen kuin kuulamyllyllä 1-20 vuorokaudessa jo ·* ajassa muutamasta minuutista useisiin tunteihin.

, 11309C

5 3. Erotetaan jauhatusväliaine muodostuneesta vä-riainepäällystyskoostumuksesta, edullisesti seulomalla seulan läpi, jonka silmäkoko on noin 0,1 - 0,2 mm.

Yllä kuvatulla menetelmällä saadaan uusia kuiva-5 päällystyskoostumuksia, jotka ovat käyttökelpoisia kuivina analyysimonikerroselementteinä. Päällystyskoostumukset käsittävät

Komponentti_Kuivapainosuh.de (alue) 10 a) Triaryyli-imidatsolileuko- väriaine 55 - 80 b) Hapettumisen estoaine 7-40 c) Poly[poly(eteenioksidi)blokki -poly(propeenioksidi)]- ioniton blokki - 15 kopolymeeri 6-20 d) Alkyyliaryylioksipoly(alkeeni- oksidi)- ioniton pinta-aktiivinen aine 1-16 Tässä taulukossa esitetyt suhteet pätevät vain taulukon komponentteihin. Nämä päällystyskoostumukset voi-20 vat myös käsittää kuljettimen, kuten gelatiinin, ja kove-tusaineen ja valinnaisesti muita tavanomaisia lisäaineita, ,· kuten puskuria ja muita pinta-aktiivisia aineita.

·, Jauhatusprosessi on vedessä suoritettava hienon- : : nusprosessi, jossa käytetään kahden ionittoman pinta- ;· 25 aktiivisen aineen yhdistelmää stabiloimaan muodostunut ve- • sipitoinen päällystyskoostumus. Käytetyt pinta-aktiivinen aine/stabiloint iainekomponentit ylläpitävät päällystys-koostumuksen stabiiliuden siten, että sekä väriaineen että .. . hapettumisen estoaineen laskeutuminen ja flokkuloituminen 1 ; 30 estyvät ja jokainen dispergoitunut komponentti voi esiin- ’ * tyä erillisinä hiukkasina päällystyskoostumuksessa aggre- : . j goitumatta tai f lokkuloitumatta.

, j Toinen pinta-aktiivisista aineista on ioniton , ’ . blokkikopolymeeri, joka käsittää kahdesta erilaisesta po- 35 lyalkeenioksidista muodostuvia blokkeja, edullisesti suo- > · raketjuisesta polyalkeenioksidista, kuten polyeteenioksi-

11309C

6 dista, muodostuvia blokkeja ja haaraketjuisesta polyal-keenioksidista, kuten polypropeenioksidista, muodostuvia blokkeja, ja edullisimmin se on poly[polyeteenioksi-diblokkipoly(propeenioksidi)]kopolymeeri. Tämä pinta-5 aktiivinen aine on välttämätön leukoväriaineen stabiloimi-seksi kolloidisesti sekä jauhatusprosessin aikana että päällystyskoostumuksessa. Tällaiset polymeerit ovat saatavissa esim. yhtymästä BASF kauppanimillä sekä Pluronic että Tetronic, yhtymästä Rhone-Poulenc kauppanimellä Anta-10 rox, yhtymästä Witco Corp. kauppanimellä Arnox BF-Series, yhtymästä PPG Industries kauppanimellä Macol, yhtymästä Olin Corp. kauppanimellä Poly-Tergent ja muista yhtymistä. Edullinen blokkikopolymeeri on Tetronic 908, joka on poly [poly(eteenioksidiblokkipoly(propeenioksidi)]kopolymeeri 15 ja jota myy BASF.

Toinen pinta-aktiivinen aine on ioniton alkyy-liaryylioksipolyalkeenioksidi, jonka jokaisessa alkyyli-ryhmässä on noin 6-16 hiiliatomia (oktyyli, iso-oktyyli, nonyyli tai isononyyli); aryyliryhmä on edullisesti fenyy-20 li tai alkyylisubstituoitu fenyyli, jossa on yksi tai kaksi alkyylilisäsubstituenttia. Tämä pinta-aktiivinen aine on välttämätön hapettumisen estoaineen stabiloimiseksi : : : kolloidisesti jauhatuskoostumuksessa ja päällystyskoostu- muksessa. Ko. alkyyliryhmissä on 1 - 16 hiiliatomia. Al-!. 25 keenioksidipolymeerin alkeeniosa on suora tai haarautunut, » > i * : 2-4 hiiliatomia sisältävä alkeeniryhmä. Aikeeni voi olla t » i substituoitu hydroksyyliryhmillä ja polymeroituj en ai- * * · keenioksidiryhmien lukumäärä per molekyyli on noin 5-30, . edullisesti 5 - 15 ja edullisimmin noin 10. Edullinen pin- • > · ' 30 ta-aktiivinen aine on isononyylifenoksipolyglysidoli, jos sa on noin 10 toistuvaa polymeroitua glysidoliyksikköä ja ; jota myy Olin Chem Co. kauppanimellä Surfactant 10G. Muita ·,·; sopivia materiaaleja myyvät Union Carbide kauppanimellä , * . Triton, Witco Corp. kauppanimillä Arnul ja Desonic, Texaco

* * I

35 Chem Co. kauppanimellä Surfonic, ja muut.

11309C

7 Tämän keksinnön mukaisissa väriainepäällystyskoos-tumuksissa on hapettumisen estoainetta estämään väriaineen hapettuminen (haitallinen värinmuodostus) jauhatusproses-sin aikana ja sen jälkeen ja myös valmiiden analyysiele-5 menttien varastoinnin aikana. Edullinen hapettumisen esto-aine on dimedoni. Muita sopivia hapettumisen estoaineita ovat 41-hydroksiasetanilidi ja sen johdannaiset, joissa on elektroneja poistavia ryhmiä 3'-, 5'- tai molemmissa asemissa, sen naftaleenianalogit, hydrokinonit ja amino-10 fenolit.

Hienontamisessa käytetään jauhatusväliainetta tavanomaisessa jauhatusprosessissa esimerkkeinä kuulamylly-jauhatus, jauhatus väliaineessa, kiekkomyllyjauhatus ja tärymyllyjauhatus. Jauhatusväliaine muodostuu yleensä pal-15 lomaisista hiukkasista, joiden keskimääräinen läpimitta on alle noin 4 mm ja edullisesti välillä noin 0,3 mm tai suurempi ja noin 2,0 mm. Sopivia jauhatusväliaineita ovat la-sihiukkaset, keraamiset hiukkaset (esim. titaanidioksidi-, zirkoniumoksidi- ja alumiinioksidihiukkaset), muovihiukka-20 set, metallihiukkaset (esim. teräs-, piinitridi- ja vol-framikarbidihiukkaset), hiekkahiukkaset ja muut tekniikan tasolla tunnetut hiukkaset. Lasi- ja keraamiset helmet ; ovat edullisia. Zirkoniumoksidi on käyttökelpoinen.

Kuulamyllyjauhatus suoritetaan siten, että lie- .j. 25 riömäiseen astiaan lisätään niin paljon jauhatusväliainet- • » ♦ · : ,·, ta, että helmet täyttävät noin puolet astian tilavuudesta.

• » · [··[ Astiaan lisätään niin paljon kuivaseoksesta valmistettua i t * lietettä, että 25 - 100 % lietteen tilavuudesta täyttää , edullisesti väliaineen ontelot ja noin 25 % on jauhatusvä- • ·’ 30 liaineen päällä "supernatanttina". Astia suljetaan ja sitä • · pyöritetään konsentrisesti akselinsa ympäri nopeudella, joka on noin 10 - 90 % "kriittisestä nopeudesta". Satapro- • · >;··· senttinen kriittinen nopeus on pyöritysnopeus, jolla jau- ,· , hatusväliaine sinkoutuu keskipakovoiman vaikutuksesta as- i · i *· '· 3 5 tian seinämään eikä pysty enää syöksähtelemään vapaasti * · '*··* astian pyöriessä. Pyörimisnopeudella noin 40 - 70 % kriit- 8 1 13090 tisestä nopeudesta aikaansaadaan yleensä maksimijauhatus-teho ja se on siten edullinen.

Jauhatus lopetetaan, kun haluttu hiukkaskoko on saavutettu. Hiukkaskoko määritetään poistamalla näyte, 5 erottamalla väriainepäällystyskoostumus jauhatusväliai-neesta ja mittaamalla leukoväriaineen keskimääräinen hiukkaskoko tavanomaisilla koonmääritysmenetelmillä, kuten va-lonsirontamittauksella tai kiekkosentrifugoinnilla.

Jauhatusväliaine erotetaan väriainepäällystyskoos-10 tumuksesta tavanomaisilla seulontamenetelmillä, joissa jauhatushelmet pidättyvät ja voidaan ottaa talteen väriaineesta ja hapettumisen estoaineesta muodostuva väriainepäällystyskoostumus .

Kuten yllä mainittiin ovat päällystyskoostumukset 15 käyttökelpoisia kuivissa analyysimonikerroselementeissä, erityisesti immuunimäärityselementeissä. Elementit voivat muodostua yhdestä tai monesta kerroksesta tai kerrosten yhdistelmästä, jonka kerroksissa on vyöhykkeitä. Elementit voivat yleisesti ottaen käsittää säteilyä läpäisevän alus-20 tan, yhden tai useamman reagenssikerroksen, erityisen le-vityskerroksen ja joissakin suoritustavoissa reseptoriker-roksen reagenssikerroksen (-kerrosten) ja levityskerrosten : : : välissä. Reseptorikerros tai levityskerros sisältää resep- torihelmiä, joiden pinnalle vasta-aineet immobilisoidaan.

* t * .;· 25 Kerrokset voidaan päällystää käyttäen tekniikan • M t : ,·. tasolla hyvin tunnettuja päällystystekniikkoja. Esim. US- * * · patentissa 2 761 417 selitetyn tyyppiset luistiekst- i » · ruusiosyöttösuppilot ovat usein edullisia päällystettäessä ,, . samanaikaisesti useita kerroksia, joista ainakin yksi kä- ' 30 sittää polymeerihiukkasia, joiden pinnalla on immobilisoi- tuja vasta-ainehelmiä. Monikerroselementti voidaan tarkem-min ottaen päällystää syöttämällä helmiä sisältävä pääl- ..j lystyskoostumus luistiekstruusiosyöttösuppilon ekst- ’ , ruusioraon kautta ja antamalla samanaikaisesti toisen » i » * · 35 päällystyskoostumuksen kerroksen, joka haluttaessa voi • »

11309C

9 myös sisältää helmiä, virrata luistiekstruusiosyöttösuppi-lon luistipintaa pitkin.

Hiukkasjakoinen kerros, johon vasta-aineet on im-mobilisoitu, on huokoinen. Tällaisissa kerroksissa käytet-5 tävät materiaalit tunnetaan hyvin kuivien analyysielement-tien valmistuksen alalla. Edullinen hiukkasjakoinen kerros on helmilevityskerros (BSL) . Tällainen kerros on helposti konstruoitavissa siten, että se on sopivan huokoinen käytettäväksi käsiteltävänä olevan keksinnön elementeissä 10 vastaanottamaan testinäyte (esim. 1 - 100 mL) , joka voi olla laimennettu tai laimentamaton. Levityskerros on edullisesti isotrooppisesti huokoinen ja tämä ominaisuus aikaansaadaan vyöhykkeen muodostavien hiukkasten toisiinsa liittyvillä välitiloilla. Sanonnalla isotrooppisesti huo-15 koinen tarkoitetaan sitä, että levityskerros levittää lisätyn nesteen tasaisesti säteissuuntaisesti koko kerrokseen.

Käyttökelpoisia hiukkasjakoisia levityskerroksia mukaan lukien helmilevityskerrokset on julkistettu US-20 patenteissa 4 670 381, 4 258 001 ja 4 430 436.

Elementin hiukkasjakoinen kerros asetetaan sopi-: valle alustalle. Tällaisena alustana voi olla mikä tahansa 4 I t :V: sopiva mittapysyvä ja edullisesti huokoseton ja läpinäkyvä t i h"; (eli säteilyä läpäisevä) materiaali, joka läpäisee sähkö- • · * 25 magneettista säteilyä, jonka aallonpituus on välillä noin ; ,·, 200 ja noin 900 nm. Määrättyä elementtiä varten valittavan alustan on sovittava yhteen aiotun määritystavan kanssa t · i ‘ (heijastus-, transmissio- tai fluoresenssispektroskopia).

Käyttökelpoisia alustamateriaaleja ovat polystyreeni, po-: ·’ 30 lyesterit (esim. polyeteenitereftalaatti), polykarbonaa- ' tit, selluloosaesterit (esim. selluloosa-asetaatti) jne.

' .j Elementti voi myös käsittää yhden tai useamman li- säkerroksen, esim. erillisen tai yhdistetyn reagens- • t si/levityskerroksen ja gelatiini/puskurikerroksen, jotka » t *- '· 35 sisältävät muita välttämättömiä lisäaineita, kytkentäent- ·...* syymejä jne.

10 113090

Elementtiin kuuluva gelatiini/puskurikerros tai reagenssikerros tai levityskerros voi sisältää indikaatto-rikoostumuksen, joka koostuu yhdestä tai useammasta rea-genssista dispergoituna yhteen tai useampaan synteettiseen 5 tai luonnonsideainemateriaaliin kuten gelatiiniin tai muihin luonnossa esiintyviin kolloideihin, homopolymeereihin tai kopolymeereihin kuten polyakryyliamidiin, polyvinyyli-pyrrolidoniin, poly-N-isopropyyliakryyliamidiin, polyak-ryyliamidiko-N-vinyyli-2-pyrrolidoniin ja vastaaviin kopo-10 lymeereihin.

Haluttaessa voidaan lisätä muita valinnaisia kerroksia, kuten pinnoituskerroksia, säteilyn estokerroksia jne. Elementin kaikki kerrokset ovat nestekosketuksessa toisiinsa ja tämä merkitsee sitä, että nesteet ja nesteen 15 sisältämät reagenssit ja kompleksoimattomat reaktiotuot teet voivat kulkea viereisten kerrosten päällekkäin olevien alueiden välillä.

Elementtien kerrokset voivat sisältää erilaisia muita toivottavia, mutta valinnaisia komponentteja, mm. 20 pinta-aktiivisia aineita, sakeuttamisaineita, puskureita, kovetteita, hapettumisen estoaineita, kytkentäliuotteita lii ja muita tekniikan tasolla tunnettuja materiaaleja. Näiden komponenttien määrätkin ovat ammattimiehelle tuttuja.

« *

Elementtejä voidaan käyttää immunologisesti reak- < * * 25 tiokykyisten ligandien pienien konsentraatioiden määrittä-: ι·ι miseksi nesteestä, kuten biologisesta nesteestä (esim. ko- koverestä, seerumista, plasmasta, virtsasta, selkäydinnes- > « t ’ teestä, ihmis- tai eläinkudossuspensioista, ulosteista, syljestä, imukudosnesteestä ja vastaavista). Ligandit voi- 30 daan määrittää konsentraatioina, jotka ovat niinkin pieniä ,* kuin noin 10'11 moolia ja yleisesti konsentraationa noin ! 10~10 - noin 10"4 moolia.

.Ligandeja, jotka ovat määritettävissä joko kvanti-• _ tatiivisesti tai kvalitatiivisesti, ovat lääkeaineet * 35 (esim. fenobarbitaali, digoksiini, digitoksiini, teofyl- *. .* liini, gentamisiini, kinidiini, fenytoiini, propranololi,

u 11309C

karbamatsepiini, tobramysiini, lidokaiini, prokaiiniamidi ja vastaavat), luonnon- tai synteettiset steroidit (esim. kortisoli, aldosteroni, testosteroni, progesteroni, es-trioli jne.), hormonit (esim. tyroidihormonit, peptidihor-5 monit, insuliini jne.), proteiinit (esim. albumiini, IgG, IgM, ferritiini, veren hyytymistekijät, C-reaktiivinen proteiini, isoentsyymit, apolipoproteiinit jne.), antigeenit, vasta-aineet mukaan lukien monoklooniset vasta-aineet ja muut lajikkeet, jotka reagoivat luonnossa reseptorin 10 kanssa. Käsiteltävänä oleva keksintö on erityisen käyttö kelpoinen lääkeaineiden, kuten digoksiinin, fenytoiinin, teofylliinin tai fenobarbitaalin, ja hormonien, kuten ty-rokeiinin tai trijodityroniin määrittämiseksi.

Määritys voi olla kilpaileva tai kerrosmääritys. 15 Määrityksessä voidaan käyttää mitä tahansa sopivaa merkkiainetta, joka voidaan kiinnittää analyytin johdannaisiin ja vasta-aineisiin (käytettäessä kerrosmääritystä). Käyttökelpoisia merkkiaineita ovat radioaktiiviset leimat, väriaineet, fluoresoivat aineet, entsyymit, entsyymisubst-20 raatit, entsyymi-inhibiittorit, allosteeriset effektorit, kofaktorit ja muut tunnetut entsyymin muuntoaineet. Edul-* lisiä merkkiaineita ovat entsyymit kuten glukoosioksidaa- >/> · si, peroksidaasit, kuten piparjuuriperoksidaasi ja amii- : ' : nilla rikastettu piparjuuriperoksidaasi, alkalinen fosfa- •h 25 taasi ja galaktosidaasi.

♦ » » t : . \ Käytettäessä entsyymimerkkiainetta on entsyymin substraatti valmiina elementissä tai lisätään siihen kehi-tysliuoksen mukana. Substraatti voidaan lisätä elementtiin . ennen nestemäistä näytettä tai samanaikaisesti sen kanssa ’ ; 30 tai sitomisreaktion jälkeen. Kliinisen kemian ammattimies pystyy määrittelemään sopivan substraatin määrättyä merk-: kiainetta varten. Substraattina voi olla materiaali, johon ; entsyymimerkkiaine vaikuttaa suoraan, tai joka osallistuu . sarjaan reaktioita, joissa merkkiaine reagoi entsymaatti- 35 sesti. Jos entsyymimerkkiaine on esim. peroksidaasi, sub- ’ ·’ straattina on vetyperoksidi. Käytettäessä esim. glukoosi-

11309C

12 oksidaasia substraattiglukoosi on yleensä reagenssikerrok-sessa tai se lisätään kehitysliuoksen mukana siten, että konsentraatioksi tulee noin 0,01 moolia/m2 ja edullisesti noin 0,001 - noin 0,1 moolia/m2. Ammattimies pystyy säätä-5 mään valitun substraatin määrä määrityksessä käytetyn ent-syymimerkkiaineen määrän mukaan.

Indikaattorikoostumus käsittää tämän keksinnön mukaisen leukoväriainepäällystyskoostumuksen. Koostumus käsittää siten leukoväriaineen ja peroksidaasin tai muun so-10 pivan peroksidatiivisen yhdisteen, joka synnyttää todettavissa olevan värin muodostuneen vetyperoksidin vaikutuksesta, joka muodostuu esim. glukoosioksidaasin muuttaessa glukoosin glukonihapoksi. Mainittu yhdiste sisältyy koostumukseen tai lisätään siihen määrityksen aikana.

15 Immuunimääritys voi tapahtua käsin tai automaatti sesti. Ligandin määrä nesteessä määritetään yleensä siten, että elementti otetaan rullapakkauksesta, palapakkauksesta tai muusta lähteestä ja saatetaan levityskerroksen rajallinen alue fyysisesti kosketukseen nesteestä otetun näyt-20 teen, esim. 1 - 100 ml:n kanssa. Rajallinen kosketusalue on yleensä enintään noin 150 mm2.

' * Ligandin määrä määritetään syöttämällä elementti sopivan laitteen läpi, jolla voidaan suoraan todeta komp-: leksoitu ligandianalogi tai todettavissa olevat lajikkeet, :* 25 jotka muodostuvat entsyymimerkkiaineen reagoidessa entsy- • maattisesti substraatin kanssa. Lajikkeet voidaan esim.

• · . . todeta käyttäen sopivaa spektrofotometriä ja yleisesti tunnettuja menetelmiä. Entsymaattisessa reaktiossa muodos- . >t tunut tuote määritetään mittaamalla esim. heijastus- tai ! 30 transmissiotiheyden muutosnopeus rajallisella alueella, joka oli kosketuksessa testinäytteen kanssa. Mitattava / I alue on yleensä noin 5 - noin 25 mm2. Ligandin määrä li- • gandinäytteessä on kääntäen verrannollinen rajalliselta . alueelta mitatun merkkiaineen määrään. Merkkiaine mitataan 35 yleensä substraattiliuoksen käytön jälkeen.

i > · »

11309C

13

Erityisen käyttökelpoisia immuunimäärityselement-tejä on julkistettu Suttonin ja muiden 16. kesäkuuta 1994 jättämässä US-patenttihakemuksessa 08/260 939. Tämä patenttihakemus on nimenomaan liitetty käsiteltävänä olevaan 5 patenttihakemukseen viitteenä. Edellä mainitussa patenttihakemuksessa julkistetaan kuiva immuunimääritysanalyy-sielementti ligandin määrittämiseksi, joka käsittää seu-raavassa järjestyksessä (a) merkityn ligandin sisältävän kerroksen, (b) helmilevityskerroksen, (c) silloitetun, 10 hydrofiilisen polymeerikerroksen ja (d) kantajan, joilloin menetelmälle on tunnusomaista, että (i) merkityn ligandin immobilisoitu reseptori, jonka konsentraatio on vakio, on vyöhykkeessä (reseptori-vyöhykkeessä) kerrosten (b) ja (c) rajapinnassa, 15 (ii) reseptorit immobilisoidaan sitomalla ne kova- lenttisesti polymeerihelmiin, jotka ovat pienempiä kuin helmet kerroksessa (b).

Käsiteltävänä olevan keksinnön mukainen kuiva leu-koväripäällystyskoostumus on erityisen käyttökelpoinen li-20 sättynä keksinnön mukaiseen reseptorivyöhykkeeseen tai le-vityskerrokseen.

V : Merkitty ligandi on rasteritelapäällystetty '·' ' 1) merkityn ligandin päällystyskoostumuksen märkäpäällys- : : tymisen minimoimiseksi siten, että merkityn ligandin ja :· 25 reseptorin liian varhainen kosketus estyy ja kosteus säi- : lyy samalla riittävänä peittämään merkitty ligandi tasai- » . sesti, ja 2) nopean kuivumisen saavuttamiseksi siten, että > » ♦ a) päällystysliuote poistuu olennaisesti täysin, b) haitallinen vaikutus levityskerroksen huokoisuuteen ja 30 levitysaikaan estyy ja c) entsyymin aktiivisuus säilyy riittävänä.

. Myös vasta-aineen ja merkityn ligandin keskinäinen V'· suhteellinen affiniteetti on tärkeä tekijä liian varhaisen / . sitoutumisen minimoimiseksi. Ammattimiehen tuntemalla ta- 35 valla tätä tekijää voidaan säädellä merkityn ligandin ra- 113090 14 kenteen käsittelyllä ja vasta-aineen harkitulla valinnalla .

Elementissä tarvittavan päällystetyn, merkityn li-gandin päällystemäärän pitoisuus määritetään yleensä em-5 piirisesti jokaista määrättyä immuunimääritystä varten seuraavan menettelyn avulla: 1. Määritetään merkityn ligandin konsentraatio, joka on tarpeen hyväksyttävän immuunimäärityssuorituskyvyn aikaansaamiseksi toteutettaessa immuunimääritys siten, et- 10 tä analyysielementti saatetaan kosketukseen merkityn ligandin ja samanaikaisesti näytteen kanssa. Määrityssuori-tuskyky on hyväksyttävä, kun (a) määritys voidaan suorittaa alle 20 minuutissa, (b) määrityksen dynaaminen alue on sellainen, että ligandin määritettävissä oleva minimi- ja 15 maksimikonsentraatio kattaa kliinisesti käyttökelpoisen konsentraatioalueen ja (c) kliinisesti merkitsevät ligan-dikonsentraatiot voidaan havaita koko dynaamisella alueella .

2. Määritetään empiirisesti päällystetyn, merkityn 20 ligandin päällystemäärän pitoisuus, joka on tarpeen samalla analyysielementillä yllä määritellyn hyväksyttävän mää- , rityssuorituskyvyn saavuttamiseksi toimimalla siten, että ' A. Päällystetään suoraan elementin hiukkasjakoi- : : selle reseptorivyöhykkeelle, jota elementtiä käytetään :· 25 täplänä lisätyn, merkityn liganidin optimipitoisuuksien · määrittämiseksi, merkitty ligandi päällystemäärällä g/m2, » , joka on osa, kerrannainen tai sama kuin merkityn ligandin » · konsentraatio, jota käytettiin yllä kohdassa 1 lisättäessä .. . merkitty ligandi täplänä.

' ; 30 B. Suoritetaan sarja määrityksiä testinäytteillä, * jotka sisältävät konsentraatioltaan tunnettuja ligandeja.

: C. Verrataan määritystulokset ligandin tunnettuun · konsentraatioon ja ' . D. Toistetaan tarvittaessa vaiheet B ja C siten, • » ! ,* 35 että vaihdellaan merkityn ligandin päällystemäärää vaiheen • ·

11309C

15 2C tulosten mukaisesti merkityn ligandin päällystemäärä-tarpeen selvittämiseksi.

Merkitystä ligandista riippuen merkityn ligandin päällystemäärä voi olla pienempi, sama tai monta kertaa 5 suurempi (2x, 3x, 4x jne.) kuin merkityn ligandin konsent-raatio, joka on tarpeen suoritettaessa sama määritys siten, että merkitty ligandi lisätään täplänä suoraan ana-lyysilelementille.

Noudattaen yllä esitettyjä ohjeita voitiin menes-10 tyksellisesti toteuttaa huolellisesti säädeltyjä rasteri-telapäällystysmenettelyjä käyttämällä seuraavia päällystys- ja kuivausohjeitä. Keksinnön mukaisten elementtien merkittyjen ligandien päällysteet valmistettiin rasterite-lakoneella (valmistaja Yasui, Japani). Kuivausolosuhteet 15 olivat yleensä noin 120 °F (49 °C) vain ensimmäisessä kui-vausosassa. Toista osaa ei käytetty. Tyypillisesti käytetyssä rasteritelasylinterissä oli 295 kuppia/tuuma (1,344 x 108 kuppia/m2) . Kuppien syvyys oli 19 mikrometriä, leveys 72 mikrometriä ja kuppien sileäväli 12 mikrometriä. 20 Tällä sylinterillä voidaan siirtää noin 4,3 g/m2 merkittyä ligandia sisältävää päällystyskoostumusta helmilevitysker-rokseen käyttämällä suoraa rasteritelapäällystysmenetelmää päällystyskoneen nopeudella 50 jalkaa/min (15,24 m/min).

: ; Muilla rasteritelasylintereillä voidaan siirtää noin 2,5 - ··· 25 6,8 g/m2 päällystysliuosta. Rasteritelatekniikan ammatti- • mies pystyy helposti sovittamaan yllä selitetty menettely > · » mihin tahansa rasteritelapäällystyskoneeseen. Merkityn li-gandin päällystyskoostumus oli seuraava: ... Päällystetyn, merkityn ligandin päällystyskoostu- * » ~ 30 mus, jolla voidaan levittää 4,3 g/m märkäpäällystettä ;_'.j Komponentti g/m kuivapääl- *. j lystettä ‘ 35 MOPS-puskuri 0,0045 ’· *’ BSA (naudanseerumialbumiini) 0,000215 113090 16

Polyakryyliamidi 0,00108 4'-hydroksiasetanilidi 0,000325

Merkitty ligandi* 0,000016 5 * Merkityn ligandin päällystemäärä on mikä tahansa välillä 4 ja 64 Mg/m2

Elementin muut kerrokset voidaan päällystää käyttämällä tekniikan tasolla tunnettuja tekniikkoja. Jokainen 10 kerros päällystetään kuitenkin erikseen ja annetaan kuivua ennen seuraavien kerrosten lisäämistä.

Seuraavissa esimerkeissä käytetyt elementit muodostavat kerrokset valmistettiin seuraavan menettelyn avulla. Jokainen kerros kuivattiin ennen päällystämistä 15 seuraavalla kerroksella.

1. Pinnoitettu polyeteenitereftalaattialusta pääl lystetään silloitetulla gelatiinikerroksella. Päällystys-koostumus sisälsi gelatiinia ja elektronin siirtoainetta [esim. 4'-hydroksiasetanilidia (4'-HA)], puskuria, pinta- 20 aktiivista ainetta ja gelatiinin kovetetta.

2. Reseptorivyöhykkeen päällystäminen. Vyöhykkeen v : päällystyskoostumus sisälsi (a) vasta-ainetta analyyttiä : : (ligandia) varten immobilisoituna 0,1-5 μτη:η polymeeri- : helmille polymeerissä ja (b) tämän keksinnön mukaista leu- 25 koväriainepäällystyskoostumusta. Leukoväriaine voidaan va-; ·, linnaisesti lisätä vaihtoehtoisesti helmilevityskerrok- , seen.

3. Kuivatun reseptorivyöhykkeen päällystäminen . helmilevityskerroksella. Päällystyskoostumus sisälsi suu- I » ‘ 30 ria (20 - 35 ^m) polymeerihiukkasia tai -helmiä (tyypilli- ’ ·* sesti polyvinyylitolueenikometakryylihelmiä, painosuhde ; .· 98/2), jotka on liitetty yhteen lateksipolymeeriliimalla, ;*·· edullisesti polymetyyliakrylaattikonatrium-2-akryyliamido- , 2-metyylipropaanisulfonaattiko-2-asetoasetoksietyylimetak- » » · ‘ / 35 rylaatilla (painosuhde 90/4/6). Kerros voi käsittää leuko- < ·

11309C

17 väriaineen, elektronin siirtoaineen, dimedonin, puskurin, naudanseerumialbumiinin ja pinta-aktiivisen aineen.

4. Helmilevityskerrokselle levitetään rasteritela-päällystämällä piparjuuriperoksidaasilla, tavallisesti 5 amiinilla rikastetulla piparjuuriperoksidaasilla merkitty analyyttikoostumus. Koostumus voi valinnaisesti käsittää elektronin siirtoaineen (4'-HA), puskurin (MOPS), naudanseerumialbumiinin ja hydrofiilisen polymeerikuljettimen kuten polyakryyliamidin.

10 Reseptorivyöhyke on päällystettävä polymeerillä ryhmistä (I), (II), (III), (IV), (V) ja (VI). Mutta valmiin elementin vyöhykkeessä ei olennaisesti saa olla polymeeriä. Polymeeri vaeltaa osaksi, ei lainkaan tai olennaisesti kokonaisuudessaan helmilevityskerrokseen (b), kun 15 kerros (b) levitetään reseptorivyöhykepäällysteelle.

Reseptorivyöhyke on päällystettävä polymeerillä ryhmistä (I) , (II) , (III) , (IV) , (V) ja (VI) valittuna seuraavasti: (I) silloitetut polymeerit, jotka käsittävät noin 20 30 - 97 paino-% polymeroituja, N-alkyylisubstituoituja ak- ryyliamidimonomeerejä, noin 3-25 paino-% polymeroituvaa, silloittavaa monomeeriä, jossa on vähintään kaksi polyme- • » : : ! roituvaa lisäryhmää silloittavan monomeerin molekyyliä kohti, ja O - 60 paino-% muita polymeroituja, hydrofiili-25 siä monomeerejä, I * ' ; ; (II) polyvinyylialkoholi, (III) naudanseerumialbumiini, • » (IV) arabikumi, ,, , (V) poly-N-vinyylipyrrolidonin homopolymeerit,

* I

* 30 joiden molekyylipaino on alueella 8 000 - 400 000, ja * * '·<* (VI) vesiliukoiset vinyyliadditiokopolymeerit, ; joissa on kaksi tai useampia monomeerejä valittuina ryh- * » >;.j mästä akryyliamidi, metakryyliamidi, N-alkyylisubs- , tituoidut akryyliamidit, N-alkyylisubstituoidut metakryy- i i * 35 liamidit, 1-vinyyli-imidatsoli, 2-alkyylisubstituoidut 1- vinyyli-imidatsolit, 2-hydroksialkyylisubstituoidut 1-

11309C

18 vinyyli-imidatsolit, N-vinyylipyrrolidoni, hydroksialkyy-liakrylaatit, hydroksialkyylimetakrylaatit, akryylihappo, sulfoalkyyliakrylaatit, sulfatoalkyyliakrylaatit, sulfoal-kyylimetakrylaatit, sulfatoalkyylimetakrylaatit, N-5 sulfoalkyyliakryyliamidit, N-sulfatoalkyyliakryyliamidit ja N-sulfoalkyylimetakryyliamidit, N-sulfatoalkyylimet-akryyliamidit, eteenisulfonihappo ja sulfosubstituoidut styreenit. Sulfato- ja sulfo-osia sisältävien monomeerien alkalimetallisuolat (natrium, litium ja kalium) ja ammoni-10 umsuolat kuuluvat ryhmään (VI). Ryhmiin (I) ja (VI) kuuluvien monomeerien alkyylissä on aina 1-6 hiiliatomia.

Reseptorivyöhyke on päällystettävä polymeerillä ryhmistä (I), (II), (III), (IV), (V) ja (VI). Mutta val miin elementin vyöhykkeessä ei olennaisesti saa olla poly-15 meeriä. Polymeeri vaeltaa osaksi, ei lainkaan tai olennai sesti kokonaisuudessaan helmilevityskerrokseen (b), kun kerros (b) levitetään reseptorivyöhykepäällysteelle.

Ryhmien (I) ja (IV) polymeerejä varten käyttökelpoisia N-alkyylisubstituoituja akryyliamideja ovat N-20 isopropyyliakryyliamidi, N-n-butyyliakryyliamidi, N,N- dietyyliakryyliamidi ja N-n-propyyliakryyliamidi. Näihin kuuluvat silloitetut polymeerit, jotka käsittävät noin : 30 - 97 paino-% polymeroitua N-alkyylisubstituoitua akryy- ; liamidia, kuten N-isopropyyliakryyliamidia. Polymeerejä, 25 jotka käsittävät 60 - 97 paino-% polymeroitua N- tl ; ,isopropyyliakryyliamidia, käytetään esimerkeissä selventä-» · ['· [ mään ryhmän (I) polymeerien käyttöä.

* >

Ryhmän (I) polymeerit käsittävät myös noin 3-25 paino-% yhtä tai useampaa polymeroitua, silloittavaa mono-30 meeriä, joissa on vähintään kaksi polymeroituvaa lisäryh-mää molekyyliä kohti. Nämä silloittavat monomeerit ovat • yleensä tekniikan tasolla tunnettuja. Edulliset silloitta- | vat monomeerit sisältävät akryyliamido- tai metakryyliami- doryhmiä edistämään polymeroitumista N-alkyylisubsti- • 35 tuoitujen akryyliamidien kanssa.

• »

11309C

19 Käyttökelpoisten silloittavien monomeerien esimerkkejä ryhmän (I) polymeerejä varten ovat N,N'-metyleenibisakryyliamidi, N,N'-metyleenibismetakryyli- amidi, eteenidimetakrylaatti, 2,2-dimetyyli-1,3-propeeni- 5 diakrylaatti, divinyylibentseeni, mono-2,3-bismetakryloyy-lioksipropyylifosfaatti, N,N'-bismetakryloyyliurea, trial-lyylisyanuraatti, allyyliakrylaatti, allyylimetakrylaatti, N-allyylimetakryyliamidi, 4,4 '-isopropylideenidifenyleeni- diakrylaatti, 1,3-buteenidiakrylaatti, 1,4-sykloheksy- 10 leenidimetyleenidimetakrylaatti, 2,21-oksidieteenidi- metakrylaatti, divinyylioksimetaani, eteenidiakrylaatti, etylideenidiakrylaatti, propylideenidimetakrylaatti, 1,6- diakryyliamidoheksaani, 1,6-heksametyleenidiakrylaatti, 1,6-heksametyleenidimetakrylaatti, fenyylieteenidimetakry-15 laatti, tetrametyleenidimetakrylaatti, 2,2,2-trikloori- etylideenidimetakrylaatti, eteenibisoksieteenidiakrylaat-ti, eteenibisoksieteenidimetakrylaatti, etylidyynitrimeta-krylaatti, propylidyynitriakrylaatti, vinyyliallyylioksi-asetaatti, l-vinyylioksi-2-allyylioksietaani, 2-krotonoyy-20 lioksietyylimetakrylaatti, diallyyliftalaatti ja 2-(5-fenyyli-2,4-pentadienoyylioksi)etyylimetakrylaatti.

: Ryhmän (I) polymeereissä voi olla 0-60 paino-% polymeroituja, hydrofiilisiä monomeerejä. Käyttökelpoisia ovat myös määrät 5-35 paino-% Tällaisessa monomeerissä i » · 25 on erityisesti yksi tai useampi ryhmä valittuna ryhmästä ; hydroksi-, pyrrolidoni-, amiini-, amidi-, karboksi-, sul- h fo-, karboksylaattisuola-, sulfonaattisuola- ja sulfaatti- * » ‘ suolaryhmät. Suolaryhmien vastaionina on yleensä alkalime- talli tai ammonium. Käyttökelpoisia hydrofiilisiä monomee- i * ' ·’ 30 rejä ovat akryylihappo ja metakryylihappo ja niiden suo- ‘ lat, natrium-2-akryyliamido-2-metyylipropaanisulfonaatti, ! 2-hydroksietyyliakrylaatti , 2-hydroksietyylimetakrylaatti , * \ 2-hydroksipropyyliakrylaatti, 2-hydroksipropyylimetakry- laatti, o- ja p-styreenisulfonihapon kaliumsuola, p- i • 35 styreenisulfonihapon kaliumsuola, p-styreenisulfonihapon natriumsuola, eteenisulfonihapon natriumsuola, 2- 20 113 0 9 0 sulfoetyylimetakrylaatin natriumsuola, 2-sulfoetyylimet-akrylaatti, 3-akryloyylioksipropaani-1-sulfonihapon natriumsuola, 2-sulfobutyylimetakrylaatin natriumsuola, 4-sulfobutyylimetakrylaatin natriumsuola, n-(2-metakrylo-5 yylioksi)etyylisulfaatti ja glyseryylimetakrylaatti.

Ryhmän (I) edustavia polymeerejä ovat 1. Poly-N-isopropyyliakryyliamidikonatrium-2-ak-ryyliamido-2-metyylipropaanisulfonaattiko-N,N'-metylee-nibisakryyliamidi (painosuhde 80/10/10) .

10 2. Poly-N-isopropyyliakryyliamidikometakryyli- happoko-Ν,Ν'-metyleenibisakryyliamidi (painosuhde 80/10/-10) .

3. Poly-N-isopropyyliakryyliamidiko-2-hydroksi-etyylimetakrylaattiko-N,N'-metyleenibisakryyliamidi (pai- 15 nosuhde 85/5/10).

4, 5, 6, 7, 8. Poly-N-isopropyyliakryyliamidiko-2- hydroksietyylimetakrylaattikonatrium-2-akryyliamido-2-metyylipropaanisulfonaattiko-N,N'-metyleenibisakryyliamidi, jonka painosuhteet ovat 20

Polymeeri Painosuhde : 4 80/5/5/10 V,: 5 83/5/2,5/9,5 :* 25 6 84,5/5/0,5/10 ; : 7 83/5/2/10 ; : 8 80,9/4,8/4,8/9,5

Ryhmän (I) sulfonaattisuolaryhmiä sisältäville po- » ' 30 lymeereille on eduksi, että niiden hydrofi il isyys on riit tävä siten, että ne voidaan valmistaa ilman pinta-'. aktiivisia aineita, jotka voivat haitata määrityselemen- : teissä päällystettyjen entsyymien ja/tai vasta-aineiden ; aktiivisuutta. Käytettäessä polymerointiprosessissa pinta- 35 aktiivisia aineita niiden pitoisuus voi olla O - noin 9 % polymerointiseoksesta laskettuna.

113090 21

Edustavat monomeerit ryhmän (VI) vesiliukoisten vinyyliadditiokopolymeerien muodostamiseksi valitaan ryhmästä 2-akryyliamido-2-metyylipropaanisulfonihapon natri-umsuola, o- ja p-styreenisulfonihapon kaliumsuola, p-5 styreenisulfonihapon kaliumsuola, p-styreenisulfonihapon natriumsuola, eteenisulfonihapon natriumsuola, 2-sulfo-etyylimetakrylaatin natriumsuola, 2-sulfoetyylimet- akrylaatti, 3-akryloyylioksipropaani-l-sulfonihapon natriumsuola, 3-metakryloyylioksipropaani-l-sulfonihapon natri-10 umsuola, 3-sulfobutyylimetakrylaatin natriumsuola, 4- sulfobutyylimetakrylaatin natriumsuola, N-2-sulfo-l,1-dimetyylietyyliakryyliamidin kaliumsuola ja natrium-2-metakryloyylioksietyylisulfaatti. Poly-N-isopropyyli- akryyliamidikonatrium-2 -akryyliamido-2-metyylipropaani-15 sulfonaatti (painosuhde 85/15) on erityisen edullinen.

Alustana voi olla mikä tahansa sopiva mittapysyvä ja edullisesti huokoseton ja läpinäkyvä (ts. säteilyä läpäisevä) materiaali, joka läpäisee sähkömagneettista säteilyä, jonka aallonpituus on noin 200 - noin 900 nm. Mää-20 rättyä elementtiä varten valittavan alustan on sovittava yhteen aiotun määritystavan kanssa (heijastus-, transmis-sio- tai fluoresenssispektroskopia). Käyttökelpoisia alus- • / tamateriaaleja ovat polystyreeni, polyesterit (esim. poly- : eteenitereftalaatti) , polykarbonaatit, selluloosaesterit 25 (esim. selluloosa-asetaatti) jne.

• Seuraavissa esimerkeissä käytetyt elementit muo- , dostavat kerrokset valmistettiin seuraavan menettelyn avulla. Jokainen kerros kuivattiin ennen päällystämistä _ seuraavalla kerroksella.

30 1. Pinnoitettu polyeteenitereftalaattialusta pääl- i lystetään silloitetulla gelatiinikerroksella. Päällystys- i : koostumus sisältää gelatiinia ja elektronin siirtoainetta , ; (esim. 4'-hydroksiasetanilidia (4'-HA)), puskuria, pinta- - . aktiivista ainetta ja gelatiinin kovetetta.

; 35 2. Reseptorivyöhykkeen päällystäminen. Vyöhykkeen päällystyskoostumus sisältää vasta-ainetta analyyttiä (li- 22

11309C

gandia) varten immobilisoituna 0,1-5 μιη:η polymeerihel-mille polymeerissä. Joissakin esimerkeissä vyöhyke sisältää väriainetta, puskuria ja pinta-aktiivista ainetta.

3. Kuivatun reseptorivyöhykkeen päällystäminen 5 helmilevityskerroksella. Päällystyskoostumus sisältää suuria (20 - 35 /xm) polymeerihiukkasia tai -helmiä (tyypillisesti polyvinyylitolueenikometakryylihappohelmiä, painosuhde 98/2), jotka on liitetty yhteen lateksipolymeeri-liimalla, edullisesti polymetyyliakrylaattikonatrium-2-10 akryyliamido-2-metyylipropaanisulfonaattiko-2-asetoaset-oksietyylimetakrylaatilla (painosuhde 90/4/6). Kerros voi käsittää leukoväriaineen, elektronin siirtoaineen, dimedo-nin, puskurin, naudanseerumialbumiinin ja pinta-aktiivisen aineen.

15 4. Helmilevityskerrokselle levitetään rasteritela- päällystämällä piparjuuriperoksidaasilla, tavallisesti amiinilla rikastetulla piparjuuriperoksidaasilla merkitty analyyttikoostumus. Koostumus voi valinnaisesti käsittää elektronin siirtoaineen (4'-HA), puskurin (MOPS), naudan-20 seerumialbumiinin ja hydrofiilisen polymeerikuljettimen kuten polyakryyliamidin.

Seuraavat esimerkit valaisevat käsiteltävänä ole-·, ’ van keksinnön käyttöä.

Esimerkki 1 ‘ 25 Stabiilin, leukoväriainetta ja hapettumisen esto- ; ainetta sisältävän päällystyskoostumuksen valmistus

/ ; Osa I

Jauhatusväliaineen esikonditionointi 4,0 litran lasipulloon panostettiin 2 200 cm3 zir- ‘ * ^ 30 koniumoksidijauhatuspalloja, joiden keskimääräinen läpi- » mitta oli 1 mm (Zirbeads XR, myy Zircoa Inc.), ja 1 600 ; cm3 1 N rikkihappoa, tulpitetaan ja pyöritetään 12 tuntia : nopeudella, joka on 50 % kriittisestä nopeudesta. Hapan , : liuos erotettiin jauhatushelmistä pidättävän seulan läpi ! 35

23 1 13 0 9C

ja helmet pestiin täryseulalla jatkuvalla vesisuihkulla happotähteiden ja alamittaisten väliainefragmenttien poistamiseksi ja kuivattiin sitten ilmankiertolämpökaapissa kosteuden poistamiseksi.

5 Osa II

Jauhettavan lietteen valmistus

Valmistettiin seos, jonka koostumus oli Paino Märkä (%) Kuiva (%) 10 - 4,5-bis(4-dimetyyliami-nofenyyli)-2-(3,5-dime-toksi-4-hydroksifenyyli)- imidatsoli, leukoväriaine 49,50 4,8 68 15 Dimedoni (5,5-dimetyyli-1,3-sykloheksaanidioni), hapettumisen estoaine 12,38 1,2 17

Tetronic 908 (83 % aktiiviainesta) 8,95 0,73 10 20 Surfactant 10G (10-prosenttinen vesiliuos) 37,12 0,004 5 V 7 (3,712 •, · kuiv.) ‘ Vesi 882,05 loput 25

·; : Osa III

. Jauhatusprosessi 2,5 litran lasiastiaan panostettiin 1 375 cm3 osas-sa I valmistettuja kuivakonditionoituja helmiä ja osassa ! 30 II valmistettu liete ja sitten huuhdeltiin typpikaasulla suojakaasukehän aikaansaamiseksi astiassa ja väriaineen | hapettumisen minimoimiseksi ilmanhapen vaikutuksesta, tulvi pitettiin ja asetettiin tavanomaisille pyöritysteloille.

‘ ; Pyörittävän telan nopeus säädettiin siten, että pyöri- 35 tysnopeus oli 60 % astian kriittisestä nopeudesta (70,4 24 113090 kierr./min mitattuna tavanomaisella takometrillä). Jauhatus keskeytettiin 5 vrk kuluttua ja väliaine erotettiin kaatamalla seulan läpi, jonka keskimääräinen silmäkoko oli 0,2 mm. Talteen otettu stabiili, väriaineesta ja hapettu-5 misen estoaineesta muodostuva päällystyskoostumus asetettiin jälleen typpisuojaan varastointia varten ennen lopullisen päällystyskoostumuksen formulointia. Päällystyskoos-tumuksen kiintoainehiukkasista suurimman osan hiukkaskoko oli noin 300 - 600 nm mitattuna valonsirontatekniikalla 10 laitteella Microtrac Particle Analyzer.

Esimerkki 2 Tässä esimerkissä verrataan tekniikan tason leuko-väripäällystyskoostumusta ja käsiteltävänä olevan keksinnön mukaisesti valmistettua päällystyskoostumusta. Vertai-15 lu suoritettiin monikerroskuivaimmuunimäärityselementillä digoksiinin määrittämiseksi. Käsiteltävänä olevan keksinnön mukaisesti valmistettu leukoväriainepäällystyskoostu-mus lisättiin reseptorivyöhykkeeseen, joka sijaitsi elementin levityskerroksen ja silloitetun hydrofiilisen ker-20 roksen välissä. Tekniikan tason päällystyskoostumus lisättiin alla selitetyn kontrollielementin levityskerrokseen.

: Elementti on kuvattu kaaviomaisesti alempana.

·,,·’ Menettely t i > : Valmistettiin kaksi elementtisarjaa. Ensin valmis- ·;· 25 tettiin tavanomaisin menetelmin dimetyylisulfoksidin avul- • la kontrollielementti, jossa leukoväriaine lisättiin levi- « : » , tyskerrokseen. Toiseksi elementti, jossa väriainepäällys- tyskoostumus valmistettiin esimerkissä 1 selitetyllä ta-valla ja levitettiin reseptorin kera yllä selitettyyn re-! 30 septorivyöhykkeeseen. Konsentraatiot jauhetussa päällys- tyskoostumuksessa olivat » j Leukoväriaine (sama kuin esimerkissä 1) 5 % ; Dimedoni 1,25 % . . Tetronic 908 (83 % aktiiviainesta) 0,50 % 35 Surfactant 10G 0,25 %

11309C

25

Muodostunut, jauhettu väriainepäällystyskoostumus lisättiin reseptorikerroksen muiden aineosien muodostamaan vesipitoiseen päällystyskoostumukseen. Helmilevityskerros sisälsi lisää dimedonia. Väriaine lisättiin kontrolliele-5 menttiin liuottamalla väriaine 9,76 %) ja dimedoni (2,44 %) dimetyylisulfoksidiin ja liuos lisättiin helmile-vityskerroksen muiden aineosien muodostamaan vesipitoiseen päällystyskoostumukseen, joka myös sisälsi lisää dimedonia, jolloin väriaine saostui ja muodostui vesipitoinen 10 väriainepäällystyskoostumus.

Yritettäessä lisätä yllä kuvattu DMSO/väriaine/di-medoniliuos reseptorikerrokseen syntyi agglomeroitunut, ei-päällystettävissä oleva reseptorikerrospäällystyskoos-tumus. Tämä päällystyskoostumus on lisättävä kontrollin 15 levityskerrokseen. Kontrolli ja testattavat päällystys-koostumukset levitettiin helmilevityskerroksena ja vastaavasti erillisenä reseptorikerroksena testielementtien muiden tarpeellisten kerrosten kera digoksiinin määrittämiseksi. Lopullisten elementtien konfiguraatiot ja päällys-20 tyskoostumukset ilmenevät kuvioista 1 (kontrolli) ja 2 (kokeellinen). Elementit paloiteltiin ja kiinnitettiin le-vykiinnittimiin prosessausta varten.

::: Valmistetun kontrollielementin ja keksinnön mukai- : ' sen elementin konfiguraatio ja aineosien konsentraatiot ·*· 25 ilmenevät alla olevista kuvioista 1 ja 2.

»III

I 1 ♦ » » . Kuvio 1 » * »

Kontrolli (esimerkki 2)

Kerros Märkäpäällyste Komponentti Kuivapäällyste » · ,! 3 0 (g/m2) (g/m2) » » . ‘Merkitty 4,3 DI-vesi ·· ligandi Digoksiini-HRP 0,000012 MOPS, pH 7,0 0,0045 ' * » i » i/ 3 5 Naudanseerumialbumiini 0,000215 • »

Polyakryyliamidi 0,00108

11309C

26 4'-hydroksiasetanilidi 0,000325

Magentaväriaine 0,0269

Helmilevitys- 5 kerros 270 DI-vesi TES, pH 7,0 0,219

Dimedoni 0,50

Triaryyli-imidatsolileuko väriaine 0,2 10 Dimetyylisulfoksidi 1,8 4'-hydroksiasetanilidi 0,45

Naudanseerumialbumiini 1,0

Mannitoli 1,0

Glyseroli 2,0 15 Polymeeriliima 2,583

Polymeerihelmiä (30 μπι) 130

Reseptori- 45 DI-vesi vyöhyke 20 Polymeerisideaine 0,60 TES, pH 7,0 0,1 ‘ TX-100 0,02 • Vasta-aine/polymeeri < A-hiukkasia (0,5 μπι) 0,015 2 5 - ; Gelatiini- 100 DI-vesi , kerros

Gelatiini 10 TES, pH 7,0 4,85 » 30 4'-hydroksiasetanilidi 0,30 TX-100 0,02 > Kovete 0,15 . Polyeteenitereftalaattialusta : ’ 35

11309C

27

Kuvio 2 (Esimerkki 2) - Keksintö: reseptorin sisältämä vä- riainepäällystyskoostumus

Kerros Märkäpäällyste Komponentti Kuivapäällyste 5 (g/m2) (g/m2)

Merkitty 4,3 DI-vesi ligandi Digoksiini-HRP 0,000012 MOPS, pH 7,0 0,0045 10 Naudanseerumialbumiini 0,000215

Polyakryyliamidi 0,00108 41-hydroksiasetanilidi 0,000325

Magentaväriaine 0,0269 15 Helmilevitys- kerros 270 DI-vesi TES, pH 7,0 0,219

Dimedoni 0,45 4'-hydroksiasetanilidi 0,45 20 Naudanseerumialbumiini 1,0

Mannitbli 1,0 ' ; · Glyseroli 2,0 ! Ϊ l Polymeeriliima 2,583 ; ; Polymeerihelmiä (30 Mm) 130 . , 25 - ; , Reseptori- 45 DI-vesi vyöhyke

Polymeerisideaine 0,45

Triaryyli-imidatsolileuko ' 30 väriaine 0,2

Dimedoni 0,05 ; Tetronic 908 0,02 • Surfactant 10G 0,01 , TES, pH 7,0 0,1 ’ 35 TX-100 0,02 * Vasta-aine/polymeeri

11309C

28 A-hiukkasia (0,5 μπι) 0,015

Gelatiini- 100 DI-vesi kerros 5 Gelatiini 10 TES, pH 7,0 4,58 41-hydroksiasetanilidi 0,30 TX-100 0,02

Kovete 0,15 10 -

Polyeteenitereftalaattialusta

Kuvioiden 1 ja 2 ja alla olevan kuvion 3 elementtien yhteydessä käytetyt nimet ja symbolit merkitsevät 15 seuraavasti.

DMSO = dimetyylisulfoksidi DI-vesi = tislattu, deionisoitu vesi Digoksiini/piparjuuriperoksidaasi (HRP) = digoksiinista ja piparjuuriperoksidaasista muodos-20 tuva konjugaatti MOPS = 3-morfolinopropaanisulfonihappopuskuri * TES = N-(tris(hydroksimetyyli)metyyli-2-aminoetaanisulfonihappopuskuri : Dimedoni = 5,5-dimetyyli-1,3-sykloheksaanidioni * 25 Triaryyli-imidatsolileukoväriaine = 4,5-bis(4- dimetyyliaminofenyyli)-2-(3,5-dimetoksi-4-, hydroksifenyyli)imidatsolisinisen muodostava leukoväriaine 28 Zonyl FSN = ioniton, fluorattu pinta-aktiivinen aine, myy duPont de Nemours 30 Polymeeriliima = polymetyyliakrylaattikonatrium-2- akryyliamido-2-metyylipropaanisulfonaattiko-2-; asetoasetoksietyylimetakrylaatti * Polymeerihelmet = poly-m- ja -p-vinyylitolueeniko-metakryylihappo

11309C

29

Vasta-aine/polymeeri A-hiukkaset = polystyreeniko-p-2-kloorietyylisulfonyylimetyylistyreenipolymeerihiuk-kasia, joihin vasta-aine on sitoutunut kovalenttisesti

Vasta-aine/polymeeri B-hiukkaset = polystyreeniko-5 3-p-vinyylibentsyylitiopropionihappopolymeerihiukkasia, joihin vasta-aine on sitoutunut kovalenttisesti

Kovete = bisvinyylisulfonyylimetyylieetterigela-tiinikovete TX-100 = Triton X-100, joka on oktyylifenoksipoly-10 etoksietanolista muodostuva ioniton pinta-aktiivinen aine, myy Rohm & Haas

Tetronic 908 = poly(polyeteenioksidiblokkipoly-

propeenioksidi)blokkikopolymeeri, myy BASF

Surfactant 10G = isononyylifenoksipolyglysidolista 15 muodostuva pinta-aktiivinen aine, myy Olin Chem Co., jossa on noin 10 polymeroitua glysidoliyksikköä

Magentaväriaine = 4,5-dihydroksi-3-(6,8-disulfo-2-naftyyliatso)-2,7-naftaleenidisulfonihapon natriumsuola

Polymeerisideaine = poly-N-isopropyyliakryyliami-20 dikometakryylihappoko-Ν,Ν'-metyleenibisakryyliamidi (painosuhde 80/10/10) .

.'t : Jokaiselle elementille levitettiin täplänä 11 ml :V: seerumia, joka sisälsi joko O tai 6 ng/ml digoksiinia, ja • > l ; sitten inkuboitiin 5 minuuttia 37 °C:ssa Elementit pois- 25 tettiin inkubaattorista ja pestiin 12 millilitralla pe- ; *t sunestettä, jonka koostumus oli

Vetyperoksidi (HRP) 0,03 %

41-hydroksiasetanilidi (41-HA) 5 mM

30 Dietyleenitriamiinipentaetikkahappo

(DTPA) 10 mM

\ Natriumfosfaattipuskuri (pH 6,8) 0,01 M

; Heksadekyylipyridiniumkloridi 0,1 % » t ) > : 35 Elementit palautettiin pesun jälkeen inkubaatto- ,· riin 37 °C:seen ja leukoväriaineen hapettumisnopeus mitat- 30

11309C

tiin heijastusdensitometrisesti aallonpituudella 670 nm. Taulukon I tulokset osoittavat herkkyyden parantuneen ja epätarkkuuden vähentyneen, ts. nopeuksien eroilman digok-siinia ja määrän 6 ng/ml kera digoksiinia ilmaisee nopeus-5 alueen. Mitä laajempi tämä alue on, sitä suurempi on herkkyys. Epätarkkuus mitattiin prosentuaalisena varianssiker-toimena. Mitä pienempi varianssi on, sitä pienempi on epätarkkuus. N on rinnakkaismääritysten lukumäärä (nopeusalue ja epätarkkuus ovat tämän rinnakkaismääritysten lukumäärän 10 keskiarvoja).

Taulukko I

Väriainekoostumus Nopeusalue (herkkyys) Epätarkkuus N

(% keskiarvosta) 15 -

Kontrolli 0,0603 0,00162 10

Keksintö 0,0807 0,00128 10

Muutos-% Kasvu 34 % Väheneminen 21 % 20 VertailuesImerkkl 3 Väriainepäällystyskoostumusmenetelmien vertailu digoksiinin määrityselementissä / Valmistettiin toinen esimerkissä 1 selitetty vä- ; : riainepäällystyskoostumus sillä erolla, että käytettiin 25 0,952 % Alkanol XC:tä, joka on natriumalkyyli naftaleeni- sulfonaatista muodostuva anioninen pinta-aktiivinen aine, myy duPont Chem. Co., keksinnön mukaisten pinta-aktiivisten aineiden eli Tetronic 908:n ja Surfactant 10G:n yhdistelmän asemasta. Päällystyskoostumus lisättiin 30 digoksiinin kontrollimäärityselementin levityskerrokseen käyttäen samaa tekniikkaa kuin valmistettaessa kontrolli : esimerkissä 2, jossa helmilevityskerros toimi samalla re- • septorikerroksena. Valmistettiin myös kontrollielementti samalla tavoin kuin esimerkissä 2 käyttämällä DMSO-35 liuosta. Molempien konfiguraatio ja päällystyskoostumus

11309C

31 ilmenevät kuviosta 3. Päällysteistä valmistetut elementit valmistettiin ja testattiin samalla tavoin kuin esimerkissä 2 ja tulokset ilmenevät taulukosta II. Kuten esimerkissä 2 keksinnön mukaisten, jauhetusta päällystyskoostumuk-5 sesta valmistettujen testielementtien herkkyys oli suurempi ja epätarkkuus pienempi kuin DMSO-päällys-tyskoostumuksesta valmistettujen elementtien, mutta jauhettu päällystyskoostumus (joka ei sisältänyt keksinnön mukaista pinta-aktiivisen aineen ja stabilointiaineen yh-10 distelmää), joka päällystettiin välittömästi valmistuksen jälkeen, oli kuitenkin epästabiili ja saostui noin 24 tunnissa. Tällainen koostumus ei sovi tuotantomittaiseen valmistukseen. Tähän verrattuna keksinnön mukainen, esimerkissä 2 valmistettu päällystyskoostumus pysyi stabiilina 15 yli 2 viikkoa.

Taulukko II

Väriainekoostumus Nopeusalue (herkkyys) Epätarkkuus N

(% keskiarvosta) 20 Kontrolli 0,037 0,00127 10

Keksintö 0,045 0,000816 10 ** Muutos-% Kasvu 22 % Väheneminen 36 % ,·* Kuvio 3 I* 25 Elementtejä esimerkkiä 3 varten I Kuivapäällyste (g/m2) • Kerros Märkäpäällyste Komponentti DMSO Keksintö (g/m2) 3 0 Merkitty 4,3 DI-vesi ligandi Digoksiini-HRP 0,000012 0,000012 ; kerros MOPS, pH 7,0 0,0045 0,0045 • Naudanseerumi- ; albumiini 0,000215 0,000215 35 Polyakryyliamidi 0,00108 0,00108 4'-hydroksiaset-

11309C

32 anilidi 0,000325 0,000325

Helmi- 270 DI-vesi levitys TES, pH 7,0 0,219 0,219 5 kerros Dimedoni 0,5 0,5

Triaryyli-imidat soli leukoväriaine 0,2 0,2

Alkanol XC 0,0 0,038

Dimetyylisulfoksidi 1,8 0 10 4'-hydroksi- asetanilidi 0,15 0,15

Zonyl FSN 0,054 0,057

Polymeeriliima 2,583 2,583

Polymeerihelmiä 15 (30 Mm) 130 130

Kaliumfosfaatti, pH 7,0 0,039 0,039

Vasta-aine/polymeeri B-hiukkasia 0,010 0,010 20 -—-

Gelatiini 100 DI-vesi »" Gelatiini 10 10 .· TES, pH 7,0 4,58 4,58 * 4'-hydroksi- ;* 25 asetanilidi 0,30 0,15 'j TX-100 0,02 0,02 '· Kovete 0,15 0,15 < Polyeteenitereftalaattialusta : 30

Keksintöä on kuvattu yksityiskohtaisesti viittaa-.· maila erityisesti sen edullisiin suoritustapoihin, mutta • on selvää, että keksintöä voidaan vaihdella ja muunnella keksinnön hengen ja suoja-alan puitteissa.

Claims (9)

113090

1. Immuunimäärityselementti, tunnettu siitä, että se käsittää vähintään yhden kerroksen, joka si- 5 sältää leukoväriainepäällystyskoostumusta, joka käsittää: Komponentti_Kuivapainosuhde (alue) a) Triaryyli-imidatsolileuko- väriaine 55 - 80 10 b) Hapettumisen estoaine 7-40 c) Poly[poly(eteenioksidi)blokki - poly(propeenioksidi)]- ioniton blokki -kopolymeeri 6 20 d) Alkyyliaryylioksipoly(aikeeni- 15 oksidi)- ioniton pinta-aktiivinen aine 1-16

2. Kuivaimmuunimääritysanalyysielementti ligandin määrittämiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavassa järjestyksessä (A) merkittyä ligandia sisältävän kerroksen, 20 (B) helmilevityskerroksen, (C) silloitetun, hydrofiilisen polymeerikerroksen ja (D) alustan, jolloin .* (i) merkityn ligandin immobilisoitu reseptori, ,· jonka konsentraatio on vakio, on vyöhykkeessä (reseptori- : vyöhykkeessä) kerrosten (B) ja (C) rajapinnassa, 25 (ii) reseptorit on immobilisoitu sitomalla ne ko- ; valenttisesti polymeerihelmiin, jotka ovat pienempiä kuin kerroksessa (B) olevat helmet, ja (iii) mainittu vyöhyke käsittää myös leukovä-riainepäällystyskoostumusta, joka käsittää 30 Komponentti_Kuivapainosuhde (alue) » a) Triaryyli-imidatsolileuko- i väriaine 55 - 80 . b) Hapettumisen estoaine 7-40 35 c) Poly[poly(eteenioksidi)blokki- poly(propeenioksidi)]- ioniton blokki- 11309C kopolymeeri 6 20 d) Alkyyliaryylioksipoly(aikeeni- oksidi)- ioniton pinta-aktiivinen aine 1-16

3. Kuivaimmuunimääritysanalyysielementti ligandin 5 määrittämiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavassa järjestyksessä (A) merkittyä ligandia sisältävän kerroksen, (B) helmilevityskerroksen, (C) silloitetun, hydrofiilisen polymeerikerroksen ja (D) alustan, jolloin helmilevityskerros sisältää 10 (i) helmiä, joiden koko on alueella 20 - 35 μτα, (ii) merkityn ligandin reseptorin, jonka konsent-raatio on vakio, (iii) reseptorit on immobilisoitu sitomalla ne ko-valenttisesti polymeerihelmiin, jotka ovat pienempiä kuin 15 helmet kohdassa (i), ja (iv) leukoväriainepäällystyskoostumusta, joka kä sittää : Komponentti_Kuivapainosuhde (alue) a) Triaryyli-imidatsolileuko- 20 väriaine 55 - 80 b) Hapettumisen estoaine 7-40 c) Poly[poly(eteenioksidi)blokki- ,· poly (propeenioksidi) ] - ioniton blokki- kopolymeeri 6 20 ;· 25 d) Alkyyliaryylioksipoly (aikeeni- oksidi)- ioniton pinta-aktiivinen aine 1-16

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1, 2 tai 3 mukai nen elementti, tunnettu siitä, että leukoväriaine on 4,5-bis(4-dimetyyliaminofenyyli)-2 -(3,5-dimetyylioksi- ! 30 4-hydroksifenyyli)imidatsoli.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1, 2 tai 3 mukai- | nen elementti, tunnettu siitä, että se käsittää ; dimedonia, [poly(polyeteenioksidi)-blokkipoly(propeeni oksidi) ] kopolymeeriä ja isononyylifenoksipolyglysidolia, 35 jossa on noin 10 toistuvaa, polymeroitua glysidoliyksik-* köä. 11309C

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1, 2 tai 3 mukai nen elementti, tunnettu siitä, että se käsittää 4,5-bis(4-dimetyyliaminofenyyli)-2-(3,5-dimetoksi-4-hyd-roksifenyyli)imidatsolia, dimedonia, poly[poly(eteeni- 5 oksidi)-blokkipoly(propeenioksidi)]kopolymeeriä ja isono-nyylifenoksipolyglysidolia, jossa on noin 10 toistuvaa, polymeroitua glysidoliyksikköä.

7. Menetelmä immunologisesti reaktiivisen ligandin määrittämiseksi vesipitoisesta, nestemäisestä näytteestä, 10 tunnettu siitä, että se käsittää vaiheet, joissa A. otetaan patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen kuivaimmuunimääritysanalyysielementti, jossa merkitty li-gandi on entsyymillä merkitty, B. saatetaan rajallinen alue kerroksesta, joka kä-15 sittää entsyymillä merkityn ligandin, kosketukseen nestemäisestä näytteestä otetun näytteen kanssa siten, että muodostuu joko (i) immobilisoitu ligandi/reseptori-kompleksi tai (ii) immobilisoitu, entsyymillä merkitty li-gandi/reseptorikompleksi,

20 C. saatetaan rajallinen alue kerroksesta, joka kä sittää entsyymillä merkityn ligandin, kosketukseen sub-straattiliuoksen kanssa värin kehittymisen katalysoimisek-: si, ja : D. määritetään ligandin konsentraatio kolorimetri- 25 sesti. 1 » 11309C