CN111417395A - 用于治疗癌症的芳基咪唑 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种预防、减轻或治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)，其中所述受试者在DNA修复基因中具有突变。

Description

用于治疗癌症的芳基咪唑
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年10月30日提交的美国临时申请号62/578,938的权益，所述申请的内容特此以引用方式整体并入。
发明领域
本发明总体上涉及预防、减轻或治疗受试者的癌症的方法。
背景技术
由乳腺癌易感性基因编码的蛋白质(BRCA蛋白质)与乳腺癌、卵巢癌和其他癌症的倾向性相关联。这些蛋白质广泛表达，从而使得这些蛋白质参与对所有细胞而言是基本的许多过程，包括DNA修复和重组、细胞周期的检查点控制和转录。
具体地，乳腺癌的遗传易感性与某些基因(例如BRCA-1和BRCA-2)的突变有关。认为由这些基因编码的蛋白质具有保护染色体结构的作用，但由于它们参与多种过程，因此其确切作用尚不明确。推测突变导致蛋白质破坏，这导致BRCA缺陷型(deficient)细胞的染色体不稳定性，从而使这些细胞易于发生赘生性转化。
约10％的乳腺癌病例聚集在家族中，一些是由于BRCA-1和BRCA-2基因中的突变，引起较高的癌症风险。与肿瘤抑制有关的其他基因中的突变可解释癌症倾向性。这些突变包括p53肿瘤抑制、STK11/LKB、蛋白激酶或PTEN磷酸酶中的突变。
肿瘤中同源重组缺陷为选择性杀死肿瘤细胞提供机会；然而，目前用于利用此机会的药物会产生严重的骨髓抑制，这限制了剂量。因此，在本领域中仍然存在未满足的高度优先需要，以鉴定BRCA1或BRCA2功能丧失引起超敏性但不导致骨髓抑制的药物。
发明内容
本公开涉及一种预防、减轻或治疗受试者的癌症的方法。
在一个实施方案中，本公开涉及一种预防、减轻或治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的化合物I，
Figure BDA0002518693610000021
或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)，其中所述受试者在DNA修复基因中具有突变。在某些实施方案中，DNA修复基因是同源重组基因。例如，DNA修复基因是同源重组(HR)依赖性脱氧核糖核酸(DNA)双链断裂(DSB)修复通路中的基因。在一些实施方案中，DNA修复基因是一个或多个选自由以下组成的组的基因：BRCA-1、BRCA-2、ATM、ATR、CHK1、CHK2、Rad51、RPA和XRCC3。例如，DNA修复基因是BRCA-1和/或BRCA-2。在一个实施方案中，受试者是人类。
在一个实施方案中，受试者在DNA修复基因中的突变是杂合的。在某些实施方案中，受试者在同源重组(HR)依赖性脱氧核糖核酸(DNA)双链断裂(DSB)修复通路中的基因突变是杂合的。在一个实施方案中，受试者在BRCA1或BRCA2中的突变是杂合的。在另一个实施方案中，受试者在BRCA1或BRCA2中的突变是纯合的。
在一个实施方案中，癌症选自由以下组成的组：血液癌、结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、淋巴结癌、白血病、肾癌、结肠癌、前列腺癌、脑癌、头颈癌、骨癌、喉癌和口腔癌、尤文氏肉瘤、皮肤癌、肾癌和心脏癌。在某些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、肺癌、卵巢癌、淋巴结癌、结肠癌、白血病、肾癌和前列腺癌。在一个实施方案中，癌症是乳腺癌。
在一些实施方案中，癌症是恶性血液病。恶性血液病的实例包括但不限于白血病、淋巴瘤、霍奇金氏病和骨髓瘤。此外，急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性早幼粒细胞白血病(APL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性中性粒细胞白血病(CNL)、急性未分化性白血病(AUL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、前淋巴细胞性白血病(PML)、青少年型慢性髓单核细胞白血病(JMML)、成人T细胞ALL、AML伴三系骨髓发育不良(AMLITMDS)、混合谱系白血病(MLL)、嗜酸性粒细胞白血病、套细胞淋巴瘤、骨髓异常增生综合征(MDS)(例如高风险MDS)、骨髓增生性病症(MPD)和多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施方案中，癌症是急性骨髓性白血病。在一些实施方案中，癌症是慢性骨髓性白血病。在一些实施方案中，癌症是淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症是高风险骨髓异常增生综合征。
在一个实施方案中，癌症是BRCA相关的癌症。在某些实施方案中，BRCA相关的癌症具有BRCA-1和/或BRCA-2基因的一个或多个突变。
在一个实施方案中，本公开的方法还包括施用治疗有效量的第二治疗活性剂。在已向受试者施用
Figure BDA0002518693610000031
之前、期间或之后施用第二治疗活性剂。第二治疗活性剂选自由免疫治疗剂、抗癌剂和血管生成剂组成的组中的一者或多者。在一个实施方案中，第二治疗活性剂是PARP抑制剂。例如，PARP抑制剂是奥拉帕利。
在一个实施方案中，相对于未施用治疗有效量的
Figure BDA0002518693610000041
或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)的受试者，所述受试者经历小于90％的骨髓活性降低。例如，所述受试者可经历小于10％的骨髓活性降低或骨髓活性未降低。
在一个实施方案中，受试者已患有癌症。在某些实施方案中，已患有癌症的受试者经历与癌症相关的肿瘤的尺寸的缩小或减小。例如，受试者经历与癌症相关的肿瘤的完全消除。在某些实施方案中，已患有癌症的受试者经历与癌症相关的肿瘤中新血管形成或血管生成的抑制、降低或减少。
在另一个实施方案中，本公开涉及一种用于杀死癌细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与治疗有效量的
Figure BDA0002518693610000042
或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)接触。在一个实施方案中，癌细胞在一个或多个选自由以下组成的组的基因中具有缺陷：BRCA-1、BRCA-2、ATM、ATR、CHK1、CHK2、Rad51、RPA和XRCC3。
在另一个实施方案中，本公开涉及一种用于诱导癌细胞中细胞周期停滞的方法，所述方法包括使所述细胞与治疗有效量的细胞接触，由此使所述细胞易于发生赘生性转化。
在另一个实施方案中，本公开涉及一种预防、减轻或治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括以具有一个或多个金属原子的复合物形式施用治疗有效量的
Figure BDA0002518693610000051
的一个或多个分子，其中所述受试者在DNA修复基因中具有突变。在一个实施方案中，所述一个或多个金属原子选自由以下组成的组：铁、锌、铝、镁、铂、银、金、铬、镍、钛、铜、钪、锆、钒、钼、锰、钨和钴。在一个实施方案中，所述一个或多个金属原子是铁。在某些实施方案中，复合物具有以下结构：
Figure BDA0002518693610000052
应当理解，前述概念和下文更详细论述的额外概念的所有组合(前提条件是这些概念并非互相不兼容)均被视为本文所公开的发明主题的部分。特别地，在本公开结尾处出现的所要求保护的主题的全部组合均被视为本文所公开的发明主题的部分。还应当理解，本文中明确采用的也可出现在以引用方式并入的任何公开中的术语应符合与本文所公开的特定概念最为一致的含义。
附图说明
图1显示Fe(化合物I)3是化合物I的活性胞内形式。(A)化合物I的结构。(B)Fe(化合物I)3的结构。(C)化合物I(■)和Fe(化合物I)3(●)在Raji细胞中的相对细胞毒性。(D)暴露于0.5μM化合物I或Fe(化合物I)3达6小时的Raji细胞中化合物I(■)和Fe(化合物I)3(■)的胞内积聚。垂直条，±SEM；其中缺失SEM小于符号的尺寸；***，P<0.001；****，p<0.0001。
图2显示化合物I导致DNA损伤。(A)Raji细胞中phospho-ATM、γ-H2AX和裂解PARP的积聚随暴露于0.5μM化合物I的持续时间而变。所显示的免疫印迹为三次独立实验的代表。(B)核灶形成的代表性免疫荧光图像，比较了经DMSO处理的和经化合物I处理的CAOV3细胞。(C)每细胞γH2AX病灶的平均值±SEM数；N＝100。(D)显示用DMSO或0.5μM化合物I处理6小时的CAOV3细胞中中性彗星测定定量的尾DNA百分比的盒须图，N＝检验细胞的数量。垂直条，±SEM；*，p<0.05，****，p<0.0001。
图3显示BRCA1和BRCA2功能丧失引起对化合物I的超敏性。BRCA1富含型(proficient)和缺陷型同基因MCF10A克隆(A)、hTERT-IMEC克隆(B)和MCF7(C)对奥拉帕利(右图)和化合物I(左图)的敏感度。BRCA2富含型和缺陷型同基因PEO4和PEO1(D)和HCT116BRCA2缺陷型克隆(E)对奥拉帕利和化合物I的敏感度。MCF7对照和shBRCA1克隆E7细胞中g-H2AFX的积聚(F)，和BRCA2富含型HCT116和缺陷型克隆B18细胞中g-H2AFX的积聚(用DMSO或所指示浓度的化合物I处理24小时)(G)。垂直条，±SEM。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。
图4显示对化合物I(称为化合物IR)具有抗性的细胞的表征。(A)Raji(●)、Raji/化合物IR(■)Raji/化合物IR和在无药物培养基中培养3个月后Raji/化合物IR细胞(▲)的浓度-存活曲线。(B)涉及用DMSO或化合物I 0.5μM处理24小时的Raji和Raji/化合物IR中的细胞凋亡的蛋白质的蛋白质印迹分析。(C)在暴露于0.5μM化合物I 6小时之后，Raji和Raji/化合物IR细胞中化合物I(■)和Fe(化合物I)3(■)的胞内积聚。(D)在6小时时，随化合物I浓度而变的Raji和Raji/化合物IR细胞中Fe(化合物I)3的胞内积聚。垂直条，±SEM；**p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001。
图5显示ABCG2在对化合物I的抗性中的作用。(A)Raji和Raji/化合物IR中ABCG2mRNA的相对水平。(B)用抗ABCG2抗体探测生物素化蛋白质的蛋白质印迹。Na/K ATP酶充当上样对照。(C)Ko143在Raji(●)和Raji/化合物IR(■)中的细胞毒性。(D)用单独的化合物I或化合物I与5nM(▲)或50nM Kol43(▼)组合治疗的Raji(●)和Raji/化合物IR(■)的浓度-存活曲线。(E)托泊替康在Raji(●)和Raji/化合物IR(■)中以及托泊替康与50nMKo143的组合在Raji/化合物IR(▲)中的细胞毒性。(F)卡铂在Raji(●)和Raji/化合物IR(■)中以及卡铂与50nM Ko143的组合在Raji/化合物IR(▲)中的细胞毒性。(G)用化合物I治疗的经pcDNA(●)和ABCG2克隆R5(■)转染的HEK-293的浓度-存活曲线。垂直条，±SEM；**，p<0.01。
图6显示化合物I和Fe(化合物I)3的流入和流出。(A)化合物I和Fe(化合物I)3积聚到与0.5μM化合物I一起孵育的Raji和Raji/化合物IR细胞中的时程。(B)Fe(化合物I)3积聚到与0.5μM Fe(化合物I)3一起孵育的Raji和Raji/化合物IR细胞中的时程。(C)历经2小时，化合物I和Fe(化合物I)3自通过暴露于0.5μM化合物I 6小时而负载的Raji和Raji/化合物IR细胞的流出。
图7显示与Raji/化合物IR细胞相比，Raji中phospho-ATM、γ-H2AX和裂解PARP的积聚。
图8显示化合物I针对白血病和淋巴瘤细胞系的抗增生活性。A)用化合物I处理5天的AML细胞系的浓度-反应曲线。细胞生长表示为经媒介物处理的细胞的生长百分比。B)其他白血病和淋巴瘤细胞系的浓度-反应曲线。误差条，至少三次重复测定的±SD。
图9显示AML细胞系中，化合物I以剂量依赖性和时间依赖性方式诱导G0-G1细胞周期停滞。A)上图，用化合物I以所指示的浓度处理24小时的MV4-11细胞。如材料和方法部分中所描述测定的细胞周期分布。下图，在暴露于化合物I 24小时之后MV4-11细胞中的CDK4和CCND3蛋白质水平。从三次独立蛋白质印迹定量的蛋白质水平，图示为相对于媒介物的倍数变化。B)和C)化合物I对KG-1和EOL-1细胞中细胞周期分布的效应。D)-F)，随暴露(MV4-11细胞，500nmol/L；KG-1细胞，600nmol/L化合物I；且EOL-1细胞，300nmol/L化合物I)持续时间而变的化合物I对细胞周期分布的效应。误差条，两次重复的流式细胞术检测和三次重复的蛋白质印迹的±SD。
图10显示化合物I处理以时间依赖性和浓度依赖性方式诱导细胞凋亡。A，在暴露于化合物I 24小时之后，MV4-11、KG-1和EOL-1细胞的细胞凋亡百分比(早期和晚期)。如材料和方法部分中所描述测量细胞凋亡。B，用V-媒介物或A-化合物I处理24小时的AML细胞的PARP1-特异性抗体的蛋白质印迹分析。PARP1抗体识别全长(较高条带)和裂解PARP1(较低条带)两者。C，用500nmol/L化合物I处理1至24小时的MV4-11、KG-1和EOL-1细胞中PARP1裂解物的蛋白质印迹分析。GAPDH被包括为上样对照。D，化合物I诱导MV4-11(500nmol/L)、KG-1(600nmol/L)和EOL-1(300nmol/L)细胞中细胞凋亡的时程。误差条，两次重复测定的±SD。
图11显示MYC RNA和蛋白质表达受到化合物I的负调控。A，处理AML细胞系24小时并通过qRT-PCR用MYC-特异性引物/探针对测量MYC mRNA水平。使用GraphPad Prism图示为媒介物百分比。b，以所列浓度处理24小时的MV4-11、KG-1和EOL-1细胞中MYC蛋白质水平的蛋白质印迹分析。GAPDH充当上样对照。C，图示为用500nmol/L化合物I处理所列时间的MV4-11、KG-1和EOL-1细胞中相对于媒介物的倍数变化的MYC mRNA表达的直方图。D，与来自健康供体的PBMC相比，AML细胞系中MYC mRNA的基础表达水平。相对于通过qRT-PCR测定的GAPDH的表达。误差条，来自至少三次重复实验的±SD。
图12显示化合物I诱导DDR通路。A，用(V)媒介物或500nmol/L(A)化合物I处理延长时间段的MV4-11细胞中的总TP53蛋白质水平。B，在如A中那样进行处理的MV4-11细胞中，通过蛋白质印迹分析检测的TP53的翻译后修饰。C，暴露于500nmol/L化合物I的MV4-11细胞的蛋白质印迹分析。D，用化合物I以指定浓度处理24小时的MV4-11、KG-1和EOL-1细胞中γ-H2AX(H2AX phos-S139)水平的蛋白质印迹分析。
图13显示Fe(化合物I)3复合物的体外和细胞活性。A，用亲代化合物I或Fe(化合物I)3处理5天的AML细胞系的浓度-反应曲线。细胞生长表示为经媒介物处理的细胞的生长百分比。误差条，来自3-5次重复测定的平均SD。B，左边，在用Fe(化合物I)3以所列浓度治疗24小时之后，KLF4、CDKN1A和MYC mRNA表达。误差条，平均值±SD。右边，在暴露于媒介物(v)或浓度增加的Fe(化合物I)3 24小时之后，MV4-11细胞中c-PARP1、MYC和γH2AX蛋白质水平的蛋白质印迹分析。C，自图22和23中所示的代表性实例FRET曲线计算的ΔT1/2值，其中对各曲线重复至少三次。相对于各所测试的化合物的log[药物]mol/L标绘各寡核苷酸的ΔT1/2。
图14显示ABCG2在对Fe(化合物I)3的抗性中的作用。(A)用单独的Fe(化合物I)3或与50nm Kol43组合(▼)治疗的Raji(●)和Raji/化合物IR(■)的浓度-存活曲线。(B)用Fe(化合物I)3治疗的经空载体(●)或表达ABCG2的载体(■)转染的HEK-293克隆R5的浓度-存活曲线。
图15显示AML细胞系中化合物I对KLF4和CDKN1A(p21)的诱导。A)用化合物I以所列浓度治疗24小时之后的KLF4 mRNA诱导。B)AML细胞系中CDKN1AmRNA表达的浓度依赖性增加。C)在暴露于媒介物(v)或浓度增加的化合物I 24小时之后，MV4-11细胞中CDKN1A蛋白质水平的蛋白质印迹分析。D)p21 mRNA的时间依赖性增加。E)与媒介物(V)相比，随暴露于500nM化合物I(A)的持续时间而变的MV4-11细胞中CDKN1A蛋白质水平的蛋白质印迹分析。所有mRNA测量均通过qRT-PCR进行并相对于GAPDH上样对照进行图示。误差条，来自3次重复实验的±SD。
图16显示AML细胞系中，化合物I以剂量依赖性和时间依赖性方式诱导G0/G1细胞周期停滞。A)在图16A-C的下图中定量的MV4-11、KG-1和EOL-1细胞中CDK4和CCND3蛋白质水平的代表性蛋白质印迹。B)在暴露于IC50浓度的化合物I指定时间之后，CDK4和CCND3蛋白质水平。蛋白质水平自3次独立蛋白质印迹定量，并且图示为相对于媒介物的倍数变化。误差条，±SD。C)随化合物I暴露(MV4-11细胞500nM，KG-1细胞600nM，且EOL-1细胞300nM)持续时间而变的CDK4和CCND3蛋白质水平的代表性蛋白质印迹。V-媒介物，A-化合物I。
图17显示化合物I处理以时间依赖性和浓度依赖性方式诱导细胞凋亡。A)显示早期相对于晚期凋亡细胞的分布的直方图。B)随时间而变的经化合物I处理相对于经媒介物处理的MV4-11、KG-1和EOL-1细胞中的总凋亡细胞。误差条，来自2次重复实验的±SD。
图18显示MV4-11细胞中由化合物I调控的通路。A)通过用媒介物或500nM化合物I处理6小时的MV4-11细胞的RNA-seq分析所检测的差异表达基因的基因本体分析(GO)。使用广泛分子标识数据库(MSigDB)计算GO项和p值。B)6小时后，经媒介物和化合物I(500nM)处理的MV4-11细胞中的归一化蛋白质水平。蛋白质水平通过反相蛋白质阵列来检测。GraphPad Prism中所产生的热图，3个重复样品的平均值。C)利用MSigDB的差异表达蛋白质的GO分析。
图19显示AML细胞中化合物I对MYC表达的调控。A)用500nM化合物I处理指定时间的MV4-11、KG-1和EOL-1细胞中的总MYC蛋白质水平。蛋白质水平自3次独立蛋白质印迹定量、归一化至GAPDH并且图示为相对于媒介物的倍数变化。误差条，±SD。B)在A)中定量的代表性蛋白质印迹。C)相对于来自健康供体的PBMC，AML细胞系中MYC的基础蛋白质表达。D)在ChIP-qPCR分析中所使用的MYC特异性引物对的位置。E)用500nM化合物I处理2、6和24小时的MV4-11细胞中，MYC启动子处H3K27ac的ChIP-qPCR分析，图示为在归一化至输入之后相对于媒介物处理的倍数变化。F)用化合物I(500nM)或媒介物预处理3小时的MV4-11细胞中，通过RT-qPCR测定的MYC mRNA水平。在添加1μM放线菌素D之后，在所列时间点采取的样品。误差条，来自3次生物重复实验的±SD。通过TTEST使用excel所计算的*P值<0.05，**<0.005。
图20显示化合物I的细胞药理学。A)化合物I吸收到KG-1细胞中的时程。B)通过使KG-1细胞暴露于1μM化合物I，化合物I自所负载的细胞流出1或6小时。C)亲代单体化合物I的结构。D)Fe(化合物I)3的结构。E)吸收到MV4-11细胞中的化合物I和Fe(化合物I)3。
图21显示G-四链体结构的FRET测定分析。A)淬灭FRET测定的示意图。在低温下，G-四链体结构形成并且荧光FAM信号由BHQ1淬灭；随着温度上升，G4结构展开并且FAM信号增强。针对各药物浓度，计算荧光信号为max(T1/2)的50％时的温度，然后相对于药物浓度标绘ΔT1/2(药物T1/2-媒介物T1/2)。B)ds-DNA对照寡核苷酸的熔解曲线。C)与化合物I一起孵育6小时之后G4寡核苷酸的熔解曲线。误差条，来自3次生物重复实验的±SD。
图22显示Fe(化合物I)3使G-四链体寡核苷酸的Tm稳定。A-D)含有A)人类端粒、B)MYC基因启动子、C)rRNA基因座和D)KIT基因启动子的G-四链体序列的5'FAM-3'BHQ1双标记寡核苷酸的熔解曲线。误差条，来自3次生物重复实验的±SD。
具体实施方式
鉴于前述与鉴定BRCA1或BRCA2功能丧失引起细胞超敏性但不导致个体骨髓抑制的药物有关的挑战，已鉴定化合物I。出乎意料地发现化合物I导致DNA损伤，并且存在同源重组缺陷的细胞对此药物的超敏性与其对奥拉帕利的超敏性一样，所述奥拉帕利是经FDA批准的PARP抑制剂。化合物I加入有限的药物库，所述药物库可以利用同源重组的缺陷而不导致骨髓抑制。
还进行了关于作用机制和对化合物I的抗性的机理研究，以便鉴定可以引导组合药物研究的合成致死相互作用。如本文所述，化合物I胞内转化成Fe复合物(Fe(化合物I)3)，其为药物的活性形式。化合物I在如由γH2AX积聚和病灶形成所记录的早期时间点下产生DNA损伤。发现BRCA1和BRCA2缺陷型细胞对化合物I的超敏性与对奥拉帕利的超敏性程度相当。Raji细胞中对化合物I的抗性与流出性转运蛋白ABCG2的上调相关联并且抗性部分地由ABCG2抑制逆转。特别关注化合物I利用同源重组缺陷的能力，因为与丧失此修复功能而引起超敏性的所有其他药物不同，化合物I即使在最大耐受剂量下也不会产生骨髓抑制。
关注化合物I是因为其是表现出对广泛范围的实体瘤和恶性血液病两者的强细胞毒性并且不会导致骨髓抑制的新颖类别化合物的成员。本文所报告的关键发现是化合物I单体可以胞内转化成含有亚铁Fe原子和三个化合物I分子的活性复合物，该活性复合物的胞内浓度可超过原来药物的胞内浓度。化合物I和/或其具有铁的复合物导致DNA损伤，其中DNA修复需要BRCA1和BRCA2两者的功能，如由化合物I的合成致死所证明。就Raji淋巴瘤细胞而言，后天抗性与减少的药物吸收和标记的ABCG2药物流出泵的过表达相关联，所述ABCG2药物流出泵的抑制部分地逆转抗性。
与许多其他用于治疗淋巴瘤的化学治疗剂相比，化合物I的细胞积聚相对缓慢，但其表现为快速转化成Fe(化合物I)3，因为一在细胞中检测到原来形式的药物，此复合物就出现。按6小时计，Fe(化合物I)3的细胞含量超出原来形式的细胞含量的约18倍。Fe(化合物I)3复合物的效能仅比原来药物的效能小2倍，这可以通过以下事实来解释：虽然化合物I为中性的，但Fe(化合物I)3大得多并且含有2+电荷，预期这将削弱跨膜流入。在与Fe(化合物I)3复合物一起孵育的细胞中未检测到原来药物的事实表明Fe(化合物I)3是药物的活性胞内形式。已知含有2,10吲哚环结构的药物可螯合Fe和Zn。就化合物I而言，虽然Fe螯合物在细胞中充足，但Zn螯合物不可检测。实际上，Fe螯合物水平足够高使得暴露于化合物I的细胞变成粉红色。高水平的Fe(化合物I)3引发其形成是否消耗Fe细胞至细胞代谢削弱的点的问题，并且此问题仍然是进一步研究的令人感兴趣的点。不受任何特定理论的束缚，螯合可由胞内环境促进，因为当化合物I与完全组织培养基一起孵育时，未检测到胞外Fe(化合物I)3。
已采用由BRCA1/2功能丧失所产生的同源重组缺陷引起对某些类型的DNA损伤药物的超敏性的观测结果，以提高含铂药物顺铂和卡铂以及特别地就卵巢癌而言的PARP抑制剂奥拉帕利和尼拉帕尼(niraparib)的效用。Lederman等人,"Olaparib MaintenanceTherapy in Platinum-Sensitive Relapsed Ovarian Cancer,"N.Engl.J.Med.,2012；366(15):1382-92；Mirza等人,"Niraparib Maintenance Therapy in Platinum-Sensitive,Recurrent Ovarian Cancer,"N.Engl.J.Med.,2016；375(22):2154-64，这两者均以引用方式并入。已在多种其他肿瘤中以较低频率鉴定了各种程度的同源重组缺陷。Davies等人,"HRDetect is a Predictor of BRCA1 and BRCA2 Deficiency Based on MutationalSignatures,"Nat.Med.2017；23(4):517-525，其特此以引用方式并入。特别关注化合物I利用同源重组缺陷的能力，因为与丧失此修复功能而引起超敏性的所有其他药物不同，化合物I即使在最大耐受剂量下也不会产生骨髓抑制。Cercek等人,"Phase 1study ofCOMPOUND I HCl,an Inducer of KLF4,in Patients with Advanced or MetastaticSolid Tumors,"Invest.New Drugs,2015；33(5):1086-92，其特此以引用方式并入。因此，化合物I加入有限的药物库，所述药物库可以利用此重要的治疗窗。本文所报告的观测结果将γ-H2AX鉴定为临床药物效应的潜在生物标记物，并且指出朝向更详细的化合物I如何导致DNA损伤的研究的方式。Ivashkevich等人,"Use of theGamma-H2AX Assay to MonitorDNA Damage and Repair in Translational cancer Research,"Cancer Lett,2012；327(1-2):123-33，其特此以引用方式并入。
Raji淋巴瘤细胞中对化合物I的后天抗性的发展与减少的化合物I和Fe(化合物I)3复合物积聚相关联。Raji敏感细胞比抗性细胞中的胞内Fe(化合物I)3多16.5±1.94倍，这极佳地对应于Raji/化合物IR对敏感细胞的相对抗性(16.7±3.9倍)。Raji/化合物IR细胞的RNA-seq分析大多直接指出ABCG2的过表达为可能的抗性机制。蛋白质印迹分析证实蛋白质水平上调，并且ABCG2具有功能性，并且通过其抑制剂部分地逆转对化合物I以及托泊替康的抗性的能力建立直接参与化合物I抗性。在与预先形成的复合物一起孵育的抗性细胞中Fe(化合物I)3积聚减少的事实表明Fe(化合物I)3以及原来的药物可为用于ABCG2转运蛋白的底物。增加的ABCG2赋予抗性的已知类别的药物中无一者与化合物I或Fe(化合物I)3具有明显的结构类似性。因此，ABCG2可以调节对化合物I的抗性的发现扩展用于此重要转运蛋白的已知底物的范围。将需要在大面积细胞系中探索ABCG2是否可以用作对化合物I的敏感性的生物标记物。在大面积细胞系中研究关联图谱(Connectivity Map)(https://portals.broadinstitute.org/cmap/)未公开任何显著的化合物I与迄今为止所测试的其他药物中的任一者的毒性图案之间的类似性，进一步突出此化合物的独特性。
考虑到ABCG2、Ko143的特异性抑制剂不会完全逆转后天化合物I抗性，其他机制似乎很可能也有助于表型。就此而言，特别关注对卡铂的交叉抗性。卡铂并非已知的ABCG2底物，但其也会导致DNA损伤，并且已广泛报告转录偶联修复的上调有助于对卡铂和顺铂两者的抗性，这两者均在DNA中产生相同类型的加合物。Enoiu等人,"Repair of Cisplatin-induced DNA Interstrand Crosslinks by a Replication-independent PathwayInvolving Transcription-coupled Repair and Translesion Synthesis,"NucleicAcids Res.2012；40(18):8953-64，其特此以引用方式并入。尚待确定DNA修复能力的上调是否有助于卡铂和化合物I两者抗性。
本文中还描述，发现AML细胞中化合物I与CDKN1A上调和MYC下调、接着是G0-G1细胞周期停滞和细胞凋亡相关联。此外，AML中公认的关键致癌基因MYC的抑制与化合物I的细胞毒性有关。差异表达分析表明涉及DNA损伤，包括诱导γ-H2AX积聚，以及在化合物I处理后的细胞应激通路。先前的细胞药代动力学研究证明在细胞中化合物I从单体形式转换为亚铁复合物[Fe(化合物I)3]，并且此复合物是所述药物的主要胞内形式。在此研究中，我们证明亲代化合物I和Fe(化合物I)3复合物结合至G-四链体(G4)基序并且使所述G-四链体(G4)基序稳定。在关键致癌基因(例如MYC、KIT)以及rRNA基因和端粒的启动子中发现经Fe(化合物I)3复合物稳定的G4基序。二级DNA结构的稳定化对G4基序而言是特异性的，因为亲代化合物I和Fe(化合物I)3不与dsDNA相互作用。用预先形成的Fe(化合物I)3处理MV4-11 AML细胞还抑制MYC表达并诱导CDKN1A表达以及诱导细胞凋亡和DNA损伤通路。总之，所述结果支持化合物I对MYC及其下游靶基因的表达、细胞周期停滞和DNA损伤和应激反应的效应可与化合物I和Fe(化合物I)3对G-四链体DNA基序的作用关联的结论。
定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本申请所属领域中的普通技术人员通常所理解相同的含义。虽然可以在本申请的实践或测试中使用与本文所述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但在本文中描述代表性方法和材料。
贯穿本说明书提及的“一个实施方案(one embodiment)”或“实施方案(anembodiment)”意指结合实施方案所描述的特定特征、结构或特性包括在至少一个实施方案中。因此，短语“在一个实施方案中(in one embodiment)”或“在一个实施方案中(in anembodiment)”在本说明书通篇中各处的出现未必都指代同一个实施方案。此外，可在一个或多个实施方案中以任何合适的方式组合特定特征、结构或特性。此外，除非内容另外明确指定，否则如本说明书和所附权利要求中所使用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述/该(the)”包括复数指示物。还应当指出的是，除非内容明确指定，否则术语“或”通常以其包括“和/或”的含义来采用。
除非另外指示，否则本说明书和权利要求中所使用的表达成分数量、反应条件等的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非相反指示，否则本说明书和所附权利要求中所阐述的数值参数为近似值，这些值可取决于本申请试图获得的所需性质而变化。
贯穿本说明书，提供某些量的数值范围。应当理解，这些范围包括其中的所有子范围。因此，范围“50至80”包括其中所有可能的范围(例如，51-79、52-78、53-77、54-76、55-75、60-70等)。此外，给定范围内的所有值可以是由此涵盖的范围的端点(例如，范围50-80包括具有诸如55-80、50-75等的端点的范围)。
化合物I是指2-(5-氟-2-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-咪唑并[4,5-f][1,10]菲咯啉、其药学上可接受的盐、酯、前药、水合物、溶剂合物和异构体，其结构如下。
Figure BDA0002518693610000161
Fe(化合物I)3是指以下结构：
Figure BDA0002518693610000171
“药学上可接受的盐”包括酸加成盐和碱加成盐两者。
化合物I的药学上可接受的盐可为衍生自无机酸或有机酸的“药学上可接受的酸加成盐”，并且这种盐可为含有阴离子的药学上可接受的无毒性酸加成盐。例如，所述盐可包括由以下所形成的酸加成盐：无机酸，诸如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢溴酸、氢碘酸等等；有机碳酸，诸如酒石酸、甲酸、柠檬酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、葡糖酸、苯甲酸、乳酸、富马酸、马来酸等等；和磺酸，诸如甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、萘磺酸等等。
化合物I的药学上可接受的盐可通过本领域中众所周知的常规方法来制备。具体地，根据本发明的“药学上可接受的盐”可通过以下方式来制备：例如将化合物I溶解于可与水混溶的有机溶剂诸如丙酮、甲醇、乙醇或乙腈等等中；向其中添加过量有机酸或无机酸的水溶液；使由此获得的混合物沉淀或结晶。此外，该盐可通过进一步使来自其的溶剂或过量酸汽化；并且接着通过使用例如吸滤器干燥混合物或过滤提取物来制备。
如本文所用，术语“螯合物”意指由与至少一个双齿配体相关联并且任选地与一个或多个单齿或多齿配体相关联的中心金属构成的分子实体。例如，如所使用的“螯合物”意指由与化合物I的至少一个双齿配体相关联的中心金属构成的分子实体。在中心金属与配体中的任一者之间的相互作用中，配体与中心金属之间的键可包括共价键、离子键和/或配位共价键。
如本文所用，术语“复合物”或“金属复合物”意指金属和配体的配位复合物。例如，如本文所用，“复合物”或“金属复合物”意指金属和化合物I的配位复合物。
如本文所用，术语“金属”意指任何可与配体配位的碱金属、碱土金属、过渡金属、稀土金属、碱性金属和半金属。代表性金属包括过渡金属、镧系金属和锕系金属。在一些实施方案中，金属具有能够与配体相互作用的d-轨道。例如，金属可为铁、锌、铝、镁、铂、银、金、铬、镍、钛、铜、钪、锆、钒、钼、锰、钨和钴。在一个实施方案中，金属为铁。
除非另外指示，否则如本文所用，术语“酯”是指具有化学结构-(R)n-COOR’的化学部分，其中R和R’各自独立地选自由以下组成的组：烷基、环烷基、芳基、杂芳基(通过芳族环连接至氧原子)和杂脂环(通过芳族环连接)，并且n为0或1。
如本文所用，术语“前药”是指将经历体内代谢活化而产生亲代药物的前体化合物。前药常常是有用的，因为在一些情况下与其亲代药物相比前药可容易地施用。举例而言，与前药的亲代药物常常显示出不良的生物利用率不同，一些前药经由口服施用而生物可用。此外，前药与其亲代药物相比可显示出改进的在药物组合物中的溶解度。举例而言，由于药物的溶解度会不利地影响整个细胞膜中的渗透性，因此可以酯前药形式施用化合物I，以便提高药物递送效率。接着，一旦呈酯前药形式的化合物进入靶细胞中，化合物就可代谢水解至羧酸和活性实体中。
化合物I的水合物或溶剂合物包括在本发明的范围之内。如本文所用，“溶剂合物”意指由溶合作用(溶剂分子与本发明的活性剂的分子或离子的组合)形成的复合物，或由溶质离子或分子(本发明的活性剂)与一个或多个溶剂分子组成的聚集物。溶剂可为水，在此情况下溶剂合物可为水合物。水合物的实例包括但不限于半水合物、单水合物、二水合物、三水合物、六水合物等。本领域普通技术人员应当理解本发明化合物的药学上可接受的盐同样可以溶剂合物形式存在。溶剂合物通常经由水合或由本发明的无水化合物自然吸收水分形成，所述水合为制备本发明化合物的任一部分。包括水合物的溶剂合物可在化学计量比中一致，例如，每个溶剂合物分子或每个水合物分子具有两个、三个、四个盐分子。另一种可能性，例如，两个盐分子在化学计量上与三个、五个、七个溶剂分子或水合物分子相关。用于结晶的溶剂，诸如醇，尤其是甲醇和乙醇；醛；酮，尤其是丙酮；酯，例如乙酸乙酯；可以嵌入晶栅特别是药学上可接受的溶剂中。
本公开的化合物或其药学上可接受的盐可以含有一个或多个手性轴，使得阻转异构化成为可能。阻转异构体为由于围绕单键的位阻旋转而产生的立体异构体，其中因立体应变或其他促成因素所致的能量差异产生高至足以允许个别构象异构体分离的旋转屏障。本公开意在包括所有此类可能的异构体，以及其外消旋和光学纯形式，无论它们是否在本文中具体描绘。光活性异构体可使用手性合成子或手性试剂来制备，或使用常规技术例如色谱法和分级结晶来解析。用于制备/分离个别阻转异构体的常规技术包括由合适的光学纯前体进行手性合成或使用例如手性高压液相色谱法(HPLC)对外消旋体(或盐或衍生物的外消旋体)进行解析。
“立体异构体”是指由相同键所键合的相同原子构成但具有不可互换的不同三维结构的化合物。本发明考虑了各种立体异构体及其混合物，因为其涉及阻转异构化。
关于特定疾病或病症的术语“治疗(treat、treating或treatment)”包括预防所述疾病或病症，和/或减轻、改善、减缓或消除所述疾病或病症的症状和/或病变。一般来讲，如本文所用的术语是指减缓、缓解、减轻和移除疾病或疾患的症状。本文中的化合物I可以治疗有效量在制剂或药剂中，所述治疗有效量为可引起生物效应诸如DNA损伤、某些细胞(例如癌细胞)的细胞凋亡、某些细胞的增殖减少，或引起例如减缓、缓解、减轻或移除疾病或疾患的症状的量。所述术语还可以指降低或遏止细胞增殖速率(例如减缓或阻止肿瘤生长)或减少增殖癌细胞的数目(例如移除部分或所有肿瘤)。
当如上所述的治疗是指预防疾病、病症或疾患时，所述治疗被称为预防性治疗。施用所述预防剂可在增生性病症的特征性症状表现之前进行，使得疾病或病症得到预防或替代地延迟其进展。
如本文所用，术语“抑制”或“降低”细胞增殖意指当与不经受本申请的方法、组合物和组合的增殖性细胞相比时，如使用本领域普通技术人员已知的方法所测量的将细胞增殖量减缓、减少或例如遏止例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。
如本文所用，“细胞周期停滞”是指阻止在细胞中发生的导致其分裂和复制的一系列事件，这可由许多因素引起，包括但不限于DNA损伤、X-辐射、电离辐射和化学治疗剂。在某些实施方案中，“DNA损伤”和“细胞周期停滞”可互换使用。
如本文所用，术语“细胞凋亡”是指固有的细胞自毁或自杀程序。响应于触发刺激，细胞经受一连串的事件，包括细胞收缩、细胞膜出泡和彩色凝结以及破碎。这些事件以细胞转化为膜结合的粒子团簇(凋亡小体)告终，所述团簇之后由巨噬细胞吞噬。
如本文所用，“骨髓抑制”是指造血中的一种或多种组分的抑制，其体现在一种或多种细胞类型的异常水平中，所述细胞类型为此过程的产物。对于造血综述和造血细胞的特性，参见Clinical Immunology:Principles and Practice,第1卷,第2章,第15-24页(Lewis和Harriman编.Mosby—Year Book,Inc.1996)，其页面特此以引用方式并入。在一般水平上，骨髓抑制是指减少白细胞和/或血小板计数。在更特定的水平上，骨髓抑制还是指相对于正常水平抑制以下由造血产生的细胞中的一者或多者：B细胞、T细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和血小板。其他术语可与骨髓抑制互换使用并且对技术人员而言将显而易见。此类术语的非限制性实例包括“骨髓抑制(bone marrow suppression)”、“骨髓毒性”和“骨髓清除”。另一方面，因此，“骨髓恢复(myelorecovery)”与骨髓抑制相反。因此，在一个实施方案中，术语“骨髓活性”是指以下由造血产生的细胞的水平：B细胞、T细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞血小板、红细胞、血小板、骨髓和淋巴白细胞以及其他对技术人员而言显而易见的细胞。
如本文所用，术语“受试者”是指动物，诸如哺乳动物或非哺乳动物。例如，受试者可为需要治疗或预防癌症的哺乳动物，诸如人类。在本发明的上下文中，术语受试者可与术语患者互换使用。
“哺乳动物”包括人类，和驯养动物(诸如实验动物和家养宠物(例如猫、犬、猪、牛、绵羊、山羊、马、兔))与非驯养动物(诸如野生动物等等)两者。如本文所用，术语“患者”或“受试者”包括人类和动物。
“非哺乳动物”包括非哺乳无脊椎动物和非哺乳脊椎动物，诸如鸟(例如鸡或鸭)或鱼。
“药物组合物”是指本公开化合物与本领域中普遍接受用于将生物活性化合物递送至哺乳动物(例如人类)的介质的制剂。这种介质包括所有药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
“有效量”是指治疗有效量或预防有效量。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段下，有效地获得所需治疗结果诸如癌细胞死亡、肿瘤尺寸减小、生命期延长或预期寿命延长的量。化合物的治疗有效量可以根据诸如疾病状态、年龄、性别和受试者体重以及化合物在受试者中引发所需反应的能力的因素而变。可调整给药方案以提供最佳治疗反应。治疗有效量还是其中化合物的治疗有益效应超过其任何毒性或有害效应的量。“预防有效量”是指在必要的剂量和时间段下，有效地获得所需预防结果诸如肿瘤变小或细胞增殖变慢的量。通常，预防剂量在疾病之前或在疾病早期阶段用于受试者，使得预防有效量可以少于治疗有效量。
方法
本发明提供预防、减轻或治疗受试者的癌症的方法。
在本公开的一个实施方案中，提供一种预防、减轻或治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的
Figure BDA0002518693610000221
(化合物I)或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)，其中所述受试者在DNA修复基因中具有突变。在一个实施方案中，受试者是人类。在另一个实施方案中，受试者已患有癌症。
在另一个实施方案中，本公开涉及一种预防、减轻或治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括以具有一个或多个金属原子的复合物形式施用治疗有效量的一个或多个化合物I分子，其中所述受试者在DNA修复基因中具有突变。在一个实施方案中，所述一个或多个金属原子选自由以下组成的组：铁、锌、铝、镁、铂、银、金、铬、镍、钛、铜、钪、锆、钒、钼、锰、钨和钴。在一个实施方案中，所述一个或多个金属原子是铁。在某些实施方案中，复合物具有以下结构：
Figure BDA0002518693610000231
在一个实施方案中，DNA修复基因是同源重组基因。在某些实施方案中，DNA修复基因是同源重组(HR)依赖性脱氧核糖核酸(DNA)双链断裂(DSB)修复通路中的基因。技术人员应当了解HR依赖性DNA DSB修复通路经由同源机制修复DNA中的双链断裂(DSB)以重新形成连续的DNA螺旋。K.K.Khanna和S.P.Jackson,Nat.Genet.27(3):247-254(2001)，其特此以引用方式整体并入。HR依赖性DNA DSB修复通路的组分包括但不限于ATM、ATR、CHK1、CHK2、RPA、RAD51、RAD51L1、RAD51C、RAD51L3、DMC1、XRCC2、XRCC3、RAD52、RAD54L、RAD54B、BRCA1、BRCA2、RAD50、MRE11A和NBS1。其他涉及HR依赖性DNADSB修复通路的蛋白质包括调控因子诸如EMSY。Hughes-Davies等人,Cell,第115卷,第523-535页，其特此以引用方式整体并入。因此，在某些实施方案中，DNA修复基因是一个或多个选自由以下组成的组的基因：BRCA-1、BRCA-2、ATM、ATR、CHK1、CHK2、Rad51、RPA和XRCC3。在某些实施方案中，DNA修复基因是BRCA-1和/或BRCA-2。
在本公开的一个实施方案中，受试者在DNA修复基因中的突变是杂合的。在某些实施方案中，受试者在同源重组(HR)依赖性脱氧核糖核酸(DNA)双链断裂(DSB)修复通路中的基因突变是杂合的。因此，在某些实施方案中，同源重组(HR)依赖性脱氧核糖核酸(DNA)双链断裂(DSB)修复通路中的基因是一个或多个选自由以下组成的组的基因：BRCA-1、BRCA-2、ATM、ATR、CHK1、CHK2、Rad51、RPA和XRCC3。在某些实施方案中，DNA修复基因是BRCA-1和/或BRCA-2。
在本公开的一个实施方案中，受试者在DNA修复基因中的突变是纯合的。在某些实施方案中，受试者在同源重组(HR)依赖性脱氧核糖核酸(DNA)双链断裂(DSB)修复通路中的基因突变是纯合的。因此，在某些实施方案中，同源重组(HR)依赖性脱氧核糖核酸(DNA)双链断裂(DSB)修复通路中的基因是一个或多个选自由以下组成的组的基因：BRCA-1、BRCA-2、ATM、ATR、CHK1、CHK2、Rad51、RPA和XRCC3。在某些实施方案中，DNA修复基因是BRCA-1和/或BRCA-2。
在一个实施方案中，向受试者施用治疗有效量的化合物I，或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)，以治疗或预防癌症。技术人员应当了解在本公开的上下文内，可治疗或预防多种癌症。因此，在一个实施方案中，癌症选自由以下组成的组：血红素癌(heme cancer)、结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、淋巴结癌、白血病、肾癌、结肠癌、前列腺癌、脑癌、头颈癌、骨癌、喉癌和口腔癌、尤文氏肉瘤、皮肤癌、肾癌和心脏癌。在某些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、肺癌、淋巴结癌、结肠癌、白血病、肾癌和前列腺癌。在一个实施方案中，癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，癌症是恶性血液病。恶性血液病的实例包括但不限于白血病、淋巴瘤、霍奇金氏病和骨髓瘤。此外，急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性早幼粒细胞白血病(APL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性中性粒细胞白血病(CNL)、急性未分化性白血病(AUL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、前淋巴细胞性白血病(PML)、青少年型慢性髓单核细胞白血病(JMML)、成人T细胞ALL、AML伴三系骨髓发育不良(AMLITMDS)、混合谱系白血病(MLL)、嗜酸性粒细胞白血病、套细胞淋巴瘤、骨髓异常增生综合征(MDS)(例如高风险MDS)、骨髓增生性病症(MPD)和多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施方案中，癌症是急性骨髓性白血病。在一些实施方案中，癌症是慢性骨髓性白血病。在一些实施方案中，癌症是淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症是高风险骨髓异常增生综合征。
在一个实施方案中，向受试者施用治疗有效量的化合物I，或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)，以治疗或预防BRCA相关的癌症。技术人员应当了解多种癌症与BRCA相关联。在一个实施方案中，BRCA相关的癌症具有BRCA-1和/或BRCA-2基因的一个或多个突变。
癌细胞可具有一种表型，其特征在于HR依赖性DNA DSB修复通路的组分缺陷，即癌细胞中所述通路的组分的活性降低或消除。具有这种表型的癌细胞的通路组分例如上文所列的组分可能存在缺陷，即癌细胞中所述组分的表达和/或活性可能降低或消除，例如借助于编码核酸或编码调控因子的基因中的突变、多态性或表观遗传修饰，诸如高甲基化。
在一些优选实施方案中，癌细胞具有BRCA1和/或BRCA2缺陷表型，即癌细胞中BRCA1和/或BRCA2活性降低或消除。具有此表型的癌细胞的BRCA1和/或BRCA2可能存在缺陷，即癌细胞中BRCA1和/或BRCA2的表达和/或活性可能降低或消除，例如借助于编码核酸或编码调控因子的基因(例如编码BRCA2调控因子的EMSY基因)(Hughes-Davies等人,Cell,第115卷,第523-535页，其特此以引用方式并入)中的突变、多态性或表观遗传修饰，诸如高甲基化。
BRCA1和BRCA2是已知的肿瘤抑制因子，其野生型等位基因经常在杂合载体的肿瘤中丢失(Jasin M.Oncogene.2002年12月16日；21(58):8981-93；Tutt等人Trends Mol Med.(2002)8(12):571-6)。BRCA1和/或BRCA2突变与乳腺癌的关联在本领域中充分表征(RadiceP J Exp Clin Cancer Res.2002年9月；21(3增刊):9-12，其特此以引用方式并入)。还已知编码BRCA2结合因子的EMSY基因的扩增与乳腺癌和卵巢癌相关联。
BRCA1和/或BRCA2突变的载体也具有较高的卵巢癌、前列腺癌和胰腺癌风险。
在其他优选实施方案中，癌细胞可具有ATM、ATR、CHK1、CHK2、Rad51、DSS1、RPA和/或XRCC3缺陷表型，即癌细胞中这些组分中的一者或多者的活性降低或消除。例如，癌细胞的ATM、ATR、CHK1、CHK2、Rad51、DSS1、RPA和/或XRCC3可能存在缺陷，即癌细胞中ATM、ATR、CHK1、CHK2、Rad51、DSS1、RPA和/或XRCC3的表达和/或活性可能降低或消除，例如借助于编码核酸或编码调控因子的基因中的突变、多态性或表观遗传修饰，诸如高甲基化。
在一个实施方案中，具有突变型DNA修复基因、被施用治疗有效量的化合物I或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)的受试者是动物。在某些实施方案中，受试者是哺乳动物。因此，在本公开的上下文内的受试者可为人类、驯养动物(例如实验动物)、家养宠物(例如猫、犬、猪、牛、绵羊、山羊、马、兔)和非驯养动物诸如野生动物等等。在一个实施方案中，受试者是人类。
骨髓抑制
在一个实施方案中，本公开的方法涉及向受试者施用治疗有效量的化合物I，或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物，其中相对于未施用治疗有效量的化合物I的受试者，所述受试者中骨髓抑制的发病率被预防或降低。在某些实施方案中，已向未施用治疗有效量的化合物I的受试者施用用于治疗或预防癌症的非化合物I的化学治疗剂。因此，在一个实施方案中，本公开的方法涉及向受试者施用治疗有效量的化合物I，或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)，其中相对于已施用非化合物I的化学治疗剂的受试者，所述受试者中骨髓抑制的发病率被预防或降低。如本文所用，骨髓抑制一般是指造血中的一种或多种组分(例如骨髓活性)的抑制，其体现在一种或多种细胞类型的异常水平中，所述细胞类型为此过程的产物。造血中的一种或多种组分(例如骨髓活性)的抑制可指代例如白细胞计数和/或血小板计数的抑制。因此，在一个实施方案中，提供一种本公开的预防、减轻或治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的化合物I或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)，其中所述受试者在DNA修复基因中具有突变，并且其中相对于未施用治疗有效量的化合物I的受试者，所述受试者经历小于90％的骨髓活性降低。举例而言，相对于未施用治疗有效量的化合物I的受试者，所述受试者经历小于90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％的骨髓活性降低。在一个实施方案中，相对于未施用治疗有效量的化合物I的受试者，施用治疗有效量的化合物I的受试者经历小于10％的骨髓活性降低。在一个实施方案中，相对于未施用治疗有效量的化合物I的受试者，施用治疗有效量的化合物I的受试者未经历骨髓活性降低。
在一个实施方案中，提供一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的化合物I，或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)，其中所述受试者在DNA修复基因中具有突变。在某些实施方案中，可在患有癌症的受试者中通过施用治疗有效量的化合物I或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)来治疗各种与癌症相关并且对技术人员而言显而易见的病理状态。因此，在一个实施方案中，受试者经历与癌症相关的肿瘤的尺寸的缩小或减小。肿瘤尺寸的缩小或减小可为约1％肿瘤尺寸缩小或减小至约100％肿瘤尺寸缩小或减小不等，包括其间的所有整数和范围。举例而言，肿瘤尺寸的缩小或减小可为约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。在一个实施方案中，受试者经历与癌症相关的肿瘤的完全消除(即100％肿瘤尺寸缩小或减小)。在另一个实施方案中，受试者经历与癌症相关的肿瘤中新血管形成或血管生成的抑制、降低或减少。与癌症相关的肿瘤中新血管形成或血管生成的降低或减少可为约1％新血管形成或血管生成减少或降低至约100％新血管形成或血管生成减少或降低不等，包括其间的所有整数和范围。举例而言，新血管形成或血管生成的减少或降低可为约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。在一个实施方案中，受试者经历与癌症有关的新血管形成或血管生成的完全减少或降低(即100％新血管形成或血管生成减少或降低)。
在一个实施方案中，本公开涉及一种用于杀死癌细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与治疗有效量的化合物I或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)接触。在某些实施方案中，癌细胞在一个或多个选自由以下组成的组的基因中具有缺陷：BRCA-1、BRCA-2、ATM、ATR、CHK1、CHK2、Rad51、RPA和XRCC3。
在一个实施方案中，本公开涉及一种用于诱导癌细胞中细胞周期停滞的方法，所述方法包括使所述细胞与治疗有效量的
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或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)接触。在某些实施方案中，癌细胞在一个或多个选自由以下组成的组的基因中具有缺陷：BRCA-1、BRCA-2、ATM、ATR、CHK1、CHK2、Rad51、RPA和XRCC3。
在一个实施方案中，提供一种用于使受试者中的G-四链体(G4)稳定的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的化合物I，或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)。在另一个实施方案中，提供一种用于使受试者中的G-四链体(G4)稳定的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含化合物I或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)和至少一种额外的如本文所述的治疗活性剂的药物组合。在一些实施方案中，提供一种用于使受试者中的G-四链体(G4)稳定的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含化合物I或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)的医药组合，以及在已向所述受试者施用前述化合物之前、期间或之后施用放射疗法或至少一种额外的治疗活性剂。
在一个实施方案中，以约1毫克/天至约3克/天的剂量施用化合物I，或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)。在某些实施方案中，以约1毫克/天至约200毫克/天的剂量施用化合物I，或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)。在某些实施方案中，以约50毫克/天至约200毫克/天的剂量施用化合物I，或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)。
组合疗法
在一个实施方案中，本发明提供一种包含化合物I与至少一种额外的治疗活性剂的组合疗法。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗有需要的患者中与细胞增殖相关的疾患的方法。在一个实施方案中，本发明提供一种治疗癌症或肿瘤的方法。所述方法包括向有需要的患者共同施用治疗有效量的化合物I或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、酯、溶剂合物和/或前药和至少一种额外的治疗活性剂。在一个实施方案中，所述至少一种额外的治疗活性剂是奥拉帕利。
术语“共同施用(co-administration或coadministration)”是指以协同方式一起施用(a)化合物I或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)和(b)至少一种额外的治疗活性剂。例如，共同施用可为同时施用、依序施用、重叠施用、间隔施用、连续施用或它们的组合。在一个实施方案中，将化合物I或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)和至少一种额外的治疗活性剂配制成单剂型。在另一个实施方案中，化合物I或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)和至少一种额外的治疗活性剂以单独剂型提供。
药物制剂
在另一个实施方案中，本发明提供一种包含与药学上可接受的赋形剂或载体组合的作为活性成分的如本文所公开的治疗有效量的化合物I或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)的药物组合物和/或组合。出于多种目的将赋形剂添加到制剂中。
在一些实施方案中，可将化合物I或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)和至少一种治疗活性剂配制成单一药物组合物和/或组合。在一些实施方案中，可将化合物I或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)和至少一种治疗活性剂配制成包含药学上可接受的赋形剂或载体的单独药物组合物和/或组合。
在特定实施方案中，可将化合物I或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)和至少一种治疗活性剂配制成单一药物组合物和/或组合组合物。在另一个实施方案中，组合物可以约1mg至约1g的量包含如本文所公开的化合物I或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)。在另一个实施方案中，所述量为约5mg至约500mg。在另一个实施方案中，所述量为约20mg至约400mg。在另一个实施方案中，所述量为约50mg至约300mg。在另一个实施方案中，所述量为约100mg至约200mg。在另一个实施方案中，化合物为化合物I的盐、酯、溶剂合物或前药。
在另一个实施方案中，药物组合物可包含浓度为约0.1mg/ml至约10mg/ml的化合物I或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)。在另一个实施方案中，所述浓度为约0.5mg/mL至约5mg/ml。在另一个实施方案中，所述浓度为约0.75mg/mL至约4.5mg/ml。在另一个实施方案中，所述浓度为约3mg/ml至约5mg/ml。
在另一个实施方案中，化合物为化合物I的盐、酯、溶剂合物或前药。在另一个实施方案中，组合物可包含化合物I或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、酯、溶剂合物和/或前药，以及PARP抑制剂。在另一个实施方案中，PARP抑制剂为奥拉帕利。
在另一个实施方案中，组合物可包含化合物I或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、酯、溶剂合物和/或前药和奥拉帕利，其中组合物中奥拉帕利的量为约10mg至约800mg。在另一个实施方案中，奥拉帕利的量为约20mg至约600mg。在另一个实施方案中，奥拉帕利的量为约100mg至约500mg。在另一个实施方案中，奥拉帕利的量为约300mg至约400mg。
可将药学上可接受的赋形剂添加到组合物/制剂中。例如，可将稀释剂添加到本发明的制剂中。稀释剂提高固体药物组合物和/或组合的容积，并且可使含有组合物和/或组合的药物剂型更易于患者和护理者处理。用于固体组合物和/或组合的稀释剂包括例如微晶纤维素(例如AVICEL)、微细纤维素、乳糖、淀粉、预胶化淀粉、碳酸钙、硫酸钙、糖、葡聚糖、糊精、右旋糖、磷酸氢钙二水合物、磷酸三钙、高岭土、碳酸镁、氧化镁、麦芽糖糊精、甘露糖醇、聚甲基丙烯酸酯(例如EUDRAGIT(r))、氯化钾、粉状纤维素、氯化钠、山梨糖醇和滑石。
压实成诸如片剂的剂型的固体药物组合物和/或组合可包含赋形剂，其功能包括帮助活性成分和其他赋形剂在压缩后结合在一起。用于固体药物组合物和/或组合的粘合剂包括阿拉伯胶、海藻酸、卡波姆(例如卡波普)、羧甲基纤维素钠、糊精、乙基纤维素、明胶、瓜尔胶、黄蓍胶、氢化植物油、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素(例如KLUCEL)、羟丙基甲基纤维素(例如METHOCEL)、液体葡萄糖、硅酸镁铝、麦芽糖糊精、甲基纤维素、聚甲基丙烯酸酯、聚维酮(例如KOLLIDON、PLASDONE)、预胶化淀粉、海藻酸钠和淀粉。
可通过将崩解剂添加到组合物和/或组合中来提高压实的固体药物组合物和/或组合在患者胃中的溶解速率。崩解剂包括海藻酸、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠(例如AC-DI-SOL和PRIMELLOSE)、胶态二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮(例如KOLLIDON和POLYPLASDONE)、瓜尔胶、硅酸铝镁、甲基纤维素、微晶纤维素、波拉克林钾、粉状纤维素、预胶化淀粉、海藻酸钠、羟基乙酸淀粉钠(例如EXPLOTAB)、马铃薯淀粉和淀粉。
可添加助流剂以改善非压实的固体组合物和/或组合的流动性并提高剂量的准确性。可用作助流剂的赋形剂包括胶态二氧化硅、三硅酸镁、粉状纤维素、淀粉、滑石和磷酸三钙。
当通过压实粉状组合物和/或组合来制备诸如片剂的剂型时，组合物和/或组合经受来自冲头和染料的压力。一些赋形剂和活性成分具有粘附于冲头和染料的表面的趋势，这会导致产物具有凹痕和其他表面不平整性。可以将润滑剂添加到组合物和/或组合中以减少粘附并使产品易于从染料释放。润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、单硬脂酸甘油酯、棕榈酰基硬脂酸甘油酯、氢化蓖麻油、氢化植物油、矿物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、月桂基硫酸钠、硬脂酰富马酸钠、硬脂酸、滑石和硬脂酸锌。
调味剂和增味剂使剂型对患者来说更加可口。可包含在本发明的组合物和/或组合中的用于药物产品的常用调味剂和增味剂包括麦芽酚、香草醛、乙基香草醛、薄荷醇、柠檬酸、富马酸、乙基麦芽酚和酒石酸。
还可使用任何药学上可接受的着色剂来使固体和液体组合物和/或组合染色，以改善其外观和/或便于患者鉴定产品和单位剂量水平。
可使用本发明的化合物I或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、酯、溶剂合物和/或前药和任何其他固体赋形剂来制备成呈液体药物组合物和/或组合形式，在赋形剂中的组分溶解于或悬浮于液体载体诸如水、植物油、醇、聚乙二醇、丙二醇、甘油或聚乙二醇15羟硬脂酸酯(Solutol)中。
液体药物组合物和/或组合可含有乳化剂以使不可溶于液体载体的活性成分或其他赋形剂均匀地分散在整个组合物和/或组合中。可用于本发明的液体组合物和/或组合的乳化剂包括例如明胶、蛋黄、酪蛋白、胆固醇、阿拉伯树胶、黄蓍胶、角叉菜、果胶、甲基纤维素、卡波姆、十八十六醇和十六醇。
液体药物组合物和/或组合还可含有增粘剂以改善产品的口感和/或涂覆胃肠道的内层。这些剂包括阿拉伯树胶、海藻酸膨润土、卡波姆、羧甲基纤维素钙或羧甲基纤维素钠、十八十六醇、甲基纤维素、乙基纤维素、明胶瓜尔胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糖糊精、聚乙烯醇、聚维酮、碳酸丙烯酯、海藻酸丙二醇酯、海藻酸钠、羟基乙酸淀粉钠、淀粉黄蓍胶和黄原胶。
可添加甜味剂诸如天冬甜素、乳糖、山梨糖醇、糖精、糖精钠、蔗糖、天冬甜素、果糖、甘露糖醇和转化糖以改善味道。
可添加安全摄取水平的防腐剂和螯合剂诸如醇、苯甲酸钠、丁基化羟基甲苯、丁基化羟基苯甲醚和乙二胺四乙酸以改善储存稳定性。
液体组合物和/或组合还可含有缓冲剂诸如葡萄糖酸、乳酸、柠檬酸或乙酸、葡萄糖酸钠、乳酸钠、柠檬酸钠或醋酸钠。赋形剂和所用量的选择可通过配制科学家基于经验并考虑本领域中的标准程序和参考著作来容易地确定。
本发明的固体组合物和/或组合包括粉末、颗粒、聚集体和压实的组合物和/或组合。剂量包括合适于经口、经颊、经直肠、肠胃外(包括皮下、肌内和静脉内)、吸入和经眼施用的剂量。尽管在任何给定情况下最合适的施用将取决于所治疗的疾患的性质和严重程度，但本发明的最优选途径为口服。剂量可方便地以单位剂型存在并且通过药学技术中众所周知的任何方法来制备。
剂型包括固体剂型如片剂、粉剂、胶囊、栓剂、药囊、糖锭和锭剂，以及液体糖浆、悬浮液、气雾剂和酏剂。
本发明的剂型可为含有在硬壳或软壳内的本发明的组合物和/或组合优选是粉状或颗粒状固体组合物和/或组合的胶囊。壳可由明胶来制备并且任选地含有增塑剂(诸如甘油和山梨糖醇)，和乳浊剂或着色剂。
用于制片或胶囊填充的组合物和/或组合可通过湿法制粒来制备。在湿法制粒中，将呈粉末形式的活性成分和赋形剂中的一些或所有掺混并且接着在导致粉剂凝集成颗粒剂的液体(通常为水)存在下进一步混合。对颗粒进行筛选和/或研磨、干燥并且接着筛选和/或研磨至所需粒度。可将颗粒制片，或可在制片之前添加其他赋形剂，诸如助流剂和/或润滑剂。
制片组合物和/或组合可通过干式掺混来常规地制备。例如，可将活性剂和赋形剂的掺混的组合物和/或组合压成块或片并且接着捣碎成压实的颗粒剂。可随后将压实的颗粒剂压缩成片剂。
作为干法制粒的替代方案，可使用直接压缩技术将掺混的组合物和/或组合直接压缩成压实剂型。直接压缩产生更多的均匀片剂而非颗粒剂。特别良好地适于直接压缩制片的赋形剂包括微晶纤维素、喷干乳糖、磷酸二钙二水合物和胶态二氧化硅。这些和其他赋形剂在直接压缩制片中的适当用途对本领域中具有特别是直接压缩制片的配制挑战的经验和技能的那些人员而言是已知的。
本发明的胶囊填充可包含关于制片所描述的前述掺混物和颗粒中的任一者；然而，它们不经受最终制片步骤。
可根据本领域中已知的方法将活性成分和赋形剂配制成组合物和/或组合和剂型。
在一个实施方案中，剂型可作为药盒提供，所述药盒包含化合物I或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、酯、溶剂合物和/或前药和药学上可接受的赋形剂和载体作为单独组分。在一个实施方案中，剂型可作为药盒提供，所述药盒包含化合物I或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、酯、溶剂合物和/或前药、至少一种额外的治疗活性剂和药学上可接受的赋形剂和载体作为单独组分。在一些实施方案中，剂型药盒允许医师和患者在使用之前通过溶解、悬浮或混合化合物I或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、酯、溶剂合物和/或前药与药学上可接受的赋形剂和载体来配制口服溶液或注射溶液。在一个实施方案中，与预先配制的化合物I或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、酯、溶剂合物和/或前药的制剂相比，提供化合物I或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、酯、溶剂合物和/或前药的剂型药盒具有改善的稳定性。
在一个实施方案中，在制剂或组合物和/或组合中，本发明的药物制剂或组合物和/或组合含有25-100重量％或50-100重量％的如本文所述的化合物I或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、酯、溶剂合物和/或前药。
在另一个实施方案中，本发明的方法包括以上述药物制剂或组合物和/或组合形式施用治疗有效量的化合物I或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物(包括金属螯合物，诸如铁、锌和其他金属)。在特定实施方案中，所述方法用于预防、减轻或治疗受试者的癌症。在另一个实施方案中，所述方法用于杀死癌细胞。在另一个实施方案中，所述方法用于诱导癌细胞中细胞周期停滞。
以下实施例进一步说明了本发明但不应解释为以任何方式限制其范围。
实施例
实施例1：实施例2-7的材料和方法
药物和试剂
化合物I和氘代化合物I(化合物I-d6)由APTOSE Biosciences(San Diego,CA)提供。清洁剂相容性蛋白质测定试剂盒，DCTM蛋白质测定购自BioRad Laboratories,Inc.(Hercules,CA)。CellTiter
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Aqueous单溶液细胞增殖测定(MTS)购自Promega(Madison,WI)。PARP、MCL-1、BAD、BIK、Na+/K+ATP酶抗体来自Cell Signaling Technology,Inc.(Danvers,MA)。pSer139 H2AX和ATM抗体购自Abcam(Cambridge,UK)。ABCG2抗体获自KAMIYABiomedical(Tukwila,WA)。Ko143和pSer1981-ATM抗体获自Millipore Sigma(St.Louis,MO)。奥拉帕利购自Selleckchem(Houston,TX)。卡铂和托泊替康获自UCSD Moores CancerCenter Pharmacy。
细胞类型和培养
人类伯基特淋巴瘤细胞系Raji获自美国典型培养物保藏中心并在37℃、5％CO2下在补充有10％胎牛血清(ATCC)的RPMI 1640培养基(ATCC)中培养。通过在6个月时段内暴露于浓度逐渐升高的化合物I来产生化合物I抗性Raji(Raji/化合物IR)细胞系。CAOV3细胞获自ATCC并在补充有10％胎牛血清的完全DMEM中培养。受控MCF7载体和BRCA1 shRNA亚克隆获自Dr.Simon Powell(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center)并在具有10％胎牛血清的EMBM中培养。MCF10A和hTERT-IMEC克隆获自Dr.Ben Ho Park(Johns HopkinsUniversity)。HCT116 BRCA2+/+细胞和BRCA2-/-细胞获自Dr.Samuel Aparicio(BritishColumbia Cancer Research Centre)。PEO1和PEO4细胞获自Dr.Sharon Cantor(University of Massachusetts)并且这些细胞系在如先前公布的相同条件下培养。Sakai等人,Functional restoration of BRCA2 protein by secondary BRCA2 mutations inBRCA2-mutated ovarian carcinoma,Cancer Res.2009；69(16):6381-6；Konishi等人,Mutation of a single allele of the cancer susceptibility gene BRCA1 leads togenomic instability in human breast epithelial cells,Proc.Natl.Acad.Sci.2011；108(43):17773-8；Xu等人,CX-5461is a DNA G-quadruplex stabilizer with selectivelethality in BRCA1/2deficient tumours,Nature Communications 2017；8:14432，所有这些文献特此以引用方式并入。
细胞毒性研究
将细胞铺在96孔板中，并用所指示的药物处理细胞5天。使用购自Promega的CellTiter 96AQueous单溶液(MTS)细胞增殖测定来测量细胞存活率，并且使用GraphPadPrism 6软件计算IC50值。
生物素化和免疫印迹程序
为了定量ABCG2表达，用EZ-LINK sulfo-NHS-SS-biotin(Thermo Scientific,Pittsburg,PA)使细胞表面生物素化并使其经受如先前所报告的蛋白质印迹分析并经受蛋白质印迹分析。Tsai CY,Liebig JK,Tsigelny IF,Howell SB,The copper transporter 1(CTR1)is required to maintain the stability of copper transporter 2(CTR2).Metallomics2015；7:1477-87，其特此以引用方式并入。
RNA-seq和qRT-PCR
使用RNeasy微型试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA)从三个独立样品中分离总细胞RNA用于各实验。将RNA-seq样品提交至IGM Genomics Center,University of California,San Diego,La Jolla,CA(http://igm.ucsd.edu/genomics/)，以便使用AgilentBioanalyzer进行库生成和验证。在Illumina序列发生器HiSeq4000上进行测序。由OHSU进行生物信息学分析。用于证实ABCG2过表达的正向引物和反向引物分别是：5′-TTA-GGA-TTG-AAG-CCA-AAG-G-3′和5′-TAG-GCA-ATT-GTG-AGG-AAA-ATA-3′。
化合物I的细胞药理学
将暴露于化合物I或Fe(化合物I)3的细胞在含有5ng氘代化合物I标准物的乙腈中均质化。采用与使用正离子模式电喷射离子化(ESI)作为离子源的Thermo LCQdeca质谱仪连接的Agilent 1260液相色谱(LC)系统，在UCSD分子质谱设备上分析样品。分别地，ESI离子源电压设定为5kV，鞘气临率为80单元，辅助气临率为20单元，毛细管温度为250℃。使用具有0.1％甲酸的水作为流动相A和具有0.1％甲酸的乙腈作为流动相B，利用PhenomenexKinetex Biphenyl柱(ID 2.1mm×长50mm，粒度2.6μm)进行LC分离。将LC流速设定为0.30毫升/分钟。LC梯度在10分钟内从5％流动相B上升至95％流动相B，在95％B下保持2分钟，在1分钟内恢复至5％B，并且接着在5％B下保持6分钟。在正离子模式ESI-MS/MS分析下，自位于m/z 368([M+H]+)处的化合物I的分子离子峰，在m/z 353处观察到其主要碎片峰，其中归一化碰撞能量为45％；并且自位于m/z 374([M+H]+)处的化合物I-d6的分子离子峰，在m/z359处观察到其主要碎片峰，其中归一化碰撞能量为45％。选择反应监测(Selectedreaction monitoring，SRM)模式用于获取m/z 353和m/z 359碎片峰。与外加化合物I-d6的量有关的SRM峰面积比(化合物I/化合物I-d6)用于定量样品中的化合物I和Fe(化合物I)3。使用相同的柱、梯度和流速检测Fe(化合物I)3，使用Agilent 1100HPLC和Orbitrap XL(Thermo)质谱仪采用Thermo IonMax ESI界面进行检测。在这些情况下，将Fe(化合物I)3洗脱约11.5分钟。将10:1分散流用于0.3毫升/分钟的洗脱剂流速，使得分散后将约0.030毫升/分钟引入ESI中。离子源MS参数如下：毛细管温度250℃、鞘气流量20单元、正极性、源电压5.0kV、毛细管电压22V和镜筒透镜80V。傅里叶变换(Fourier transform)MS(Orbitrap)参数为：FTMS AGC 1e6、FTMS微扫描平均为2和FTMS完整扫描最大离子时间为500毫秒。使用15,000(在400m/z处，峰m/z除以峰宽，以半极大处全宽度形式给出)的分辨率参数。对于MS-MS CID谱，使用45％的归一化碰撞能量。
Fe(化合物I)3的合成和表征
将浓缩水原料中的五摩尔当量的亚铁离子(如FeSO4)添加到乙醇中的化合物I中，这产生深红色沉淀物，随后将该深红色沉淀物溶解于DMSO中并通过HPLC和质谱来表征。Fe(化合物I)3的纯度＞95％并且在完全RPMI-1640培养基中稳定至少5天。
彗星测定
彗星测定试剂盒购自Trevigen(Gaithersburg,MD)并且根据生产商的说明书进行中性彗星测定。用Fluorescent Microscope(Keyence America,Itasca,IL)采集图像并用OpenComet软件定量。
免疫荧光染色
将细胞收集并用PBS洗涤两次，固定在Z-fix溶液(缓冲锌福尔马林固定剂，Anatech,Inc,Creek,MI)中，并用在含有5％牛血清白蛋白的PBS中的0.3％Triton X-100渗透和封闭。然后将细胞与γ-H2AX抗体(1:250稀释于在含有1％牛血清白蛋白的PBS中的0.3％Triton X-100中)一起孵育过夜，之后进行三次洗涤。将细胞与荧光缀合二级抗体(1:1000稀释)一起孵育1小时，之后进行三次洗涤。用具有4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的ProLong Gold抗淬灭试剂安置载玻片以对细胞核进行染色(Molecular Probes)。荧光用Keyence荧光显微镜使用100×物镜来查看并用Image J软件(the National Institutesof Health)来定量。
统计分析
所有两组比较均利用假设不等方差的学生t检验。数据呈现为最少三次独立实验的平均值±SEM。
实施例2：化合物I的细胞药理学。
在化合物I表现出强细胞毒性的细胞类型中，淋巴瘤得到关注，因为大多数用于治疗此疾病的标准化学治疗剂导致骨髓抑制，这限制了剂量。出于此原因，选择Raji伯基特氏淋巴瘤细胞用于化合物I的细胞药理学的研究。Raji细胞中化合物I的胞内积聚通过液相色谱串联式质谱(LC-MS/MS)来定量。化合物I及其内标化合物I-d6在约6.9分钟时自LC柱洗脱，具有尖峰轮廓。Raji细胞相对缓慢地积聚化合物I，其中6小时后含量接近稳态(图6A)。
在选择用于化合物I的检测的相同反应监测模式下，对LC-MS/MS追踪的仔细检查鉴定出在约8.7分钟时自LC柱洗脱的次峰。使用LC-HR-ESI-TOFMS(液相色谱高分辨率电喷射离子化飞行时间质谱)，鉴定出峰具有m/z 578.65，其也在约8.7分钟时洗脱。利用Obritrap-MS的高分辨率MS/MS分析证明其为化合物I与亚铁以3比1比率的复合物(图1B)。Fe(化合物I)3三元复合物的结构通过LC-MS-ESI来表征。前体离子质谱的两个主要特征约束所述结构的鉴定。第一特征是通过高分辨率MS对其两个带正电离子的质荷比(m/z)进行的精确质量测量。第二特征是所测量的峰的显示所述结构含有至少一个铁原子的同位素分布。另外，复合物的MS-MS谱显示两个碎片离子，一个在与游离化合物I相同的368m/z处，并且一个离子在与铁和两个剩余的化合物I配体一致的789m/z处。三元复合物的质量计算值578.6520m/z非常接近于对若干不同天数中每天所观察到的平均m/z结果578.6519m/z。测量值与计算值的差值比为-0.2ppm。日间标准偏差为0.0003m/z，n＝3，并且日内质量差值比一致小于1.0ppm。此一致性测量值在3ppm标准内，所述标准通常应用于合成有机产物的结构证明。铁的存在通过该元素特征性的同位素图案来证实。铁具有4个稳定的同位素，54Fe、56Fe、57Fe和58Fe，其天然丰度分别为5.85％、91.75％、2.12％和0.28％。由于54Fe同位素而出现的MS峰是独特的，因为其与化合物I配体的碳、氢和氮的天然同位素不一致。在复合物的谱中，其质量计算值为577.6542m/z(比大多数丰富的同位素峰小约1m/z，因为离子为正二电荷)。对此峰所观察到的平均质量为577.6545m/z，其标准偏差为0.0003m/z。在n＝3的情况下日间差值比为0.5ppm。54Fe峰的强度还一致地测量为56Fe主峰的离子丰度强度的约6％，如根据天然丰度比所预期的。对于上文给出的峰值位置的测量，相对于391.2843m/z的内标(由于环境背景而普遍存在的邻苯二甲酸二异辛酯离子)重新校准结果。
发现Fe(化合物I)3复合物可以通过向在乙醇中的化合物I中添加FeSO4来简单地合成。通过HPLC来记录Fe(化合物I)3的纯度并且发现所述复合物在储存时稳定。Fe(化合物I)3的IC50为145.7±0.5nM，比化合物I的效能小1.5倍，大概归因于用其正双重带电的Fe离子难以进入细胞(图1C)。通过用0.5μM的各化合物处理Raji细胞6小时并基于各分子的离子化效率校正胞内浓度来检测化合物I和Fe(化合物I)3的相对吸收率(图1D)。经化合物I处理的细胞比经Fe(化合物I)3处理的细胞积聚更多的胞内Fe(化合物I)3，与这两个分子的IC50的差值一致。虽然大部分化合物I在经化合物I处理的细胞中胞内转化成Fe(化合物I)3，但在经Fe(化合物I)3处理的细胞中Fe(化合物I)3并不会胞内解离产生可检测的游离化合物I。因此，认为Fe(化合物I)3是化合物I的主要活性胞内形式。
实施例3：化合物I导致DNA损伤。
化合物I的结构与结合至DNA中的四链体结构的药物的结构类似，该结合引起链断裂；这引向化合物I是否对DNA造成损伤的研究。用0.5μM化合物I处理亲代Raji细胞以延长时间段并且通过经由蛋白质印迹分析所测量的磷酸化形式的ATM和γH2AX的积聚来评定DNA损伤的诱导。图2A显示在Raji细胞中从6小时处开始化合物I产生磷酸化ATM和γH2AX的明显增加，并且其随着药物暴露持续时间长达24小时而增加。从8小时处开始检测到PARP的裂解，指示细胞凋亡的诱导。Raji细胞具有极小核，使得难以定量γH2AX病灶的形成，因此将人类卵巢癌细胞系CAOV3用于此目的。图2B显示在暴露于DMSO或1μM化合物I 24小时的CAOV3细胞中γH2AX病灶形成的代表性图像。图2C显示在1小时处可检测到病灶数目增加并且在8小时后病灶数目更加明显地增加。DNA损伤的证据由主要检测DNA双链断裂的中性彗星测定的结果(图2D)进一步强化。尽管与DMSO处理相比，当将细胞用0.5μM化合物I处理6小时时尾DNA没有增加，但当将细胞用化合物I处理6小时并且接着在无药物的培养基中孵育18小时时，彗星尾部中的DNA显著更多(脉冲追踪)。这些结果提供有力的证据，即化合物I产生DNA损伤并且产生能够触发细胞凋亡的DNA链断裂的积聚。
实施例4：BRCA1/2缺陷型细胞对化合物I超敏。
化合物I产生DNA损伤的发现引向同源重组中的细胞缺陷是否对此药物超敏的研究。使用BRCA1富含型和缺陷型人类细胞系的同基因对，测试化合物I与BRCA1缺陷之间存在合成致死的假设。发现各含有产生提前终止密码子(BRCA1-het#1和#2)的BRCA1中的2-bp缺失的杂合基因敲入的两个独立的MCF10A亚克隆，比在克隆的基因组(对照)内经历靶向载体的随机整合的克隆对奥拉帕利更敏感，证实在所述两个基因敲入克隆中BRCA1功能的丧失(图3A，左边)。这两个基因敲入克隆甚至对化合物I更加超敏(图3A，右边)。在含有衍生自hTERT-IMEC细胞系的相同2-bp基因敲入的克隆中证实了BRCA1功能受损的效应，同时还发现其对奥拉帕利和化合物I两者都超敏(图3B)。BRCA1缺陷型细胞对化合物I超敏的结论进一步得到在BRCA1表达被shRNAi的表达稳定地敲低的MCF7 E7细胞中获得的结果的支持。如图3C中所示，E7克隆对奥拉帕利和化合物I具有类似的超敏性程度。在BRCA1胜任细胞和BRCA1非胜任细胞的三个独立的同基因对中的这些结果指示：由化合物I产生的DNA损伤的修复部分地取决于BRCA1在其中起作用的同源重组和/或其他DNA修复通路。分别使用BRCA2富含型和BRCA2缺陷型卵巢癌细胞系PEO4和PEO1测试BRCA2缺陷型细胞是否对化合物I较敏感。PEO1为BRCA2缺陷型并且对顺铂和聚(ADP-核糖)聚合酶抑制剂AG14361敏感。PEO4衍生自顺铂抗性复发时的腹水并且含有使BRCA2功能复原的二级突变。BRCA2功能的复原增强对奥拉帕利(图3D，左边)和化合物I(图3D，右边)两者的抗性。使用BRCA2富含型HCT116细胞和两个BRCA2-/-亚克隆B18和B46获得类似结果(图3E)。因此，BRCA1或BRCA2功能的丧失使得恶性细胞对化合物I超敏。
实施例5：后天抗药性的选择
为了划定化合物I的哪些效应与对此药物的敏感性最为密切相关，开发出Raji伯基特氏淋巴瘤细胞系的亚系，该亚系由于在6个月时段内反复暴露于浓度逐渐升高的化合物I而具有后天抗性(Raji/化合物IR)。在选择过程中，抗性缓慢并且逐渐地演变，在任何点处都没有陡变。当使用在暴露于药物120小时期间定量生长率的测定进行测试时，对于亲代Raji细胞化合物I的IC50为91.9±22.3nM。这与针对新鲜分离的AML胚细胞和CLL细胞已报告的范围相同。Zhang等人,"Inhibition of c-Myc by ATPO-COMPOUND I as an InnovativeTherapeutic Approach to Induce Cell Cycle Arrest and Apoptosis in AcuteMyeloid Leukemia[abstract],"Blood 2016；128:1716；Kurtz等人,"Broad Activity ofCOMPOUND I in AML and other Hematologic Malignancies Correlates with KFL4Expression Level[abstract],"Blood2015；126:1358，这两者特此以引用方式并入。Raji/化合物IR细胞对化合物I具有16.7±3.9倍抗性(IC50：1387.7±98.5nM)。在于无药物培养基中培养期间，抗性的水平保持稳定达至少3个月(图4A)。Raji/化合物IR细胞比亲代细胞生长地略快，但差值在统计学上并不显著。在诱导Raji敏感细胞中细胞凋亡的浓度下，化合物I未能触发Raji/化合物IR细胞中的细胞凋亡。当用0.5μM化合物I处理敏感细胞24小时时，与DMSO对照相比，促凋亡蛋白质BIK和BAD分别增加47.5±16.8％和2.1±0.25倍(p<0.05，n＝3)并且抗凋亡蛋白质MCL-1减少38.1±2.3％(p<0.001，n＝3)。在经受相同暴露的Raji/化合物IR细胞中未检测到这些变化中的一者(图4B)。
实施例6：抗药性机制
Raji/化合物IR细胞中的抗性可归因于流入或流出的改变、胞内解毒作用或药物的主要靶标的变化。监测与原来的化合物I或Fe(化合物I)3复合物一起孵育的Raji和Raji/化合物IR细胞中原来的化合物I和Fe(化合物I)3两者的胞内积聚。在暴露于化合物I的Raji/化合物IR细胞中，两种形式的药物的积聚率均严重降低(图6A和表1)。
表1.在前2小时内化合物I和Fe(化合物I)3从Raji和
Raji/化合物IR细胞流出的速率(log fmole/10^7细胞/小
时).
Figure BDA0002518693610000451
*平均值±SEM，n＝6
￥95％置信区间
当细胞与Fe(化合物I)3复合物一起孵育时，在较小程度上亦如此(图6B)。相比之下，在细胞加载任一形式的药物后的前2小时内ATPO-化合物I或Fe(化合物I)3的流出没有明显差异。这些结果指示Raji细胞中对化合物I的抗性与药物的两种形式的积聚减弱相关联。当Raji/化合物IR细胞与化合物I一起孵育时，在6小时时药物积聚的更详细的测量证实药物的两种形式的积聚明显减少；然而，Fe(化合物I)3复合物的水平仍超过原来药物的水平(图4C)。仅当用至少3倍的化合物I处理Raji/化合物IR细胞时，Fe(化合物I)3的胞内含量最终达到与敏感细胞中的水平类似的水平(图4D)。用0.5μM化合物I处理Raji/化合物IR细胞24小时不会产生增加的phospho-ATM或phospho-γH2AX，并且在抗性细胞中没有检测到与较少的胞内化合物I和Fe(化合物I)3基本上一致的PARP裂解(图7)。
为获得对抗性机制的进一步洞察，对敏感Raji和抗性Raji/化合物IR细胞两者的三个独立样品实施RNA-seq分析。通过去除所有6个样品中的所有具有少于50个读段的基因来进行基因水平差异表达分析，因为仅具有低水平表达的基因会导致差异表达分析的不规则性。如果基因的经调整的p值小于0.05水平并且它们在任一方向上的倍数变化>2，则认为基因差异表达。在13,791个可评估基因中，有1,012个在Raji/化合物IR细胞中显著上调，且有704个基因显著下调。ATP结合盒亚家族成员ABCG2是转录水平增加超过千倍的上调最多的基因(表2)。
表2.Raji/化合物IR细胞中上调的基因的等级次序.
基因ID 基因名称 增加倍数 经调整的p值
ENSG00000118777 ABCG2 1127.3 2.24E-05
ENSG00000114200 BCHE 173.8 3.24E-05
ENSG00000142149 HUNK 52.9 8.59E-04
ENSG00000060709 RIMBP2 46.6 3.99E-04
ENSG00000165695 AK8 42.5 5.74E-04
ENSG00000234323 RP11-308N19.1 41.4 3.16E-04
ENSG00000261690 AC009133.12 39.3 1.60E-03
ENSG00000161570 CCL5 37.3 5.74E-05
ENSG00000168824 NSG1 33.0 9.84E-04
ENSG00000154864 PIEZO2 31.6 3.88E-04
尽管Raji/化合物IR中若干其他的多抗药性ABC转运蛋白也上调，但ABCG2转录物的增加最为突出(表3)。通过qRT-PCR和蛋白质印迹分析证实Raji/化合物IR细胞中ABCG2的显著上调(图5A和图5B)。
表3.Raji/化合物IR细胞中上调的ABC转运蛋白家族成员基因.
Figure BDA0002518693610000461
Ko143是一种特异性ABCG2抑制剂，相对于其抑制P-gp或MRP-1转运蛋白的能力，其选择性超过200倍。在多至300nM的浓度下，Ko143本身对Raji或Raji/化合物IR细胞而言无毒(图5C)。为了测试化合物I是ABCG2的底物的假设，评估Ko143逆转Raji/化合物IR细胞的抗性的能力。表4和图5D中的数据显示在Raji/化合物IR细胞中用Ko143同步处理显著逆转化合物I抗性。
表4.ABCG2抑制剂对化合物I的抗性的效应
Figure BDA0002518693610000471
#平均值±SEM
§相对抗性
ap<0.05；bp<0.01；cp<0.001
为提供ABCG2功能增强的进一步证据，对抗性细胞进行托泊替康(一种证据充分的ABCG2底物)交叉抗性测试。发现Raji/化合物IR细胞对托泊替康具有3倍交叉抗性并且用Ko143处理完全逆转此抗性(图5E)。有趣地，尽管卡铂不被认为是ABCG2底物，但Raji/化合物IR对卡铂也具有显著的交叉抗性；用Ko143处理不会减小Raji/化合物IR细胞中的卡铂IC50(图5F)。出人意料地，发现Raji/化合物IR细胞对依托泊苷(etoposide)(ABCG2底物)和强效双链断裂诱导剂超敏。根据RNA-seq数据的GO和通路揭露：Raji/化合物IR中DNA修复通路下调，这部分解释了对依托泊苷的超敏性。
实施例7：化合物I与G-四链体DNA的相互作用与c-MYC的抑制有关
当前机理研究证明化合物I在转录水平下通过降低其启动子处的乙酰化H3K27并且另外通过使c-MYC mRNA去稳定来调节c-MYC。另外，RNA-seq和反相蛋白质阵列(RPPA)数据的差异基因表达分析突出c-MYC在化合物I的机制中的作用(GO项-由c-MYC下调(p值6E-26)，基因启动子受c-MYC束缚(p值4.2E-10)，c-MYC的ChIP靶标(p值3.3E-8))。此外，自RPPA数据观察到p-Chk1、p-Chk2、γH2Ax和总p53和E2F1增加，所有这些都是DNA损伤反应通路活化的指示。这伴随着XBP1、GRP78和p-p38水平升高，这指向细胞应激反应信号传导(GO项-细胞应激的调节，p值1.89E-8)。
尽管化合物I可参与多种机理性事件，但化合物I对c-MYC表达、细胞周期停滞和DNA损伤以及具有受损DNA修复机制的细胞中的合成致死的效应可以通过Fe(化合物I)3复合物对G-四链体DNA基序的作用来解释。
实施例8：实施例9-16的材料和方法
细胞和化合物
EOL-1、GRANTA-519、Jeko-1、Jurkat、Molm-13、NOMO-1、SKM-1和SU-DHL-6获自Leibniz-Institut DSMZ。HL-60、KG-1、Mino、MV4-11、Raji和THP-1获自ATCC。HEL92.1.7获自European Collection of Authenticated Cell Cultures并且Ramos细胞是Dr.M.Andreeff(MD Anderson Cancer Center,Houston,TX)的赠品。所有细胞均按照生产商的说明书在完全培养基中培养。在从生产商收到后1个月内收集并冷冻早期传代细胞。所有实验均在解冻后6周内对早期传代细胞进行。每6个月使用MycoScope支原体检测试剂盒(Genlantis目录号MY01050)来筛检潜在污染。使用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare，目录号17-1440-02)从新鲜健康供体血液中分离外周血单核细胞(PBMC)。为合成化合物I游离碱，将10-菲咯啉-5,6-二酮(1.2当量)、乙酸(22体积)、2-甲基-5-氟吲哚-3-甲醛(1.0当量)和乙酸铵(15当量)在中等搅拌下反应，同时在95±5℃下加热3至7小时。将反应冷却至20℃与25℃之间，过滤，用乙酸和乙醇冲洗，并用N2吹扫干燥，之后在65℃下用2:1乙醇:水洗涤4小时，冷却至20℃至25℃，过滤，用2:1乙醇:水和EtOAc冲洗，并且接着用N2吹扫干燥。通过HPLC获得的纯度为99.5％，并且通过FT-IR、1HNMR、13C NMR和LC/MS证实结构特性。对于Fe(化合物I)3合成，将五摩尔当量的于水中的亚铁离子FeS04添加到溶解于乙醇中的化合物I中。收集所产生的深红色沉淀物(Fe(化合物I)3)并将其溶解于DMSO中并通过HPLC和质谱来表征，其纯度＞95％。CX-5461(7)购自MedChem Express(目录号HY-13323)。
细胞毒性研究
将细胞铺在96孔板中，并用媒介物DMSO或化合物I(10浓度)在37℃和5％CO2下处理细胞持续5天。使用CellTiter 96AQueous单溶液(MTS)细胞增殖测定(Promega，目录号G3581)来测量细胞存活率，并且使用GraphPad Prism 7软件计算IC50值。
吸收和流出测定
将暴露于化合物I的细胞在含有5ng氘代化合物I标准物的乙腈中均质化。采用与使用正离子模式电喷射离子化作为离子源的Thermo LCQdeca质谱仪连接的Agilent 1260液相色谱(LC)系统，在UCSD分子质谱设备上分析样品。
qRT-PCR
将细胞用媒介物或化合物I以不同浓度处理24小时或以单一浓度处理1、3、6、12和24小时，然后收集。通过QiaShredder柱(QIAGEN，目录号79656)溶解细胞，使用QIAGENRNeasy Plus微型试剂盒(目录号74134)分离总RNA，并且利用Transcriptor UniversalcDNA主混合物(Roche，目录号05893151001)合成cDNA，并且接着用于使用FastStart基本DNA探针主混合物(Roche，目录号06402682001)和Roche LightCycler96进行qRT-PCR分析。引物探针对购自IDT(表5)。按归一化至GAPDH后在经媒介物治疗的样品内的倍数变化计算表达(2ΔΔC t)。
表5：IDT引物探针对
基因 IDT测定名称
GAPDH Hs.PT.58.40035104
CDKN1A(p21) Hs.PT.58.40874346
MYC Hs.PT.58.26770695
蛋白质印迹
如上所述处理细胞。制备全细胞溶解产物，将其通过SDS-PAGE分离，并转移至硝化纤维膜。所使用的检测抗体列于表6中。使用ImageJ或Image Studio Lite第5.2版软件进行密度测定法并归一化至GAPDH的密度。
表6：抗体
Figure BDA0002518693610000501
Figure BDA0002518693610000511
用于细胞凋亡和细胞周期分析的流式细胞术
如上所述处理细胞。为了确定细胞凋亡，将细胞用FITC-Annexin V和碘化丙锭(PI；BD Pharmingen，目录号556570)染色并且接着在BD Accuri C6流式细胞计数器上进行分析。为了测量DNA合成和细胞周期的阶段，将经处理的细胞用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(Edu)Alexa Fluor 488(Thermo Fisher Scientific，目录号C10425)和PI(PI/RNA酶A染色溶液，BD Biosciences，目录号550825)染色。通过使用Live/Dead Fixable Far Red死亡细胞染色试剂盒(Thermo Fisher Scientific，目录号L34973)从分析中排除死亡细胞。按照生产商的说明书进行染色。
RNA测序分析
使经处理的MV4-11细胞经受总RNA提取(对于qRT-PCR分析)并在UCSD基因组学核心设施处测序。将RNA使用Illumina TruSeq来处理并且在Illumina HiSeq4000上对50-bp读段进行单端测序。由位于Oregon Health and Science University(Portland,OR)的McWeeny实验室分析数据。使用FASTQC http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/评定FASTQ文件的读段基础分布和序列表示。使用SubRead v1.5.0-pl使读段与HG37对准，保持独特的映射读段。丢弃具有小于50个读段的差异表达基因(在所有4个样品中)。原始数据和经处理的文件可在GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc＝GSE111949)上获得，登录号GSE111949。
反相蛋白质阵列分析
对于RNA测序(RNA-seq)分析处理MV4-11细胞并且制备全细胞提取物用于蛋白质印迹。样品在MD Anderson Cancer Center反相蛋白质阵列(RPPA)核心设施(详见https://www.mdanderson.org/research/research-resources/core-facilities/functional-proteomics-rppa-core/rppa-process.html)处进行处理。对蛋白质表达水平求3次平均值，并使用GraphPad Prism 7绘制热图。
与qPCR结合的染色质免疫沉淀
将MV4-11细胞用媒介物DMSO或500nmol/L化合物I处理2、6或24小时并且接着用1％的甲醛交联。将染色质通过超声处理来提取并且接着与H3K27ac(活性基序#39133)抗体一起孵育过夜。将抗体:DNA复合物与蛋白G珠粒(Invitrogen Dynabeads目录号10004D)分离并且用对MYC启动子具有特异性的引物(表7)通过qPCR来分析。按相对于输入DNA对照的倍数计算H3K27ac富集。
表7：ChIP引物
Figure BDA0002518693610000521
RNA降解测定
将细胞用媒介物DMSO或500nmol/L化合物I接着1μmol/L放线菌素D处理3小时。对于qRT-PCR分析，在放线菌素D添加前和添加后每10分钟取细胞等分试样，用于RNA提取和cDNA合成。使用特异性引物(表8)分析MYC和28s rRNA的水平并将MYC RNA表达归一化至28srRNA[2^(28s Ct值-MYC Ct值)]。
表8：表达引物
Figure BDA0002518693610000522
Figure BDA0002518693610000531
FRET测定
FRET测定和数据分析如先前所描述来进行并且通过使用双标记(5'FAM-3'BHQ1)单链寡核苷酸来修改。使用Roche LightCycler 96[在37℃下持续300秒，接着温度以3℃间隔升高至91℃(25步)，其中在各温度下的总孵育时间为300秒]，在媒介物DMSO或浓度递增的化合物I、Fe(化合物I)3、CX-5461或TMPyP4存在下评定各寡核苷酸的熔解温度。立即对药物和寡核苷酸反应混合物进行分析或将它们在室温下孵育6小时并且接着进行分析。引物信息提供于表9中。较长的孵育时间并不影响Fe(化合物I)3、TMPyP4或CX-5461活性反而增强化合物I G4结合能力。针对6小时时间点呈现化合物I数据。
表9：G-四链体寡核苷酸
Figure BDA0002518693610000532
实施例9：在AML细胞中化合物I诱导细胞毒性、上调p21并且诱导G0-G1细胞周期停 滞
化合物I抑制AML细胞系和各种形式的淋巴瘤细胞系的增殖，其中IC50值在57nmol/L至1.75μmol/L范围内(图8；表10)。在MV4-11细胞中作为暴露持续时间的函数，药物的效能仅显示出适度变化，其中暴露48、72和120小时的IC50值分别为0.47、0.40和0.24μmol/L。先前研究将KLF4和CDKN1A表达的上调报告为肿瘤中APT0-化合物I活性的潜在机制。尽管在所测试的6个AML细胞系中的4个中化合物I上调KLF4表达(图15A)，但在所有AML细胞系中均以浓度依赖性方式诱导CDKN1A(p21)表达(图15B和图15C)。在所测试的所有AML细胞系中CDKN1A mRNA的上调随暴露持续时间而增加(图15D和图15E)。在稍后的时间点处，CDKN1A表达开始下降，可能是由于细胞死亡增加。CDKN1A表达的诱导通常与随后的G0-G1细胞周期停滞相关联，所述细胞周期停滞是在化合物I处理实体瘤细胞系后观察到的。与此一致，观察到G0-G1中剂量依赖性的细胞增加，其伴随所测试的所有AML细胞系的S-和G2-M期中细胞分数降低(图9A-图9C，上图)。在MV4-11的情况下，在暴露于1μmol/L APT0-化合物I 24小时之后，所有活细胞均已在G0-G1中停滞。已知CCND3(周期蛋白D3)和CDK4促进G1细胞周期进展，而CDKNIA用于负调控此过程。经化合物I处理的AML细胞的蛋白质印迹分析显示CDK4和CCND3两者的剂量依赖性抑制，尽管3个AML细胞系中每个细胞系中的程度不同(图9A-图9C，下图；图16A)。
表10：白血病和淋巴瘤细胞系中的化合物I IC50值
Figure BDA0002518693610000541
Figure BDA0002518693610000551
为了将细胞周期停滞与各种通路扰动关联，并且为了划定机理事件的序列，在用媒介物或化合物I(IC50浓度)多次处理细胞长达24小时后进行细胞周期分析。用单独媒介物处理的细胞中没有细胞周期时相分布扰动。早在2小时时就检测到G0-G1中细胞分数增加，并且在整个24小时的药物暴露时段中，此分数以时间依赖性方式持续增加(图9D-图9F)。蛋白质印迹分析显示与G0-G1停滞相似的CDK4和CCND3蛋白质水平的时间依赖性下降(图16B和16C)。这些数据确立在AML细胞中化合物I产生时间依赖性和浓度依赖性G0-G1停滞，并表明这由所建立的p21和周期蛋白依赖性激酶通路介导。
实施例10：在AML细胞系中化合物I诱导细胞凋亡
为了研究由化合物I导致细胞死亡的机制，用或不用化合物I处理MV4-11、EOL-1和KG-1AML细胞，并通过流式细胞术和蛋白质印迹使这些细胞经受细胞凋亡标记物检测。用PI和Annexin V对细胞进行染色，以区分活(Annexin V和PI阴性)、早期细胞凋亡(Annexin V阳性和PI阴性)、晚期细胞凋亡(Annexin V和PI阳性)和死亡(Annexin V阴性和PI阳性)细胞。在所有细胞系中在24小时时观察到凋亡细胞的浓度依赖性增加(图10A；图17A)。基于Annexin V和PI染色的IC50值与抗增殖IC50值相似。PARP裂解(c-PARP1)为内源性和外源性通路两者的下游细胞凋亡的典型信号。化合物I以浓度依赖性和时间依赖性方式诱导c-PARP1积聚，这与如通过Annexin V/PI染色所测量的细胞凋亡诱导相似(图10B-图10C；图17B)。对于所有3个AML细胞系，在暴露于化合物I之后3与6小时之间出现凋亡细胞增加(图10D)，这跟随在暴露2小时时所观察到的G0-G1细胞周期停滞之后。
实施例11：化合物I药效动力学
为了进一步洞察由化合物I所采用的导致细胞周期停滞和细胞凋亡的通路，在mRNA和蛋白质水平上进行差异表达分析。将MV4-11细胞用媒介物或500nmol/L化合物I处理6小时，并且接着通过RNA-seq分析基因表达。发现总共1,643个基因在化合物I治疗后经差异调控(＞2倍变化且P<0.05)，其中416个基因上调并且1,227个基因下调(表11)。RNA-seq分析检测到KLF4的2倍增加和CDKN1A表达的4.5倍增加，这由MV4-11细胞的qRT-PCR数据证实。利用广泛分子标识数据库(http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp)分析差异调控基因的丰富通路或GO(基因本体)项(图18A)。如所预期，差异表达的基因集中富含细胞凋亡和细胞周期通路。出乎意料地，化合物I治疗后，DNA损伤反应(DDR)和内质网(ER)应激/未折叠蛋白响应通路中也富含基因表达谱。另外，TP53通路中富含上调的基因并且基因由MYC下调。在MV4-11细胞中检测到的基因表达变化提高了化合物I可通过诱导DNA损伤以及激活细胞应激通路和/或通过抑制MYC致癌基因的表达来导致细胞凋亡的可能性。
表11：来自RNA-seq和RPPA的差异表达基因
Figure BDA0002518693610000561
Figure BDA0002518693610000571
为了检验化合物I对蛋白质表达的效应，将MV4-11细胞如上进行处理并且通过RPPA微阵列进行分析以定量>300总经修饰的蛋白质和翻译后经修饰的蛋白质。在总经修饰的蛋白质和翻译后经修饰的蛋白质两者的水平上观察到效应(>1.25倍且P<0.05)，其中上调蛋白质多于下调蛋白质(图18B；表11)。值得注意的是，裂解的半胱天冬酶-7增加，这指示细胞凋亡。利用广泛分子标识数据库进行差异表达蛋白质的GO分析。显著的GO项包括细胞死亡和G1-S细胞周期停滞通路，即G0-G1停滞的正式描述，并且与通过流式细胞术和RNA-seq分析所检测到的细胞周期效应一致(图18C)。E2F1、TP53、γH2AX、CHEK1 phos-S296和CHEK2phos-T68的增加支持DNA损伤通路由化合物I治疗触发的观念。另外，观察到XBP1、HSPA5和MAPK14(p38)phos-T180/182增加，指示ER或细胞应激(P＝1.89E-08；参考文献15)。DDR通路还可以通过激活MAPK14和MAPK8(JNK)的MAPK通路进行信号传导，并且尽管不清楚哪一条通路代表起始事件，但DDR通路与ER应激之间的串扰为公认的现象。差异表达蛋白质和mRNA的显著部分是MYC致癌蛋白的靶基因，已知所述MYC致癌蛋白是细胞周期和细胞凋亡通路调控的组成部分。总之，这些数据表明MYC致癌基因的调控可能在化合物I的机制中起到早期和关键作用。
实施例12：在AML细胞中化合物I浓度依赖性和时间依赖性地下调MYC mRNA和蛋白质水平
MYC表达牵涉到广泛范围的癌症包括白血病和淋巴瘤的发病。最近的研究证明抑制MYC转录导致血液系统起源的癌细胞凋亡，使MYC成为具有吸引力的治疗靶标。对我们地RNA-seq数据集的回顾显示，在MV4-11细胞中，在6小时时MYC由化合物I下调。在经化合物I处理的MV4-11细胞中，还观察到基因转录增加由MYC负调控。在所测试的所有AML细胞系中化合物I产生MYC mRNA和蛋白质水平上的浓度依赖性降低，并且MYC抑制的IC50值与抗增殖性IC50值相似(图11A和图11B)。在MV4-11、EOL-1和KG-1AML细胞中，这些变化随暴露时间直至24小时而增加(图11C；图19A和图19B)。MV4-11细胞中的MYC蛋白质阻遏的时程与由RNA-seq检测到的MYC基因表达水平的抑制的时程相似。与来自健康供体的PBMC相比，所测试的所有AML细胞系的MYC的基础表达均显著更高(图11D；图19C)。因此，在所有经检验的AML细胞系中化合物I均下调mRNA的MYC和蛋白质水平。
调节MYC表达是涉及MYC转录、mRNA稳定性和蛋白质转换的复杂过程。对公认的活性染色质标记物H3K27ac进行ChIP-qPCR分析，以评定用化合物I治疗后MYC基因启动子的转录能力(图19D)。MV4-11细胞中MYC启动子处H3K27ac降低早在2小时时就已观察到并随时间推移而发展，指示MYC启动子的修饰和随后的MYC基因转录阻遏是化合物I作用机制的早期介体(图19E)。为了确定化合物I是否影响MYC mRNA稳定性，对EOL-1细胞进行RNA降解测定。相对于媒介物，经化合物I预处理的细胞中的MYC mRNA水平明显降低(图19F)，指示化合物I可降低MYC mRNA的稳定性。这些数据表明化合物I通过影响转录和mRNA稳定性两者而调控MYC。
实施例13：化合物I触发DNA损伤和细胞应激通路
除了MYC之外，RNA和蛋白质差异表达分析也指出TP53、DNA损伤和ER应激参与化合物I的作用机制。寻求验证在MV4-11细胞中化合物I处理后显示TP53蛋白质水平增加的RPPA数据。在早期时间点(1、3和6小时)下MV4-11细胞暴露于500nmol/L化合物I产生显著的TP53水平增加，接着在12小时时恢复至基线并且在24小时时进一步减少，大概归因于此时大量的细胞死亡(图12A)。总蛋白质增加伴随着phospho-Ser15和乙酰基-K382增加(图12B)。响应于DNA损伤TP53在Ser15和Ser20处磷酸化，这减少MDM2结合和p53的蛋白酶体降解。此外，响应于细胞应激p53被乙酰化，并且此修饰可以进一步稳定TP53蛋白质水平并调节结合活性。TP53的活化可通过上调诸如BBC3(PUMA)、PMAIP1(NOXA)和BAX的促凋亡因子来触发细胞凋亡。RNA-seq数据集显示在经化合物I处理的MV4-11细胞中，BBC3增加3.95倍并且PMAIP1增加1.38倍。在用500nmol/L化合物I处理后的早期时间点下，进一步询问MV4-11细胞中DNA损伤和细胞应激通路的参与。在添加化合物I后1小时时检测到phos-CHEK1增加，其中峰位于约4小时处，表明DNA损伤为早期事件(图12C)。在CHEK1磷酸化后，DDR标记物γH2AX在6小时内稳定增加。在所测试的所有AML细胞系中均检测到浓度依赖性的γH2AX增加，由此进一步为化合物I触发DDR通路的概念增加凭证(图12D)。另外，在4至6小时治疗时，MAPK14phos-T180和MAPK8 phos-Thr183/pTyr185两者均增加，这指示经由DDR或ER应激通路进行信号传导(图12C)。总体而言，数据表明由化合物I诱导的DNA损伤是化合物I机制中的早期事件。
实施例14：化合物I的胞内药代动力学
通过质谱法确定的KG-1AML细胞中化合物I的吸收和流出动力学的测量结果指示逐渐接近稳态和快速初始流出，但末端流出非常长(图20A和图20B)。当使KG-1细胞暴露于化合物I1或6小时并且接着置于无药物培养基中时，流出模式由在前30分钟期间发生的快速期、接着为延长的末期组成，使得大量化合物I保留在KG-1细胞中持续超过24小时。与这些数据一致，细胞药代动力学研究公开化合物I胞内转换成含有1个铁原子和3个化合物I分子的复合物[Fe(化合物I)3](图20C和图20D)。实际上，在细胞毒性测定中，预复合的Fe(化合物I)3药物与亲代化合物I单体一样强效(图13A)。此外，如分别通过c-PARP和γH2AX所测量，在MV-4-11细胞中，Fe(化合物I)3复合物触发细胞凋亡和DNA损伤通路。Fe(化合物I)3还以剂量依赖性方式诱导KLF4和CDKN1A表达并抑制MYC(图13B)。然而，在24小时测定中需要较高浓度的Fe(化合物I)3来引发对亲代化合物I的相同反应(与细胞毒性测定中的5天处理相比)，可能归因于观察到的预复合的Fe(化合物I)3的流入速率较慢(图20E)。
实施例15：化合物I使G-四链体序列稳定
亲代化合物I及其胞内Fe(化合物I)3形式含有某些特征，诸如金属配位菲咯啉环和平面结构，这可以允许剂充当G-四链体(G4)DNA配体。G4为由富含鸟嘌呤的区域折叠形成相互堆叠的平面鸟嘌呤四分体所产生的动态二级DNA结构。在端粒处和许多重要致癌基因的启动子中发现G4特异性序列。G4序列充当基因表达的调控子，并且已采用使G4四链体稳定的小分子配体来下调重要的致癌基因，诸如KIT和MYC。端粒DNA中G4基序的稳定化会导致端粒酶的抑制、端粒不稳定和去保护，这些都可以触发DDR通路。此外，DNA复制的起始位点与DNAG4序列重叠，并且在这些位点处G-四链体结构的稳定化导致复制叉停顿和细胞周期停滞。
评估化合物I(药物的亲代单体形式)和Fe(化合物I)3使用改良的FRET测定来结合和稳定G4序列的能力(图21和图22)。将众所周知的G4配体TMPyP4和最近报告具有G4结合性质的临床阶段分子CX-5461用作对照，以评定化合物I和Fe(化合物I)3对G4稳定活性的特异性。如所预期，CX-5461是所测试的所有G4序列的强效稳定剂，并且TMPyP4使除KIT基因启动子的G4外的所有G4基序稳定(图13C)。有趣地，Fe(化合物I)3浓度的增加使与MYC和KIT基因启动子、rRNA和端粒相对应的G4结构稳定，其效能与TMPyP4的效能类似(图13C；图22)。亲代单体化合物I也显示G4基序的时间依赖性稳定化，但其显示稳定MYC G4序列的最大倾向(图13C)。
为了评定G4结构对与ds-DNA非特异性相互作用的选择性，用在溶液中形成ds-DNA发夹的自互补寡核苷酸重复FRET测定。值得注意的是，Fe(化合物I)3证明G4结构对ds-DNA的选择性比对CX-5461和TMPyP4两者的选择性的程度高得多，突出化合物I是更具辨别力的G4配体的事实(图13C；图21B)。基因表达分析显示，响应于化合物I处理在AML细胞中MYC和KIT表达降低(RNA-seq数据，MV4-11细胞6小时处理)，但45s rRNA的水平没有降低。缺乏对45s rRNA的效应可能反映了化合物I和/或Fe(化合物I)3进入细胞核的富含rRNA的核仁区的可用性的差异。尽管如此，化合物I显然能使G4结构稳定，这为MYC和其他基因表达的抑制提供解释。在不受任何特定理论束缚的情况下，假设由化合物I稳定G4基序引起复制叉和端粒处的单链和双链断裂；化合物I的此G4结合力鉴定了药物触发DDR通路、细胞周期停滞和细胞凋亡的机制。
实施例16：论述
化合物I因其在非临床模型中的功效及其在动物中或在实体瘤患者初始第I期试验中不产生骨髓抑制的事实，目前在临床开发中用于治疗AML。此处所报告的数据为此新颖剂的作用机制提供新见解，这为更精确的临床应用和生物标记物开发指明道路。这些研究证实化合物I是AML细胞中G0-G1细胞周期停滞和细胞凋亡的强效诱导剂。额外的新发现包括化合物I经由对MYC的启动子和mRNA稳定性两者的效应产生时间依赖性和浓度依赖性的MYC下调，在许多AML细胞系中化合物I诱导主转录因子和肿瘤抑制因子KLF4，并且化合物I诱导DNA损伤。另外，化合物I、Fe(化合物I)3的预复合铁形式导致相当的细胞毒性效应，包括细胞凋亡、DNA损伤和MYC表达下调。
无论化合物I呈其亲代单体形式还是Fe(化合物I)3铁复合物形式，其均使DNA中的G4基序稳定，这一发现为此药物的许多药效动力学效应提供解释。已知G4的稳定化会破坏端粒稳定性并阻滞复制叉，引起单链和双链DNA断裂。认为MYC启动子中如此稳定化的G4充当基因沉默子。与化合物I靶向KIT和端粒G4结构结合，这提供一种机制，经由该机制，化合物I激活在AML细胞中协调细胞周期停滞并促进细胞凋亡的DDR通路。
另外，含有BRCA1/2突变的细胞对化合物I超敏，进一步支持化合物I作用机制中DNA损伤的作用。化合物I持续产生CDKN1A的上调，这介导G0-G1的停滞。另外，在DNA双链断裂后可以诱导CDKN1A阻断细胞周期进程，以允许有足够的时间来修复DNA。与CDKN1A诱导组合，在许多AML细胞系中化合物I增加KLF4基因表达，已知其作为G1细胞周期检查点的一部分调控CDKN1A。还已知KLF4响应于DNA损伤而上调，并且在G0-G1停滞和细胞凋亡两者中起作用。对未来研究而言KLF4在化合物I作用机制中的作用值得关注。尽管化合物I的结构表明其可能能够产生反应性氧物质，但在MV4-11、EOL1或KG-1细胞中，使用分子传感器或GSH的变化未检测到此类物质。
CHEK1/2的活化、TP53的稳定化和E2F1的诱导也指示化合物I处理后的早期事件用于对细胞周期停滞和DNA修复进行信号传导。化合物I处理2小时后检测到细胞周期停滞，而6小时后观察到RNA和蛋白质水平上的若干促凋亡因子的上调。除了激活DNA修复过程外，pCHEK1/2和TP53还可以在触发细胞凋亡中起作用。如果DNA修复失败，则p53可以经由BAX、BAD、BBC3或PMAIP1的上调来激活细胞凋亡。通过经化合物I处理的MV4-11细胞的RNA-seq分析检测到这些促凋亡因子的表达增加。已知为了进行细胞凋亡需要半胱天冬酶依赖性的PARP1裂解。化合物I产生稳健和早期的PARP1裂解，进一步为化合物I通过触发DDR通路而起作用的假设增加凭证。这表明DNA损伤的水平对细胞而言是灾难性的，并且转录程序的改变使细胞向细胞凋亡方向倾斜。MYC失调是多种恶性肿瘤中常见的致癌驱动子，这使其成为一种有吸引力的潜在治疗靶标。然而，由于MYC调控和信号传导的复杂性，靶向MYC具有挑战性。最近，已证明由BET-溴结构域抑制剂阻遏MYC表达能有效触发白血病细胞中的细胞凋亡。然而，溴结构域蛋白存在于所有活性基因上，并且溴结构域蛋白的抑制会导致严重的毒性和骨髓抑制。在所测试的所有AML细胞系中，化合物I在RNA和蛋白质水平上均产生MYC表达降低，并且在不同AML细胞中MYC的下调与其细胞毒性效能相似。检测到AML细胞系中的MYC水平高于来自健康供体的PBMC中的MYC水平，这可能与化合物I对这些类型的细胞的差异效应有关。最近的研究证明，协同的TP53上调和MYC下调导致有效清除CML中的白血病干细胞群。化合物I治疗MV4-11产生相同的效应，这为其发展提供额外的理论依据。已报告，较高的MYC表达与上皮性卵巢癌和成神经细胞瘤的不良临床结果相关，表明化合物I可能对这些恶性肿瘤具有有益效应。总体而言，此数据显示化合物I主要通过G-四链体结构的参与的多层面作用机制，该作用机制唯一适于靶向造血性恶性肿瘤。此外，化合物I代表一种不导致骨髓抑制的首创MYC抑制剂，使其特别适于管理骨髓功能受损的AML患者。
前述实施例和某些实施方案的描述应视为说明而非限制如由权利要求所定义的本发明。如将容易了解的，可以在不脱离如由权利要求中所阐述的本发明的情况下利用上述特征的众多变型和组合。意欲将所有此类变型包括在本发明的范围之内。所引用的所有参考文献均以引用方式整体并入本文。
应当理解，如果在本文中提及任何现有技术出版物，在任何国家中，这种提及并不构成承认所述出版物形成本领域中公共常识的一部分。
通过鉴定引用而在本文中提及的所有出版物、专利、专利申请和公布专利申请的公开内容特此以引用方式整体并入本文。

Claims (35)

1.一种预防、减轻或治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的化合物I：
Figure FDA0002518693600000011
或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物；其中所述受试者在DNA修复基因中具有突变。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述DNA修复基因是同源重组基因。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述DNA修复基因是同源重组(HR)依赖性脱氧核糖核酸(DNA)双链断裂(DSB)修复通路中的基因。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述DNA修复基因是一个或多个选自由以下组成的组的基因：BRCA-1、BRCA-2、ATM、ATR、CHK1、CHK2、Rad51、RPA和XRCC3。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述DNA修复基因是BRCA-1和/或BRCA-2。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者在DNA修复基因中的突变是杂合的。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述受试者在所述同源重组(HR)依赖性脱氧核糖核酸(DNA)双链断裂(DSB)修复通路中的基因突变是杂合的。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述受试者在BRCA1或BRCA2中的突变是杂合的。
9.如权利要求6所述的方法，其中所述受试者在BRCA1或BRCA2中的突变是纯合的。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：血红素癌、结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、淋巴结癌、白血病、肾癌、结肠癌、前列腺癌、脑癌、头颈癌、骨癌、喉癌和口腔癌、尤文氏肉瘤、皮肤癌、肾癌和心脏癌。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、肺癌、淋巴结癌、结肠癌、白血病、肾癌和前列腺癌。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症是BRCA相关的癌症。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述BRCA相关的癌症具有所述BRCA-1基因和/或所述BRCA-2基因的一个或多个突变。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者是人类。
16.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括施用治疗有效量的第二治疗活性剂。
17.如权利要求16所述的方法，其中在已向所述受试者施用化合物I之前、期间或之后施用所述第二治疗活性剂。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述第二治疗活性剂选自由免疫治疗剂、抗癌剂和血管生成剂组成的组中的一者或多者。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述第二治疗活性剂是PARP抑制剂。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述PARP抑制剂是奥拉帕利。
21.如权利要求1所述的方法，其中相对于未施用治疗有效量的化合物I
Figure FDA0002518693600000031
或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物的受试者，所述受试者经历小于90％的骨髓活性降低。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述受试者经历小于10％的骨髓活性降低。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述受试者未经历骨髓活性降低。
24.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者已患有癌症。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述受试者经历与癌症相关的肿瘤的尺寸缩小或减小。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述受试者经历所述与癌症相关的肿瘤的完全消除。
27.如权利要求24所述的方法，其中所述受试者经历与癌症相关的肿瘤中的新血管形成或血管生成的抑制、降低或减少。
28.一种杀死癌细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与治疗有效量的化合物I
Figure FDA0002518693600000041
或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物接触。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述癌细胞在一个或多个选自由以下组成的组的基因中具有缺陷：BRCA-1、BRCA-2、ATM、ATR、CHK1、CHK2、Rad51、RPA和XRCC3。
30.一种诱导癌细胞中细胞周期停滞的方法，所述方法包括使所述细胞与治疗有效量的化合物I
Figure FDA0002518693600000042
或其药学上可接受的盐、游离碱、水合物、复合物或螯合物接触。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述癌细胞在一个或多个选自由以下组成的组的基因中具有缺陷：BRCA-1、BRCA-2、ATM、ATR、CHK1、CHK2、Rad51、RPA和XRCC3。
32.一种预防、减轻或治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括以具有一个或多个金属原子的复合物形式施用治疗有效量的一个或多个
Figure FDA0002518693600000043
分子，其中所述受试者在DNA修复基因中具有突变。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述一个或多个金属原子选自由以下组成的组：铁、锌、铝、镁、铂、银、金、铬、镍、钛、铜、钪、锆、钒、钼、锰、钨和钴。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述一个或多个金属原子是铁。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述复合物具有以下结构：
Figure FDA0002518693600000051
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