TW201343920A - 預測前列腺癌預後之分子標記、方法與套組 - Google Patents

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Chi-Rong Li
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Abstract

本發明係提供一種預測已檢測罹患前列腺癌之人類病患之臨床預後之方法，係包括：由該人類病患所得之包含前列腺癌細胞之生物性樣本中，檢測由ABCG1、PDCD4、KLF6、ST6、BTD、BANF1、IRS1、ZNF185、ANXA11、DUSP2、KLF4及DSC2所成群組之一種或多種標記基因之表現量；以及，藉由該標記基因之表現量與參考值之比較，預測臨床預後之可能性。本發明亦提供一種分子標記之組合及包含該組合之套組。

Description

預測前列腺癌預後之分子標記、方法與套組
本發明係關於前列腺癌之新穎分子標記，以及包括該等分子標記之用於檢測前列腺癌之方法及套組。
前列腺癌為男性主要致死癌症。針對早期、局部性之前列腺癌，進行根治性前列腺切除術(radical prostatectomy)有機會可根除此疾病，然而，具有初始局部病症之約15-30%之病患會在5-10年內復發，造成很差的治療結果(Bill-Axelson et al.,2005；Pound et al.,1999)。前列腺癌病患之預後(prognosis)之進一步之改善，可依據對病理分子機制更深入的瞭解而進行，可以人類前列腺癌臨床變化之更佳預測為基礎，進行疾病復發率及合理治療計畫之改善。
如同大多數腺癌，前列腺上皮之惡性轉形係與一般腺體結構之逐步性及多樣性喪失相關。因此，人類前列腺癌常展現於腺體分化作用中顯著的腫瘤內基因異質性(heterogeneity)，為一種廣泛用於前列腺癌之病理學分類(例如格里森分級系統(Gleason grading system，參考文獻Gleason,1992))之因子。大量的臨床研究已建立了腺體分化作用程度，以作為前列腺癌臨床變化之決定因子。尤其是，低分化、高格里森評分之腫瘤，係具 有高腫瘤復發及低預後之可能性(Albertsen et al.,1995；Stamey et al.,1999)。然而，此種以表型為基礎之分類系統僅針對適度的預後症狀，無法將具有類似組織病理學特徵之前列腺癌進行風險分級。組織結構之評估無法對可見性腫瘤變異提供功能性或機制性之觀察指標。因此，亟需能應用於前列腺癌之臨床結果預測，且能增加正確性，能指示途徑(pathway-informed)，並以分子學為基礎之檢測分析。
近來，高處理能力之基因解析技術有利於發現包括前列腺癌之人類惡性腫瘤之分子特徵(Glinsky et al.,2004；Henshall et al.,2003；Singh et al.,2002；Stratford et al.,2010；van 't Veer et al.,2002；van de Vijver et al.,2002)。該等基因標記之預後應用係說明腫瘤之固有分子特徵可作為其臨床表現之重要決定因子(Ramaswamy et al.,2003)。舉例言之，Dhanasekaran等人藉由比較前列腺癌檢體與相鄰之正常前列腺之基因表現圖譜，鑑定出前列腺癌之協同表現基因群(Dhanasekaran et al.,2001)，該等基因之其中兩個，包含hepsin(HPN)及pim-1(PIM1)，顯示與臨床結果測量相關。類似地，Varambally等人藉由比較轉移性前列腺癌及局部性前列腺癌之基因表現圖譜，鑑定出55個上游基因及480個下游基因(Varambally et al.,2002)。針對排名前位之基因，它們係Zeste蛋白同系物2(Zeste homolog2，EZH2)之經實驗證實之強化子，Zeste蛋白為一種促轉移基因，且為前列腺癌之預後標記。Singh等人研究21位接受根治性前列腺切除術之前列腺癌患者之腫瘤基因表現圖譜，並建立了5-基因模組，可預測術後疾病復發之風險，正確率達90%(參考文獻：Singh et al.,2002)。此模組係基於少量腫瘤樣本而建立，且其表現並未於獨立病患群中進行驗證。以相同的21個前列腺癌樣本組為 基礎，Glinsky等人藉由比較前列腺癌復發與未復發病患之腫瘤之基因表現圖譜，鑑定出三基因組(參考文獻：Glinsky et al.,2004)。該等基因印記能夠區分前列腺癌在臨床表現上為易復發或非復發，正確率為86-95%。Gary等人則以少量之腫瘤樣本：4個來自前列腺癌復發之病患及5個來自未復發之腫瘤，鑑定出33個基因，其在前述兩組前列腺癌中有區別性的表現(美國專利公開號US 2010/0196902 A1)，但此組前列腺癌之基因印記亦來自少量樣本數及缺乏獨立驗證。
除了分子標記建構外，基因工具亦可用於腫瘤次型之分子性定義、或用於區分初級/轉移性之前列腺癌。例如，人類前列腺癌組織之轉錄圖譜已證實三種不同之腫瘤次型之存在，其與腫瘤分級與階段相關(參考文獻：Lapointe et al.,2004)。LaTulippe等人鑑定出超過3000個基因，於初級與轉移性前列腺癌中具有區別性之表現(參考文獻：LaTulippe et al.,2002)。由格里森級數代表之腫瘤分化之基因表現圖譜亦被描述。例如，29個顯微切割之前列腺腫瘤之基因表現圖譜，展示了一種86基因模組，其能夠區分低級數至高級數之前列腺癌(參考文獻：True et al.,2006)。應留意，上述分子圖譜係以臨床前列腺腫瘤檢體所建立，可能只能反映已形成之腫瘤之特徵，而無法提供該等腫瘤變異型之病理學機制。因此，以知識為基礎之方法可提供定出更多合理標記或分類系統之機會，此有利於臨床決定進行及療效進展。該等方法已被用於數種實性腫瘤中，以建立腫瘤前驅細胞、基質活化或組織分化相關基因圖譜之預後應用(Chang et al.,2004；Fournier et al.,2006；Liu et al.,2007；Sotiriou et al.,2006)。
近來，主要的腫瘤發生模式認為，組織分化與腫瘤進程共享 類似的基因調控作用及分子途徑。與腺體上皮分化過程相關之分子改變可能難以於活體內進行研究。然而，生理學相關之三維器官培養模式已被應用於乳腺泡(正常乳房上皮之基本結構單位)之結構性及功能性分化過程之再現(Debnath and Brugge,2005；Lee et al.,2007)。類似模式已成功再現前列腺、胰及肺之上皮之型態發生過程及分化過程(Gutierrez-Barrera et al.,2007；Mondrinos et al.,2006；Webber et al.,1997)。利用此建構性模式之比較性基因表現分析係展示出基因表現圖譜及標記基因之鑑定，其顯示了與乳癌預後之明顯關連性(Fournier et al.,2006；Kenny et al.,2007)。相同模式是否可被應用於其他腺癌類型(如前列腺癌)仍然不清楚。
因此，用於預測前列腺癌臨床結果(如復發率)之分子標記，且具有改良之正確率及臨床應用性者，仍有其需求。
本發明係提供一種預測已檢測得前列腺癌之人類病患之臨床預後(clinical prognosis)之方法，包括：由該人類病患所得之包含前列腺癌細胞之生物性樣本中，檢測由ABCG1、PDCD4、KLF6、ST6、BTD、BANF1、IRS1、ZNF185、ANXA11、DUSP2、KLF4及DSC2所成群組之一種或多種標記基因(marker gene)之表現量；以及，藉由該標記基因之表現量與參考值之比較，預測臨床預後之可能性(likehood)。該生物性樣本係以抽吸術(aspiration)、活檢(biopsy)、或手術切除術(surgical resection)取得。
本發明亦提供一種用於預測前列腺癌之臨床預後之分子標記組合，係包括ABCG1、PDCD4、KLF6、ST6、BTD、BANF1、IRS1、ZNF185、ANXA11、DUSP2、KLF4、及DSC2中之至少二者。
本發明亦提供一種用於預測前列腺癌之臨床預後之套組，係包括一種檢測選自由ABCG1、PDCD4、KLF6、ST6、BTD、BANF1、IRS1、ZNF185、ANXA11、DUSP2、KLF4、及DSC2所成群組之一種或多種標記基因之表現量之工具。
第1圖顯示以三維培養模式之前列腺上皮細胞之結構性組織，其中，第1A圖上列顯示於三維重建基底膜膠培養之RWPE-1細胞團(培養48小時所形成)及腺泡(培養6天所形成)之共焦影像，而下列顯示於三維重建基底膜膠培養之前列腺癌LNCaP細胞團(培養48小時所形成)及球狀物(培養6天所形成)之共焦影像。該等結構係以底部胞外基質受體α6-整合素(紅色)及頂部標記GM130(綠色)進行免疫染色。細胞核以Hoechst 33342(藍色)進行複染色。比例尺為20μm。第1B圖顯示RWPE-1細胞或LNCaP細胞所形成之極化構造之比例，係於螢光顯微鏡下以目測計數定量。數據以平均數± SEM表示，n=3.***,P<0.001。
第2圖顯示與前列腺腺泡分化相關基因之功能分析，其中，第2A圖顯示與前列腺分化相關基因之功能分析，該等高功能性基因類型之分類係依據基因本體學生物性程序，如方框所示，並以橫截面區域表示包含於各分類之基因之數量；與各分類相關之基因係以圓形框所示，且，比較前列腺腺泡及細胞團中的表現量，紅色表示增加，綠色則表示減少。第2B圖顯示於RWPE-1腺泡或惡性LNCaP球狀物與細胞團相較，與上皮分化、或前列腺之荷爾蒙或分泌功能相關之基因轉錄體表現量之倍數變化，其係以 定量即時PCR分析進行測量。數據以平均數± SEM表示，n=3.*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。
第3圖顯示卡普蘭-梅耶存活曲線，係比較BWH組之21位前列腺癌病患之未復發之存活率將該等病患區分為兩群：高與低r acini 。P值係以對數等級檢定計算。
第4圖顯示卡普蘭-梅耶存活曲線，係比較Lapointe組之29位前列腺癌病患之未復發之存活率，依r acini 將該等病患分群。P值係以對數等級檢定計算。
第5圖顯示所選擇之12-基因組，係以BWH組之21位前列腺癌病患之疾病復發風險預測之一致性指數(C-指數)為基礎。於R語言統計編程(cran.r-project.org)中使用「survcomp」包裝進行C-指數統計分析。
第6圖顯示卡普蘭-梅耶存活曲線，係比較BWH組之21位前列腺癌病患之未復發之存活率。依據表列12個分子標記之轉錄體表現量計算復發級分(方程式1)，並以據此所得之預測復發風險為基礎，將該等病患區分為兩群。P值係以對數等級檢定計算。
第7圖顯示卡普蘭-梅耶存活曲線，係比較Lapointe組之29位前列腺癌病患之未復發之存活率。依據表列12個分子標記之表現圖譜計算復發級分(方程式1)，並以據此將該等病患區分為兩群。P值係以對數等級檢定計算。
第8圖顯示BWH組之21位前列腺癌病患之未復發之存活率，係依據表列之代表性分子標記表現量為基礎，將該等病患分群。各基因標記之閥值係以最大尤登指數決定。P值係以對數等級檢定計算。
第9圖顯示CFMC組之前列腺癌組織之PDCD4(i,ii)、KLF6(iii,iv)、及ABCG1(v,vi)之免疫染色(400×倍率)。所顯示為具有各標記之高染色強度(i、iii、v)或低染色強度(ii、iv、vi)之腫瘤。
第10圖顯示卡普蘭-梅耶存活曲線，係比較CFMC組之61位前列腺癌病患之未復發之存活率，依據PDCD4、ABCG1或KLF6之染色強度分群。該染色圖譜係以組織學評分(H-評分)定量。各基因標記之閥值係以最大尤登指數決定。P值係以對數等級檢定計算。
第11圖顯示卡普蘭-梅耶存活曲線，係比較CFMC組之61位前列腺癌病患之未復發之存活率。依據PDCD4、ABCG1及KLF6之染色強度(以H-評分定量)計算之復發評分(方程式1)，將該等病患分為兩群。P值係以對數等級檢定計算。
第12圖顯示卡普蘭-梅耶存活曲線，係比較BWH組之21位前列腺癌病患之未復發之存活率。依據PDCD4、ABCG1及KLF6之轉錄體表現量(以抗體雜合強度表示)計算之復發評分(方程式1)，將該等病患分為兩群。P值係以對數等級檢定計算。
第13圖顯示卡普蘭-梅耶存活曲線，係比較CFMC組之61位前列腺癌病患之未復發之存活率。依據PDCD4及ABCG1之染色強度(以H-評分定量)計算之復發評分(方程式1)，將該等病患分為兩群。P值係以對數等級檢定計算。
第14圖顯示卡普蘭-梅耶存活曲線，係比較BWH組之21位前列腺癌病患之未復發之存活率。依據PDCD4及ABCG1之轉錄體表現量(以探 針雜合強度表示)計算之復發評分(方程式1)，將該等病患分為兩群。P值係以對數等級檢定計算。
定義
於此處，「前列腺癌」意指衍生自前列腺上皮細胞之哺乳類惡性癌症，特別是指腺癌。本發明所指前列腺癌係包含轉移性及非轉移性癌症。
術語「分化作用」意指於發育期間，一器官或組織在結構或功能上發生廣泛性或特異性的改變。分化作用的概念於本技術領域中為習知，無須多加詳述。例如，前列腺之分化，意指腺狀結構之形成及/或正常前列腺之荷爾蒙或分泌功能之取得之過程。
於此處，術語「臨床預後」意指患有前列腺癌之病患之結果，包括腫瘤復發之可能性、存活、疾病進程(disease progression)、及治療反應。手術後(如前列腺切除術)之前列腺癌復發率暗示了更具侵襲性之癌症；更短的宿主(如前列腺癌患者)存活期；腫瘤之尺寸、體積、或數量增加之可能性提高；及/或治療失敗之可能性提高。
於此處，術語「預測臨床預後」意指提供一前列腺癌之可信進程或結果之預測，包括預測轉移、多重抗藥性、無疾病存活期、整體存活率、復發率等。該方法亦可用於設計適當之癌症治療之療法，例如，藉由指示該癌症是否仍為早期階段、或是否該癌症進展至侵襲性療法亦無效之階段。
於此處，術語「復發」意指於初期治療或後續治療後，前列腺癌又重新發生。典型之治療包括任何形式之手術(如根治性前列腺切除術)、任何形式之放射線治療、任何形式之化療或生物性療法、任何形式之荷爾蒙療法。於部分實例中，前列腺癌復發係由上升的前列腺專一性抗原(PSA)量(如，至少0.4ng/ml之PSA、或兩個連續之PSA值為0.2mg/ml並升高)(Stephenson et al.,2006)；及/或由罹患前列腺癌之患者所得之任何生物性樣本中鑑定出前列腺癌細胞所表示。
於此處，術語「疾病進程」意指一種狀況，儘管進行治療，其中一種或多種前列腺癌指標(如血清之PSA量、可測得之腫瘤尺寸或體積、或新病灶)顯示該疾病正在進展中。
該等術語「分子標記」、「基因標記」、「癌症相關抗原」、「腫瘤專一性(特異性)標記」、「腫瘤標記」、「標記」、或「生物標記」意義相通，意指一分子或一基因(典型為蛋白質或核酸，如RNA)，與非癌細胞或其他種癌細胞相較，該分子或該基因係可區別性表現於該種癌細胞中、表現於該癌細胞之表面、或由該癌細胞所分泌；以及，其係有用於癌症診斷，以提供一預後，及優先訂出癌症之藥劑。通常，與非癌症細胞或其他種癌細胞相較，一癌症相關抗原係於該癌細胞中過度表現或表現過低之一分子，例如，與非癌症細胞相較為1倍之過度表現量、2倍之過度表現量、3倍之過度表現量、或更多倍；或，例如，與非癌症細胞相較為20%、30%、40%、50%或更低者。通常，一癌症相關抗原為在該癌細胞中不適當地合成之分子，例如，與非癌症細胞所表現之分子相較，為包含缺失、新增或突變之分子。通常，一癌症相關抗原為僅表現於癌細胞之細胞表面，且不被正常 細胞所合成或表現。例示性細胞表面腫瘤標記包含：前列腺癌之前列腺專一性抗原(PSA)、乳癌之c-erbB-2蛋白質及人類上皮生長因子受體(HER)蛋白質、及多種癌症(包含乳癌、卵巢癌及大腸癌)之醣類黏蛋白。通常，一癌症相關抗原並非該癌細胞表面之主要表現者。
於本發明中，術語「區別性表現」或「區別性調控」通常意指，與至少一種其他樣本相較，於樣本中，一蛋白質或核酸過度表現(增量調控)或表現過低(減量調控)。
於此處所載之「ABCG1」、「PDCD4」、「KLF6」及其他分子標記，包括記載於圖表者，意指核酸(如基因、前驅mRNA、mRNA)及多肽、多型變異體、對偶基因、突變型、及物種間同源體，其係：(1)與由一參考核酸所編碼之多肽或此處所述之胺基酸序列，具有胺基酸序列相同度大於約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%；較佳為91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高之胺基酸序列相同度之胺基酸序列；較佳係涵蓋超過至少約25、50、100、200、500、1000或更多個胺基酸之區域；(2)專一性鍵結至抗體(如多株抗體)，該抗體可拮抗包括一參考胺基酸序列、其免疫原性片段、及其保留性修飾之變異體之免疫原；(3)於可信賴雜合條件下，與編碼參考胺基酸序列之核酸、及其保留性修飾之變異體產生專一性雜合；(4)與一參考核酸序列相較，具有核苷酸序列相同度大於約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%；較佳為91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高之核苷酸序列相同度之核苷酸序列；較佳係涵蓋超過至少約10、15、20、25、50、100、200、500、1000或更多個核苷酸之區域。典型地，聚核苷酸或多肽 序列係來自哺乳類，並非用以限制，係包含靈長類(如人類)、齧齒類(如大鼠、小鼠、倉鼠)、牛、豬、馬、羊、或其他哺乳動物。本發明之核酸及蛋白質包含自然產生的分子及重組分子。該等抗原之截短型及選擇性剪接型包含於此定義中。
熟習本技術領域之通常知識者可理解，此處所描述之標記可單獨使用或與其他標記組合使用於任何應用中，例如診斷或多重抗藥性癌症之預後。
「生物性樣本」係包含組織切片(如活檢樣本及抽吸術樣本)及為組織學目的所採之冷凍切片。該等切片包含前列腺癌組織、血液及血液餾份或產品(如血清、血漿、血小板、紅血球細胞等)、唾液、組織、經培養之細胞(如初代培養、培植體、及轉形細胞)、糞便、尿液等。
「活檢」意指移除一組織樣本以進行診斷評估或預後評估之過程，以及意指該組織檢體本身。於本技術領域中已知之任何活檢技術均可應用於本發明之診斷及預後方法。所應用之活檢技術係依進行評估之組織類型(如乳房等)、腫瘤尺寸及類型、及其他因素而定。具代表性之活檢技術包含，但不限於，切除性切片、切開性切片、針頭活檢、外科手術切片、及骨髓活檢。「切除性切片」意指移除整個腫瘤及小部分邊緣之圍繞該腫瘤之正常組織。「切開性切片」意指以一楔形狀移除部分組織，包含腫瘤之橫切直徑。以內視鏡或螢光鏡進行之診斷或預後可要求「核心針頭活檢」或「細針頭抽吸活檢」，通常自標的組織內取得細胞之懸浮物。
「核酸」意指去氧核醣核酸或核醣核酸，及其聚合物，無論是單股或多股形式，及其互補物。該術語涵蓋包含已知核苷酸類似物或經 修飾之骨架殘基或連鎖之核酸，可為合成、自然發生及非自然發生者，其具有與參考核酸類似的鍵結性質，並以與參考核酸類似的方式代謝。該類似物之實例包含，但非用以限制，硫代磷酸酯、磷醯胺、膦酸甲酯、對掌性膦酸甲酯、2-O-甲基核醣核酸、肽-核酸(PNAs)。
於此處，該等術語「多肽」、「胜肽」及「蛋白質」之意思互通，意指胺基酸殘基之聚合物。該等術語應用於胺基酸聚合物，其可為天然胺基酸聚合物及非天然胺基酸聚合物，其中一個或多個胺基酸殘基可為合成之化學模擬物(對應於天然胺基酸)。
該術語「胺基酸」意指天然胺基酸及合成天然胺基酸，以及胺基酸類似物及胺基酸模擬物，其功能模式係與天然胺基酸類似。天然胺基酸係由基因密碼子所編碼者、及隨後經修飾(如羥基脯胺酸、γ-羧基穀胺酸、及O-磷酸絲胺酸)之胺基酸。
「抗體」意指一多肽，包括一來自免疫球基因或其片段之骨架區域，其可專一性鍵結並辨識一抗原。該辨識之免疫球基因包含κ、λ、α、γ、δ、ε、μ保留區段基因，及極大數量之免疫球變異區段基因。輕鍊之分類為κ或λ。重鍊之分類為γ、μ、α、δ、或ε，依序分別定義為免疫球蛋白分類為IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。典型地，抗體之抗原鍵結區段為對於鍵結專一性及親和性最重要之處。
例示性分子標記：
ATP-鍵結卡匣(cassette)，次族G，成員1(ABCG1)
人類ATP-鍵結卡匣，次族G，成員1(ABCG1)基因(NCBI Entrez Gene 9619)位於編號21之染色體上，基因地圖位置21q22.3，可編碼 一複數穿膜蛋白，其主要座落於內質網(ER)及高基氏體之膜上。已鑑定出六種選擇性剪接變異型。例示性ABCG1序列為公開，例如由基因庫GenBank(如編號：NM_004915.3、NM_016818.2、NM_207174.1、NM_997510、NM_207628.1、及NM_207629.1(mRNAs)及NP_004906.3、NP_058198.2、NP_997057.1、NP_997510.1、NP_997511.1、及NP_997512.1(蛋白質))或UniProtKB(如P45844)。
計畫性細胞死亡4(PDCD4)
人類計畫性細胞死亡4(PDCD4)基因(NCBI Entrez Gene 27250)位於編號10之染色體上，基因地圖位置10q24，可編碼一核-質間穿梭蛋白。已鑑定出三種選擇性剪接變異型。例示性PDCD4序列為公開，例如由基因庫GenBank(如編碼：NM_001199492.1、NM_014456.4、及NM_145341.3(mRNAs)、及NP_001186421.1、NP_055271.2、及NP_663314.1(蛋白質))或UniProtKB(如Q53EL6)。
類庫氏因子6(Kruppel-like factor 6，KLF6)
人類類庫氏因子6(KLF6)基因(NCBI Entrez Gene 1316)位於編號10之染色體上，基因地圖位置10q15，可編碼一核蛋白質。已鑑定出三種選擇性剪接變異型。例示性KLF6序列為公開，例如由基因庫GenBank(如編碼：NM_001160124.1、NM_001160125.1、及NM_001300.5(mRNAs)、及NP_001153596.1、NP_001153597.1、及NP_001291.3(蛋白質))或UniProtKB(如Q99612)。
於本發明中，該分子標記包括該等標記基因：ABCG1、PDCD4、KLF6、ST6、BTD、BANF1、IRS1、ZNF185、ANXA11、DUSP2、 KLF4、DSC2或前述之任意組合，係用以預測前列腺癌之臨床預後。亦提供以前述分子標記為基礎之方法與套組。
作為分子標記，該等標記基因ABCG1、PDCD4、KLF6、ST6、BTD、BANF1、IRS1、ZNF185、ANXA11、DUSP2、KLF4及DSC可單獨使用或組合使用。該分子標記包含基因、RNA轉錄產物、及表現產物(如蛋白質)，可為野生型、截短型、或經選擇性剪接型。
於一實施例中，以前述標記基因之至少兩者為組合為較佳，例如該等標記基因中的3、4、5、6、7、8、9、10、11、或全部12個。於一較佳實施例中，該分子標記為12-基因模組，使用所有該標記基因進行預測。於另一較佳實施例中，該分子標記為3-基因模組或2-基因模組，其中，該標記基因係選自ABCG1、PDCD4、及KLF6所成群組。尤其是，該分子標記為ABCG1、PDCD4、及KLF6之組合；或ABCG1及PDCD4之組合。
該標記基因之表現量可以該標記基因之RNA轉錄產物、或其表現產物、或兩者之組合為基礎而決定。於一實施例中，測定該標記基因之表現量之手段係包括核酸探針、適配體(aptamer)、抗體、或前述之任意組合，其能夠專一性辨識該標記基因之RNA轉錄產物或表現產物(如蛋白質)。更具體而言，該標記基因之RNA轉錄產物之表現量可藉由聚合酶連鎖反應(PCR)、北方墨點試驗、RNA酶保護試驗、微陣列試驗、RNA原位雜合反應等方法檢測；而該標記基因之表現產物(如蛋白質或多肽)之表現量可藉由免疫轉漬試驗、免疫組織化學法、二維蛋白質電泳、質譜分析試驗、組織學染色等方法檢測。前述檢測手段可單獨或組合使用。
該生物性樣本係如前述所定義，可以抽吸術、活檢、或手術切除術取得。該生物性樣本可為新鮮、冷凍、或經福馬林固定石蠟包埋(FFPE)之前列腺腫瘤檢體。
於一實施例中，核酸結合分子例如探針、寡核苷酸、寡核苷酸陣列、及引子可用於該試驗中，以測定病患樣本中之標記基因之差異性RNA表現，例如RT-PCR、qPCR、及核酸微陣列。
於另一實施例中，蛋白質表現量之檢測係包括使用該基因標記專一性之抗體，及對於經固定(如福馬林固定)及/或經蠟包埋(如石蠟包埋)之前列腺腫瘤組織之免疫組織化學染色。該免疫組織化學法可以手動或自動操作方式進行。
於另一實施例中，抗體或核酸探針可應用於固定於顯微鏡玻片上之病患樣本。所得抗體染色或原位雜合圖譜，可使用本技術領域已知之不同光學顯微鏡檢或螢光顯微鏡檢之任一進行者顯像。
於另一實施例中，該蛋白質或核酸分析可藉由例如高效液相色層分析(HPLC)單獨使用、或與質譜儀(例如MALDI/MS、MALDI-TOF/MS、tandem MS等)組合使用而達成。
於一實施例中，該臨床預後包括疾病進程之可能性、臨床預後、復發率、死亡率等。該疾病進程係包括前列腺癌之分類、前列腺癌細胞之分化程度之測定等。
於另一實施例中，該臨床預後可為：一時間間距，介於疾病檢測日期或手術日期至疾病復發或轉移日期；一時間間距，介於疾病檢測日期或手術日期至病患死亡日期；前列腺癌之可測量腫瘤病灶(lesion)之數 量、尺寸、體積之至少一項之變化；或前述之任意組合。腫瘤病灶之變化之測定，可於診斷或手術之前、或期間之不同時間點、或之後，藉由目測、放射學及/或病理學檢驗該前列腺癌而進行。
於本發明中，該參考值係作為該預測之基準線，其可以一前列腺癌病患族群中，經常態化之該標記基因之表現量為基準而決定。典型地，該參考值可為一參考閥值，其係代表一大數量之前列腺癌病患或前列腺癌組織中之該標記基因之多肽或聚核苷酸，以組織樣本或活檢或其他生物性樣本(如細胞、血清、或血液)進行量測，且該等患者之臨床預後資料為可獲得。所述參考閥值係藉由定義量而決定，其中，與表現量低於參考閥值者相比，當該患者之腫瘤之標記表現量高於參考閥值時，係被預測為具有較高或較低程度之分化作用、或臨床預後或疾病進程之較低風險。本發明之多肽或聚核苷酸之量與該參考範圍之差異(不論是高或低)暗示了該患者具有較高或較低程度之腫瘤分化作用或臨床預後或疾病進程之較低風險，此係與表現量低於該參考閥值者相比所得。
為了比較該標記基因之表現量及該參考值，可採用包括下列之統計方法，但並非用以限制，級別區分可使用非監督式分類法(例如：k平均法(k-means)、階層式叢集法、主成分分析法、非負矩陣分解法、或多維尺度法)(Hastie et al.,2009)、監督式分類法(例如：判別分析、支持向量機、或k-最近鄰法)、或半監督式分類法；或結果預測(例如：無復發存活期、疾病進程、或整體存活期)可使用Cox回歸模型(Kalbfleisch and Prentice,2002)、加速失效時間模型、貝氏存活模型(Bayesian survival model)、或存活資料之平滑分析(Wand,2003)。
於一實施例中，與該參考值相較，該標記基因表現量增加係表示陽性臨床預後之可能性提高，例如前列腺癌未復發之長期存活率。於另一實施例中，該標記基因表現量增加可表示陽性臨床預後之可能性降低，例如前列腺癌之復發率。
於本發明中，該套組包括檢測該分子標記表現量之工具，例如，一探針或一抗體。該套組可進一步包括對照組，例如可專一性鍵結至持家基因(housekeeping gene)或蛋白質之探針或抗體(例如，β-肌動蛋白、GAPDH、RPL13A、微管蛋白等)。
於一較佳實施例中，該套組可包含至少一核酸探針，其對ABCG1轉錄子、PDCD4轉錄子、或KLLF6轉錄子具專一性；至少一對引子，可專一性擴增ABCG1、PDCD4、或KLF6；及/或至少一抗體，其對ABCG1蛋白質、PDCD4蛋白質、或KLF6蛋白質具專一性。該套組可進一步包含一核酸探針、引子、及/或一抗體，係對持家基因/轉錄子/蛋白質具專一性。
於一實施例中，該初級檢測工具(如探針、引子、或抗體)可直接標記有螢光團、發色團、或能產生可測定產物之酵素(如鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、及其他本技術領域習知者)，或可應用次級檢測工具，例如二次抗體或非抗體之不完全抗原(hapten)鍵結分子(如抗生物素蛋白或卵白素)。可將一可測定基團直接標記於該二次檢測工具。於其他例子中，該二次或更高次之抗體可與不完全抗原(如生物素、DNP、或FITC)連接，該不完全抗原可藉由同源之不完全抗原鍵結分子(如鏈親和素(streptavidin)辣根過氧化物酶、鏈親和素鹼性磷酸酶、或鏈親和素QDotTM)檢測得。於其他實施例中，該套組可進一步包括一呈色劑，係用於協助以 酵素標記之初級、二次、或更高次檢測工具，該酵素可以藉由該等呈色劑顯色。
於一實施例中，該套組可進一步包括一陽性及/或陰性對照組樣本，例如，包含或未包含該標記基因之轉錄產物之mRNA樣本、包含或未包含該標記基因編碼之蛋白質或區段蛋白質之蛋白質溶解物(lysate)、及/或已知可表現或未表現該標記基因之細胞株或組織。
於部分實施例中，該套組可進一步包括一載體，例如箱、袋子、藥水瓶、管子、小包、塑膠盒、包材、或其他容器。該套組之成分可以單劑為單位封裝，且該單位可具有分隔而容置該套組之一個或多個成分；或，該套組可包含一或多個容器，以容置例如一種或多種待測生物性樣本。於部分實施例中，該套組可進一步包括緩衝液及其他試劑，其可用於該預測方法之實施。
本發明之分子標記之組合可應用於微陣列，如核酸陣列或蛋白質陣列。該微陣列係包括一固態表面(如玻片)，於其上固定該專一性鍵結物(如cDNA探針、mRNA探針、或抗體)。於該陣列上，該專一性鍵結物係位於一可定址編排模式(如：網格)中。該專一性鍵結物係與存在於樣本中之同源標的物產生交互作用。在所有固定物中之標的鍵結模式係提供了基因表現之圖譜。
於一實施例中，該微陣列係由對該等標記基因之至少兩種之專一性鍵結物所構成，例如，由ABCG1、PDCD4、及KLF6專一性核酸探針或抗體所構成之微陣列。該微陣列可進一步包含對一種或多種持家基因或其基因產物(如mRNA、cDNA、或蛋白質)專一性之核酸探針或抗體。
該核酸探針或抗體所形成之陣列可直接連結於一撐體上，或藉由作為間隔物或連結物之寡核苷酸或其他分子而接附至該撐體。該固態撐體可為玻璃玻片或以有機聚合物形成者。於本發明中，可應用不同的陣列模式。例如，寡核苷酸條帶之線性陣列、不連續細胞之二維模式等。
以下藉由實施例詳述本發明，除非另有指明，否則該等實施例係僅用於說明，並非意欲限制本發明。熟習本領域之技藝者可理解，在不悖離後附申請專利範圍所界定之範疇下針對本發明所進行之各種變化或修改係落入本發明之一部分。
實施例 實施例1：鑑定與前列腺腺泡分化作用相關之基因表現圖譜
前列腺之腺泡分化過程係藉由於生理學相關三維(3D)培養模式中培養前列腺上皮RWPE-1細胞(Bello et al.,1997)而再現，如參考文獻(Weaver et al.,1997)所述。RWPE-1細胞為不死化前列腺上皮細胞，衍生自人類前列腺腺泡，已知可維持正常的細胞發生特徵及功能特徵(Bello et al.,1997)。將RWPE-1細胞植入3D重建基底膜膠(Matrigel,BD Biosciences)之厚層中並於此生長。該培養物係培養於添加牛腦下垂體萃取物、10ng/ml上皮生長因子、及抗生素(均購自Invitrogen)之Keratinocyte-SFM培養基(Sigma-Aldrich)中(Bello et al.,1997；Liu et al.,1998)。
如第1圖所示，當於前述條件下培養短期間(48小時)，RWPE-1細胞形成小型細胞團，缺乏細胞極化作用或組織建構。接著延長於3D培養之時間(10-12天)，此等細胞有顯著比例(平均93.1%)產生表型組織化，形成圓形、類腺泡結構，可聯想到正常前列腺或低度PCA。共焦影 像分析確認了該等結構係由具有頂部-底部極化作用之單層細胞所構成，如底部表面標記α6-整合素(紅色)及頂部標記GM130(綠色)所指示，其環繞一中空的中央內腔(第1A圖)。檢驗3D結構，顯示高於93.1%之RWPE-1細胞形成極化之腺泡，而僅有非常少數的前列腺癌LNCaP細胞能夠形成極化構造(第1B圖)。
為了詳細分析關於此種前列腺腺泡分化過程相關之基因表現之改變，以早期細胞培養形成之RWPE-1細胞團及晚期形成之腺泡進行整體基因表現圖譜實驗。簡言之，使用TRIZOL(Invitrogen)抽取全RNA樣本，接著以RNeasy迷你套組及DNase(Qiagen)處理進行純化。進行三重複實驗。以Affymetrix人類基因體U133A 2.0 Plus基因晶片平台(購自Affymetrix)，根據操作手冊進行基因表現分析。以基因晶片操作軟體(GeneChip Operating software，購自Affymetrix)處理雜合強度數據，並以Affymetrix P/A/M flags為基礎，篩選過濾基因，保留於至少一種培養條件中之重複樣本之至少三個中表現之基因。為了在比較組別中選出區別性表現之基因，採用低於0.025之偽發現率。
表1提供了411個特定基因(以447 Affymetrix探針組表現)之詳細列表，係鑑定為在RWPE-1細胞之腺泡分化期間之區別性表現基因。該等基因係藉由微陣列實驗，以其表現量於RWPE-1細胞團與腺泡之間有顯著差異，所鑑定出。依據各探針在RWPE-1腺泡與RWPE-1細胞團間之平均雜合強度之比例，將該等基因係以遞減排序。
表1、於RWPE-1腺泡(A)及細胞團(C)中具區別性表現之411個基因(以447 Affymetrix探針組表現)
於第2圖中，基因本體功能群分析顯示，於此411個基因組中，於前列腺腺泡分化期間為增量調控之該等基因，實質上多為關於上皮及外胚分化作用與上皮結構之維持(第2A圖)，包含細胞角蛋白KRT15、KRT16及KRT4、角質細胞膜蛋白質SPRR1B及SPRR1A、層黏蛋白-5次單元LAMB3、縫隙連接蛋白質GJB6及GJB3、緊密連接蛋白質CLDN8、及分化相關轉錄因子KLF4及FOXQ1，以及，與前列腺之荷爾蒙與分泌功能相關之因子，包含類固醇與黃體激素代謝(HSD11B2,DHRS9)、黏蛋白或硫酸乙醯肝素生成(MUC1,HS3ST1)、亞精胺/精胺代謝(SAT1)、及生殖腺蛋白質(FST)(第2B圖)。此等發現係強力支持本組織器官化模型，可作為獲得前列腺結構及功能分化過程之特定分子訊號之確切途徑。
實施例2
本實施例證實，帶有分化之前列腺腺泡之411個基因表現圖譜之前列腺癌係與較佳臨床預後具關連性。
為了證實前列腺腺泡分化相關之分子圖譜是否帶有人類前列腺癌之重要預後資訊，本實施例審視了已公開之以21位罹患局部性前列腺癌並接受根治性前列腺切除術之患者之基因表現微陣列數據組(該等患者之切除術係於布萊根婦女醫院(Boston,MA)進行，以下簡稱BWH組)(Singh et al.,2002)。以該411個腺泡分化相關基因之表現為基礎，藉由計算皮爾森相關係數(r acini )而測定該患者腫瘤與前列腺腺泡之間之相似程度。
於第3圖中，依r acini 將病患區分為兩次群，臨界值係以最大尤登指數決定(Pepe,2003)。將具有較高r acini 之腫瘤定為「腺泡狀」腫瘤，且，藉由卡普蘭-梅耶分析(對數等級檢定P=0.009)發現，與具有較低相關值之病患相較，患有此類型腫瘤之病患具有顯著較低之復發之風險。於具有腺泡狀PCA之病患中，完全未復發之3年存活率預估為92.1%，而於較低r acini 群組中則為58.3%。
如表2所示，於一多變量Cox比例風險分析中，發現腫瘤之r acini 是復發之唯一顯著預測者(風險比例=0.173(0.041-0.725),P=0.016)。
表2、藉由腺泡及臨床及病理學標準，於該BWH組中以多變量Cox比例風險模組預測復發
為評估前列腺腺泡之表現圖譜對於前列腺癌之風險分級可多精確，此處以來自接受根治性前列腺切除術並後續追蹤達5年之29位前列腺癌病患之獨立腫瘤轉錄體數據組(Lapointe et al.,2004，以下簡稱Lapointe組)重複上述分析。
第4圖顯示，於此驗證組(對數等級檢定P=0.032)中，具有較高r acini 之患者(即腺泡狀腫瘤)表現較具有較低r acini 者佳；於具有較高r acini 組之病患中，完全未復發之18個月存活率預估為80%，而於較低關聯值組中則為0%。
如表3所示，多變量Cox回歸分析確認了r acini 係於前列腺癌中提供獨立的預後資訊，而於此組中格里森評分僅能提供輕微預後。
實施例3
本實施例係鑑定以前列腺腺泡分化相關之分子圖譜為基礎之前列腺癌之12-基因預後模組。
已確認於前列腺癌中，前列腺腺泡相關之表現圖譜之預後 值，此處意圖完善此圖譜、並定出較高臨床應用性之較少基因數之組。為此，將該411個腺泡相關基因與該BWH數據組(Singh et al.,2002)進行比對，並以Cox模組為基礎設定「復發級分」以預測根治性前列腺切除術後之腫瘤復發之發生率。本實施例採用前述監督式方法並進行調整(Wang et al.,2005)。簡言之，對於每個基因，採用單變量Cox之回歸分析以測量基因表現量(以log2規格)與該BWH組之PCA患者之完全未復發之存活長度之間的關連性。本實施例建立了該組病患之1000個引導樣本，並對各樣本進行Cox之回歸分析。接著，藉由計算該1000個引導樣本之P-值中數及Cox係數中數，分別決定各基因之預估P-值及預估標準化Cox回歸係數。為確保本模組之一致性，選擇了於前列腺腺泡分化期間表現量改變之基因，且該等改變係與復發風險預期為陽性(於細胞團中增量調控之基因)或陰性(於前列腺腺泡中增量調控之基因)，如同以預估標準化Cox回歸係數決定者。接著將所選基因依據預估P-值排列分級，以頂端前三個基因為起始組，自該遞減排列之列表頂端開始每次重複添加一個或多個基因，藉此產生複數個基因組。接著，計算「復發級分」(方程式1)以測量針對一基因組之病患手術後復發之風險： 其中，k為探針組中的探針數量，b i 為第i個探針之標準化Cox回歸係數，且x i 為第i個探針之log2表現量。
針對各所選探針組，一致性指數(C-指數，C-index)係用於評估存活分析之預測正確性(Pencina and D'Agostino,2004)。於R語言統計編 程(cran.r-project.org)中使用「survcomp」包裝進行C-指數統計分析。選出達到最大預測正確性且包含最少數目基因之基因組，作為最適化之預後預測者。如第5圖所示，由此方法選出一組之12個基因，如C-指數所評估，其預後預測之表現可達高峰。
表4顯示所選擇之12個基因之鑑定。
第6圖顯示，以復發級分(方程式1)為基礎，此12-基因印記之表現圖譜可以藉由卡普蘭-梅耶分析於該BWH組中(對數等級檢定P=0.0005)相當有效率地進行疾病復發之風險分級。
第7圖顯示，以該12-基因模組為基礎而計算之復發級分亦可將該Lapointe et al.組之病患區分為於復發風險上具有顯著差異之兩群(對數等級檢定P=0.0455)。
如表5所示，多變量Cox回歸分析係證實此12-基因模組可提供強力且獨立之前列腺癌預後資訊(風險比例=42.304,P=0.004)。
表6顯示，該12-基因模組係顯著增加了包含臨床及病理變因之組合式臨床模組之預後準確性(C-指數：由0.620至0.847)，且更優於先前報導之數種前列腺癌之預後基因印記(Glinsky et al.,2004；Singh et al.,2002)。
*該5-基因印記包含染色顆粒素A(CHGA)、血小板衍生之生長因子受體β(PDGFRB)、同源框C6(HOXC6)、三磷酸肌醇受體3(IPTR3)、及唾液酸轉移酶-1(ST3GAL1)。
†該5-基因印記包含非銘印普瑞德-威氏/安裘曼氏症候群區域蛋白質2 (NIPA2)或HGC5466、無翅型MMTV整合點家族，成員5A(WNT5A)、含DENN/MADD區域4B(DENND4B)或KIAA0476、肌醇1,4,5-三磷酸受體第1型(ITPR1)及轉錄因子2(TCF2)。
實施例4
本實施例詳述表4所列之特定標記之預後值。
第8圖顯示表4中之12分子標記之大部分均可獨立將該BWH群之前列腺癌病患分級成兩群，具有明顯不同之根治性前列腺切除術後復發風險。例外的是ANXA11及DSC2，僅提供輕微的預後(對數等級檢定P>0.1)。另外一個例外為BANF1，所以該等標記係於前列腺腺泡中增量調控(相對於在細胞團中)(表4)，並相關於較低之疾病復發風險，顯示它們作為組織分化及腫瘤抑制物之潛在角色。反之，BANF1之轉錄增加程度，在前列腺腺泡會被減量調控，故其為復發風險正相關者。
若可併入慣常病理學檢驗中，癌症生物標記可更具臨床應用性。為了檢測該12-基因模組之基因之預後相關性是否可於人類前列腺癌材料中於蛋白質及組織層級中觀察到，測定包含PDCD4、ABCG1、及KLF6之三個選定標記之組織表現，係以來自接受根治性前列腺切除術並後續追蹤達11年之61位早期前列腺癌患者之獨立群組，以腫瘤組織之免疫組織化學染色進行(奇美醫學中心，台灣，台南；簡稱CFMC組)。該等選定標記之專一性及病理學驗證過之抗體為商業可購得，包含抗-ABCG1抗體(品系EP1366Y)、抗-PDCD4抗體(品系EPR3431)、及抗-KLF6抗體(均購自Epitomics,Burlingame,CA)。簡言之，取得於奇美醫學中心接受根治性前列腺切除術之61位患者之福馬林固定、石蠟包埋之人類前列腺癌組織及相關臨床數據，並依人體試驗委員會所核准之計畫(該CFMC組)進行實驗。PCA 之生化性復發係定義為前列腺專一性抗原(PSA)為至少0.4ng/ml、或兩個連續的PSA值為0.2mg/ml且為升高(Stephenson et al.,2006)。將組織切片去石蠟、水合、浸泡於pH 6.0之檸檬酸延緩衝液中，以於微波中將抗原位恢復。內生性過氧化物酶活性係以3%過氧化氫酶驟冷15分鐘，接著將玻片以10%一般馬血清培養以阻斷非專一性免疫反應。接著施用抗體並以DAKO EnVision套組(DAKO)檢測。所有免疫組織化學(IHC)染色均由相同病理學專家評估，且該染色型態係以組織學評分(H-評分)量化(Budwit-Novotny et al.,1986)。
第9圖顯示於PCA組織中，PDCD4(i、ii)、KLF6(iii、iv)、及ABCG1(v、vi)之代表性之免疫染色(400×放大倍率)。所用抗體包含抗-ABCG1抗體(品系EP1366Y)、抗-PDCD4抗體(品系EPR3431)、及抗-KLF6抗體(均購自Epitomics,Burlingame,CA)。所顯示為具有各標記之高染色強度(i、iii、v)或低染色強度(ii、iv、vi)之腫瘤。
如第10圖所示，以H-評分評估之PDCD4染色強度顯示了與卡普蘭-梅耶分析(對數等級檢定P<0.001)進行之手術後生化性復發風險之強烈的負相關性。類似地，亦發現，與較低染色強度者相較，KLF6或ABCG1之腫瘤染色強度係與明顯較長之無復發存活期相關(對數等級檢定分別為P<0.001)。
如表7所示，多變量Cox回歸分析證實，PCDC4、ABCG1、或KLF6係強力預後資訊，且獨立於臨床標準及格里森評分。
實施例5
本實施例係詳述以PDCD4、ABCG1、及KLF6表現量為基礎之前列腺癌之3-基因預後模組。
於實施例4中，該前列腺癌之12-基因模組中之三個基因標記，包含PDCD4、ABCG1、及KLF6，可藉由前列腺腫瘤組織之免疫組織化學染色檢驗。該等標記之個別染色強度顯示了與手術後生化性復發風險之強烈的負相關性(第10圖)。同理，PDCD4、ABCG1、或KLF6之mRNA表現量顯示了與手術後疾病復發風險之強烈的負相關性(第8圖)。因此，進行是否可使用PDCD4、ABCG1、及KLF6之表現量以建立前列腺癌之3-基因預後模組。對此，以染色強度為基礎而計算復發級分(方程式1)，如H-評分所量化之該CFMC組之PDCD4、ABCG1、及KLF6。依據該復發級分及以最大尤登指數決定之臨界值(Pepe,2003)，病患可被區分成兩次群，具有手術後生化性復發之高風險或低風險。
如第11圖所示，基於該復發級分，PDCD4、ABCG1、及KLF6之染色強度可以於該CFMC組中，藉由卡普蘭-梅耶分析而有效地進行疾病復發之風險分級(風險比例=30.2，對數等級檢定P<0.0001)。顯然，在低風險群之病患中，並無於整體追蹤期間復發疾病者。反之，高風險群之病患之存活期中數為4.833個月。
如表8所示，多變量Cox回歸分析證實，該3-基因模組係提供最強力之前列腺癌預後資訊，其獨立於臨床標準及格里森評分(風險比例=22.591,P=0.004)。
表9顯示，依據C-指數數值(Pencina and D'Agostino,2004)，該3-基因模組之預測正確性可達0.951，顯然優於藉由C-統計之預測正確性為0.695之組合式臨床模組(包含年齡、腫瘤階段、血清PSA、及格里森評分)(P=0.001)。
證實該前列腺癌之3-基因預後模組之較佳表現後，接著測試其對於BWH組之表現。於此數據組，使用PDCD4、ABCG1、及KLF6之轉錄表現量以計算該復發級分，並將該等病患分成兩次群，具有手術後復發之高風險或低風險，且以最大尤登指數決定之臨界值。
第12圖顯示，基於該復發級分(方程式1)，PDCD4、ABCG1、及KLF6之轉錄程度可以於該BWH組中，藉由卡普蘭-梅耶分析而有效地進行疾病復發風險之分級(風險比例=12.0，對數等級檢定P=0.0005)。
如表10所示，多變量Cox回歸分析證實，該3-基因模組係提供最強力且獨立之前列腺癌預後資訊，其手術後疾病復發率之風險比例達59.551(P=0.006)。
表11顯示，依據C-指數，該3-基因模組於該BWH組之預測正確性可達0.939(P<0.001)，顯然可增進組合式臨床模組(包含年齡、腫瘤階段、血清PSA、及格里森評分)之預測正確性(P=0.002)，組合式臨床模組本身並不具備明顯的預後數值(C-指數=0.617,P=0.113)。
實施例6
本實施例係詳述以PDCD4及ABCG1表現量為基礎之前列腺癌之2-基因預後模組。
已驗證PDCD4及ABCG1之表現量可被用於建立有效之前列腺癌之2-基因預後模組。以染色強度為基礎而計算復發級分(方程式1)，如H-評分所量化之該CFMC組之PDCD4及ABCG1。以最大尤登指數決定之臨界值。依據該復發級分及以最大尤登指數決定之臨界值，病患可被區分成兩次群，具有手術後生化性復發之高風險或低風險。
第13圖顯示，基於該復發級分，PDCD4及ABCG1之染色強度可以於該CFMC組中，藉由卡普蘭-梅耶分析而有效地進行疾病復發風險之分級(風險比例=15.6，對數等級檢定P=0.009)。
如表12所示，多變量Cox回歸分析證實，該2-基因模組係提供最強力之前列腺癌預後資訊，其獨立於臨床標準及格里森評分(風險比例=16.25，P=0.002)。
表13顯示，依據C-指數數值，該2-基因模組之預測正確性可達0.915，很顯然地優於組合式臨床模組(包含年齡、腫瘤階段、血清PSA、及格里森評分)(P=0.012)。
接著測試具有21位患者之BWH組中，該2-基因預後模組之表現。於此數據組中，使用PDCD4及ABCG1之轉錄表現量以計算復發級分，並將病患分為兩次群：手術後復發高風險或低風險者。
第14圖顯示，基於該復發級分，PDCD4及ABCG1之轉錄表現量可以於該BWH組中，藉由卡普蘭-梅耶分析而有效地進行疾病復發風險之分級(風險比例=6.8，對數等級檢定P=0.009)。
如表15所示，多變量Cox回歸分析證實，該2-基因模組係提供最強力且獨立之前列腺癌預後資訊，其手術後疾病復發率之風險比例達139.963(P=0.048)。
表15顯示，依據C-指數，該2-基因模組於該BWH組之預測正確性可達0.875(P<0.001)，顯然可增進組合式臨床模組(包含年齡、腫瘤階段、血清PSA、及格里森評分)之預測正確性(P=0.022)。
如表16所示，比較上述12-基因模組、3-基因模組及2-基因模組對於該BWH組病患之前列腺癌臨床預後之預測正確性。很顯然地，該3-基因模組與該12-基因模組表現一樣好(分別為C-指數0.939、P<0.001)。雖然2-基因模組表現略微遜色於12-基因或3-基因模組(C-指數=0.875，P<0.001)，但C-指數上的差異並不具有統計顯著性(P=0.134)。
N.A.：未採用
進一步比較3-基因模組及2-基因模組對該CFMC組病患之預後預測之表現。如表17所示，3-基因模組表現較2-基因模組稍佳，儘管並無統計上之顯著差異性(P=0.195)。
N.A.：未採用
實施例7
本實施例係詳述以實施例3所示之12-基因預後模組為基礎，對於前列腺癌病患之預測復發率之計算及預期無復發存活。
如實施例3所述，可量測一前列腺癌病患之手術後復發率以所選基因組計算復發級分(復發級分=(方程式1))。針對已知復發級分之病患，該病患於時間點t之復發風險率可藉由Cox回歸評估，且該風險率可以h(t)=h 0(t)exp(bx)表示，其中x為復發級分之值，b為回歸係數，及h 0(t)為風險基準函數。於時間點t之預測之復發率可依下列方程式評估：F(t)=1-S 0(t)exp(bx) (方程式1)其中，為無復發基準函數。該等計算可以商業可購得軟體(如SPSS軟體(IBM)等)進行。又，復發時間中數可由F(t)=1-S 0(t)exp(bx) (方程式1)，設定F(t)=0.5而解決。
舉例而言，對於BWH組之病患之復發級分，可依該標的之12基因標記之轉錄表現程度為基準，以下列方程式計算：x=10.028+(-1.636 ABCG1-1.74 ANXA11+1.811 BANF1-1.345 BTD-0.711 DSC2-1.844 DUSP2-1.419 IRS1-1.000 KLF4-2.601 KLF6-2.185 PDCD4-2.028 ST6GALNAC2-1.488 ZNF185)/12 (方程式2)
預估Cox回歸為h(t)=h 0(t)exp(1.490x)。復發函數可由下列表示： F(t)=1-S 0(t)exp(1.490x) (方程式3)
所預估之S 0(t)之值係顯示於表18。
故，依列於表中之該病患之12基因標記轉錄表現量，可依KLF6-2.185 PDCD4-2.028 ST6GALNAC2-1.488 ZNF185)/12(方程式2)、及表12而預測該病患之復發率及預期之完全未復發之存活率。表19顯示選自BWH組之4位病患之預測結果。
實施例8
本實施例係詳述以實施例5所示之3-基因預後模組為基礎，對於前列腺癌病患之預測復發率之計算及預期無復發存活。
實施例7之相同原理亦可應用於如實施例5所示之3-基因模組，以預測CFMC組病患之復發率及預期無復發存活率。依據(復發級分=(方程式1))，可依下列方程式，以H-評分表示之於該病患腫瘤中PDCD4、ABCG1、及KLF6之染色強度為基礎，計算CFMC組病患之復發級分：x=7.112÷(-2.771 ABCG1-2.814 KLF6-3.442 PDCD4)/3· (方程式5)。
預估Cox回歸為h(t)=h 0(t)exp(1.235x)。復發函數可由下列表示：F(t)=1-S 0(t)exp(1.235x) (方程式6).
所預估之S 0(t)之值係顯示於表20。
因此，對於ABCG1、PDCD4及ABCG1之染色強度為已知之CFMC組之任何病患，所預測之3年復發率、5年復發率及預期無復發存活率可依x=7.112÷(-2.771 ABCG1-2.814 KLF6-3.442 PDCD4)/3· (方程式5)、F(t)=1-S 0(t)exp(1.235x) (方程式6)、及表20計算。表21顯示選自CFMC組之4位病患之預測結果。
以相同原理，可以ABCG1、PDCD4、及KLF6之轉錄表現量為基礎，依下列方程式計算復發級分：x=16.682÷(-1.636 ABCG1-2.601 KLF6-2.185 PDCD4)/3) (方程式7)。
預估Cox回歸為h(t)=h 0(t)exp(0.672x)，且復發函數可依F(t)=1-S 0(t)exp(0.672x) (方程式8)而計算。
所預估之S 0(t)之值係顯示於表22。
表23顯示選自BWH組之4位病患之預測之3年復發率及無復發存活率。
依據上述結果，本發明係提供預測前列腺癌之臨床預後之分子標記之組合。與已知模式相較，本發明係顯示更佳的正確性，且更適於臨床應用。

Claims (19)

  1. 一種預測已檢測得前列腺癌之人類病患之臨床預後之方法，係包括：由該人類病患所得之包含前列腺癌細胞之生物性樣本中，檢測由ABCG1、PDCD4、KLF6、ST6、BTD、BANF1、IRS1、ZNF185、ANXA11、DUSP2、KLF4及DSC2所成群組之一種或多種標記基因之表現量；以及藉由該標記基因之表現量與參考值之比較，預測臨床預後之可能性。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中，該臨床預後係選自疾病進程之可能性、臨床預後、復發率、死亡率、或前述任意之組合。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中，該臨床預後係包括：一時間間距，係介於疾病檢測或手術之日期至疾病復發或轉移之日期；一時間間距，係介於疾病檢測或手術之日期至病患死亡之日期；前列腺癌之可測量腫瘤病灶之數量、尺寸、體積之至少一項之變化；或前述之任意組合。
  4. 如申請專利範圍第2項之方法，其中，該疾病進程係包括前列腺癌之分類、前列腺癌細胞分化程度之測定、或其組合。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中，該標記基因係選自由ABCG1、PDCD4、及KLF6所成群組之一種或多種。
  6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中，該標記基因為ABCG1及PDCD4之組合。
  7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中，該標記基因之表現量係以該標記基因之RNA轉譯子或該標記基因之表現產物為基礎而測定。
  8. 如申請專利範圍第1項之方法，其中，該標記基因之表現量係藉由聚合酶連鎖反應(PCR)、北方墨點試驗、RNA酶保護試驗、微陣列試驗、RNA原位雜合反應、免疫轉漬試驗、免疫組織化學法、二維蛋白質電泳、質譜分析試驗、或前述之任意組合。
  9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中，該生物性樣本係以抽吸術、活檢、或手術切除術取得。
  10. 如申請專利範圍第1項之方法，其中，該參考值係以一前列腺癌病患族群中，經常態化之該標記基因之表現量為基準而決定。
  11. 如申請專利範圍第1項之方法，其中，當該標記基因之表現量增加，表示陽性臨床預後之可能性為增加或減少。
  12. 如申請專利範圍第10項之方法，其中，該陽性臨床預後係包括無前列腺癌復發之長期存活率、或前列腺癌病患之長期整體存活率。
  13. 一種用於預測前列腺癌之臨床預後之分子標記組合，係包括ABCG1、PDCD4、KLF6、ST6、BTD、BANF1、IRS1、ZNF185、ANXA11、DUSP2、KLF4、及DSC2中之至少二者。
  14. 如申請專利範圍第13項之分子標記組合，其中，該至少二個分子標 記係選自由ABCG1、PDCD4、及KLF6所成群組。
  15. 如申請專利範圍第13項之分子標記組合，其中，該臨床預後該臨床預後係包括疾病進程、臨床預後、復發率、死亡率、或前述任意之組合。
  16. 如申請專利範圍第15項之分子標記組合，其中，該疾病進程係包括前列腺癌之分類、前列腺癌細胞分化程度之測定、或其組合。
  17. 一種用於預測前列腺癌之臨床預後之套組，係包括一種檢測選自由ABCG1、PDCD4、KLF6、ST6、BTD、BANF1、IRS1、ZNF185、ANXA11、DUSP2、KLF4、及DSC2所成群組之一種或多種標記基因之表現量之工具。
  18. 如申請專利範圍第17項之套組，其中，該標記基因之表現量係以該標記基因之RNA轉譯子或該標記基因之表現產物為基礎而測定。
  19. 如申請專利範圍第17項之套組，其中，該工具係包括核酸探針、適配體、抗體、或前述之任意組合。
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