CN113355412B - 用于辅助诊断癌症的甲基化标志物及试剂盒 - Google Patents

用于辅助诊断癌症的甲基化标志物及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN113355412B
CN113355412B CN202010135360.8A CN202010135360A CN113355412B CN 113355412 B CN113355412 B CN 113355412B CN 202010135360 A CN202010135360 A CN 202010135360A CN 113355412 B CN113355412 B CN 113355412B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
primer
abcg1
dna fragment
cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010135360.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113355412A (zh
Inventor
狄飞飞
韦玉杰
王俊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tengchen Biotechnology Shanghai Co ltd
Original Assignee
Tengchen Biotechnology Shanghai Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tengchen Biotechnology Shanghai Co ltd filed Critical Tengchen Biotechnology Shanghai Co ltd
Priority to CN202010135360.8A priority Critical patent/CN113355412B/zh
Publication of CN113355412A publication Critical patent/CN113355412A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113355412B publication Critical patent/CN113355412B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于辅助诊断癌症的甲基化标志物及试剂盒。本发明提供了甲基化ABCG1基因作为标志物在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下至少一种：辅助诊断癌症或预测癌症患病风险；辅助区分良性结节和癌症；辅助区分癌症不同亚型；辅助区分癌症不同分期；辅助区分不同癌症；确定待测物对癌症的发生是否存在阻碍或促进作用；所述癌症可为肺癌、胰腺癌或食管癌。本发明研究发现了肺癌、胰腺癌和食管癌患者血液中ABCG1基因的低甲基化现象，本发明对提高肺癌、胰腺癌和食管癌早期诊疗效果和降低死亡率均有重要的科学意义和临床应用价值。

Description

用于辅助诊断癌症的甲基化标志物及试剂盒
技术领域
本发明涉及医学领域，特别涉及一种用于辅助诊断癌症的甲基化标志物及试剂盒。
背景技术
肺癌是一种发生于支气管粘膜上皮的恶性肿瘤，近几十年来，其发病率和死亡率一直呈上升趋势，为全世界发病率和死亡率最高的癌症。尽管最近几年在诊断方法、手术技术及化疗药物等方面均有新进展，但肺癌患者总的5年生存率仅为16％，主要是由于大部分肺癌患者就诊时己发生转移从而失去了手术根治机会。研究表明，肺癌的预后与分期直接相关，I期肺癌5年生存率为83％，II期为53％，III期为26％，IV期为6％。因此，降低肺癌患者死亡率的关键在于早诊断早治疗。
目前主要的肺癌诊断方法有如下几种：(1)影像学方法：例如胸部X射线和低剂量螺旋CT。但胸部X射线很难发现早期肺癌。低剂量螺旋CT虽然可以发现肺内小结节，但是假阳性率高达96.4％，给被检查者带来不必要的心理负担。同时，胸部X射线和低剂量螺旋CT由于辐射的原因不宜频繁使用。另外，影像学方法也往往受设备和医生看片经验，以及有效读片时间的影响。(2)细胞学方法：例如痰液细胞学检查、支气管镜下刷片或取活检、支气管肺泡灌洗液细胞学检查等。痰液细胞学检查和支气管镜下刷片或取活检对于周围性肺癌的灵敏度较低。同时支气管镜下刷片或取活检、支气管肺泡灌洗液细胞学检查操作比较繁琐，且体检者舒适度不佳。(3)目前常用的血清肿瘤标志物：癌胚抗原(CEA)、糖类抗原(CA125/153/199)、细胞角蛋白19片段抗原(CYFRA21-1)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)等。这些血清肿瘤标志物对肺癌的灵敏度有限，一般为30％-40％，对于I期肿瘤甚至更低。而且肿瘤特异性也比较有限，受许多良性病变如良性肿瘤、炎症、退行性疾病等影响。目前，肿瘤标志物主要用于恶性肿瘤的筛查和肿瘤治疗效果复查。因此，需要进一步开发高效特异的肺癌早期诊断技术。
目前国际公认的肺部结节诊断的最有效方法是胸部低剂量螺旋CT筛查。但是低剂量螺旋CT的灵敏度高，能发现大量的小结节，却难以进行良恶性的判别。在发现的小结节中，恶性的比例还不到4％。目前，临床上对肺结节的良恶性鉴定需要长期随访、反复CT检查或者依赖肺部结节活组织取样(包括胸壁细针穿刺活检、支气管镜组织活检、胸腔镜或开胸手术肺活检)等创伤性检查方法。CT引导或超声引导经胸穿刺活检有较高的灵敏度，但对于<2cm的结节诊断率较低，有30～70％漏诊率，且气胸和出血发生率较高。气管镜针吸活检并发症发生率相对较低，但对周围型结节诊断率有限，对≤2cm的结节诊断率仅34％，大于2cm的结节诊断率为63％。手术切除诊断率高且可直接对结节进行处理，但会造成患者肺功能出现短暂减退，若结节为良性，则患者进行了不必要的手术，导致了过度医疗。因此，目前迫切需要新的体外诊断分子标志物来辅助进行肺部结节的鉴别，在降低漏诊率的同时也尽量减少不必要的穿刺或者手术。
胰腺癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，其中约90％为胰腺导管腺癌，是目前世界上第四大致死性恶性肿瘤。由于发病隐匿、临床症状特异性差和早期浸润性特点，大部分胰腺癌患者发现时已处于晚期，失去手术治疗机会，导致5年生存率只有7％。如果病人可以在早期(I期)发现，胰腺癌患者5年生存率可达到60％。目前临床上关于胰腺癌的常用诊断方法有：(1)超声、增强CT和核磁共振(MRI)等影像学方法，超声波诊断的准确性受医生看片经验、病人肥大的体形和胃肠道气体的限制；通常，超声这种诊断胰腺癌的方法可作为CT的补充检查来运用，但增强CT对人体辐射较大，不易频繁使用；MRI没有辐射的影响，但它对于一些人并不适用(体内有金属物品及心脏起搏器等)，检查所需时间较长，由于设备比较昂贵，一些中小医院尚未普及。(2)临床上会结合一些血清肿瘤标志物如CA19-9、CA242、CA50等进一步检测，以上肿瘤标志物敏感度较高，但特异性较低，容易受肝功能及胆汁郁积的影响。(3)病理学检查：经皮穿刺活检、超声胃镜引导下的活检、腹水脱落细胞学检查及腹腔镜或开腹手术下探查活检，但该方法为创伤性检查，并不适用于早期患者。因此，更为敏感、特异的早期胰腺癌分子标记亟待发掘。
食管癌为一种起源于食管黏膜上皮的恶性肿瘤，其中约80％为鳞状细胞癌，是临床常见的恶性肿瘤之一。在全球范围内，食管癌的发病率在恶性肿瘤中居第8位，死亡率居第6位。我国是食管癌高发国家，且其发病率有逐渐增加的趋势。目前，90％以上的食管癌患者确诊时已进展至中晚期，总体5年生存率不足20％。目前临床上食管癌检测主要有以下几种方法。内镜超声检查：因高频探头穿透力低，仅甚至更短，所见范围非常有限，此外有/>患者因食管过度狭窄而不能使用此方法。食管镜检查：食管镜可详细观察病灶的位置、大小及形态，也可直接钳取病理组织或用毛刷刷取标本作细胞学检查，但会引起患者的不适。X线钡餐造影：患者在X线检查时吞食钡粥，观察钡粥通过食管时的显影，达到定性和定位的诊断，受医生操作及看片经验的影响，且此方法不适用极早期食管癌患者。CT扫描：能够显示出病患食管与邻近器官之间的关系，但是它的弊端在于对于早期患者灵敏度很低。此外还有一些常用的肿瘤标志物，如CA72-4、CA19-9、CEA、CYFRA21-1和鳞状细胞癌相关抗原(SCC)等可用于食管癌的诊断，但其灵敏度不足40％，且特异性较低，尤其对于早期患者的诊断价值较低。因此，需要进一步开发高效特异的食管癌早期诊断技术。
DNA甲基化是基因上重要的一种化学修饰，影响着基因转录的调控过程和细胞核结构。DNA甲基化的改变是癌症发展的早期事件和伴随事件，主要体现在肿瘤组织上抑癌基因的高甲基化和原癌基因的低甲基化等。但是血液中的DNA甲基化跟肿瘤发生发展的相关性则报道得较少。此外血液容易收集，DNA甲基化较稳定，如果可以发现肿瘤特异的血液DNA甲基化分子标志物则有巨大的临床应用价值。因此，探索和开发适用于临床检测需要的血液DNA甲基化诊断技术对提高肺癌早期诊疗效果和降低死亡率均有重要的临床应用价值和社会意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于辅助诊断癌症的三磷酸腺苷结合盒转运体G1(ATPbinding cassette subfamily G member 1,ABCG1)甲基化标志物及试剂盒。
第一方面，本发明要求保护甲基化ABCG1基因作为标志物在制备产品中的应用。所述产品的用途可为如下中的至少一种：
(1)辅助诊断癌症或预测癌症患病风险；
(2)辅助区分良性结节和癌症；
(3)辅助区分癌症不同亚型；
(4)辅助区分癌症不同分期；
(5)辅助诊断肺癌或预测肺癌患病风险；
(6)辅助区分肺部良性结节和肺癌；
(7)辅助区分肺癌不同亚型；
(8)辅助区分肺癌不同分期；
(9)辅助诊断胰腺癌或预测胰腺癌患病风险；
(10)辅助诊断食管癌或预测食管癌患病风险；
(11)辅助区分肺癌和胰腺癌；
(12)辅助区分肺癌和食管癌；
(13)辅助区分胰腺癌和食管癌；
(14)确定待测物对癌症的发生是否存在阻碍或促进作用。
进一步地，(1)中所述辅助诊断癌症具体可体现为如下中的至少一种：辅助区分癌症患者和无癌对照(可理解为现在及曾经均没有患过癌症且没有报告肺部良性结节且血常规指标都在参考范围内)；辅助区分不同癌症。
进一步地，(2)中所述良性结节为(2)中所述癌症对应的良性结节，如肺部良性结节和肺癌。
进一步地，(3)中所述癌症不同亚型可为病理分型，如组织学分型。
进一步地，(4)中所述癌症不同分期可为临床分期或TNM分期。
在本发明的具体实施方式中，(5)中所述辅助诊断肺癌具体体现为如下中的至少一种：可辅助区分肺癌患者和无癌对照、可辅助区分肺腺癌患者和无癌对照、可辅助区分肺鳞癌患者和无癌对照、可辅助区分小细胞肺癌患者和无癌对照、可辅助区分I期肺癌患者和无癌对照、可辅助区分II-III期肺癌患者和无癌对照、可辅助区分无淋巴结浸润的肺癌患者和无癌对照、可辅助区分有淋巴结浸润的肺癌患者和无癌对照。其中，所述无癌对照可理解为现在及曾经均没有患过癌症且没有报告肺部良性结节且血常规指标都在参考范围内。
在本发明的具体实施方式中，(6)中所述辅助区分肺部良性结节和肺癌具体体现为如下中的至少一种：可辅助区分肺癌和肺部良性结节、可辅助区分肺腺癌和肺部良性结节、可辅助区分肺鳞癌和肺部良性结节、可辅助区分小细胞肺癌和肺部良性结节、可辅助区分I期肺癌和肺部良性结节、可辅助区分II-III期肺癌和肺部良性结节、可辅助区分无淋巴结浸润的肺癌和肺部良性结节、可辅助区分有淋巴结浸润的肺癌和肺部良性结节。
在本发明的具体实施方式中，(7)中所述辅助区分肺癌不同亚型具体体现为：可辅助区分肺腺癌、肺鳞癌和小细胞肺癌中的任意两种。
在本发明的具体实施方式中，(8)中所述辅助区分肺癌不同分期具体体现为如下中的至少一种：可辅助区分T1期肺癌、T2期肺癌和T3肺癌中的任意两种；可辅助区分无淋巴结浸润的肺癌和有淋巴结浸润的肺癌；可辅助区分临床I期肺癌、临床II期肺癌和临床III期肺癌中的任意两种。
在本发明的具体实施方式中，(9)中所述辅助诊断胰腺癌具体体现为如下中的至少一种：可辅助区分胰腺癌患者和无癌对照、可辅助区分胰腺导管癌和无癌对照。其中，所述无癌对照可理解为现在及曾经均没有患过癌症且没有报告肺部良性结节且血常规指标都在参考范围内。
在本发明的具体实施方式中，(10)中所述辅助诊断食管癌具体体现为如下中的至少一种：可辅助区分食管癌患者和无癌对照、可辅助区分食管鳞状细胞癌和无癌对照。其中，所述无癌对照可理解为现在及曾经均没有患过癌症且没有报告肺部良性结节且血常规指标都在参考范围内。
在上述(1)-(14)中，所述癌症可为能够引起机体内ABCG1基因甲基化水平降低的癌症，如肺癌、胰腺癌、食管癌等。
第二方面，本发明要求保护用于检测ABCG1基因甲基化水平的物质在制备产品中的应用。所述产品的用途可为前文(1)-(14)中的至少一种。
第三方面，本发明要求保护用于检测ABCG1基因甲基化水平的物质和储存有数学模型建立方法和/或使用方法的介质在制备产品中的应用。所述产品的用途可为前文(1)-(14)中的至少一种。
所述数学模型可按照包括如下步骤的方法获得：
(A1)分别检测n1个A类型样本和n2个B类型样本的ABCG1基因甲基化水平(训练集)；
(A2)取步骤(A1)获得的所有样本的ABCG1基因甲基化水平数据，按照A类型和B类型的分类方式，通过二分类逻辑回归法建立数学模型，确定分类判定的阈值。
其中，(A1)中的n1和n2均为50以上的正整数。
所述数学模型的使用方法包括如下步骤：
(B1)检测待测样本的ABCG1基因甲基化水平；
(B2)将步骤(B1)获得的所述待测样本的ABCG1基因甲基化水平数据代入所述数学模型，得到检测指数；然后比较检测指数和阈值的大小，根据比较结果确定所述待测样本的类型是A类型还是B类型。
在本发明的具体实施方式种，所述阈值设为0.5。大于0.5归为一类，小于0.5归为另外一类，等于0.5作为不确定的灰区。其中A类型和B类型为相对应的两分类，二分类的分组，哪一组是A类型，哪一组是B类型，要根据具体的数学模型来确定，无需约定。
在实际应用中，所述阈值也可根据最大约登指数确定(具体可为最大约登指数对应的数值)。大于阈值归为一类，小于阈值归为另外一类，等于阈值作为不确定的灰区。其中A类型和B类型为相对应的两分类，二分类的分组，哪一组是A类型，哪一组是B类型，要根据具体的数学模型来确定，无需约定。
所述A类型样本和所述B类型样本可为如下中的任一种：
(C1)肺癌样本和无癌对照；
(C2)肺癌样本和肺良性结节样本；
(C3)肺癌不同亚型样本；
(C4)肺癌不同分期样本；
(C5)肺癌样本和食管癌样本；
(C6)肺癌样本和胰腺癌样本；
(C7)胰腺癌样本和食管癌样本；
(C8)胰腺癌样本和无癌对照；
(C9)食管癌样本和无癌对照。
第四方面，本发明要求保护前文第三方面中所述的“储存有数学模型建立方法和/或使用方法的介质”在制备产品中的应用。所述产品的用途可为前文(1)-(14)中的至少一种。
第五方面，本发明要求保护一种试剂盒。
本发明所要求保护的试剂盒包括用于检测ABCG1基因甲基化水平的物质。所述试剂盒的用途可为前文(1)-(14)中的至少一种。
进一步地，所述试剂盒中还可含有前文第三方面或第四方面中所述的“储存有数学模型建立方法和/或使用方法的介质”。
第六方面，本发明要求保护一种系统。
本发明所要求保护的系统，包括：
(D1)用于检测ABCG1基因甲基化水平的试剂和/或仪器；
(D2)装置，所述装置包括单元A和单元B；
所述单元A用于建立数学模型，包括数据采集模块、数据分析处理模块和模型输出模块；
所述数据采集模块用于采集(D1)检测得到的n1个A类型样本和n2个B类型样本的ABCG1基因甲基化水平数据；
所述数据分析处理模块能够基于所述数据采集模块采集的n1个A类型样本和n2个B类型样本的ABCG1基因甲基化水平数据，按照A类型和B类型的分类方式，通过二分类逻辑回归法建立数学模型，确定分类判定的阈值；
所述模型输出模块用于输出所述数据分析处理模块建立的数学模型；
所述单元B用于确定待测样本类型，包括数据输入模块、数据运算模块、数据比较模块和结论输出模块；
所述数据输入模块用于输入(D1)检测得到的待测者的ABCG1基因甲基化水平数据；
所述数据运算模块用于将所述待测者的ABCG1基因甲基化水平数据代入所述数学模型，计算得到检测指数；
所述数据比较模块用于将所述检测指数与阈值进行比较；
所述结论输出模块用于根据所述数据比较模块的比较结果输出所述待测样本的类型是A类型还是B类型的结论；
所述A类型样本和所述B类型样本可为如下中的任一种：
(C1)肺癌样本和无癌对照；
(C2)肺癌样本和肺良性结节样本；
(C3)肺癌不同亚型样本；
(C4)肺癌不同分期样本；
(C5)肺癌样本和食管癌样本；
(C6)肺癌样本和胰腺癌样本；
(C7)胰腺癌样本和食管癌样本；
(C8)胰腺癌样本和无癌对照；
(C9)食管癌样本和无癌对照。
其中，n1和n2均可为50以上正整数。
在本发明的具体实施方式中，所述阈值设为0.5。大于0.5归为一类，小于0.5归为另外一类，等于0.5作为不确定的灰区。其中A类型和B类型为相对应的两分类，二分类的分组，哪一组是A类型，哪一组是B类型，要根据具体的数学模型来确定，无需约定。
在实际应用中，所述阈值也可根据最大约登指数确定(具体可为最大约登指数对应的数值)。大于阈值归为一类，小于阈值归为另外一类，等于阈值作为不确定的灰区。其中A类型和B类型为相对应的两分类，二分类的分组，哪一组是A类型，哪一组是B类型，要根据具体的数学模型来确定，无需约定。
在前文各方面中，所述ABCG1基因甲基化水平可为ABCG1基因中如下(e1)-(e5)所示片段中全部或部分CpG位点的甲基化水平。所述甲基化ABCG1基因可为ABCG1基因中如下(e1)-(e5)所示片段中全部或部分CpG位点甲基化。
(e1)SEQ ID No.1所示的DNA片段或与其具有80％以上同一性的DNA片段；
(e2)SEQ ID No.2所示的DNA片段或与其具有80％以上同一性的DNA片段；
(e3)SEQ ID No.3所示的DNA片段或与其具有80％以上同一性的DNA片段；
(e4)SEQ ID No.4所示的DNA片段或与其具有80％以上同一性的DNA片段；
(e5)SEQ ID No.5所示的DNA片段或与其具有80％以上同一性的DNA片段。
进一步地，所述“全部或部分CpG位点”可为ABCG1基因中SEQ ID No.1至SEQ IDNo.5所示5个DNA片段中的任意一个或多个CpG位点。此处所述“多个CpG位点”的上限为ABCG1基因中SEQ ID No.1至SEQ ID No.5所示5个DNA片段中所有CpG位点。SEQ ID No.1所示的DNA片段中所有CpG位点见表1，SEQ ID No.2所示的DNA片段中所有CpG位点见表2，SEQID No.3所示的DNA片段中所有CpG位点见表3，SEQ ID No.4所示的DNA片段中所有CpG位点见表4，SEQ ID No.5所示的DNA片段中所有CpG位点见表5。
或，所述“全部或部分CpG位点”为SEQ ID No.2所示的DNA片段中所有CpG位点(见表2)和SEQ ID No.1所示的DNA片段中所有CpG位点(见表1)。
或，所述“全部或部分CpG位点”为SEQ ID No.2所示的DNA片段中所有CpG位点(见表2)和SEQ ID No.3所示的DNA片段中所有CpG位点(见表3)。
或，所述“全部或部分CpG位点”为SEQ ID No.2所示的DNA片段中所有CpG位点(见表2)和SEQ ID No.4所示的DNA片段中所有CpG位点(见表4)。
或，所述“全部或部分CpG位点”为SEQ ID No.2所示的DNA片段中所有CpG位点(见表2)和SEQ ID No.5所示的DNA片段中所有CpG位点(见表5)。
或，所述“全部或部分CpG位点”为SEQ ID No.1所示的DNA片段中所有CpG位点(见表1)和SEQ ID No.2所示的DNA片段中所有CpG位点(见表2)和SEQ ID No.3所示的DNA片段中所有CpG位点(见表3)和SEQ ID No.4所示的DNA片段中所有CpG位点(见表4)和SEQ IDNo.5所示的DNA片段中所有CpG位点(见表5)。
或，所述“全部或部分CpG位点”可为ABCG1基因中所述SEQ ID No.2所示的DNA片段中的全部或任意17个或任意16个或任意15个或任意14个或任意13个或任意12个或任意11个或任意10个或任意9个或任意8个或任意7个或任意6个或任意5个或任意4个或任意3个或任意2个或任意1个。
或，所述“全部或部分CpG位点”为SEQ ID No.2所示的DNA片段中如下10个CpG位点中的全部或任意9个或任意8个或任意7个或任意6个或任意5个或任意4个或任意3个或任意2个或任意1个：SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第174-175位所示CpG位点、SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第202-203位所示CpG位点、SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第222-223位所示CpG位点、SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第341-342位所示CpG位点、SEQID No.2所示的DNA片段自5’端第371-372位所示CpG位点、SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第382-383位所示CpG位点、SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第389-390位所示CpG位点、SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第443-444位所示CpG位点、SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第456-457位所示CpG位点、SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第474-475位所示CpG位点。
在上述各方面中，所述用于检测ABCG1基因甲基化水平的物质可包含(或为)用于扩增ABCG1基因全长或部分片段的引物组合。所述用于检测ABCG1基因甲基化水平的试剂可包含(或为)用于扩增ABCG1基因全长或部分片段的引物组合；所述用于检测ABCG1基因甲基化水平的仪器可为飞行时间质谱检测仪。当然所述用于检测ABCG1基因甲基化水平的试剂中还可包含进行飞行时间质谱所用的其他常规试剂。
进一步地，所述部分片段可为如下中至少一个片段：
(g1)SEQ ID No.1所示的DNA片段或其包含的DNA片段；
(g2)SEQ ID No.2所示的DNA片段或其包含的DNA片段；
(g3)SEQ ID No.3所示的DNA片段或其包含的DNA片段；
(g4)SEQ ID No.4所示的DNA片段或其包含的DNA片段；
(g5)SEQ ID No.5所示的DNA片段或其包含的DNA片段；
(g6)与SEQ ID No.1所示的DNA片段或其包含的DNA片段具有80％以上同一性的DNA片段；
(g7)与SEQ ID No.2所示的DNA片段或其包含的DNA片段具有80％以上同一性的DNA片段；
(g8)与SEQ ID No.3所示的DNA片段或其包含的DNA片段具有80％以上同一性的DNA片段；
(g9)与SEQ ID No.4所示的DNA片段或其包含的DNA片段具有80％以上同一性的DNA片段；
(g10)与SEQ ID No.5所示的DNA片段或其包含的DNA片段具有80％以上同一性的DNA片段。
在本发明中，所述引物组合具体可为引物对A和/或引物对B和/或引物对C和/或引物对D和/或引物对E；
所述引物对A为引物A1和引物A2组成的引物对；所述引物A1具体可为SEQ ID No.6或SEQ ID No.6的第11-35位核苷酸所示的单链DNA；所述引物A2具体可为SEQ ID No.7或SEQ ID No.7的第32-56位核苷酸所示的单链DNA；
所述引物对B为引物B1和引物B2组成的引物对；所述引物B1具体可为SEQ ID No.8或SEQ ID No.8的第11-35位核苷酸所示的单链DNA；所述引物B2具体可为SEQ ID No.9或SEQ ID No.9的第32-56位核苷酸所示的单链DNA；
所述引物对C为引物C1和引物C2组成的引物对；所述引物C1具体可为SEQ IDNo.10或SEQ ID No.10的第11-35位核苷酸所示的单链DNA；所述引物C2具体可为SEQ IDNo.11或SEQ ID No.11的第32-56位核苷酸所示的单链DNA；
所述引物对D为引物D1和引物D2组成的引物对；所述引物D1具体可为SEQ IDNo.12或SEQ ID No.12的第11-31位核苷酸所示的单链DNA；所述引物D2具体可为SEQ IDNo.13或SEQ ID No.13的第32-56位核苷酸所示的单链DNA；
所述引物对E为引物E1和引物E2组成的引物对；所述引物E1具体可为SEQ IDNo.14或SEQ ID No.14的第11-35位核苷酸所示的单链DNA；所述引物E2具体可为SEQ IDNo.15或SEQ ID No.15的第32-56位核苷酸所示的单链DNA。
另外，本发明还要求保护一种区分待测样本为A类型样本还是B类型样本的方法。该方法可包括如下步骤：
(A)可按照包括如下步骤的方法建立数学模型：
(A1)分别检测n1个A类型样本和n2个B类型样本的ABCG1基因甲基化水平(训练集)；
(A2)取步骤(A1)获得的所有样本的ABCG1基因甲基化水平数据，按照A类型和B类型的分类方式，通过二分类逻辑回归法建立数学模型，确定分类判定的阈值。
其中，(A1)中的n1和n2均为50以上的正整数。
(B)可按照包括如下步骤的方法确定所述待测样本为A类型样本还是B类型样本：
(B1)检测所述待测样本的ABCG1基因甲基化水平；
(B2)将步骤(B1)获得的所述待测样本的ABCG1基因甲基化水平数据代入所述数学模型，得到检测指数；然后比较检测指数和阈值的大小，根据比较结果确定所述待测样本的类型是A类型还是B类型。
在本发明的具体实施方式中，所述阈值设为0.5。大于0.5归为一类，小于0.5归为另外一类，等于0.5作为不确定的灰区。其中A类型和B类型为相对应的两分类，二分类的分组，哪一组是A类型，哪一组是B类型，要根据具体的数学模型来确定，无需约定。
在实际应用中，所述阈值也可根据最大约登指数确定(具体可为最大约登指数对应的数值)。大于阈值归为一类，小于阈值归为另外一类，等于阈值作为不确定的灰区。其中A类型和B类型为相对应的两分类，二分类的分组，哪一组是A类型，哪一组是B类型，要根据具体的数学模型来确定，无需约定。
所述A类型样本和所述B类型样本可为如下中的任一种：
(C1)肺癌样本和无癌对照；
(C2)肺癌样本和肺良性结节样本；
(C3)肺癌不同亚型样本；
(C4)肺癌不同分期样本；
(C5)肺癌样本和食管癌样本；
(C6)肺癌样本和胰腺癌样本；
(C7)胰腺癌样本和食管癌样本；
(C8)胰腺癌样本和无癌对照；
(C9)食管癌样本和无癌对照。
以上任一所述数学模型在实际应用中可能会根据DNA甲基化的检测方法以及拟合方式不同有所改变，要根据具体的数学模型来确定，无需约定。
在本发明的实施例中，所述模型具体为log(y/(1-y))＝b0+b1x1+b2x2+b3x3+…+bnXn，其中y为因变量即将待测样品的一个或者多个甲基化位点的甲基化值代入模型以后得出的检测指数，b0为常量，x1～xn为自变量即为该测试样品的一个或者多个甲基化位点的甲基化值(每一个值为0-1之间的数值)，b1～bn为模型赋予每一个位点甲基化值的权重。
在本发明的实施例中，所述模型的建立还可酌情加入年龄、性别、白细胞计数等已知参数来提高判别效率。本发明的实施例中建立的一个具体模型为用于辅助区分肺部良性结节和肺癌的模型，所述模型具体为：log(y/(1-y))＝-15.308+1.660*ABCG1_B_4+0.357*ABCG1_B_5-3.814*ABCG1_B_6+1.660*ABCG1_B_7-3.154*ABCG1_B_8+3.154*ABCG1_B_9+4.443*ABCG1_B_10-10.338*ABCG1_B_11-2.698*ABCG1_B_12-6.312*ABCG1_B_13+0.023*年龄-1.060*性别(男性赋值为1，女性赋值为0)-0.012*白细胞个数。所述ABCG1_B_4为SEQ IDNo.2所示的DNA片段自5’端第174-175位所示CpG位点的甲基化水平；所述ABCG1_B_5为SEQID No.2所示的DNA片段自5’端第202-203位所示CpG位点的甲基化水平；所述ABCG1_B_6为SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第222-223位所示CpG位点的甲基化水平；所述ABCG1_B_7为SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第341-342位所示CpG位点的甲基化水平；所述ABCG1_B_8为SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第371-372位所示CpG位点的甲基化水平；所述ABCG1_B_9为SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第382-383位所示CpG位点的甲基化水平；所述ABCG1_B_10为SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第389-390位所示CpG位点的甲基化水平；所述ABCG1_B_11为SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第443-444位所示CpG位点的甲基化水平；所述ABCG1_B_12为SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第456-457位所示CpG位点的甲基化水平；所述ABCG1_B_13为SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第474-475位所示CpG位点的甲基化水平；所述模型的阈值为0.5。通过模型计算的检测指数大于0.5的患者候选为肺癌患者，小于0.5的患者候选为肺良性结节患者。
在上述各方面中，所述检测ABCG1基因甲基化水平为检测血液中ABCG1基因甲基化水平。
在上述各方面中，当所述A类型样本和所述B类型样本为(C3)中肺癌不同亚型样本时，所述A类型样本和所述B类型样本具体可为肺腺癌样本、肺鳞癌样本和小细胞肺癌样本中的任意两种。
在上述各方面中，当所述A类型样本和所述B类型样本为(C4)中肺癌不同分期样本时，所述A类型样本和所述B类型样本具体可为临床I期肺癌样本、临床II期肺癌样本和临床III期肺癌样本中的任意两种。
以上任一所述ABCG1基因具体可包括Genbank登录号：NM_016818.2(GI:46592897)，转录物变体2；Genbank登录号：NM_207174.1(GI:46592955)，转录物变体3；Genbank登录号：NM_004915.3(GI:46592914)，转录物变体4；Genbank登录号：NM_207627.1(GI:46592963)，转录物变体5；Genbank登录号：NM_207628.1(GI:46592970)，转录物变体6；Genbank登录号：NM_207629.1(GI:46592977)，转录物变体7。
本发明提供了肺癌患者、胰腺癌患者和食管癌血液中ABCG1基因的低甲基化现象。实验证明，以血液为样本就能够区分癌症(肺癌、胰腺癌和食管癌)患者和无癌对照、区分肺部良性结节和肺癌、区分肺癌不同亚型和不同分期，并且能够区分肺癌和胰腺癌、肺癌和食管癌、胰腺癌和食管癌。本发明对于提高肺癌、胰腺癌和食管早期诊疗效果和降低死亡率均有重要的科学意义和临床应用价值。
附图说明
图1为数学模型示意图。
图2为数学模型举例说明。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的三磷酸腺苷结合盒转运体G1(ATP binding cassette subfamilyG member 1,ABCG1)基因定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、用于检测ABCG1基因甲基化位点的引物设计
经过大量序列和功能分析，选择了ABCG1基因中的五个片段(ABCG1_A片段、ABCG1_B片段、ABCG1_C片段、ABCG1_D片段、ABCG1_E片段)进行甲基化水平和癌症相关性分析。
ABCG1_A片段(SEQ ID No.1)位于hg19参考基因组chr21:43619137-43619681，正义链。
ABCG1_B片段(SEQ ID No.2)位于hg19参考基因组chr21:43642037-43642809，反义链。
ABCG1_C片段(SEQ ID No.3)位于hg19参考基因组chr21:43652714-43653389，正义链。
ABCG1_D片段(SEQ ID No.4)位于hg19参考基因组chr21:43655128-43655708，正义链。
ABCG1_E片段(SEQ ID No.5)位于hg19参考基因组chr21:43657863-43658473，反义链。
ABCG1_A片段中的CpG位点信息如表1所示。
ABCG1_B片段中的CpG位点信息如表2所示。
ABCG1_C片段中的CpG位点信息如表3所示。
ABCG1_D片段中的CpG位点信息如表4所示。
ABCG1_E片段中的CpG位点信息如表5所示。
表1 ABCG1_A片段中CpG位点信息
CpG位点 CpG位点在序列中的位置
ABCG1_A_1 SEQ ID No.1自5’端第174-175位
ABCG1_A_2 SEQ ID No.1自5’端第314-315位
ABCG1_A_3 SEQ ID No.1自5’端第374-375位
ABCG1_A_4 SEQ ID No.1自5’端第423-424位
ABCG1_A_5 SEQ ID No.1自5’端第515-516位
表2 ABCG1_B片段中CpG位点信息
CpG位点 CpG位点在序列中的位置
ABCG1_B_1 SEQ ID No.2自5’端第51-52位
ABCG1_B_2 SEQ ID No.2自5’端第63-64位
ABCG1_B_3 SEQ ID No.2自5’端第112-113位
ABCG1_B_4 SEQ ID No.2自5’端第174-175位
ABCG1_B_5 SEQ ID No.2自5’端第202-203位
ABCG1_B_6 SEQ ID No.2自5’端第222-223位
ABCG1_B_7 SEQ ID No.2自5’端第341-342位
ABCG1_B_8 SEQ ID No.2自5’端第371-372位
ABCG1_B_9 SEQ ID No.2自5’端第382-383位
ABCG1_B_10 SEQ ID No.2自5’端第389-390位
ABCG1_B_11 SEQ ID No.2自5’端第443-444位
ABCG1_B_12 SEQ ID No.2自5’端第456-457位
ABCG1_B_13 SEQ ID No.2自5’端第474-475位
ABCG1_B_14 SEQ ID No.2自5’端第601-602位
ABCG1_B_15 SEQ ID No.2自5’端第606-607位
ABCG1_B_16 SEQ ID No.2自5’端第617-618位
ABCG1_B_17 SEQ ID No.2自5’端第643-644位
ABCG1_B_18 SEQ ID No.2自5’端第734-735位
表3 ABCG1_C片段中CpG位点信息
表4 ABCG1_D片段中CpG位点信息
CpG位点 CpG位点在序列中的位置
ABCG1_D_1 SEQ ID No.4自5’端第22-23位
ABCG1_D_2 SEQ ID No.4自5’端第46-47位
ABCG1_D_3 SEQ ID No.4自5’端第62-63位
ABCG1_D_4 SEQ ID No.4自5’端第65-66位
ABCG1_D_5 SEQ ID No.4自5’端第70-71位
ABCG1_D_6 SEQ ID No.4自5’端第72-73位
ABCG1_D_7 SEQ ID No.4自5’端第74-75位
ABCG1_D_8 SEQ ID No.4自5’端第109-110位
ABCG1_D_9 SEQ ID No.4自5’端第129-130位
ABCG1_D_10 SEQ ID No.4自5’端第148-149位
ABCG1_D_11 SEQ ID No.4自5’端第184-185位
ABCG1_D_12 SEQ ID No.4自5’端第189-190位
ABCG1_D_13 SEQ ID No.4自5’端第196-197位
ABCG1_D_14 SEQ ID No.4自5’端第215-216位
ABCG1_D_15 SEQ ID No.4自5’端第232-233位
ABCG1_D_16 SEQ ID No.4自5’端第247-248位
ABCG1_D_17 SEQ ID No.4自5’端第270-271位
ABCG1_D_18 SEQ ID No.4自5’端第280-281位
ABCG1_D_19 SEQ ID No.4自5’端第285-286位
ABCG1_D_20 SEQ ID No.4自5’端第287-288位
ABCG1_D_21 SEQ ID No.4自5’端第304-305位
ABCG1_D_22 SEQ ID No.4自5’端第324-325位
ABCG1_D_23 SEQ ID No.4自5’端第327-328位
ABCG1_D_24 SEQ ID No.4自5’端第337-338位
ABCG1_D_25 SEQ ID No.4自5’端第381-382位
ABCG1_D_26 SEQ ID No.4自5’端第435-436位
ABCG1_D_27 SEQ ID No.4自5’端第466-467位
ABCG1_D_28 SEQ ID No.4自5’端第481-482位
ABCG1_D_29 SEQ ID No.4自5’端第514-515位
ABCG1_D_30 SEQ ID No.4自5’端第553-554位
表5 ABCG1_E片段中CpG位点信息
CpG位点 CpG位点在序列中的位置
ABCG1_E_1 SEQ ID No.5自5’端第42-43位
ABCG1_E_2 SEQ ID No.5自5’端第109-110位
ABCG1_E_3 SEQ ID No.5自5’端第157-158位
ABCG1_E_4 SEQ ID No.5自5’端第268-269位
ABCG1_E_5 SEQ ID No.5自5’端第533-534位
ABCG1_E_6 SEQ ID No.5自5’端第543-544位
ABCG1_E_7 SEQ ID No.5自5’端第575-576位
针对五个片段(ABCG1_A片段、ABCG1_B片段、ABCG1_C片段、ABCG1_D片段、ABCG1_E片段)设计特异PCR引物，如表6所示。其中，SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQID No.12和SEQ ID No.14为正向引物，SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ IDNo.13和SEQ ID No.15为反向引物；SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.12和SEQ ID No.14中自5’第1至10位为非特异标签，SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ IDNo.10和SEQ ID No.14中第11至35位为特异引物序列，SEQ ID No.12中第11至31位为特异引物序列；SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13和SEQ ID No.15中自5’第1至31位为非特异标签，第32至56位为特异引物序列。引物序列中不包含SNP和CpG位点。
表6 ABCG1甲基化引物序列
实施例2、ABCG1基因甲基化检测及结果分析
一、研究样本
经患者知情同意，共收集722例肺癌患者、152例肺部出现良性结节患者、79例胰腺癌患者、118例食管癌患者和945例无癌对照(无癌对照即以前和现在没有患过癌症且没有报道过肺小结节患者且血常规指标都在参考范围内)的离体血液样本。
所有患者样本都是手术前收集的且都经过影像学和病理确诊。
肺癌、胰腺癌和食管癌亚型根据病理组织学进行判断。
肺癌分期以AJCC第8版分期系统为判断标准。
722例肺癌患者按照分型划分：肺腺癌619例，肺鳞癌42例，小细胞肺癌49例，其他12例。
722例肺癌患者按照分期划分：I期649例，II期41例，III期32例。
722例肺癌患者按照肺癌肿瘤大小(T)划分：T1 603例，T2 83例，T3 36例。
722例肺癌患者按照有无肺癌淋巴结浸润(N)划分：无肺癌淋巴结浸润688例，有肺癌淋巴结浸润34例。
79例胰腺癌患者按照分型划分：胰腺导管腺癌63例，其他亚型共计16例。
118例食管癌患者按照分型划分：食管鳞状细胞癌94例，其他亚型共计24例。
无癌人群、肺部良性结节、肺癌、胰腺癌和食管癌患者各自年龄的中位数分别为56、57、58、58和57岁，且这5种群体中各自的男女比例都约为1:1。
二、甲基化检测
1、提取血液样本的总DNA。
2、将步骤1制备的血液样本总DNA进行重亚硫酸盐处理(参照Qiagen的DNA甲基化试剂盒说明书操作)。重亚硫酸盐处理后，未发生甲基化的胞嘧啶(C)被转化成尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶保持不变，即原来CpG位点的C碱基经重亚硫酸盐处理后转化为C或U。
3、以步骤2经过重亚硫酸盐处理的DNA为模板，采用表6中的5对特异引物对通过DNA聚合酶按照常规PCR反应要求的反应体系进行PCR扩增，5对引物都采用相同的常规PCR体系，且5对引物都按照以下程序进行扩增。
PCR反应程序为：95℃，4min→(95℃，20s→56℃，30s→72℃，2min)45个循环→72℃，5min→4℃，1h。
4、取步骤3的扩增产物，通过飞行时间质谱进行DNA甲基化分析，具体方法如下：
(1)向5μl PCR产物中加入2μl虾碱性磷酸盐(SAP)溶液(0.3ml SAP[0.5U]+1.7mlH2O)然后按照以下程序在PCR仪中孵育(37℃,20min→85℃,5min→4℃,5min)；
(2)取出2μl步骤(1)得到的SAP处理后的产物，根据说明书加入5μl T-Cleavage反应体系中，然后在37℃孵育3h；
(3)取步骤(2)的产物，加入19μl去离子水，再用6μg Resin在旋转摇床进行去离子化孵育1h；
(4)2000rpm室温离心5min，将微量上清由Nanodispenser机械手臂上样384SpectroCHIP；
(5)飞行时间质谱分析；获得的数据用SpectroACQUIRE v3.3.1.3软件收集，通过MassArray EpiTyper v1.2软件实现可视化。
上述飞行时间质谱检测使用的试剂均来试剂盒(T-Cleavage MassCLEAVEReagent Auto Kit，货号：10129A)；上述飞行时间质谱检测使用的检测仪器为Analyzer Chip Prep Module 384，型号：41243；上述数据分析软件为检测仪器自带软件。
5、对步骤4得到的数据进行分析。
数据统计分析由SPSS Statistics 23.0进行。
非参数检验用于两组之间的比较分析。
多个CpG位点的组合对于不同样品分组的鉴别效果通过逻辑回归和受试者曲线的统计学方法得以实现。
所有的统计检验都是双侧的，P值<0.05被认为具有统计学意义。
通过质谱实验，共获得58个可以区别的甲基化片段的峰图。采用SpectroACQUIREv3.3.1.3软件根据含甲基化片段的峰和非甲基化片段的峰面积比较，计算甲基化水平(SpectroACQUIRE v3.3.1.3软件可自动通过计算峰面积得到每个样本在每个CpG位点的甲基化水平)。
三、结果分析
1、无癌对照、良性结节和肺癌血液中ABCG1基因甲基化水平
以722位肺癌患者、152位肺部出现良性结节患者和945名无癌对照的血液为研究材料进行分析ABCG1基因中所有CpG位点的甲基化水平(表7)。结果表明，ABCG1基因中所有CpG位点在无癌对照组中甲基化水平中位数为0.66(IQR＝0.54-0.83)，良性结节中甲基化水平中位数为0.63(IQR＝0.52-0.80)，肺癌患者中甲基化水平中位数为0.62(IQR＝0.52-0.80)。
2、血液中ABCG1基因甲基化水平可以区分无癌对照和肺癌患者
通过比较分析722位肺癌患者和945名无癌对照的ABCG1基因的甲基化水平，结果发现肺癌患者ABCG1基因中所有CpG位点甲基化水平显著低于无癌对照(p<0.05，表8)。此外，肺癌不同亚型(肺腺癌，肺鳞癌，小细胞肺癌)中ABCG1基因所有CpG位点的甲基化水平分别都与无癌对照有显著性差异。肺癌不同分期(临床I期、II-III期)中ABCG1基因所有CpG位点的甲基化水平分别都与无癌对照有显著性差异。此外，无淋巴浸润的肺癌患者和有淋巴浸润的肺癌患者的甲基化水平分别与无癌对照之间有显著性差异(p<0.05)。因此，ABCG1基因的甲基化水平可以用于肺癌的临床诊断，尤其可用于肺癌的早期诊断。
3、血液中ABCG1基因甲基化水平可以区分肺部良性结节和肺癌患者
通过比较分析722位肺癌患者和152名良性结节中ABCG1基因的甲基化水平，结果发现良性结节患者中ABCG1基因所有CpG位点甲基化水平显著高于肺癌患者(p<0.05，表9)。此外还发现肺癌不同亚型(肺腺癌，肺鳞癌，小细胞肺癌)、不同临床时期(I期或II-III期)和有无淋巴浸润的肺癌患者的ABCG1基因中所有CpG的甲基化水平分别都与良性结节有显著性差异。因此，ABCG1基因的甲基化水平可应用于区分肺癌患者和良性结节患者，是非常有潜在价值的标志物。
4、血液中ABCG1基因甲基化水平区分肺癌不同亚型或者肺癌不同分期
通过比较分析不同亚型肺癌患者(肺腺癌，肺鳞癌，小细胞肺癌)和不同分期肺癌患者中ABCG1基因的甲基化水平，发现ABCG1基因中所有CpG位点甲基化水平分别在肺癌不同亚型(肺腺癌患者，肺鳞癌患者，小细胞肺癌患者)、肺癌肿瘤大小(T1、T2和T3)、肺癌不同分期(临床I期、II期和III期)、有无淋巴结浸润条件下存在显著性差异(p<0.05，表10)。因此，ABCG1基因的甲基化水平可以用于区分肺癌不同亚型或者肺癌不同分期。
5、血液中ABCG1甲基化水平可以区分胰腺癌患者和无癌对照
以79名胰腺癌患者和945名无癌对照的血液为研究材料进行分析两者之间ABCG1基因中所有CpG位点的甲基化水平差异(表11)，其中79名胰腺癌患者中有63例为胰腺导管腺癌。79名胰腺癌患者中所有目标CpG位点的甲基化水平中位数为0.58(IQR＝0.48-0.73)，无癌对照组甲基化水平中位数为0.66(IQR＝0.54-0.83)，胰腺癌患者中所有CpG位点甲基化水平显著低于无癌对照(p<0.05)。63位胰腺导管腺癌患者所有目标CpG位点甲基化水平的中位数为0.57(IQR＝0.47-0.72)，且甲基化水平显著低于无癌对照(p<0.05)。因此，ABCG1基因的甲基化水平可以用于胰腺癌的临床诊断。
6、血液中ABCG1甲基化水平可以区分食管患者和无癌对照
以118名食管癌患者和945名无癌对照的血液为研究材料进行分析食管癌患者和无癌对照之间的ABCG1基因中CpG位点甲基化水平差异(表12)，118位食管癌中包括94位食管鳞状细胞癌。结果表明，食管癌患者中所有目标CpG位点的甲基化水平中位数为0.59(IQR＝0.50-0.75)，无癌对照组甲基化水平中位数为0.66(IQR＝0.54-0.83)，食管癌患者中所有CpG位点甲基化水平显著低于无癌对照(p<0.05)。食管鳞状细胞癌中所有目标CpG位点甲基化水平的中位数为0.59(IQR＝0.49-0.75)，且甲基化水平显著低于无癌对照(p<0.05，表12)。因此，ABCG1基因的甲基化水平可以用于食管癌的临床诊断。
7、血液中ABCG1甲基化水平可以区分胰腺癌患者和肺癌患者
以79名胰腺癌患者和722名肺癌患者的血液为研究材料进行分析胰腺癌患者和肺癌患者血液中ABCG1基因中甲基化水平差异(表13)。结果表明，胰腺癌患者中所有目标CpG位点的甲基化水平中位数为0.58(IQR＝0.48-0.73)，肺癌患者甲基化水平中位数为0.62(IQR＝0.52-0.80)，胰腺癌患者中所有CpG位点甲基化水平显著低于肺癌患者(p<0.05)。因此，ABCG1基因的甲基化水平可以用于区分胰腺癌和肺癌患者。
8、血液中ABCG1甲基化水平可以区分食管癌患者和肺癌患者
以118名食管癌患者和722名肺癌患者的血液为研究材料进行分析食管癌患者和肺癌患者血液ABCG1基因中甲基化水平差异(表13)。结果表明，食管癌患者中所有目标CpG位点的甲基化水平中位数为0.59(IQR＝0.50-0.75)，肺癌患者甲基化水平中位数为0.62(IQR＝0.52-0.80)，食管癌患者中所有CpG位点甲基化水平显著低于肺癌患者(p<0.05)。因此，ABCG1基因的甲基化水平可以用于区分食管癌和肺癌患者。
9、血液中ABCG1甲基化水平可以区分胰腺癌患者和食管癌患者
分析79名胰腺癌患者和118名食管癌患者的血液中ABCG1基因中甲基化水平差异(表13)。结果表明，胰腺癌患者中所有目标CpG位点的甲基化水平中位数为0.58(IQR＝0.48-0.73)，食管癌患者中所有目标CpG位点的甲基化水平中位数为0.59(IQR＝0.50-0.75)，胰腺癌患者中所有CpG位点甲基化水平显著低于食管癌患者(p<0.05)。因此，ABCG1基因的甲基化水平可以用于区分胰腺癌患者和食管癌患者。
10、用于辅助癌症诊断的数学模型的建立
本发明建立的数学模型可以用于达到如下目的：
(1)区分肺癌患者和无癌对照；
(2)区分肺癌患者和肺良性结节患者；
(3)区分胰腺癌患者和无癌对照；
(4)区分食管癌患者和无癌对照；
(5)区分胰腺癌患者和肺癌患者；
(6)区分食管癌患者和肺癌患者；
(7)区分胰腺癌患者和食管癌患者
(8)区分肺癌亚型；
(9)区分肺癌分期。
数学模型的建立方法如下：
(A)数据来源：步骤一中列出的722例肺癌患者、152例肺部出现良性结节患者、79例胰腺癌患者、118例食管癌患者和945例无癌对照的离体血液样本的目标CpG位点(表1-表5中的一种或多种的组合)甲基化水平(检测方法同步骤二)。
数据可根据实际需要加入年龄、性别、白细胞计数等已知参数来提高判别效率。
(B)模型建立
根据需要选取任意两类不同类型患者数据即训练集(例如：无癌对照和肺癌患者、无癌对照和胰腺癌患者、无癌对照和食管癌患者、肺良性结节患者和肺癌患者、肺癌患者和胰腺癌患者、肺癌患者和食管癌患者、食管癌患者和胰腺癌患者，肺腺癌和肺鳞癌患者，肺腺癌和小细胞肺癌患者，肺鳞癌和小细胞肺癌患者，I期肺癌和II期肺癌患者，I期肺癌和III期肺癌患者，II期肺癌和III期肺癌患者)作为用于建立模型的数据，使用SAS，R，SPSS等统计软件使用二分类逻辑回归的统计方法通过公式建立数学模型。数学模型公式计算出的最大约登指数对应的数值为阈值或直接设定0.5为阈值，待测样品经过测试和代入模型计算后得到的检测指数大于阈值归为一类(B类)，小于阈值归为另外一类(A类)，等于阈值作为不确定的灰区。在对新的待测样品进行预测来判断属于哪一类时，首先通过DNA甲基化的测定方法检测该待测样品ABCG1基因上一个或者多个CpG位点的甲基化水平，然后将这些甲基化水平的数据代入上述数学模型(如果构建模型时纳入了年龄、性别、白细胞计数等已知参数，则该步骤同时向模型公式中代入该待测样品的相应参数的具体数值)，计算得到所述待测样本对应的检测指数，然后比较所述待测样本对应的检测指数和阈值的大小，根据比较结果确定所述待测样本属于哪一类样本。
举例：如图1所示，将训练集中ABCG1基因单个CpG位点的甲基化水平或者多个CpG位点组合的甲基化水平的数据通过SAS、R、SPSS等统计软件使用二分类逻辑回归的公式建立用于区分A类和B类的数学模型。该数学模型在此为二类逻辑回归模型，具体为：log(y/1-y)＝b0+b1x1+b2x2+b3x3+…+bnXn，其中y为因变量即将待测样品的一个或者多个甲基化位点的甲基化值代入模型以后得出的检测指数，b0为常量，x1～xn为自变量即为该测试样品的一个或者多个甲基化位点的甲基化值(每一个值为0-1之间的数值)，b1～bn为模型赋予每一个位点甲基化值的权重。具体应用时，先根据训练集中已经检测的样本的一个或者多个DNA甲基化位点的甲基化程度(x1～xn)及其已知的分类情况(A类或者B类，分别对y赋值0和1)建立数学模型，由此确定该数学模型的常量b0以及各个甲基化位点的权重b1～bn,并由该数学模型计算出的以最大约登指数对应的检测指数(在此例中为0.5)为划分的阈值。待测样品经过测试和代入模型计算后得到的检测指数即y值大于0.5归为B类，小于0.5归为A类，等于0.5作为不确定的灰区。其中A类和B类为相对应的两分类(二分类的分组，哪一组A类，哪一组是B类，要根据具体的数学模型来确定，在此不做约定)，比如无癌对照和肺癌患者、无癌对照和胰腺癌患者、无癌对照和食管癌患者、肺良性结节患者和肺癌患者、肺癌患者和胰腺癌患者、肺癌患者和食管癌患者、食管癌患者和胰腺癌患者、肺腺癌和肺鳞癌患者、肺腺癌和小细胞肺癌患者、肺鳞癌和小细胞肺癌患者、I期肺癌和II期肺癌患者、I期肺癌和III期肺癌患者、II期肺癌和III期肺癌患者。对受试者的样品进行预测来判断属于哪一类时，首先采集受试者的血液，然后从中提取DNA。将提取的DNA通过重亚硫酸盐转化后，用DNA甲基化的测定方法对受试者的ABCG1基因的单个CpG位点的甲基化水平或者多个CpG位点组合的甲基化水平进行检测，然后将检测得到的甲基化数据代入上述数学模型。如果该受试者的ABCG1基因一个或者多个CpG位点的甲基化水平代入上述数学模型后计算出来的检测指数大于阈值，则该受试者判定与训练集中检测指数大于0.5的归属于一类(B类)；如果该受试者的ABCG1基因一个或者多个CpG位点的甲基化水平数据代入上述数学模型后计算出来的值即检测指数小于阈值，则该受试者跟训练集中检测指数小于0.5的归属于一类(A类)；如果该受试者的ABCG1基因一个或者多个CpG位点的甲基化水平数据代入上述数学模型后计算出来的值即检测指数等于阈值，则不能判断该受试者是A类还是B类。
举例：图2的示意图举例说明ABCG1_B的优选CpG位点(ABCG1_B_4、ABCG1_B_5、ABCG1_B_6、ABCG1_B_7、ABCG1_B_8、ABCG1_B_9、ABCG1_B_10、ABCG1_B_11、ABCG1_B_12和ABCG1_B_13)的甲基化以及数学建模在用于肺部良恶性结节判别的应用：将肺癌患者和肺良性结节患者训练集(在此为：722名肺癌患者和152位肺良性结节患者)中已经检测的10个可区分的优选CpG位点组合的甲基化水平的数据以及患者的年龄、性别(男性赋值为1，女性赋值为0)、白细胞计数通过R软件使用二分类逻辑回归的公式建立用于区分肺癌患者和肺良性结节患者的数学模型。该数学模型在此为二类逻辑回归模型，由此确定该数学模型的常量b0以及各个甲基化位点的权重b1～bn，在此例中具体为：log(y/(1-y))＝-15.308+1.660*ABCG1_B_4+0.357*ABCG1_B_5-3.814*ABCG1_B_6+1.660*ABCG1_B_7-3.154*ABCG1_B_8+3.154*ABCG1_B_9+4.443*ABCG1_B_10-10.338*ABCG1_B_11-2.698*ABCG1_B_12-6.312*ABCG1_B_13+0.023*年龄-1.060*性别(男性赋值为1，女性赋值为0)-0.012*白细胞个数，其中y为因变量即将待测样品的10个可区分的甲基化位点的甲基化值以及年龄、性别、白细胞计数代入模型以后得出的检测指数。在设定0.5为阈值的情况下，待测样品的ABCG1_B_4、ABCG1_B_5、ABCG1_B_6、ABCG1_B_7、ABCG1_B_8、ABCG1_B_9、ABCG1_B_10、ABCG1_B_11、ABCG1_B_12和ABCG1_B_13这10个可区分的CpG位点的甲基化水平经过测试后连同其年龄、性别、白细胞计数的信息代入模型进行计算，得到的检测指数即y值大于0.5归为肺癌患者，小于0.5归为肺良性结节患者，等于0.5则不确定为肺癌患者还是肺良性结节患者。此模型的曲线下面积(AUC)计算结果为0.65(表17)。具体受试者判断方法举例如图2所示，从两位受试者(甲，乙)分别采集血液提取DNA，将提取的DNA通过重亚硫酸盐转化后，用DNA甲基化的测定方法对受试者的ABCG1_B_4、ABCG1_B_5、ABCG1_B_6、ABCG1_B_7、ABCG1_B_8、ABCG1_B_9、ABCG1_B_10、ABCG1_B_11、ABCG1_B_12和ABCG1_B_13这10个可区分的CpG位点的甲基化水平进行检测。然后将检测得到的甲基化水平数据连同受试者的年龄、性别和白细胞计数的信息代入上述数学模型。甲受试者经数学模型后计算出来的值为0.84大于0.5，则甲受试者判定为肺癌患者(与临床判定结果相符)；乙受试者的ABCG1基因一个或者多个CpG位点的甲基化水平数据代入上述数学模型后计算出来的值为0.18小于0.5，则乙受试者判定肺良性结节患者(与临床判定结果相符)。
(C)模型效果评价
根据上述方法，分别建立用于区分肺癌患者和无癌对照、肺癌患者和良性结节患者、胰腺癌患者和无癌对照、无癌对照和食管癌患者、肺癌患者和胰腺癌患者、肺癌患者和食管癌患者、胰腺癌患者和食管癌患者、肺腺癌和肺鳞癌患者、肺腺癌和小细胞肺癌患者、肺鳞癌和小细胞肺癌患者、I期肺癌和II期肺癌患者、I期肺癌和III期肺癌患者、II期肺癌和III期肺癌患者的数学模型，并且通过受试者曲线(ROC曲线)对其有效性进行评价。ROC曲线得出的曲线下面积(AUC)越大，说明模型的区分度越好，分子标志物越有效。采用不同CpG位点进行数学模型构建后的评价结果如表14、表15和表16所示。表14、表15和表16中，1个CpG位点代表ABCG1_B扩增片段中任意一个CpG位点的位点，2个CpG位点代表ABCG1_B中任意2个CpG位点的组合，3个CpG位点代表ABCG1_B中任意3个CpG位点的组合，……以此类推。表中的数值为不同位点组合评价结果的范围值(即任意个CpG位点组合方式的结果均在此范围内)。
上述结果显示，ABCG1基因对于各组的鉴别能力(肺癌患者和无癌对照、肺癌患者和肺良性结节患者、胰腺癌患者和无癌对照、食管癌患者和无癌对照、胰腺癌患者和肺癌患者、食管癌患者和肺癌患者、胰腺癌患者和食管癌患者、肺腺癌和肺鳞癌患者、肺腺癌和小细胞肺癌患者、肺鳞癌和小细胞肺癌患者、I期肺癌和II期肺癌患者、I期肺癌和III期肺癌患者、II期肺癌和III期肺癌患者)随着位点数的增加而增加。
除此以外，在表1-表5所示的CpG位点中，还存在少数几个较优位点的组合比多个非较优位点组合的鉴别能力更好的情况。例如表17、表18和表19所示的ABCG1_B_4、ABCG1_B_5、ABCG1_B_6、ABCG1_B_7、ABCG1_B_8、ABCG1_B_9、ABCG1_B_10、ABCG1_B_11、ABCG1_B_12和ABCG1_B_13这10个可区分的最优位点的组合是ABCG1_B中任意10个组合的优选位点。
综上所述，ABCG1基因上的CpG位点及其各种组合，ABCG1_A片段上的CpG位点及其各种组合，ABCG1_B片段上的CpG位点及其各种组合，ABCG1_B片段上ABCG1_B_4、ABCG1_B_5、ABCG1_B_6、ABCG1_B_7、ABCG1_B_8、ABCG1_B_9、ABCG1_B_10、ABCG1_B_11、ABCG1_B_12和ABCG1_B_13位点及其各种组合，ABCG1_C片段上的CpG位点及其各种组合，ABCG1_D片段上的CpG位点及其各种组合，ABCG1_F片段上的CpG位点及其各种组合，以及ABCG1_A、ABCG1_B、ABCG1_C、ABCG1_D和ABCG1_F上的CpG位点及其各种组合的甲基化水平都对肺癌患者和无癌对照、肺癌患者和肺良性结节患者、胰腺癌患者和无癌对照、食管癌和无癌对照、胰腺癌患者和肺癌患者、食管癌患者和肺癌患者、胰腺癌患者和食管癌患者、肺腺癌和肺鳞癌患者、肺腺癌和小细胞肺癌患者、肺鳞癌和小细胞肺癌患者、I期肺癌和II期肺癌患者、I期肺癌和III期肺癌患者、II期肺癌和III期肺癌患者有判别能力。
表7比较无癌对照、良性结节和肺癌的甲基化水平
/>
表8比较无癌对照和肺癌的甲基化水平差异
/>
表9比较良性结节和肺癌的甲基化水平差异
/>
/>
表10比较肺癌不同亚型或者肺癌不同分期的甲基化水平差异
/>
表11比较无癌对照和胰腺癌的甲基化水平差异
/>
表12比较无癌对照和食管癌的甲基化水平差异
/>
/>
表13比较肺癌、胰腺癌和食管癌的甲基化水平差异
/>
表14 ABCG1_B的CpG位点及其组合用于区分肺癌和无癌对照，肺癌和良性结节，胰腺癌和无癌对照，以及肺癌和胰腺癌
/>
表15 ABCG1_B的CpG位点及其组合用于区分食管癌和无癌对照，食管癌和胰腺癌，以及食管癌和肺癌
表16 ABCG1_B的CpG位点及其自由组合用于区分肺腺癌和肺鳞癌患者、肺腺癌和小细胞肺癌患者、肺鳞癌和小细胞肺癌患者、肺癌I期和肺癌II期、肺癌I期和肺癌III期、肺癌II期和肺癌III期癌患者
表17 ABCG1_B的最佳CpG位点及其组合用于区分肺癌和无癌对照，肺癌和良性结节，胰腺癌和无癌对照，以及肺癌和胰腺癌
/>
表18 ABCG1_B的最佳CpG位点及其组合用于区分食管癌和无癌对照，食管癌和胰腺癌，以及食管癌和肺癌
/>
表19 ABCG1_B的最佳CpG位点及其组合用于区分肺腺癌和肺鳞癌患者、肺腺癌和小细胞肺癌患者、肺鳞癌和小细胞肺癌患者、肺癌I期和肺癌II期、肺癌I期和肺癌III期、肺癌II期和肺癌III期癌患者
/>
<110> 南京腾辰生物科技有限公司
<120> 用于辅助诊断癌症的甲基化标志物及试剂盒
<130> GNCLN200561
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 545
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
actctggaat tgggtacttt cttgctgtga ccttgagcaa gtaaaataat ctgtgcctta 60
cttccccact gtgaataata acagtgtctg gctcatggag ctgtgatggg gattaagtga 120
gttaatggat agacttctca gcacagagca cctaatacag ccttcattcc attcgtcctt 180
gttaccaggt ttctgctaag ctcccttcca gggctgagat ctcagaggct tcaccagctc 240
actttccccc actttgctgc aataatcatt ggctagaggt attgtgatat gatgtcatta 300
aagttaatct agacgaaaat ttgatttacc taaaactatt acactgtaga cctggaggaa 360
tttcagtttt tgccgtaatt gttttcaatg tgtgttataa aaaataaatt ccactatgtt 420
cacgaatgta caacttataa tctgaccaaa agtgagagat gggtagattt tcctacttgg 480
gtccttctgt ggacaggtac taggtgctgc tttacgccca gtgacttgtg agggaacaga 540
actgc 545
<210> 2
<211> 773
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
aaccctaaca gggacagggg tgctgggagg tgggatgacc atctccagtt cggaggaggt 60
atcggaagca cagagacatg gtctgaattg cttaagaccc catgattagg gcgtggccag 120
gctggggccc tgctctgaga ggcttccagg tctgagacca caagcctctg taacggccct 180
tgactattgc ttagccttcc acgggtgagt tgtgggtgtt tcggcatctt tcagcccttg 240
tccattatag gaaaatccac accaaggaaa tcatacagcc ccatccccaa ataagccaac 300
agcaaagcaa tgcatacagt tgaccacctt tcctccacag cgtctaacag cctcacccaa 360
ttaataggat cgtgaaaact gcgtgatgcg aggcagtggc ctgtcagtct gaaatagacc 420
agctctctgg aaacacatcc tccgatgaga gctgccggca atgtaggtta cagcgagttt 480
ctccttagcc tcctgagctc attaaaatta aaacacatgc atcttctctc ttcatttttt 540
cctttcactc ttctgtttcc ctatcctact gaagcattgt ctttgacctt cccccacccc 600
cgcaccgggc cacatacgat ttgtgctgca caatacattg tacgtcatag taagttcatt 660
catagatgtg gaatgccaaa gagaccctgt ttggattgtt cctggctgct gttcatggga 720
atattttcct gggcgctgag cagagtggcc tgtgattgca gtttgaatcc tgg 773
<210> 3
<211> 676
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
ggtgtcactg tttaactgct ggaggatgtt cttaccacaa tcgttttcac ctgcatggtg 60
ggtgcccccc tgccttcctc tactgccttg aataggcttg tatcttgaaa agttcacgtt 120
ctcaaatgga ggccctccct ataaaccaga acctaatcca ccagtccaag aaatcaccaa 180
aggtgacatt ttgctgaaca tgacaccgtt tcttttgttt ataaattggc aggaagaaaa 240
atgtttagta accatacacc tgctctttct gagttcagtt ctagaatcaa cagattagct 300
atgaacaaag aaaaccatgt gggtcagatt aaatatatcc tgaaggacta aaccgtaaaa 360
ctagggattt gtcatggagg tgcattcatc aaactcagtt gatgaagttc caacacctgc 420
ataggaaact tactctcaaa tacaatgtac ccagtgccga ctgtttttgc tcacattgtg 480
aaaaaacgca aaaagatggg ttttcagtca tgagtggtgg cgggtgggcc tgcagggatc 540
cagtctgacc tgcagccaag agtttcactt cccactttgt cagctgtgtg ctgtttgtca 600
cctccgtgct ctgtggggta aatggcattt ggtgtcaaaa gtaagacaca ccagggtgac 660
ttcagggctg tgatta 676
<210> 4
<211> 581
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
gcagcctccc tgggacaggg gcggccctat gcatagggga tcacccgggc catgcaaatc 60
ccggcgcccc gcgcgtgctg gtgttctcct ccccaggtcc aggaacaccg gtccaggaag 120
cctgagagcg ctggcagtag gaagggtcgc cagtgtggac ctgagggtgg aggtgttgcc 180
acccggggcg gcctgcgctc cattcaggct tgagcggtga ctgggagacc ccgggaatgg 240
aaatggcgct caaatgctgg tgtggtgtcc gcaggggaac ggcccgcggg tgtgtggagt 300
ctgcgcccct gtggcttcag ctgcgtcggg ggactgcggg aatcttccag actccagttt 360
aaatcagaga ggtgtgtcca cgaaaagagt caaactaaaa catttaaaga gatttatcct 420
gagtgaccat ggcccgtgac acagcctcag gagaccagga gaacacgtgc ccaaaggggt 480
cgggaacagc ttggtttcat acttttaggg agacgtaaga cagtgatcaa tatttaagat 540
gtacattggt tccgtctaga aaggtgggac agcccaaagg g 581
<210> 5
<211> 611
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
cctgtcttgg gggaaagcac agagctcaga gtgttgagat tcgaaatccc cattttgtgt 60
aagagatggc actctctgtg atgcccaagc aaaggccctc actgcttccg gccacagcat 120
cttcctccct caaaaagaat gggtagaaaa cctgaccgca gggttgctgt gaagacagag 180
taagttactg ctcacagact aataaatacc aagctaatac tattattatt agaaagagga 240
gtatttgcct tcatgaaacc aggaacacga aaatcaattt ttagcaaaat ttgacctgta 300
acattaaaat accttgagca ctattgtgtg ccagccctgg ctgtagtgat gacctctgct 360
attcctcact ccaatcctga gtttggcact tggatcagcc ctgttctgca gatgcaaaaa 420
ctgaggccca gggtcacatg gttaagaaga ggtggagctg gcattcaaga gtaggctgct 480
tgacccagaa tccaggctct taccattccc cagccacccc tctgtccatc cacggtgctg 540
tgcggccaaa gaaacagccc tcagaaacca cctgcgtgaa gcttagtcag aggtggctca 600
tgggtttgac a 611
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
aggaagagag attttggaat tgggtatttt tttgt 35
<210> 7
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
cagtaatacg actcactata gggagaaggc tacaattcta ttccctcaca aatcac 56
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
aggaagagag aattttaata gggatagggg tgttg 35
<210> 9
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
cagtaatacg actcactata gggagaaggc tccaaaattc aaactacaat cacaaa 56
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
aggaagagag ggtgttattg tttaattgtt ggagg 35
<210> 11
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
cagtaatacg actcactata gggagaaggc ttaatcacaa ccctaaaatc acccta 56
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
aggaagagag gtagtttttt tgggataggg g 31
<210> 13
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 13
cagtaatacg actcactata gggagaaggc tccctttaaa ctatcccacc tttcta 56
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 14
aggaagagag tttgttttgg gggaaagtat agagt 35
<210> 15
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 15
cagtaatacg actcactata gggagaaggc ttatcaaacc cataaaccac ctctaa 56

Claims (9)

1.甲基化ABCG1基因作为标志物在制备产品中的应用；所述产品的用途为辅助区分肺癌患者和无癌对照；
所述甲基化ABCG1基因为ABCG1基因中如下(e1)-(e5)所示片段中全部CpG位点甲基化；
(e1)SEQ ID No.1所示的DNA片段；
(e2)SEQ ID No.2所示的DNA片段；
(e3)SEQ ID No.3所示的DNA片段；
(e4)SEQ ID No.4所示的DNA片段；
(e5)SEQ ID No.5所示的DNA片段。
2.用于检测ABCG1基因甲基化水平的物质在制备产品中的应用；所述产品的用途为辅助区分肺癌患者和无癌对照；
所述甲基化ABCG1基因为ABCG1基因中如下(e1)-(e5)所示片段中全部CpG位点甲基化；
(e1)SEQ ID No.1所示的DNA片段；
(e2)SEQ ID No.2所示的DNA片段；
(e3)SEQ ID No.3所示的DNA片段；
(e4)SEQ ID No.4所示的DNA片段；
(e5)SEQ ID No.5所示的DNA片段。
3.用于检测ABCG1基因甲基化水平的物质和储存有数学模型建立方法和/或使用方法的介质在制备产品中的应用；所述产品的用途为辅助区分肺癌患者和无癌对照；
所述数学模型按照包括如下步骤的方法获得：
(A1)分别检测n1个A类型样本和n2个B类型样本的ABCG1基因甲基化水平；
(A2)取步骤(A1)获得的所有样本的ABCG1基因甲基化水平数据，按照A类型和B类型的分类方式，通过二分类逻辑回归法建立数学模型，确定分类判定的阈值；
所述数学模型的使用方法包括如下步骤：
(B1)检测待测样本的ABCG1基因甲基化水平；
(B2)将步骤(B1)获得的所述待测样本的ABCG1基因甲基化水平数据代入所述数学模型，得到检测指数；然后比较检测指数和阈值的大小，根据比较结果确定所述待测样本的类型是A类型还是B类型；
所述A类型样本和所述B类型样本为肺癌样本和无癌对照；
所述甲基化ABCG1基因为ABCG1基因中如下(e1)-(e5)所示片段中全部CpG位点甲基化；
(e1)SEQ ID No.1所示的DNA片段；
(e2)SEQ ID No.2所示的DNA片段；
(e3)SEQ ID No.3所示的DNA片段；
(e4)SEQ ID No.4所示的DNA片段；
(e5)SEQ ID No.5所示的DNA片段。
4.储存有数学模型建立方法和/或使用方法的介质在制备产品中的应用；所述产品的用途为辅助区分肺癌患者和无癌对照；
所述数学模型按照包括如下步骤的方法获得：
(A1)分别检测n1个A类型样本和n2个B类型样本的ABCG1基因甲基化水平；
(A2)取步骤(A1)获得的所有样本的ABCG1基因甲基化水平数据，按照A类型和B类型的分类方式，通过二分类逻辑回归法建立数学模型，确定分类判定的阈值；
所述数学模型的使用方法包括如下步骤：
(B1)检测待测样本的ABCG1基因甲基化水平；
(B2)将步骤(B1)获得的所述待测样本的ABCG1基因甲基化水平数据代入所述数学模型，得到检测指数；然后比较检测指数和阈值的大小，根据比较结果确定所述待测样本的类型是A类型还是B类型；
所述A类型样本和所述B类型样本为肺癌样本和无癌对照；
所述甲基化ABCG1基因为ABCG1基因中如下(e1)-(e5)所示片段中全部CpG位点甲基化；
(e1)SEQ ID No.1所示的DNA片段；
(e2)SEQ ID No.2所示的DNA片段；
(e3)SEQ ID No.3所示的DNA片段；
(e4)SEQ ID No.4所示的DNA片段；
(e5)SEQ ID No.5所示的DNA片段。
5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述用于检测ABCG1基因甲基化水平的物质包含用于扩增ABCG1基因部分片段的引物组合；
所述部分片段为如下全部片段：
(g1)SEQ ID No.1所示的DNA片段；
(g2)SEQ ID No.2所示的DNA片段；
(g3)SEQ ID No.3所示的DNA片段；
(g4)SEQ ID No.4所示的DNA片段；
(g5)SEQ ID No.5所示的DNA片段。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述引物组合为引物对A、引物对B、引物对C、引物对D和引物对E；
所述引物对A为引物A1和引物A2组成的引物对；所述引物A1为SEQ ID No.6或SEQ IDNo.6的第11-35位核苷酸所示的单链DNA；所述引物A2为SEQ ID No.7或SEQ ID No.7的第32-56位核苷酸所示的单链DNA；
所述引物对B为引物B1和引物B2组成的引物对；所述引物B1为SEQ ID No.8或SEQ IDNo.8的第11-35位核苷酸所示的单链DNA；所述引物B2为SEQ ID No.9或SEQ ID No.9的第32-56位核苷酸所示的单链DNA；
所述引物对C为引物C1和引物C2组成的引物对；所述引物C1为SEQ ID No.10或SEQ IDNo.10的第11-35位核苷酸所示的单链DNA；所述引物C2为SEQ ID No.11或SEQ ID No.11的第32-56位核苷酸所示的单链DNA；
所述引物对D为引物D1和引物D2组成的引物对；所述引物D1为SEQ ID No.12或SEQ IDNo.12的第11-31位核苷酸所示的单链DNA；所述引物D2为SEQ ID No.13或SEQ ID No.13的第32-56位核苷酸所示的单链DNA；
所述引物对E为引物E1和引物E2组成的引物对；所述引物E1为SEQ ID No.14或SEQ IDNo.14的第11-35位核苷酸所示的单链DNA；所述引物E2为SEQ ID No.15或SEQ ID No.15的第32-56位核苷酸所示的单链DNA。
7.系统，包括：
(D1)用于检测ABCG1基因甲基化水平的试剂和/或仪器；
(D2)装置，所述装置包括单元A和单元B；
所述单元A用于建立数学模型，包括数据采集模块、数据分析处理模块和模型输出模块；
所述数据采集模块用于采集(D1)检测得到的n1个A类型样本和n2个B类型样本的ABCG1基因甲基化水平数据；
所述数据分析处理模块能够基于所述数据采集模块采集的n1个A类型样本和n2个B类型样本的ABCG1基因甲基化水平数据，按照A类型和B类型的分类方式，通过二分类逻辑回归法建立数学模型，确定分类判定的阈值；
所述模型输出模块用于输出所述数据分析处理模块建立的数学模型；
所述单元B用于确定待测样本类型，包括数据输入模块、数据运算模块、数据比较模块和结论输出模块；
所述数据输入模块用于输入(D1)检测得到的待测者的ABCG1基因甲基化水平数据；
所述数据运算模块用于将所述待测者的ABCG1基因甲基化水平数据代入所述数学模型，计算得到检测指数；
所述数据比较模块用于将所述检测指数与阈值进行比较；
所述结论输出模块用于根据所述数据比较模块的比较结果输出所述待测样本的类型是A类型还是B类型的结论；
所述A类型样本和所述B类型样本为肺癌样本和无癌对照；
所述ABCG1基因甲基化水平为ABCG1基因中如下(e1)-(e5)所示片段中全部CpG位点的甲基化水平；
(e1)SEQ ID No.1所示的DNA片段；
(e2)SEQ ID No.2所示的DNA片段；
(e3)SEQ ID No.3所示的DNA片段；
(e4)SEQ ID No.4所示的DNA片段；
(e5)SEQ ID No.5所示的DNA片段。
8.根据权利要求7所述的系统，其特征在于：
所述用于检测ABCG1基因甲基化水平的试剂包含用于扩增ABCG1基因部分片段的引物组合；
所述部分片段为如下全部片段：
(g1)SEQ ID No.1所示的DNA片段；
(g2)SEQ ID No.2所示的DNA片段；
(g3)SEQ ID No.3所示的DNA片段；
(g4)SEQ ID No.4所示的DNA片段；
(g5)SEQ ID No.5所示的DNA片段。
9.根据权利要求8所述的系统，其特征在于：所述引物组合为引物对A、引物对B、引物对C、引物对D和引物对E；
所述引物对A为引物A1和引物A2组成的引物对；所述引物A1为SEQ ID No.6或SEQ IDNo.6的第11-35位核苷酸所示的单链DNA；所述引物A2为SEQ ID No.7或SEQ ID No.7的第32-56位核苷酸所示的单链DNA；
所述引物对B为引物B1和引物B2组成的引物对；所述引物B1为SEQ ID No.8或SEQ IDNo.8的第11-35位核苷酸所示的单链DNA；所述引物B2为SEQ ID No.9或SEQ ID No.9的第32-56位核苷酸所示的单链DNA；
所述引物对C为引物C1和引物C2组成的引物对；所述引物C1为SEQ ID No.10或SEQ IDNo.10的第11-35位核苷酸所示的单链DNA；所述引物C2为SEQ ID No.11或SEQ ID No.11的第32-56位核苷酸所示的单链DNA；
所述引物对D为引物D1和引物D2组成的引物对；所述引物D1为SEQ ID No.12或SEQ IDNo.12的第11-31位核苷酸所示的单链DNA；所述引物D2为SEQ ID No.13或SEQ ID No.13的第32-56位核苷酸所示的单链DNA；
所述引物对E为引物E1和引物E2组成的引物对；所述引物E1为SEQ ID No.14或SEQ IDNo.14的第11-35位核苷酸所示的单链DNA；所述引物E2为SEQ ID No.15或SEQ ID No.15的第32-56位核苷酸所示的单链DNA。
CN202010135360.8A 2020-03-02 2020-03-02 用于辅助诊断癌症的甲基化标志物及试剂盒 Active CN113355412B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010135360.8A CN113355412B (zh) 2020-03-02 2020-03-02 用于辅助诊断癌症的甲基化标志物及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010135360.8A CN113355412B (zh) 2020-03-02 2020-03-02 用于辅助诊断癌症的甲基化标志物及试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113355412A CN113355412A (zh) 2021-09-07
CN113355412B true CN113355412B (zh) 2024-02-20

Family

ID=77523156

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010135360.8A Active CN113355412B (zh) 2020-03-02 2020-03-02 用于辅助诊断癌症的甲基化标志物及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113355412B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115851950A (zh) * 2022-12-12 2023-03-28 南京腾辰生物科技有限公司 一种癌症鉴别标志物及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013149039A1 (en) * 2012-03-29 2013-10-03 YU, Winston, Chung-Yuan Molecular markers for prognostically predicting prostate cancer, method and kit thereof
CN108342473A (zh) * 2018-04-13 2018-07-31 东华大学 一种用于检测血脂代谢相关基因abcg1甲基化的试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013149039A1 (en) * 2012-03-29 2013-10-03 YU, Winston, Chung-Yuan Molecular markers for prognostically predicting prostate cancer, method and kit thereof
CN108342473A (zh) * 2018-04-13 2018-07-31 东华大学 一种用于检测血脂代谢相关基因abcg1甲基化的试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ABCG1 as a potential oncogene in lung cancer;CHUNYAN TIAN等;《EXPERIMENTAL AND THERAPEUTIC MEDICINE》;20170427;第13卷;3189-3194 *
Genetic variants in ABCG1 are associated with survival of nonsmall-cell lung cancer patients;Yanru Wang 等;《International Journal of Cancer》;20160112;第138卷;第2592-2601页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113355412A (zh) 2021-09-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2023226938A1 (zh) 甲基化生物标记物、试剂盒及用途
Wang et al. Cell-free plasma hypermethylated CASZ1, CDH13 and ING2 are promising biomarkers of esophageal cancer
CN114507731A (zh) 一种用于辅助癌症诊断的甲基化标志物及试剂盒
CN113355412B (zh) 用于辅助诊断癌症的甲基化标志物及试剂盒
CN111363811A (zh) 基于foxd3基因的肺癌诊断剂及试剂盒
CN113215252B (zh) 用于辅助诊断癌症的甲基化标志物
CN113136428B (zh) 一种甲基化标志物在辅助诊断癌症中的应用
CN114480630A (zh) 用于辅助诊断癌症的一种甲基化标志物
CN113122630B (zh) 一种用于辅助诊断癌症的钙结合蛋白甲基化标志物
CN113355413B (zh) 一种分子标志物及试剂盒在辅助诊断癌症中的应用
CN113215251B (zh) 一种辅助诊断癌症的甲基化标志物
JP2018139537A (ja) 食道がんのリンパ節転移可能性のデータ取得方法
CN113215250B (zh) 一个基因的甲基化水平在辅助诊断癌症中的应用
CN113186279A (zh) 用于辅助诊断癌症的透明质酸酶甲基化标志物及试剂盒
CN117568471A (zh) 蛋白基因甲基化作为辅助诊断癌症的分子标志物
CN117568473A (zh) 一种可用于辅助诊断癌症的甲基化分子标志物
CN115612735A (zh) 一种辅助诊断癌症的潜在分子标志物
TW202012641A (zh) Hoxa9甲基化檢測試劑
CN117568472A (zh) 一种甲基化标志物在辅助诊断癌症中的应用
CN116790752A (zh) 一种肺癌早筛早诊分子标志物
CN115612731A (zh) 一种辅助诊断癌症的分子标志物
CN115701454A (zh) 一种用于辅助诊断癌症的分子标志物及试剂盒
CN117568470A (zh) 一种作为辅助诊断癌症的分子标志物及试剂盒
CN118028461A (zh) 一种蛋白基因在辅助诊断癌症中的应用
JP2020014415A (ja) がんの診断用バイオマーカー

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: 200072, 3rd to 4th floors, Building 10, No. 351 Yuexiu Road, Hongkou District, Shanghai

Applicant after: Tengchen Biotechnology (Shanghai) Co.,Ltd.

Address before: 210032 2nd floor, building 02, life science and technology Island, 11 Yaogu Avenue, Jiangbei new district, Nanjing, Jiangsu Province

Applicant before: Nanjing Tengchen Biological Technology Co.,Ltd.

CB02 Change of applicant information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant