CN113186279A

CN113186279A - 用于辅助诊断癌症的透明质酸酶甲基化标志物及试剂盒

Info

Publication number: CN113186279A
Application number: CN202010038267.5A
Authority: CN
Inventors: 狄飞飞; 韦玉杰; 王俊
Original assignee: Nanjing Tengchen Biological Technology Co ltd
Current assignee: Nanjing Tengchen Biological Technology Co ltd
Priority date: 2020-01-14
Filing date: 2020-01-14
Publication date: 2021-07-30
Anticipated expiration: 2040-01-14
Also published as: CN113186279B

Abstract

本发明公开了一种用于辅助诊断癌症的甲基化标志物及试剂盒。本发明提供了甲基化HYAL2基因作为标志物在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下至少一种：辅助诊断癌症或预测癌症患病风险；辅助区分良性结节和癌症；辅助区分癌症不同亚型；辅助区分癌症不同分期；辅助区分不同癌症；确定待测物对癌症的发生是否存在阻碍或促进作用；所述癌症可为肺癌、胰腺癌或食管癌。本发明提供了肺癌患者、胰腺癌患者和食管癌血液中HYAL2基因的低甲基化现象，具有创造性和新颖性，对提高肺癌、胰腺癌和食管早期诊疗效果和降低死亡率均有重要的科学意义和临床应用价值。

Description

用于辅助诊断癌症的透明质酸酶甲基化标志物及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于辅助诊断癌症的透明质酸酶II(Hyaluronidase-2,HYAL2)甲基化标志物及试剂盒。

背景技术

肺癌是发生于支气管粘膜上皮的恶性肿瘤，近几十年来，其发病率及死亡率一直呈上升趋势，是全世界发病率和死亡率最高的癌症。尽管最近几年在诊断方法、手术技术以及化疗药物等方面均有新的进展，但肺癌患者总的5年生存率仅为16％，主要是由于大部分肺癌患者就诊时己发生转移从而失去了手术根治机会。研究表明，肺癌的预后与分期直接相关，I期肺癌5年生存率为83％，II期为53％，III期为26％，IV期为6％。因此，降低肺癌患者死亡率的关键在于早诊断早治疗。

目前主要的肺癌诊断方法如下：(1)影像学方法：例如胸部X射线和低剂量螺旋CT。但胸部X射线很难发现早期肺癌。低剂量螺旋CT虽然可以发现肺内的小结节，但是假阳性率高达96.4％，给被检查者带来不必要的心理负担。同时，胸部X射线和低剂量螺旋CT由于辐射的原因不宜频繁使用。另外，影像学方法也往往受设备和医生看片经验，以及有效读片时间的影响。(2)细胞学方法：例如痰液细胞学检查、支气管镜下刷片或取活检、支气管肺泡灌洗液细胞学检查等。痰液细胞学检查和支气管镜下刷片或取活检对于周围性肺癌的灵敏度较低。同时支气管镜下刷片或取活检、支气管肺泡灌洗液细胞学检查操作比较繁琐，且体检者舒适度不佳。(3)目前常用的血清肿瘤标志物：癌胚抗原(CEA)、糖类抗原(CA125/153/199)、细胞角蛋白19片段抗原(CYFRA21-1)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)等。这些血清肿瘤标志物对肺癌的灵敏度有限，一般为30％-40％，对于I期肿瘤甚至更低。而且肿瘤特异性也比较有限，受许多良性病变如良性肿瘤、炎症、退行性疾病等影响。目前，肿瘤标志物主要用于恶性肿瘤的筛查和肿瘤治疗效果复查。因此，需要进一步开发高效特异的肺癌早期诊断技术。

目前国际公认的肺部结节诊断的最有效方法是胸部低剂量螺旋CT筛查。但是低剂量螺旋CT的灵敏度高，能发现大量的小结节，却难以进行良恶性的判别。在发现的小结节中，恶性的比例还不到4％。目前，临床上对肺结节的良恶性鉴定需要长期随访、反复CT检查或者依赖肺部结节活组织取样(包括胸壁细针穿刺活检、支气管镜组织活检、胸腔镜或开胸手术肺活检)等创伤性检查方法。CT引导或超声引导经胸穿刺活检有较高的灵敏度，但对于<2cm的结节诊断率较低，有30～70％的漏诊率，且气胸和出血发生率较高。气管镜针吸活检并发症发生率相对较低，但对周围型结节诊断率有限，对≤2cm的结节诊断率仅34％，大于2cm的结节诊断率为63％。手术切除诊断率高且可直接对结节进行处理，但会造成患者肺功能出现短暂减退，若结节为良性，则患者进行了不必要的手术，导致了过度医疗。因此，目前迫切需要新的体外诊断分子标志物来辅助进行肺部结节的鉴别，在降低漏诊率的同时也尽量减少不必要的穿刺或者手术。

胰腺癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，其中约90％为胰腺导管腺癌，是目前世界上第四大致死性恶性肿瘤。由于发病隐匿、临床症状特异性差和早期浸润性特点，大部分胰腺癌患者发现时已处于晚期，失去手术治疗机会，导致5年生存率只有7％。如果病人可以在早期(I期)发现，胰腺癌患者5年生存率可达到60％。目前临床上关于胰腺癌的常用诊断方法有：(1)超声、增强CT和核磁共振(MRI)等影像学方法，超声波诊断的准确性受医生看片经验、病人肥大的体形和胃肠道气体的限制；通常，超声这种诊断胰腺癌的方法可作为CT的补充检查来运用，但增强CT对人体辐射较大，不易频繁使用；MRI没有辐射的影响，但它对于一些人并不适用(体内有金属物品及心脏起搏器等)，检查所需时间较长，由于设备比较昂贵，一些中小医院尚未普及。(2)临床上会结合一些血清肿瘤标志物如CA19-9、CA242、CA50等进一步检测，以上肿瘤标志物敏感度较高，但特异性较低，容易受肝功能及胆汁郁积的影响。(3)病理学检查：经皮穿刺活检、超声胃镜引导下的活检、腹水脱落细胞学检查及腹腔镜或开腹手术下探查活检，但该方法为创伤性检查，并不适用于早期患者。因此，更为敏感、特异的早期胰腺癌分子标记亟待发掘。

食管癌是起源于食管黏膜上皮的恶性肿瘤，其中约80％为鳞状细胞癌，是临床常见的恶性肿瘤之一。在全球范围内，食管癌的发病率在恶性肿瘤中居第8位，死亡率居第6位。我国是食管癌高发国家，且其发病率有逐渐增加的趋势。目前，90％以上的食管癌患者确诊时已进展至中晚期，总体5年生存率不足20％。目前临床上食管癌检测主要有以下几种方法。内镜超声检查：因高频探头穿透力低，仅

甚至更短，所见范围非常有限，此外有

患者因食管过度狭窄而不能使用此方法。食管镜检查：食管镜可详细观察病灶的位置、大小及形态，也可直接钳取病理组织或用毛刷刷取标本作细胞学检查，但会引起患者的不适。X线钡餐造影：患者在X线检查时吞食钡粥，观察钡粥通过食管时的显影，达到定性和定位的诊断，受医生操作及看片经验的影响，且此方法不适用极早期食管癌患者。CT扫描：能够显示出病患食管与邻近器官之间的关系，但是它的弊端在于对于早期患者灵敏度很低。此外还有一些常用的肿瘤标志物，如CA72-4、CA19-9、CEA、CYFRA21-1和鳞状细胞癌相关抗原(SCC)等可用于食管癌的诊断，但其灵敏度不足40％，且特异性较低，尤其对于早期患者的诊断价值较低。因此，需要进一步开发高效特异的食管癌早期诊断技术。DNA甲基化是基因上重要的一种化学修饰，影响着基因转录的调控过程和细胞核结构。DNA甲基化的改变是癌症发展的早期事件和伴随事件，主要体现在肿瘤组织上抑癌基因的高甲基化和原癌基因的低甲基化等。但是血液中的DNA甲基化跟肿瘤发生发展的相关性则报道得较少。此外血液容易收集，DNA甲基化较稳定，如果可以发现肿瘤特异的血液DNA甲基化分子标志物则有巨大的临床应用价值。因此，探索和开发适用于临床检测需要的血液DNA甲基化诊断技术对提高肺癌早期诊疗效果和降低死亡率均有重要的临床应用价值和社会意义。

透明质酸酶II(Hyaluronidase-2,HYAL2)是透明质酸代谢过程中重要的调节因子。HYAL2基因主要在身体内一些组织和血细胞中表达，主要功能是降解透明质酸。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于辅助诊断癌症的透明质酸酶II(Hyaluronidase-2,HYAL2)甲基化标志物及试剂盒。

第一方面，本发明要求保护甲基化HYAL2基因作为标志物在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下中的至少一种：

(1)辅助诊断癌症或预测癌症患病风险；

(2)辅助区分良性结节和癌症；

(3)辅助区分癌症不同亚型；

(4)辅助区分癌症不同分期；

(5)辅助诊断肺癌或预测肺癌患病风险；

(6)辅助区分肺部良性结节和肺癌；

(7)辅助区分肺癌不同亚型；

(8)辅助区分肺癌不同分期；

(9)辅助诊断胰腺癌或预测胰腺癌患病风险；

(10)辅助诊断食管癌或预测食管癌患病风险；

(11)辅助区分肺癌和胰腺癌；

(12)辅助区分肺癌和食管癌；

(13)辅助区分胰腺癌和食管癌；

(14)确定待测物对癌症的发生是否存在阻碍或促进作用。

进一步地，(1)中所述辅助诊断癌症具体可体现为如下中的至少一种：辅助区分癌症患者和无癌对照(可理解为现在及曾经均没有患过癌症且没有报告肺部良性结节且血常规指标都在参考范围内)；辅助区分不同癌症。

进一步地，(2)中所述良性结节为(2)中所述癌症对应的良性结节，如肺部良性结节和肺癌。

进一步地，(3)中所述癌症不同亚型可为病理分型，如组织学分型。

进一步地，(4)中所述癌症不同分期可为临床分期或TNM分期。

在本发明的具体实施方式中，(5)中所述辅助诊断肺癌具体体现为如下中的至少一种：可辅助区分肺癌患者和无癌对照、可辅助区分肺腺癌患者和无癌对照、可辅助区分肺鳞癌患者和无癌对照、可辅助区分小细胞肺癌患者和无癌对照、可辅助区分I期肺癌患者和无癌对照、可辅助区分II-III期肺癌患者和无癌对照、可辅助区分无淋巴结浸润的肺癌患者和无癌对照、可辅助区分有淋巴结浸润的肺癌患者和无癌对照。其中，所述无癌对照可理解为现在及曾经均没有患过癌症且没有报告肺部良性结节且血常规指标都在参考范围内。

在本发明的具体实施方式中，(6)中所述辅助区分肺部良性结节和肺癌具体体现为如下中的至少一种：可辅助区分肺癌和肺部良性结节、可辅助区分肺腺癌和肺部良性结节、可辅助区分肺鳞癌和肺部良性结节、可辅助区分小细胞肺癌和肺部良性结节、可辅助区分I期肺癌和肺部良性结节、可辅助区分II-III期肺癌和肺部良性结节、可辅助区分无淋巴结浸润的肺癌和肺部良性结节、可辅助区分有淋巴结浸润的肺癌和肺部良性结节。

在本发明的具体实施方式中，(7)中所述辅助区分肺癌不同亚型具体体现为：可辅助区分肺腺癌、肺鳞癌和小细胞肺癌中的任意两种。

在本发明的具体实施方式中，(8)中所述辅助区分肺癌不同分期具体体现为如下中的至少一种：可辅助区分T1期肺癌、T2期肺癌和T3肺癌中的任意两种；可辅助区分无淋巴结浸润的肺癌和有淋巴结浸润的肺癌；可辅助区分临床I期肺癌、临床II肺癌和临床III期肺癌中的任意两种。

在本发明的具体实施方式中，(9)中所述辅助诊断胰腺癌具体体现为如下中的至少一种：可辅助区分胰腺癌患者和无癌对照、可辅助区分肺胰腺导管癌和无癌对照。其中，所述无癌对照可理解为现在及曾经均没有患过癌症且没有报告肺部良性结节且血常规指标都在参考范围内。

在本发明的具体实施方式中，(10)中所述辅助诊断食管癌具体体现为如下中的至少一种：可辅助区分食管癌患者和无癌对照、可辅助区分食管鳞状细胞癌和无癌对照。其中，所述无癌对照可理解为可理解为现在及曾经均没有患过癌症且没有报告肺部良性结节且血常规指标都在参考范围内。

在上述(1)-(14)中，所述癌症可为能够引起机体内HYAL2基因甲基化水平变化(例如降低)的癌症，如肺癌、胰腺癌、食管癌等。

第二方面，本发明要求保护用于检测HYAL2基因甲基化水平的物质在制备产品中的应用。所述产品的用途可为前文(1)-(14)中的至少一种。

第三方面，本发明要求保护用于检测HYAL2基因甲基化水平的物质和储存有数学模型建立方法和/或使用方法的介质在制备产品中的应用。所述产品的用途可为前文(1)-(14)中的至少一种。

所述数学模型可按照包括如下步骤的方法获得：

(A1)分别检测n1个A类型样本和n2个B类型样本的HYAL2基因甲基化水平(训练集)；

(A2)取步骤(A1)获得的所有样本的HYAL2基因甲基化水平数据，按照A类型和B类型的分类方式，通过二分类逻辑回归法建立数学模型，确定分类判定的阈值。

其中，(A1)中的n1和n2均可为50以上的正整数。

所述数学模型的使用方法包括如下步骤：

(B1)检测待测样本的HYAL2基因甲基化水平；

(B2)将步骤(B1)获得的所述待测样本的HYAL2基因甲基化水平数据代入所述数学模型，得到检测指数；然后比较检测指数和阈值的大小，根据比较结果确定所述待测样本的类型是A类型还是B类型。

在本发明的具体实施方式中，所述阈值设为0.5。大于0.5归为一类，小于0.5归为另外一类，等于0.5作为不确定的灰区。其中A类型和B类型为相对应的两分类，二分类的分组，哪一组A类型，哪一组是B类型，要根据具体的数学模型来确定，无需约定。

在实际应用中，所述阈值也可根据最大约登指数确定(具体可为最大约登指数对应的数值)。大于阈值归为一类，小于阈值归为另外一类，等于阈值作为不确定的灰区。其中A类型和B类型为相对应的两分类，二分类的分组，哪一组A类型，哪一组是B类型，要根据具体的数学模型来确定，无需约定。

所述A类型样本和所述B类型样本可为如下中的任一种：

(C1)肺癌样本和无癌对照；

(C2)肺癌样本和肺良性结节样本；

(C3)肺癌不同亚型样本；

(C4)肺癌不同分期样本；

(C5)肺癌样本和食管癌样本；

(C6)肺癌样本和胰腺癌样本；

(C7)胰腺癌样本和食管癌样本；

(C8)胰腺癌样本和无癌对照；

(C9)食管癌样本和无癌对照。

第四方面，本发明要求保护前文第三方面中所述的“储存有数学模型建立方法和/或使用方法的介质”在制备产品中的应用。所述产品的用途可为前文(1)-(14)中的至少一种。

第五方面，本发明要求保护一种试剂盒。

本发明所要求保护的试剂盒包括用于检测HYAL2基因甲基化水平的物质。所述试剂盒的用途可为前文(1)-(14)中的至少一种。

进一步地，所述试剂盒中还可含有前文第三方面或第四方面中所述的“储存有数学模型建立方法和/或使用方法的介质”。

第六方面，本发明要求保护一种系统。

本发明所要求保护的系统，包括：

(D1)用于检测HYAL2基因甲基化水平的试剂和/或仪器；

(D2)装置，所述装置包括单元A和单元B；

所述单元A用于建立数学模型，包括数据采集模块、数据分析处理模块和模型输出模块；

所述数据采集模块用于采集(D1)检测得到的n1个A类型样本和n2个B类型样本的HYAL2基因甲基化水平数据；

所述数据分析处理模块能够基于所述数据采集模块采集的n1个A类型样本和n2个B类型样本的HYAL2基因甲基化水平数据，按照A类型和B类型的分类方式，通过二分类逻辑回归法建立数学模型，确定分类判定的阈值；

所述模型输出模块用于输出所述数据分析处理模块建立的数学模型；

所述单元B用于确定待测样本类型，包括数据输入模块、数据运算模块、数据比较模块和结论输出模块；

所述数据输入模块用于输入(D1)检测得到的待测者的HYAL2基因甲基化水平数据；

所述数据运算模块用于将所述待测者的HYAL2基因甲基化水平数据代入所述数学模型，计算得到检测指数；

所述数据比较模块用于将所述检测指数与阈值进行比较；

所述结论输出模块用于根据所述数据比较模块的比较结果输出所述待测样本的类型是A类型还是B类型的结论；

所述A类型样本和所述B类型样本为如下中的任一种：

(C1)肺癌样本和无癌对照；

(C2)肺癌样本和肺良性结节样本；

(C3)肺癌不同亚型样本；

(C4)肺癌不同分期样本；

(C5)肺癌样本和食管癌样本；

(C6)肺癌样本和胰腺癌样本；

(C7)胰腺癌样本和食管癌样本；

(C8)胰腺癌样本和无癌对照；

(C9)食管癌样本和无癌对照。

其中，n1和n2均可为50以上正整数。

在前文各方面中，所述“HYAL2基因甲基化水平”为HYAL2基因中如下(e1)-(e6)所示片段中全部或部分CpG位点的甲基化水平；所述甲基化HYAL2基因指HYAL2基因中如下(e1)-(e6)所示片段的甲基化；

(e1)SEQ ID No.1所示的DNA分子；

(e2)SEQ ID No.2所示的DNA分子；

(e3)SEQ ID No.3所示的DNA分子；

(e4)与SEQ ID No.1所示的DNA分子具有80％以上同一性的DNA分子；

(e5)与SEQ ID No.2所示的DNA分子具有80％以上同一性的DNA分子；

(e6)与SEQ ID No.3所示的DNA分子具有80％以上同一性的DNA分子。

所述HYAL2基因中如下(e1)-(e6)所示片段中全部或部分CpG位点的甲基化水平可以为如下(e1)-(e6)所示片段中任一CpG位点的甲基化水平(具体可为表1或表2或表3中任一所示CpG位点的甲基化水平)。

进一步地，所述“全部或部分CpG位点”为SEQ ID No.2所示的DNA片段中任意1个CpG位点或任意2个CpG位点或任意3个CpG位点或任意4个CpG位点或任意5个CpG位点或任意6个CpG位点或任意7个CpG位点或任意8个CpG位点或任意9个CpG位点或任意10个CpG位点或任意11个CpG位点或任意12个CpG位点或任意13个CpG位点。

或，所述“全部或部分CpG位点”为SEQ ID No.1所示的DNA片段中所有CpG位点(具体如表1所示)和SEQ ID No.2所示的DNA片段中所有CpG位点(具体如表2所示)。

或，所述“全部或部分CpG位点”为SEQ ID No.2所示的DNA片段中所有CpG位点(具体如表2所示)和SEQ ID No.3所示的DNA片段中所有CpG位点(具体如表3所示)。

或，所述“全部或部分CpG位点”为SEQ ID No.1所示的DNA片段中所有CpG位点(具体如表1所示)和SEQ ID No.3所示的DNA片段中所有CpG位点(具体如表3所示)。

或，所述“全部或部分CpG位点”为SEQ ID No.1所示的DNA片段中所有CpG位点(具体如表1所示)、SEQ ID No.2所示的DNA片段中所有CpG位点(具体如表2所示)和SEQ IDNo.3所示的DNA片段中所有CpG位点(具体如表3所示)。

或，所述“全部或部分CpG位点”为SEQ ID No.2所示的DNA片段中如下4个CpG位点中的全部或任意3个或任意2个或任意1个：SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第850-851位所示CpG位点、SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第873-874位所示CpG位点、SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第898-899位所示CpG位点、SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第960-961位所示CpG位点。

或，所述SEQ ID No.1所示的DNA片段为SEQ ID No.1所示的单链DNA片段；所述SEQID No.2所示的DNA片段为SEQ ID No.2所示的单链DNA片段；所述SEQ ID No.3所示的DNA片段为SEQ ID No.3所示的单链DNA片段。

在上述各方面中，所述用于检测HYAL2基因甲基化水平的物质包含用于扩增HYAL2基因全长或部分片段的引物组合。所述用于检测HYAL2基因甲基化水平的试剂包含用于扩增HYAL2基因全长或部分片段的引物组合；所述用于检测HYAL2基因甲基化水平的仪器可为飞行时间质谱检测仪。当然所述用于检测HYAL2基因甲基化水平的试剂中还可包含进行飞行时间质谱所用的其他常规试剂。

进一步地，所述部分片段为如下中至少一个片段：

(f1)SEQ ID No.1所示的DNA片段或其包含的DNA片段；

(f2)SEQ ID No.2所示的DNA片段或其包含的DNA片段；

(f3)SEQ ID No.3所示的DNA片段或其包含的DNA片段；

(f4)与SEQ ID No.1所示的DNA片段或其包含的DNA片段具有80％以上同一性的DNA片段；

(f5)与SEQ ID No.2所示的DNA片段或其包含的DNA片段具有80％以上同一性的DNA片段；

(f6)与SEQ ID No.3所示的DNA片段或其包含的DNA片段具有80％以上同一性的DNA片段。

在本发明中，所述引物组合具体可为引物对A和/或引物对B和/或引物对C；

所述引物对A为引物A1和引物A2组成的引物对；所述引物A1具体可为SEQ ID No.4或SEQ ID No.4的第11-35位核苷酸所示的单链DNA；所述引物A2具体可为SEQ ID No.5或SEQ ID No.5的第32-56位核苷酸所示的单链DNA；

所述引物对B为引物B1和引物B2组成的引物对；所述引物B1具体可为SEQ ID No.6或SEQ ID No.6的第11-35位核苷酸所示的单链DNA；所述引物B2具体可为SEQ ID No.7或SEQ ID No.7的第32-56位核苷酸所示的单链DNA。

所述引物对C为引物C1和引物C2组成的引物对；所述引物C1具体可为SEQ ID No.8或SEQ ID No.8的第11-35位核苷酸所示的单链DNA；所述引物C2具体可为SEQ ID No.9或SEQ ID No.9的第32-56位核苷酸所示的单链DNA。

另外，本发明还要求保护一种区分待测样本为A类型样本还是B类型样本的方法。该方法可包括如下步骤：

(A)可按照包括如下步骤的方法建立数学模型：

其中，(A1)中的n1和n2均可为50以上的正整数。

(B)可按照包括如下步骤的方法确定所述待测样本为A类型样本还是B类型样本：

(B1)检测所述待测样本的HYAL2基因甲基化水平；

所述A类型样本和所述B类型样本为如下中的任一种：

(C1)肺癌样本和无癌对照；

(C2)肺癌样本和肺良性结节样本；

(C3)肺癌不同亚型样本；

(C4)肺癌不同分期样本；

(C5)肺癌样本和食管癌样本；

(C6)肺癌样本和胰腺癌样本；

(C7)胰腺癌样本和食管癌样本；

(C8)胰腺癌样本和无癌对照；

(C9)食管癌样本和无癌对照。

以上任一所述数学模型在实际应用中可能会根据DNA甲基化的检测方法以及拟合方式不同有所改变，要根据具体的数学模型来确定，无需约定。

在本发明的实施例中，所述模型具体为log(y/(1-y))＝b0+b1x1+b2x2+b3x3+….+bnXn，其中y为因变量即将待测样品的一个或者多个甲基化位点的甲基化值代入模型以后得出的检测指数，b0为常量，x1～xn为自变量即为该测试样品的一个或者多个甲基化位点的甲基化值(每一个值为0-1之间的数值)，b1～bn为模型赋予每一个位点甲基化值的权重。

在实际应用中，所述模型的建立还可酌情加入年龄、性别、白细胞计数等已知参数来提高判别效率。本发明的实施例中建立的一个具体模型为用于辅助区分肺部良性结节和肺癌的模型，所述模型具体为：log(y/(1-y))＝-1.09-0.707*HYAL2_B_5-3.181*HYAL2_B_6-6.182*HYAL2_B_7+9.760*HYAL2_B_8+0.021*年龄-0.841*性别(男性赋值为1，女性赋值为0)-0.019*白细胞个数。所述HYAL2_B_5为SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第850-851位所示CpG位点的甲基化水平；所述HYAL2_B_6为SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第873-874位所示CpG位点的甲基化水平；所述HYAL2_B_7为SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第898-899位所示CpG位点的甲基化水平；所述HYAL2_B_8为SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第960-961位所示CpG位点的甲基化水平。所述模型的阈值为0.5。通过模型计算的检测指数大于0.5的患者候选为肺癌患者，小于0.5的患者候选为肺良性结节患者。

在上述各方面中，所述检测HYAL2基因甲基化水平为检测血液中HYAL2基因甲基化水平。

在上述各方面中，当所述A类型样本和所述B类型样本为(C3)中肺癌不同亚型样本时，所述A类型样本和所述B类型样本具体可为肺腺癌样本、肺鳞癌样本和小细胞肺癌样本中的任意两种。

在上述各方面中，当所述A类型样本和所述B类型样本为(C4)中肺癌不同分期样本时，所述A类型样本和所述B类型样本具体可为临床I期肺癌样本、临床II肺癌样本和临床III期肺癌样本中的任意两种。

以上任一所述HYAL2基因具体可包括Genbank登录号：NM_003773.5(GI:1519311938)，转录物变体1和Genbank登录号：NM_033158.4(GI:289802999)，转录物变体2。

本发明提供了肺癌患者、胰腺癌患者和食管癌血液中HYAL2基因的低甲基化现象。实验证明，以血液为样本就能够区分癌症(肺癌、胰腺癌和食管癌)患者和无癌对照、区分肺部良性结节和肺癌、区分肺癌不同亚型和不同分期，并且能够区分肺癌和胰腺癌、肺癌和食管癌、胰腺癌和食管癌。本发明对于提高肺癌、胰腺癌和食管早期诊疗效果和降低死亡率均有重要的科学意义和临床应用价值。

附图说明

图1为数学模型示意图。

图2为数学模型举例说明。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的透明质酸酶II(Hyaluronidase-2,HYAL2)基因定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、用于检测HYAL2基因甲基化位点的引物设计

经过大量序列和功能分析，选择了HYAL2基因中的三个片段(HYAL2_A片段、HYAL2_B片段和HYAL2_C片段)进行甲基化水平和癌症相关性分析。

HYAL2_A片段位于hg19参考基因组chr3:50359100-50360435，正义链。

HYAL2_B片段位于hg19参考基因组chr3:50360255-50361540，反义链。

HYAL2_C片段位于hg19参考基因组chr3:50355307-50356296，正义链。

HYAL2_A片段(SEQ ID No.1)中的CpG位点信息如表1所示。

HYAL2_B片段(SEQ ID No.2)中的CpG位点信息如表2所示。

HYAL2_C片段(SEQ ID No.3)中的CpG位点信息如表3所示。

表1 HYAL2_A片段中CpG位点信息

表2 HYAL2_B片段中CpG位点信息

CpG位点	CpG位点在序列中的位置
		HYAL2_B_1	序列2自5’端第231-232位
HYAL2_B_2	序列2自5’端第275-276位
		HYAL2_B_3	序列2自5’端第278-279位
HYAL2_B_4	序列2自5’端第360-361位
		HYAL2_B_5	序列2自5’端第850-851位
HYAL2_B_6	序列2自5’端第873-874位
		HYAL2_B_7	序列2自5’端第898-899位
HYAL2_B_8	序列2自5’端第960-961位
		HYAL2_B_9	序列2自5’端第1143-1144位
HYAL2_B_10	序列2自5’端第1152-1153位
		HYAL2_B_11	序列2自5’端第1169-1170位
HYAL2_B_12	序列2自5’端第1229-1230位
		HYAL2_B_13	序列2自5’端第1244-1245位

表3 HYAL2_C片段中CpG位点信息

CpG位点	CpG位点在序列中的位置
		HYAL2_C_1	序列3自5’端第110-111位
HYAL2_C_2	序列3自5’端第325-326位
		HYAL2_C_3	序列3自5’端第399-400位
HYAL2_C_4	序列3自5’端第427-428位
		HYAL2_C_5	序列3自5’端第453-454位
HYAL2_C_6	序列3自5’端第492-493位
		HYAL2_C_7	序列3自5’端第540-541位
HYAL2_C_8	序列3自5’端第543-544位
		HYAL2_C_9	序列3自5’端第552-553位
HYAL2_C_10	序列3自5’端第576-577位
		HYAL2_C_11	序列3自5’端第613-614位
HYAL2_C_12	序列3自5’端第630-631位
		HYAL2_C_13	序列3自5’端第846-847位
HYAL2_C_14	序列3自5’端第875-876位
		HYAL2_C_15	序列3自5’端第927-928位
HYAL2_C_16	序列3自5’端第963-964位

针对三个片段(HYAL2_A片段、HYAL2_B片段和HYAL2_C片段)设计特异PCR引物，如表4所示。其中，序列4、序列6和序列8为正向引物，序列5、序列7和序列9为反向引物；序列4、序列6和序列8中自5’第1至10位为非特异标签，第11至35位为特异引物序列；序列5、序列7和序列9自5’第1至31位为非特异标签，第32至56位为特异引物序列。引物序列中不包含SNP和CpG位点。

表4 HYAL2甲基化引物序列

实施例2、HYAL2基因甲基化检测及结果分析

一、研究样本

经患者知情同意，共收集722例肺癌患者、152例肺部出现良性结节患者、79例胰腺癌患者、118例食管癌患者和945例无癌对照(无癌对照即现在及曾经均没有患过癌症且没有报告肺部良性结节且血常规指标都在参考范围内)的离体血液样本。

所有患者样本都是手术前收集的且都经过影像学和病理确诊。

肺癌、胰腺癌和食管癌亚型根据病理组织学进行判断。

肺癌分期以AJCC第8版分期系统为判断标准。

722例肺癌患者按照分型划分：肺腺癌619例，肺鳞癌42例，小细胞肺癌49例，其他12例。

722例肺癌患者按照分期划分：I期649例，II期41例，III期32例。

722例肺癌患者按照肺癌肿瘤大小(T)划分：T1603例，T283例，T336例。

722例肺癌患者按照有无肺癌淋巴结浸润(N)划分：无肺癌淋巴结浸润688例，有肺癌淋巴结浸润34例。

79例胰腺癌患者按照分型划分：胰腺导管腺癌63例，其他亚型共计16例。

118例食管癌患者按照分型划分：食管鳞状细胞癌94例，其他亚型共计24例。

无癌对照、良性结节、肺癌、胰腺癌和食管癌患者各自年龄的中位数分别为56、57、58、58和57岁，且这5种群体中各自的男女比例都约为1:1。

二、甲基化检测

1、提取血液样本的总DNA。

2、将步骤1制备的血液样本总DNA进行重亚硫酸盐处理(参照Qiagen的DNA甲基化试剂盒说明书操作)。重亚硫酸盐处理后，未发生甲基化的胞嘧啶(C)被转化成尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶保持不变，即原来CpG位点的C碱基经重亚硫酸盐处理后转化为C或U。

3、以步骤2经过重亚硫酸盐处理的DNA为模板，采用表4中的3对特异引物对通过DNA聚合酶按照常规PCR反应要求的反应体系进行PCR扩增，3对引物都采用相同的常规PCR体系，且3对引物都按照以下程序进行扩增。

PCR反应程序为：95℃，4min→(95℃，20s→56℃，30s→72℃，2min)45个循环→72℃，5min→4℃，1h。

4、取步骤3的扩增产物，通过飞行时间质谱进行DNA甲基化分析，具体方法如下：

(1)向5μl PCR产物中加入2μl虾碱性磷酸盐(SAP)溶液(0.3ml SAP[0.5U]+1.7mlH₂O)然后按照以下程序在PCR仪中孵育(37℃,20min→85℃,5min→4℃,5min)；

(2)取出2μl步骤(1)得到的SAP处理后的产物，根据说明书加入5μl T-Cleavage反应体系中，然后在37℃孵育3h；

(3)取步骤(2)的产物，加入19μl去离子水，再用6μg Resin在旋转摇床进行去离子化孵育1h；

(4)2000rpm室温离心5min，将微量上清由Nanodispenser机械手臂上样384SpectroCHIP；

(5)飞行时间质谱分析；获得的数据用SpectroACQUIRE v3.3.1.3软件收集，通过MassArray EpiTyper v1.2软件实现可视化。

上述飞行时间质谱检测使用的试剂均来试剂盒(T-Cleavage MassCLEAVEReagent Auto Kit，货号：10129A)；上述飞行时间质谱检测使用的检测仪器为

Analyzer Chip Prep Module 384，型号：41243；上述数据分析软件为检测仪器自带软件。

5、对步骤4得到的数据进行分析。

数据统计分析由SPSS Statistics 23.0进行。

非参数检验用于两组之间的比较分析。

多个CpG位点的组合对于不同样品分组的鉴别效果通过逻辑回归和受试者曲线的统计学方法得以实现。

所有的统计检验都是双侧的，P值<0.05被认为具有统计学意义。

通过质谱实验，共获得74个可以区别的甲基化片段的峰图。采用SpectroACQUIREv3.3.1.3软件根据含甲基化片段的峰和非甲基化片段的峰面积比较，计算甲基化水平(SpectroACQUIRE v3.3.1.3软件可自动通过计算峰面积得到每个样本在每个CpG位点的甲基化水平)。

三、结果分析

1、无癌对照、良性结节和肺癌血液中HYAL2基因甲基化水平

以722位肺癌患者、152位肺部出现良性结节患者和945名无癌对照的血液为研究材料进行分析HYAL2基因中所有CpG位点的甲基化水平(表5)。结果表明，HYAL2基因中所有CpG位点在无癌对照组中甲基化水平的中位数为0.52(IQR＝0.36-0.63)，良性结节中甲基化水平中位数为0.45(IQR＝0.29-0.58)，肺癌患者中甲基化水平中位数为0.47(IQR＝0.30-0.59)。

2、血液中HYAL2基因甲基化水平可以区分无癌对照和肺癌患者

通过比较分析722位肺癌患者和945名无癌对照的HYAL2基因的甲基化水平，结果发现肺癌患者HYAL2基因中所有CpG位点甲基化水平显著低于无癌对照(p<0.05，表6)。此外，肺癌不同亚型(肺腺癌，肺鳞癌，小细胞肺癌)中HYAL2基因所有CpG位点的甲基化水平分别都与无癌对照有显著性差异。肺癌不同分期(临床I期、II-III期)中HYAL2基因所有CpG位点的甲基化水平分别都与无癌对照有显著性差异。此外，无淋巴浸润的肺癌患者和有淋巴浸润的肺癌患者的甲基化水平分别与无癌对照之间有显著性差异(p<0.05)。因此，HYAL2基因的甲基化水平可以用于肺癌的临床诊断，尤其可用于肺癌的早期诊断。

3、血液中HYAL2基因甲基化水平可以区分肺部良性结节和肺癌患者

通过比较分析722位肺癌患者和152名良性结节中HYAL2基因的甲基化水平，结果发现良性结节患者中HYAL2基因所有CpG位点甲基化水平显著低于肺癌患者(p<0.05，表7)。此外还发现肺癌不同亚型(肺腺癌，肺鳞癌，小细胞肺癌)、不同临床时期(I期或II-III期)和有无淋巴浸润的肺癌患者的HYAL2基因中所有CpG的甲基化水平分别都与良性结节有显著性差异。因此，HYAL2基因的甲基化水平可应用于区分肺癌患者和良性结节患者，是非常有潜在价值的标志物。

4、血液中HYAL2基因甲基化水平区分肺癌不同亚型或者肺癌不同分期

通过比较分析不同亚型肺癌患者(肺腺癌，肺鳞癌，小细胞肺癌)和945名无癌对照中HYAL2基因的甲基化水平，发现HYAL2基因中所有CpG位点甲基化水平分别在肺癌不同亚型(肺腺癌患者，肺鳞癌患者，小细胞肺癌患者)、肺癌肿瘤大小(T1、T2和T3)、肺癌不同分期(临床I期、II期和III期)、有无淋巴结浸润条件下存在显著性差异(p<0.05，表8)。因此，HYAL2基因的甲基化水平可以用于区分肺癌不同亚型或者肺癌不同分期。

5、血液中HYAL2甲基化水平可以区分胰腺癌患者和无癌对照

以79名胰腺癌患者和945名无癌对照的血液为研究材料进行分析两者之间的HYAL2基因所有CpG位点的甲基化水平差异(表9)，其中79名胰腺癌患者中有63例为胰腺导管腺癌。79名胰腺癌患者中所有目标CpG位点的甲基化水平中位数为0.43(IQR＝0.28-0.55)，无癌对照组甲基化水平中位数为0.52(IQR＝0.36-0.63)，胰腺癌患者中HYAL2基因所有CpG位点甲基化水平显著低于无癌对照(p<0.0001)。63位胰腺导管腺癌患者所有目标CpG位点甲基化水平的中位数为0.42(IQR＝0.28-0.55)，且甲基化水平显著低于无癌对照(p<0.0001)。因此，HYAL2基因的甲基化水平可以用于胰腺癌的临床诊断。

6、血液中HYAL2甲基化水平可以区分食管患者和无癌对照

以118名食管癌患者和945名无癌对照的血液为研究材料进行分析食管癌患者和无癌对照之间的HYAL2甲基化水平差异(表10)，118位食管癌中包括94位食管鳞状细胞癌。结果表明，食管癌患者中所有目标CpG位点的甲基化水平中位数为0.44(IQR＝0.29-0.56)，无癌对照组甲基化水平中位数为0.52(IQR＝0.36-0.63)，食管癌患者中HYAL2基因所有CpG位点甲基化水平显著低于无癌对照(p<0.0001)。食管鳞状细胞癌中所有CpG位点甲基化水平的中位数为0.44(IQR＝0.28-0.56)，且甲基化水平显著低于无癌对照(p<0.0001，表10)。因此，HYAL2基因的甲基化水平可以用于食管癌的临床诊断。

7、血液中HYAL2甲基化水平可以区分胰腺癌患者和肺癌患者

以79名胰腺癌患者和722名肺癌患者的血液为研究材料进行分析胰腺癌患者和肺癌患者血液中HYAL2基因的甲基化水平差异(表11)。结果表明，胰腺癌患者中所有CpG位点的甲基化水平中位数为0.43(IQR＝0.28-0.55)，肺癌患者甲基化水平中位数为0.47(IQR＝0.30-0.59)，胰腺癌患者中所有CpG位点甲基化水平显著低于肺癌患者(p<0.05)。因此，HYAL2基因的甲基化水平可以用于区分胰腺癌和肺癌患者。

8、血液中HYAL2甲基化水平可以区分食管癌患者和肺癌患者

以118名食管癌患者和722名肺癌患者的血液为研究材料进行分析食管癌患者和肺癌患者血液中HYAL2基因的甲基化水平差异(表11)。结果表明，食管癌患者中所有目标CpG位点的甲基化水平中位数为0.44(IQR＝0.29-0.56)，肺癌患者甲基化水平中位数为0.47(IQR＝0.30-0.59)，食管癌患者中所有CpG位点甲基化水平显著低于肺癌患者(p<0.05)。因此，HYAL2基因的甲基化水平可以用于区分食管癌和肺癌患者。

9、血液中HYAL2甲基化水平可以区分胰腺癌患者和食管癌患者

分析79名胰腺癌患者和118名食管癌患者的血液中HYAL2基因的甲基化水平差异(表11)。结果表明，胰腺癌患者中所有目标CpG位点的甲基化水平中位数为0.43(IQR＝0.28-0.55)，食管癌患者中所有目标CpG位点的甲基化水平中位数为0.44(IQR＝0.29-0.56)，胰腺癌患者中所有CpG位点甲基化水平显著低于食管癌患者(p<0.05)。因此，HYAL2基因的甲基化水平可以用于区分胰腺癌患者和食管癌患者。

10、用于辅助癌症诊断的数学模型的建立

本发明建立的数学模型可以用于达到如下目的：

(1)区分肺癌患者和无癌对照；

(2)区分肺癌患者和肺良性结节患者；

(3)区分胰腺癌患者和无癌对照；

(4)区分食管癌患者和无癌对照；

(5)区分胰腺癌患者和肺癌患者；

(6)区分食管癌患者和肺癌患者；

(7)区分胰腺癌患者和食管癌患者；

(8)区分肺癌不同亚型；

(9)区分肺癌不同分期。

数学模型的建立方法如下：

(A)数据来源：步骤一中列出的722例肺癌患者、152例肺部出现良性结节患者、79例胰腺癌患者、118例食管癌患者和945例无癌对照的离体血液样本的目标CpG位点(表1-表3中的一种或多种的组合)甲基化水平(检测方法同步骤二)。

数据可根据实际需要加入年龄、性别、白细胞计数等已知参数来提高判别效率。

(B)模型建立

根据需要选取任意两类不同类型患者数据即训练集(例如：无癌对照和肺癌患者、无癌对照和胰腺癌患者、无癌对照和食管癌患者、肺良性结节患者和肺癌患者、肺癌患者和胰腺癌患者、肺癌患者和食管癌患者、食管癌患者和胰腺癌患者，肺腺癌和肺鳞癌患者，肺腺癌和小细胞肺癌患者，肺鳞癌和小细胞肺癌患者，I期肺癌和II期肺癌患者，I期肺癌和III期肺癌患者，II期肺癌和III期肺癌患者)作为用于建立模型的数据，使用SAS，R，SPSS等统计软件使用二分类逻辑回归的统计方法通过公式建立数学模型。数学模型公式计算出的最大约登指数对应的数值为阈值或直接设定0.5为阈值，待测样品经过测试和代入模型计算后得到的检测指数大于阈值归为一类(B类)，小于阈值归为另外一类(A类)，等于阈值作为不确定的灰区。在对新的待测样品进行预测来判断属于哪一类时，首先通过DNA甲基化的测定方法检测该待测样品HYAL2基因上一个或者多个CpG位点的甲基化水平，然后将这些甲基化水平的数据代入上述数学模型，计算得到所述待测样本对应的检测指数，然后比较所述待测样本对应的检测指数和阈值的大小，根据比较结果确定所述待测样本属于哪一类样本。

举例：如图1所示，将训练集中HYAL2基因单个CpG位点的甲基化水平或者多个CpG位点组合的甲基化水平的数据通过SAS、R、SPSS等统计软件使用二分类逻辑回归的公式建立用于区分A类和B类的数学模型。该数学模型在此为二类逻辑回归模型，具体为：log(y/(1-y))＝b0+b1x1+b2x2+b3x3+….+bnXn，其中y为因变量即将待测样品的一个或者多个甲基化位点的甲基化值代入模型以后得出的检测指数，b0为常量，x1～xn为自变量即为该测试样品的一个或者多个甲基化位点的甲基化值(每一个值为0～1之间的数值)，b1～bn为模型赋予每一个位点甲基化值的权重。具体应用时，先根据训练集中已经检测的样本的一个或者多个DNA甲基化位点的甲基化程度(x1～xn)及其已知的分类情况(A类或者B类，分别对y赋值0和1)建立数学模型，由此确定该数学模型的常量b0以及各个甲基化位点的权重b1～bn，并由该数学模型计算出的以最大约登指数对应的数值为阈值或直接设定0.5为划分的阈值。待测样品经过测试和代入模型计算后得到的检测指数即y值大于阈值归为B类，小于阈值归为A类，等于阈值作为不确定的灰区。其中A类和B类为相对应的两分类(二分类的分组，哪一组A类，哪一组是B类，要根据具体的数学模型来确定，在此不做约定)，比如无癌对照和肺癌患者、无癌对照和胰腺癌患者、无癌对照和食管癌患者、肺良性结节患者和肺癌患者、肺癌患者和胰腺癌患者、肺癌患者和食管癌患者、食管癌患者和胰腺癌患者，肺腺癌和肺鳞癌患者，肺腺癌和小细胞肺癌患者，肺鳞癌和小细胞肺癌患者，I期肺癌和II期肺癌患者，I期肺癌和III期肺癌患者，II期肺癌和III期肺癌患者。对受试者的样品进行预测来判断属于哪一类时，首先采集受试者的血液，然后从中提取DNA。将提取的DNA通过重亚硫酸盐转化后，用DNA甲基化的测定方法对受试者的HYAL2基因的单个CpG位点的甲基化水平或者多个CpG位点组合的甲基化水平进行检测，然后将检测得到的甲基化数据代入上述数学模型。如果该受试者的HYAL2基因一个或者多个CpG位点的甲基化水平代入上述数学模型后计算出来的值即检测指数大于阈值，则该受试者判定与训练集中检测指数大于阈值的归属一类(B类)；如果该受试者的HYAL2基因一个或者多个CpG位点的甲基化水平数据代入上述数学模型后计算出来的值即检测指数小于阈值，则该受试者跟训练集中检测指数小于阈值的归属一类(A类)；如果该受试者的HYAL2基因一个或者多个CpG位点的甲基化水平数据代入上述数学模型后计算出来的值即检测指数等于阈值，则不能判断该受试者是A类还是B类。

举例：图2的示意图举例说明HYAL2_B的优选CpG位点(HYAL2_B_5,HYAL2_B_6,HYAL2_B_7和HYAL2_B_8)的甲基化以及数学建模在用于肺部良恶性结节判别的应用：将肺癌患者和肺良性结节患者训练集(在此为：722名肺癌患者和152位肺良性结节患者)中已经检测的HYAL2_B_5,HYAL2_B_6,HYAL2_B_7和HYAL2_B_8这4个CpG位点组合的甲基化水平的数据以及患者的年龄、性别(男性赋值为1，女性赋值为0)、白细胞计数通过R软件使用二分类逻辑回归的公式建立用于区分肺癌患者和肺良性结节患者的数学模型。该数学模型在此为二类逻辑回归模型，由此确定该数学模型的常量b0以及各个甲基化位点的权重b1～bn，在此例中具体为：log(y/(1-y))＝-1.09-0.707*HYAL2_B_5-3.181*HYAL2_B_6-6.182*HYAL2_B_7+9.760*HYAL2_B_8+0.021*年龄-0.841*性别(男性赋值为1，女性赋值为0)-0.019*白细胞个数，其中y为因变量即将待测样品的4个甲基化位点的甲基化值以及年龄、性别、白细胞计数代入模型以后得出的检测指数。在设定0.5为阈值的情况下，待测样品的HYAL2_B_5,HYAL2_B_6,HYAL2_B_7和HYAL2_B_8这4个CpG位点的甲基化水平经过测试后连同其年龄、性别、白细胞计数的信息代入模型进行计算，得到的检测指数即y值大于0.5归为肺癌患者，小于0.5归为肺良性结节患者，等于0.5则不确定为肺癌患者还是肺良性结节患者。此模型的曲线下面积(AUC)计算结果为0.65(表15)。具体受试者判断方法举例如图2所示，从两位受试者(甲，乙)分别采集血液提取DNA，将提取的DNA通过重亚硫酸盐转化后，用DNA甲基化的测定方法对受试者的HYAL2_B_5,HYAL2_B_6,HYAL2_B_7和HYAL2_B_8这4个CpG位点的甲基化水平进行检测。然后将检测得到的甲基化水平数据连同受试者的年龄、性别和白细胞计数的信息代入上述数学模型。甲受试者经数学模型后计算出来的值为0.84大于0.5，则甲受试者判定为肺癌患者(与临床判定结果相符)；乙受试者的HYAL2基因一个或者多个CpG位点的甲基化水平数据代入上述数学模型后计算出来的值为0.18小于0.5，则乙受试者判定肺良性结节患者(与临床判定结果相符)。

(C)模型效果评价

根据上述方法，分别建立用于区分肺癌患者和无癌对照、肺癌患者和良性结节患者、胰腺癌患者和无癌对照、无癌对照和食管癌患者、肺癌患者和胰腺癌患者、肺癌患者和食管癌患者、胰腺癌患者和食管癌患者、肺腺癌和肺鳞癌患者，肺腺癌和小细胞肺癌患者，肺鳞癌和小细胞肺癌患者，I期肺癌和II期肺癌患者，I期肺癌和III期肺癌患者，II期肺癌和III期肺癌患者的数学模型，并且通过受试者曲线(ROC曲线)对其有效性进行评价。ROC曲线得出的曲线下面积(AUC)越大，说明模型的区分度越好，分子标志物越有效。采用不同CpG位点进行数学模型构建后的评价结果如表12、表13和表14所示。表12、表13和表14中，1个CpG位点代表HYAL2_B扩增片段中任意一个CpG位点的位点，2个CpG位点代表HYAL2_B中任意2个CpG位点的组合，3个CpG位点代表HYAL2_B中任意3个CpG位点的组合，……以此类推。表中的数值为不同位点组合评价结果的范围值(即任意个CpG位点组合方式的结果均在此范围内)。

上述结果显示，HYAL2基因对于各组的鉴别能力(肺癌患者和无癌对照，肺癌患者和肺良性结节患者，胰腺癌患者和无癌对照，食管癌患者和无癌对照，胰腺癌患者和肺癌患者，食管癌患者和肺癌患者，胰腺癌患者和食管癌患者，肺腺癌和肺鳞癌患者，肺腺癌和小细胞肺癌患者，肺鳞癌和小细胞肺癌患者，I期肺癌和II期肺癌患者，I期肺癌和III期肺癌患者，II期肺癌和III期肺癌患者随着位点数的增加而增加。

除此以外，在表1-表3所示的CpG位点中，还存在少数几个优选位点的组合比多个非优选位点组合的鉴别能力更好的情况。例如表15、表16和表17所示的HYAL2_B_5,HYAL2_B_6,HYAL2_B_7,HYAL2_B_8这4个CpG位点的组合是HYAL2_B中任意四个组合的优选位点。

综上所述，HYAL2基因上的CpG位点及其各种组合，HYAL2_A片段上的CpG位点及其各种组合，HYAL2_B片段上的CpG位点及其各种组合，HYAL2_B片段上HYAL2_B_5,HYAL2_B_6,HYAL2_B_7,HYAL2_B_8位点及其各种组合，HYAL2_C片段上的CpG位点及其各种组合，以及HYAL2_A、HYAL2_B和HYAL2_C上的CpG位点及其各种组合的甲基化水平都对肺癌患者和无癌对照，肺癌患者和肺良性结节患者，胰腺癌患者和无癌对照，食管癌和无癌对照，胰腺癌患者和肺癌患者，食管癌患者和肺癌患者，胰腺癌患者和食管癌患者，肺腺癌和肺鳞癌患者，肺腺癌和小细胞肺癌患者，肺鳞癌和小细胞肺癌患者，I期肺癌和II期肺癌患者，I期肺癌和III期肺癌患者，II期肺癌和III期肺癌患者有判别能力。

表5比较无癌对照、良性结节患者和肺癌患者的甲基化水平

表6比较无癌对照和肺癌患者的甲基化水平差异

表7比较良性结节患者和肺癌患者的甲基化水平差异

表8比较肺癌不同亚型患者或者肺癌不同分期患者的甲基化水平差异

表9比较无癌对照和胰腺癌患者的甲基化水平差异

表10比较无癌对照和食管癌患者的甲基化水平差异

表11比较肺癌患者、胰腺癌患者及食管癌患者的甲基化水平差异

表12 HYAL2的CpG位点及其自由组合用于区分肺癌患者和无癌对照、肺癌患者和良性结节患者、胰腺癌患者和无癌对照、肺癌患者和胰腺癌患者

表13 HYAL2_B的CpG位点及其自由组合用于区分食管癌患者和无癌对照、食管癌患者和胰腺癌患者、食管癌患者和肺癌患者

表14 HYAL2_B的CpG位点及其自由组合用于区分肺腺癌和肺鳞癌患者、肺腺癌和小细胞肺癌患者、肺鳞癌和小细胞肺癌患者、肺癌I期和肺癌II期、肺癌I期和肺癌III期、肺癌II期和肺癌III期癌患者

表15 HYAL2_B的优选CpG位点及其自由组合用于区分肺癌患者和无癌对照、肺癌患者和良性结节患者、胰腺癌患者和无癌对照、肺癌患者和胰腺癌患者

表16 HYAL2_B的优选CpG位点及其自由组合用于区分食管癌患者和无癌对照、食管癌患者和胰腺癌患者、食管癌患者和肺癌患者

表17 HYAL2_B的优选CpG位点及其自由组合用于区分肺腺癌和肺鳞癌患者、肺腺癌和小细胞肺癌患者、肺鳞癌和小细胞肺癌患者、肺癌I期和肺癌II期、肺癌I期和肺癌III期、肺癌II期和肺癌III期癌患者

序列表

<110> 南京腾辰生物科技有限公司

<120> 用于辅助诊断癌症的透明质酸酶甲基化标志物及试剂盒

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1336

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

gctttctatg ggagtctcag ccacgagcgc cagtcagcct gaaatgtttc ccctgcagcc 60

cgaggccggt ggttcagtcc tcccagctcc gcggcgccgc cagcccttta aagagacagt 120

gtgagggaca aggcaggggg acgggaaggg gggggggggg aataggagga ggcgttgccc 180

cgttcggcca tcaggaggtg ctgtggtact ccgaggttgg cagggggcag caccagatct 240

ggctctgcac cccctaacgt agacgccagc cgtgggtccc ctttgtgtgg aaaaagggac 300

tttgacctga ggcgacctct ggtctcctgg agagtagtgc cccgcctccc acgaatcagg 360

ggcccccttc tctggtccgc cgtctaaagg gaggccccgc cccctgccag actgagggaa 420

ggggccaagc accgcttctt agccggccca ggaagggccg aggcagtcgt tatcctggca 480

gcccggctct gggtcgcggc gtggccgcag ggttggggtc agggaagctc agaggggtct 540

aggaggttgg ccgcccctct ccctgactcg catcagggcg ggacagtcat ccctgagatc 600

ccgtcctttt ctgcccagtc tctgaggtcc tttgggagcc cggctccctc tcaaccccga 660

ggaggcctcc attccttgca gcagtttctg gctggacctc cgagaaagcc agcaagaggg 720

gtctcccagg gcctccatcc cgtatccagc gccccctacg ctccacaggc ctctcccggt 780

ggggggcagg cttagaccct ggcgagcccc gtgcgaaacc acctcggctc ttcctaggtc 840

cgctcccttg tgcgagactc aactcccaaa agggcccgcg tctgcaccac cagcccctaa 900

ccctcccggg cgccaggaga gggagggagt gcaactgcga gcgcatctgt gggggtgcag 960

accagccgtc tgctctgggc tcacctgtgt gggagtccgt cggcccagta ggtcggtggc 1020

ctccctcctt cctggggtga gcctctccag ctaggctact tgcgccagct gctgcccgtt 1080

gggcagctcg ccgaggactt gataaacccc attccctccc atccgctccc gcctcccatc 1140

ccagcccttt ctcctcactt cctgctgccc cctgagagga aagggccagg aacaggcgtg 1200

ggggaggaga tcgccttgac cctgtttccc tccagaatgc cctgctggct ggctgccctc 1260

cccacccttc ccgagtagga tctggccccg ccagctgcgc caggtgacag gaaggctatg 1320

ggctcaggat caggtg 1336

<210> 2

<211> 1286

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

gtcaaggcta gggcaggatc accatatcca gcctggactt gcagttctgt ggggtgcctc 60

cccatacccc cataagatgc caaacatgag gccctgtcat cctccatggt ccccctctac 120

tggctgttca aggcccaggg ctctcccatg ccagatagca tcctgtctcc taccaccact 180

gtcccagcct gagggaactc cctgtgctgg gcctacccag ctgaccccat cgctggaaac 240

aatgggggtc aggcaacact tccccactct ctcccgccgg gctgtgctca cttccttcct 300

gctggctgcc tgaggaagtg tccctgccct gggacagtct ggcctagcct ttgtttcccc 360

gggggtcccc acccatggag ctttcaaggc ttctggcccc tgtgaagcca gcacagtggt 420

acagggacac tgcaccttcc cctaccatgt cttggactcc ttggtcctca gggccagact 480

cctgggtatt cacctacccc tcacacagcc ttctgttggg ggagaggctc ctgggcattg 540

ggccattggg ttgttgaggg gttggctctg ggtgatttga gggtaggtag atttgcaccc 600

ctggagaggt ctgctggaac cttgctgcag tcctccctag ggccagccac aggaacaccc 660

ctcccagagg agtatacccc tttcctcatc catgttgtaa ggagccccct actctgtata 720

gtggactctg aaatccatcc aggaatgaac tccagcagga aagcactctg cagaaccctc 780

ccagtccatc ccctcctccc caacccacac agtcacactc actaacacat tgtcctgtca 840

cacaggatgc ggaagctctc agtggaaaaa aacggactca gctactggaa gtccccccga 900

ccctcccccc aaggctagtt cccttcttgg gcacctgctc tgggggacca tcagctgaac 960

gacccccaag tattttgact cccaaaagca ccaccacctg accccatcct ctcacaccct 1020

actggatttg aggatgggcc ccaatcctag ggaaggagtg aagaggttcc ctagtgttgg 1080

aagctgtggg tgtgggggag attggcacct gatcctgagc ccatagcctt cctgtcacct 1140

ggcgcagctg gcggggccag atcctactcg ggaagggtgg ggagggcagc cagccagcag 1200

ggcattctgg agggaaacag ggtcaaggcg atctcctccc ccacgcctgt tcctggccct 1260

ttcctctcag ggggcagcag gaagtg 1286

<210> 3

<211> 990

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

aagggagtag ggtcaggtcc tccccagccc agctgtaccc tccttcccct ctggcaggga 60

gagaaggggc ctcccaggga cttcccctcc cccttagaac aggggggtgc gagctggtat 120

ggatgccctc ctgggcttcc tgggggctct gcccactcca gactccagtt tgtccacccc 180

ctgcagggtc ctacatgcct aagagagccc ttgtggtaga ggccagcttg ctaggcagct 240

aggcaggaga cccctacaag gtccaggtaa aggccagggc tgccagagcc agcagactgg 300

tgaggtggga cccagcccag gcctcgctgg cacctccagc tgcctgccta tggtcccact 360

ggcattgctc accactccag cccaagtagc actggcagcg gaagtgtgtc tgcaggtggt 420

caatgtcggc ccaactgagc tcccccacag gtcgcagctg gggttcacca ggtgcatggc 480

caggcactag gcggaaactg ttggtgctga gatgcaggaa ggtactggca ctggggttgc 540

ggcgcacaca gcgcccatgg ccatggcact gggcccggct gcaatattgg gtggcccagg 600

acacattgac cacgtagggg accagcagcc gtgtcaggta atctttgagg tactggcagg 660

tctcctggag gcagaagaca aggaccacag gtcagggtca gctgcctcag cccacaggcc 720

cagatggaaa ctgtgtccac actgtgatga ctatacctta ttttaactgc acacattcat 780

acattcaatc tgcacctgag ccacacagtc cctgctcctg ctgagaagtg ggtgggggta 840

cagaccggaa cccagttggg cagatgggga agggcggaac tcaacagctg ttcaggacag 900

catttcctct ttcctgagag cagggccggg gtgacctcct cctgttgcca ccagggatgc 960

ctcgggtggg agacagacaa ggggaccaga 990

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aggaagagag gttttttatg ggagttttag ttatg 35

<210> 5

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cagtaatacg actcactata gggagaaggc tcacctaatc ctaaacccat aacctt 56

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aggaagagag gttaaggtta gggtaggatt attat 35

<210> 7

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cagtaatacg actcactata gggagaaggc tcacttccta ctacccccta aaaaaa 56

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aggaagagag aagggagtag ggttaggttt ttttt 35

<210> 9

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cagtaatacg actcactata gggagaaggc ttctaatccc cttatctatc tcccac 56

Claims

1.甲基化HYAL2基因作为标志物在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下中的至少一种：

(1)辅助诊断癌症或预测癌症患病风险；

(2)辅助区分良性结节和癌症；

(3)辅助区分癌症不同亚型；

(4)辅助区分癌症不同分期；

(5)辅助诊断肺癌或预测肺癌患病风险；

(6)辅助区分肺部良性结节和肺癌；

(7)辅助区分肺癌不同亚型；

(8)辅助区分肺癌不同分期；

(9)辅助诊断胰腺癌或预测胰腺癌患病风险；

(10)辅助诊断食管癌或预测食管癌患病风险；

(11)辅助区分肺癌和胰腺癌；

(12)辅助区分肺癌和食管癌；

(13)辅助区分胰腺癌和食管癌；

(14)确定待测物对癌症的发生是否存在阻碍或促进作用。

2.用于检测HYAL2基因甲基化水平的物质在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下中的至少一种：

(1)辅助诊断癌症或预测癌症患病风险；

(2)辅助区分良性结节和癌症；

(3)辅助区分癌症不同亚型；

(4)辅助区分癌症不同分期；

(5)辅助诊断肺癌或预测肺癌患病风险；

(6)辅助区分肺部良性结节和肺癌；

(7)辅助区分肺癌不同亚型；

(8)辅助区分肺癌不同分期；

(9)辅助诊断胰腺癌或预测胰腺癌患病风险；

(10)辅助诊断食管癌或预测食管癌患病风险；

(11)辅助区分肺癌和胰腺癌；

(12)辅助区分肺癌和食管癌；

(13)辅助区分胰腺癌和食管癌；

(14)确定待测物对癌症的发生是否存在阻碍或促进作用。

3.用于检测HYAL2基因甲基化水平的物质和储存有数学模型建立方法和/或使用方法的介质在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下中的至少一种：

(1)辅助诊断癌症或预测癌症患病风险；

(2)辅助区分良性结节和癌症；

(3)辅助区分癌症不同亚型；

(4)辅助区分癌症不同分期；

(5)辅助诊断肺癌或预测肺癌患病风险；

(6)辅助区分肺部良性结节和肺癌；

(7)辅助区分肺癌不同亚型；

(8)辅助区分肺癌不同分期；

(9)辅助诊断胰腺癌或预测胰腺癌患病风险；

(10)辅助诊断食管癌或预测食管癌患病风险；

(11)辅助区分肺癌和胰腺癌；

(12)辅助区分肺癌和食管癌；

(13)辅助区分胰腺癌和食管癌；

(14)确定待测物对癌症的发生是否存在阻碍或促进作用；

所述数学模型按照包括如下步骤的方法获得：

(A1)分别检测n1个A类型样本和n2个B类型样本的HYAL2基因甲基化水平；

(A2)取步骤(A1)获得的所有样本的HYAL2基因甲基化水平数据，按照A类型和B类型的分类方式，通过二分类逻辑回归法建立数学模型，确定分类判定的阈值；

所述数学模型的使用方法包括如下步骤：

(B1)检测待测样本的HYAL2基因甲基化水平；

(B2)将步骤(B1)获得的所述待测样本的HYAL2基因甲基化水平数据代入所述数学模型，得到检测指数；然后比较检测指数和阈值的大小，根据比较结果确定所述待测样本的类型是A类型还是B类型；

所述A类型样本和所述B类型样本为如下中的任一种：

(C1)肺癌样本和无癌对照；

(C2)肺癌样本和肺良性结节样本；

(C3)肺癌不同亚型样本；

(C4)肺癌不同分期样本；

(C5)肺癌样本和食管癌样本；

(C6)肺癌样本和胰腺癌样本；

(C7)胰腺癌样本和食管癌样本；

(C8)胰腺癌样本和无癌对照；

(C9)食管癌样本和无癌对照。

4.储存有数学模型建立方法和/或使用方法的介质在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下中的至少一种：

(1)辅助诊断癌症或预测癌症患病风险；

(2)辅助区分良性结节和癌症；

(3)辅助区分癌症不同亚型；

(4)辅助区分癌症不同分期；

(5)辅助诊断肺癌或预测肺癌患病风险；

(6)辅助区分肺部良性结节和肺癌；

(7)辅助区分肺癌不同亚型；

(8)辅助区分肺癌不同分期；

(9)辅助诊断胰腺癌或预测胰腺癌患病风险；

(10)辅助诊断食管癌或预测食管癌患病风险；

(11)辅助区分肺癌和胰腺癌；

(12)辅助区分肺癌和食管癌；

(13)辅助区分胰腺癌和食管癌；

(14)确定待测物对癌症的发生是否存在阻碍或促进作用；

所述数学模型按照包括如下步骤的方法获得：

所述数学模型的使用方法包括如下步骤：

(B1)检测待测样本的的HYAL2基因甲基化水平；

(B2)将步骤(B1)获得的所述待测样本的的HYAL2基因甲基化水平数据代入所述数学模型，得到检测指数；然后比较检测指数和阈值的大小，根据比较结果确定所述待测样本的类型是A类型还是B类型；

所述A类型样本和所述B类型样本为如下中的任一种：

(C1)肺癌样本和无癌对照；

(C2)肺癌样本和肺良性结节样本；

(C3)肺癌不同亚型样本；

(C4)肺癌不同分期样本；

(C5)肺癌样本和食管癌样本；

(C6)肺癌样本和胰腺癌样本；

(C7)胰腺癌样本和食管癌样本；

(C8)胰腺癌样本和无癌对照；

(C9)食管癌样本和无癌对照。

5.试剂盒，包括用于检测HYAL2基因甲基化水平的物质；所述试剂盒的用途为如下中的至少一种：

(1)辅助诊断癌症或预测癌症患病风险；

(2)辅助区分良性结节和癌症；

(3)辅助区分癌症不同亚型；

(4)辅助区分癌症不同分期；

(5)辅助诊断肺癌或预测肺癌患病风险；

(6)辅助区分肺部良性结节和肺癌；

(7)辅助区分肺癌不同亚型；

(8)辅助区分肺癌不同分期；

(9)辅助诊断胰腺癌或预测胰腺癌患病风险；

(10)辅助诊断食管癌或预测食管癌患病风险；

(11)辅助区分肺癌和胰腺癌；

(12)辅助区分肺癌和食管癌；

(13)辅助区分胰腺癌和食管癌；

(14)确定待测物对癌症的发生是否存在阻碍或促进作用。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有权利要求3或4中所述的储存有数学模型建立方法和/或使用方法的介质。

7.系统，包括：

(D1)用于检测HYAL2基因甲基化水平的试剂和/或仪器；

(D2)装置，所述装置包括单元A和单元B；

所述数据比较模块用于将所述检测指数与阈值进行比较；

所述A类型样本和所述B类型样本为如下中的任一种：

(C1)肺癌样本和无癌对照；

(C2)肺癌样本和肺良性结节样本；

(C3)肺癌不同亚型样本；

(C4)肺癌不同分期样本；

(C5)肺癌样本和食管癌样本；

(C6)肺癌样本和胰腺癌样本；

(C7)胰腺癌样本和食管癌样本；

(C8)胰腺癌样本和无癌对照；

(C9)食管癌样本和无癌对照。

8.根据权利要求1-7中任一所述的应用或试剂盒或系统，其特征在于：所述“HYAL2基因甲基化水平”为HYAL2基因中如下(e1)-(e6)所示片段中全部或部分CpG位点的甲基化水平；所述甲基化HYAL2基因为HYAL2基因中如下(e1)-(e6)所示片段的甲基化：

(e1)SEQ ID No.1所示的DNA分子；

(e2)SEQ ID No.2所示的DNA分子；

(e3)SEQ ID No.3所示的DNA分子；

(e4)与SEQ ID No.1所示的DNA分子具有80％以上同一性的DNA分子；

(e5)与SEQ ID No.2所示的DNA分子具有80％以上同一性的DNA分子；

(e6)与SEQ ID No.3所示的DNA分子具有80％以上同一性的DNA分子。

9.如权利要求8所述的应用或试剂盒或系统，其特征在于：所述“全部或部分CpG位点”为SEQ ID No.2所示的DNA片段中任意1个CpG位点或任意2个CpG位点或任意3个CpG位点或任意4个CpG位点或任意5个CpG位点或任意6个CpG位点或任意7个CpG位点或任意8个CpG位点或任意9个CpG位点或任意10个CpG位点或任意11个CpG位点或任意12个CpG位点或任意13个CpG位点；

或

所述“全部或部分CpG位点”为SEQ ID No.1所示的DNA片段中所有CpG位点和SEQ IDNo.2所示的DNA片段中所有CpG位点；

或

所述“全部或部分CpG位点”为SEQ ID No.2所示的DNA片段中所有CpG位点和SEQ IDNo.3所示的DNA片段中所有CpG位点；

或

所述“全部或部分CpG位点”为SEQ ID No.1所示的DNA片段中所有CpG位点和SEQ IDNo.3所示的DNA片段中所有CpG位点；

或

所述“全部或部分CpG位点”为SEQ ID No.1所示的DNA片段中所有CpG位点、SEQ IDNo.2所示的DNA片段中所有CpG位点和SEQ ID No.3所示的DNA片段中所有CpG位点；

或

所述“全部或部分CpG位点”为SEQ ID No.2所示的DNA片段中如下4个CpG位点中的全部或任意3个或任意2个或任意1个：SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第850-851位所示CpG位点、SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第873-874位所示CpG位点、SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第898-899位所示CpG位点、SEQ ID No.2所示的DNA片段自5’端第960-961位所示CpG位点。

10.根据权利要求1-9中任一所述的应用或试剂盒或系统，其特征在于：所述用于检测HYAL2基因甲基化水平的物质包含用于扩增HYAL2基因全长或部分片段的引物组合；

所述用于检测HYAL2基因甲基化水平的试剂包含用于扩增HYAL2基因全长或部分片段的引物组合；

进一步地，所述部分片段为如下中至少一个片段：

(f1)SEQ ID No.1所示的DNA片段或其包含的DNA片段；

(f2)SEQ ID No.2所示的DNA片段或其包含的DNA片段；

(f3)SEQ ID No.3所示的DNA片段或其包含的DNA片段；