JP2011526487A - 乳癌のゲノムフィンガープリント - Google Patents

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Abstract

本発明は、転移進行性乳癌と診断された個体の予後を判定するためまたは前記個体に適当な処置を選択するためのin vitro方法に関する。特に、本発明は、乳癌と診断された個体の予後と遺伝子発現が関連している遺伝子サインに関する。

Description

発明の詳細な説明
発明の属する技術分野
本発明は、転移進行性乳癌と診断された対象の予後を判定するためまたは前記対象に適した処置を選択するためのin vitro方法に関する。
発明の背景
乳癌は、世界的に２番目に多いタイプの癌（１０．４％、肺癌の次位）であり、癌による死亡原因の第５位（肺癌、胃癌、肝臓癌、および結腸癌の次位）である。世界的に女性の間では乳癌は癌による死亡原因の第１位である。２００５年には、乳癌により世界中で５０２，０００名が死亡した（癌による死亡の７％；総死亡のほぼ１％）。世界的な症例数は１９７０年代以降著しく増加し、この現象は１つには近代西洋のライフスタイルに原因があると考えられる。北米の女性は世界で乳癌の罹患率が最も高い。
男性と女性では乳房は全く同じ組織で構成されているため、乳癌は男性でも発生する。男性の乳癌罹患率は女性のおよそ１００倍低いが、乳癌を有する男性は統計的に女性と同じ生存率であると考えられている。
乳癌はＴＮＭ分類により病期分類される。その予後は病期分類の結果と密接に関連しており、その病期分類は、臨床試験および医療の両方において患者に処置を指定するためにも用いられる。病期分類についての情報は次のとおりである：
・ＴＸ：原発腫瘍を評価することができない。Ｔ０：腫瘍の徴候が認められない。Ｔｉｓ：上皮内癌、非浸潤。Ｔ１：腫瘍が直径２ｃｍ以下である。Ｔ２：腫瘍が直径２ｃｍを超え５ｃｍ未満である。Ｔ３：腫瘍が直径５ｃｍを超えている。Ｔ４：腫瘍の大きさに関わらず、胸壁または皮膚に拡がっている腫瘍、または炎症性乳癌。
・ＮＸ：隣接リンパ節を評価することができない。Ｎ０：癌が局所リンパ節へ進展していない。Ｎ１：癌が１〜３個の腋窩リンパ節または内胸リンパ節へ進展している。Ｎ２：癌が４〜９個の腋窩リンパ節または多数の内胸リンパ節へ進展している。Ｎ３：次のいずれかである：
・癌が１０個以上の腋窩リンパ節へ進展している、あるいは癌が鎖骨下リンパ節へ進展している、あるいは癌が鎖骨上リンパ節へ進展しているまたは癌が腋窩リンパ節を侵し内胸リンパ節へ進展している、あるいは癌が４個以上の腋窩リンパ節を侵し内胸リンパ節でまたはセンチネルリンパ節生検により少量の癌が認められる。
・ＭＸ：遠隔進展（転移）の存在を評価することができない。Ｍ０：遠隔進展が認められない。Ｍ１：遠隔臓器への進展がある、これらの臓器は鎖骨上リンパ節を含まない。
乳癌処置の重要な柱は、腫瘍が局在する場合には外科手術であり、補助ホルモン療法（タモキシフェンまたはアロマターゼ阻害薬を使用）、化学療法、および／または放射線療法を併用することもある。外科手術後の処置（補助療法）についての現在の提言はあるパターンに従う。世界的に行われた多施設共同研究の実際の結果を議論するために、２年ごとに、スイスのザンクトガレン(St. Gallen, Switzerland)で世界会議が開催されているためこのパターンは変更される可能性がある。また、前記パターンは、国立衛生研究所(the National Institute of Health)（ＮＩＨ）の合意基準に従って見直しもされる。これらの基準に基づいて、リンパ節への転移を示していない患者の８５〜９０％を超える割合が補助全身療法を受ける候補であろう。
今日、臨床情報だけに基づいた満足のいく予後の予測指標のセットは確認されていない。過去３０年間にわたって、腫瘍学者は、癌患者の転帰を最適にすることに焦点を合わせてきたが、現在やっと、新たに利用可能な技術によって、患者に合わせた化学療法を設計するために決定された療法の種々の癌患者群に対する影響を予測する目的で、多型、遺伝子の発現レベルおよび遺伝子突然変異を調査することが可能である。Ｏｎｃｏｔｙｐｅ ＤＸなどのＰＣＲアッセイやＭａｍｍａＰｒｉｎｔなどのマイクロアレイアッセイでは、遺伝子発現に基づいて乳癌再発のリスクを予測することができる。２００７年２月に、ＭａｍｍａＰｒｉｎｔアッセイは乳癌指標として初めて食品医薬品局(the Food and Drug Administration)から公式認可を受けた。
ＷＯ０２１０３３２０号公報には、遺伝子マーカー群、特に７０個の遺伝子の発現を解析することによって乳癌患者の予後を予測するための方法が記載されている（表６、８９頁）。Ｄ１には、患者のサンプルから乳癌の予後を判定するための、前記遺伝子の遺伝子発現を検出するためのプローブを含んでなるマイクロアレイも記載されている。
加えて、ＷＯ２００５／０８３４２９号公報には、乳癌の予後診断のための遺伝子マーカーサインを選択するための方法が記載されている。前記文献には、前記方法より選択された遺伝子群の発現を解析することによって乳癌を有する患者の予後を判定するため方法も記載されている。具体的には、前記文献は、７６個の遺伝子マーカーからなる特徴的なサインから乳癌の予後を予測するための遺伝子マーカーの使用に関する。前記文献には、患者のサンプルから乳癌の予後を判定するための、前記７６個遺伝子の遺伝子発現を検出するためのプローブを含んでなるキット、例えばマイクロアレイも記載されている。
そこで、より信頼性の高いサインを得ることができ、これらのサインがより少ない数の遺伝子に基づき得るように、転移に関与する最も関連する遺伝子を同定することが可能な新しい方法を開発する必要がある。前記サインにより、技術水準において記載されている方法よりも効率的に、乳癌に罹患している患者の予後を予測することが可能になる。新しい予後因子の同定は、最適な処置を選択する際の指針となる。
第１の態様において、本発明は、乳癌と診断された対象の予後を判定するためまたは乳癌と診断された対象の処置を選択するためのin vitro方法に関し、その方法は、前記対象の腫瘍組織サンプルにおいて表１および表２に記載の遺伝子の発現レベルを決定することを含んでなり、ここで、基準値に対しての、表１に記載の遺伝子の発現の増加および表２に記載の遺伝子の発現の減少は、予後の悪化または化学療法により処置すべき前記対象であることの指標となる。
第２の態様において、本発明は、表１および表２の遺伝子の発現レベルを検出することが可能な試薬に関する。
別の態様において、本発明は、本発明による少なくとも１つの試薬を含んでなるキットに関する。
別の態様において、本発明は、乳癌と診断された患者の予後診断のためまたは乳癌と診断された対象の処置を選択するための本発明によるキットの使用に関する。
本発明はまた、別の態様において、原発腫瘍の転移傾向を予測するための遺伝子マーカーを選択するための方法にも関し、その方法は、次の工程：
ｉ）腫瘍を自然発生する傾向を示す遺伝子操作非ヒト動物の腫瘍サンプルにおいて遺伝子発現が基準値に対して変化している遺伝子を決定する工程；
ｉｉ）工程ｉ）で同定された遺伝子に対応するヒトの相同遺伝子を同定する工程；および
ｉｉｉ）原発腫瘍から転移を起こしている患者の原発腫瘍サンプルにおける遺伝子発現が、転移を起こしていない患者の原発腫瘍におけるその遺伝子の発現に対して変化している、工程ｉｉ）で同定された遺伝子を選択する工程
を含む。
発明の具体的説明
本発明者らは、プローブとハイブリダイズし、かつその発現が乳癌と診断されたことがある対象の予後と関連している遺伝子のサインを選抜した。前記サインは、乳癌と診断された前記対象に最適な処置を選択するためにも用いることができる。
上述のとおり、ザンクトガレン(St. Gallen)およびＮＩＨの基準では、いくつかの組織学的および臨床的特徴に基づいて患者を高リスクまたは低リスクに分類する。本発明者らは、本発明の前記予後サインにより、前記伝統的方法によるよりも多くの患者が低リスク（すなわち、良好予後）群に割り当てられることを実証した。実際には、本発明者らは、前記臨床基準では臨床的に有意な数の患者が不良予後群に誤って分類されるために、現在の臨床診療において多くの患者が不必要に化学療法を受けていることを示した。
従って、第１の態様において、本発明は、乳癌と診断された対象の予後を判定するためまたは乳癌と診断された対象の処置を選択するためのin vitro方法に関し、その方法は、前記対象の腫瘍組織サンプルにおいて表１および表２に記載の遺伝子の発現レベルを判定することを含み、ここで、基準値に対しての、表１に記載の遺伝子の発現の増加および表２に記載の遺伝子の発現の減少は予後の悪化または化学療法により処置すべき対象であることの指標となる。本発明の特定の実施形態において、前記腫瘍組織サンプルは原発腫瘍サンプルであり、特に、前記腫瘍は乳癌である。よって、例として前記腫瘍組織サンプルは、例えば、外科的切除によって、得た生検サンプルであり得る。
本発明の方法の特定の実施形態において、前記遺伝子は、表１および表２に記載のプローブとハイブリダイズするヌクレオチド配列の遺伝子である。
表１および表２に記載の遺伝子の発現レベルの定量は、前記遺伝子の転写により得られるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から、あるいは、前記遺伝子の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）から行うことができる。従って、特定の実施形態において、表１および表２に記載の遺伝子の発現レベルの定量は、前記遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、または前記ｍＲＮＡのフラグメント、前記遺伝子の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、または前記ｃＤＮＡのフラグメント、またはそれらの混合物の定量を含む。
加えて、本発明の方法は、全ＲＮＡを得る目的のための抽出工程を行うことを含み得、そしてそれは従来技術によって行うことができる(Chomczynski et al., Anal. Biochem., 1987, 162:156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15:532)。
表１および表２のプローブとハイブリダイズするヌクレオチド配列の遺伝子によりコードされるｍＲＮＡまたはそれに対応するｃＤＮＡのレベルを検出し定量するために、事実上いずれの従来法も本発明の範囲内で用いることができる。限定されない例として、前記遺伝子によりコードされるｍＲＮＡのレベルは、従来法、例えば、ｍＲＮＡの増幅と前記ｍＲＮＡ増幅産物の定量を含む方法（例えば電気泳動と染色）を用いることによって、あるいは、ノーザンブロットと好適なプローブの使用（ノーザンブロットと、対象となる遺伝子またはそれに対応するｃＤＮＡのｍＲＮＡに特異的なプローブの使用）、Ｓ１ヌクレアーゼによるマッピング、ＲＴ−ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、マイクロアレイなどによって定量することができる。同様に、表１および表２の遺伝子によりコードされる前記ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡのレベルも従来技術を用いることによって定量することができる；この場合、本発明の方法は、対応するｍＲＮＡの逆転写（ＲＴ）、続いての増幅および前記ｃＤＮＡ増幅産物の定量によって、対応するｃＤＮＡを合成する工程を含む。発現レベルを定量する従来法は、例えば、Sambrook et al., 2001 "Molecular cloning: a Laboratory Manual", 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3に見出せる。
本発明の特定の実施形態において、表１および表２に記載の遺伝子の発現レベルの定量は、定量的多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＤＮＡもしくはＲＮＡアレイによって行われる。
本発明の別の特定の実施形態において、表１および表２に記載の遺伝子の発現レベルの判定は、表３および表４に記載のプローブを含んでなるＤＮＡアレイによって行われる。本発明のより具体的な実施形態において、前記アレイは、表１および表２の遺伝子各々の発現レベルを判定するための、１１プローブからなる少なくとも１つのセットを含んでなる。そのため、前記遺伝子各々の発現レベルを判定するために、前記遺伝子の発現を検出するために用いられる前記１１プローブのシグナルの平均値が計算される。
よって、前記方法は、表１および表２の前記遺伝子の発現レベルを基準値に対して判定することを含む。本発明の特定の実施形態において、前記基準値は、転移を起こしていない患者の原発腫瘍サンプルにおける表１および表２の前記遺伝子の遺伝子発現値である。好ましくは、遺伝子の発現比が基準値に対して少なくとも１．５倍であり、好ましくは、２倍を超え、より好ましくは、３倍、４倍、５倍および１０倍を超える場合にその遺伝子は増加した発現を示すと考えられる。同様に、本発明の特定の実施形態において、遺伝子の発現比が基準値よりも少なくとも１．５倍低い場合にその遺伝子はその基準値に対して減少した発現を示すと考えられる。
本発明の特定の実施形態において、乳癌と診断されたことがある対象の予後の好転または悪化を判定するための前記方法は、表１および表２に記載の遺伝子の前記発現値による比例ハザード回帰分析を行うことを含む。実施例２に示すデータによれば、本発明者らは、この方法により、前記予後診断が、ＲＯＣ曲線によれば感度１００％で特異度最大となる有効性で行われることを実証した。従って、本発明の特定の実施形態において、前記予後の判定は、表１および表２に記載の遺伝子の発現レベルによる前記予後の比例ハザード回帰分析を含む。
本願明細書の実施例２に記載するように、本発明者らは、乳癌と診断された対象の予後を判定するためにＣｏｘ型比例ハザード回帰分析を用いた。前記Ｃｏｘ分析では各遺伝子について回帰係数を割り当て、遺伝子発現が予後変数、例えば転移の発生、と正比例して関係している遺伝子は＞０となり、その発現が前記変数と反比例して関係している場合には、回帰係数は＜０となる。従って、本発明の特定の実施形態において、前記比例ハザード回帰分析はＣｏｘ型分析である。より具体的な実施形態において、遠隔転移は、前記Ｃｏｘ型分析において予後変数として確立されている。好ましい実施形態において、前記遠隔転移は５年または１０年時点での遠隔転移である。
本発明者らは、本発明の方法によって高い感度と特異度で患者の予後を判定することができることを実証した。そこで、本発明者らは、以上に記載した表１および表２の遺伝子の遺伝子発現値から、そして比例ハザード回帰分析のＷａｌｄ統計量の値から、下記式：
（式中、ｘｉは、表１および表２に記載の前記遺伝子各々の発現レベルのｌｏｇ２値であり；ｓｉは、表１および表２に記載の前記遺伝子各々のＣｏｘ型回帰分析のＷａｌｄ統計量の値である）
を適用することにより前記予後を判定することができ、
ここで、得られた値が０より大きいならば、それは前記患者が予後の悪化を呈することまたは前記患者を化学療法により処置すべきであることを示し、そして前記値が０より小さいならば、それは前記患者が良好な予後を呈することまたは前記患者を化学療法により処置する必要がないことを示す、ということを実証した。
Ｗａｌｄ統計量の値とは、統計解析に用いる変数が関連しているかどうかを知るために当業者が慣用する値である。前記値は、Wald A. (1943) (Transactions of the American Mathematical Society. 1943; 54:426-482)およびSilvey (1959) (Silvey SD. Annals of Mathematical Statistics. 1959; 30:389-407)に記載のとおりに計算することができる。
加えて、表１および表２に記載の遺伝子の発現レベルの定量のほかに、前記遺伝子によりコードされるタンパク質の発現レベルも本発明を実践するために定量することができる。よって、特定の実施形態において、表１および表２に記載の遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルの定量は、前記タンパク質またはその変異体の定量を含む。
本明細書において用いるように、「タンパク質」という用語は、共有結合または非共有結合により結合されたアミノ酸の分子鎖に関する。その用語は、生理学的に関連した翻訳後化学修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化またはアセチル化など）形態総てをさらに含む。
本発明において「変異体」とは、タンパク質のアミノ酸配列が特定タンパク質のアミノ酸配列と実質的に相同であるタンパク質として理解される。あるアミノ酸配列が、決定されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一性、有利には少なくとも７５％、一般には少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を示す場合に、そのアミノ酸配列は前記決定されたアミノ酸配列と実質的に相同である。２アミノ酸配列間の同一性は、従来法によって、例えば、技術水準において知られている標準的な配列アラインメントアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ[Altschul S.F. et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215(3):403-10]などによって決定することができる。
当業者であれば、タンパク質の機能性にとって重要でない位置でアミノ酸の保存的置換を引き起こす遺伝子のヌクレオチド配列における突然変異は、その全体構造またはその機能性には影響を及ぼさない中立進化が起こる突然変異であることを理解している。前記変異体は、本発明の範囲内に入る。
従って、本明細書において用いるように、「変異体」という用語は、本発明において記載するタンパク質の１つの任意のフラグメントも含む。「フラグメント」という用語は、タンパク質の一部を含んでなるペプチドに関する。
表１および表２に記載の遺伝子によりコードされるタンパク質の発現レベルは、対象のサンプルにおいて前記タンパク質を検出し定量することを可能にするいずれの従来法によっても定量することができる。限定されない例として、前記タンパク質のレベルは、例えば、前記タンパク質と（または抗原決定基を含有するそのフラグメントと）結合する能力を有する抗体を用い、続いて形成された複合体を定量することによって、定量することができる。これらのアッセイにおいて用いる抗体は、標識することもできるし標識していなくてもよい。用いることができるマーカーの例示例としては、放射性同位元素、酵素、蛍光団(flourophores)、化学発光試薬、酵素基質または補因子、酵素阻害薬、粒子、色素などが挙げられる。非標識抗体（一次抗体）および標識抗体（二次抗体）を用いる、本発明において用いることができる公知のアッセイは幅広く；これらの技術としては、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、競合ＥＩＡ（競合酵素イムノアッセイ）、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ（二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）、免疫細胞化学的および免疫組織化学的な技術、特異的抗体を含むタンパク質バイオチップまたはマイクロアレイの使用に基づく技術、またはディップスティックなどの形式でのコロイド沈殿に基づくアッセイが挙げられる。前記タンパク質を検出し定量する他の方法としては、アフィニティークロマトグラフィー技術、リガンド結合アッセイなどが挙げられる。
特定の実施形態において、表１および表２に記載の遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルの定量は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学またはタンパク質アレイによって行われる。
上述のとおり、本発明のin vitro方法は、乳癌と診断された対象の処置を選択するために用いることができ、ここで、基準値に対しての、表１に記載の遺伝子の発現の増加および表２に記載の遺伝子の発現の減少は化学療法により処置すべき対象であることの指標である。
好適な化学療法薬としては、限定されるものではないが、アルキル化剤、例えば、シクロホスファミド、カルムスチン、ダウノルビシン、メクロレタミン、クロラムブシル、ニムスチン、メルファランなど；アントラサイクリン(anthracylines)、例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、バルルビシンなど；タキサン化合物、例えば、パクリタキセル、ドセタキセルなど；トポイソメラーゼ阻害薬、例えば、エトポシド、テニポシド、イリノテカン、ツリポシドなど；ヌクレオチド類似体、例えば、アザシチジン、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、メルカプトプリン、メトトレキサート、チオグアニン フトラフールなど；白金系薬剤、例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチンなど；抗新生物薬、例えば、ビンクリスチン、ロイコボリン、ロムスチン、プロカルバジンなど；ホルモン調節剤、例えば、タモキシフェン、フィナステリド、５−α−レダクターゼ阻害薬など；ビンカアルカロイド、例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンなどが挙げられる。それらの好適な化学療法薬は、メルクインデックス（第１３版）ＣＤ−ＲＯＭ版(The Merck Index in CD ROM, 13th edition)などの文献に詳細に記載されている。
本発明において、「抗腫瘍薬」とは、腫瘍の成長、増殖および／または発達を阻害するために用いることができる抗増殖性、抗発癌性および／または制癌性を有する化学的、物理的または生物学的作用因子または化合物として理解される。本発明において用いることができる抗腫瘍薬の例は、（ｉ）代謝拮抗物質、例えば葉酸代謝拮抗薬およびプリン類似体；（ｉｉ）天然物、例えば抗腫瘍抗生物質および有系分裂阻害剤；（ｉｉｉ）ホルモンおよびその拮抗薬、例えばアンドロゲンおよびコルチコステロイド；ならびに（ｉｖ）生物学的作用因子、例えばウイルスベクターである。抗腫瘍薬として用いることができる化合物のリストは、特許出願ＷＯ２００５／１１２９７３に記載されている。
別の態様において、本発明は、表１および表２の遺伝子の発現レベルを検出することが可能な試薬（以下、本発明の試薬）に関する。
特定の実施形態において、本発明の前記試薬は、
（ｉ）表３および表４に記載のプローブのヌクレオチド配列またはそれらの転写産物を含んでなる核酸のセット、あるいは
（ｉｉ）表１および表２に記載の遺伝子によりコードされるタンパク質の１つと特異的に結合することが可能な各抗体またはフラグメントからなる、抗原を検出することが可能な抗体またはそのフラグメントのセット
を含んでなる。
本発明の特定の実施形態において、前記核酸はＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡのプローブおよび／またはプライマーである。前記核酸は、当業者には公知の従来技術により表１および表２の遺伝子のヌクレオチド配列から得ることができる。前記プローブおよび／またはプライマーは、一般的には、化学合成により企業から入手することができる。加えて、前記遺伝子の前記配列は、文献において詳しく記載されており、従って公知である。
別の態様において、本発明は、本発明による少なくとも１つの試薬を含んでなるキットに関する。本発明の特定の実施形態において、前記キットは、表３および表４のプローブのヌクレオチド配列、またはそのフラグメント、またはそれらの転写産物を含んでなる核酸のセットを含んでなるＤＮＡまたはＲＮＡアレイである。より具体的な実施形態において、前記キットは、１個または数個の構成性発現遺伝子の核酸分子をさらに含んでなる。
本発明において「構成的に発現される遺伝子」または「構成性発現遺伝子」とは、常に活性のあるまたは絶えず転写される遺伝子として理解される。構成的に発現される遺伝子の例は、２−ミオグロビン、ユビキチン、１８Ｓリボソームタンパク質、シクロフィリンＡ、トランスフェリン受容体、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チロシン３−モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質（ＹＷＨＡＺ）、ユビキチン、β−アクチンおよびβ−２−ミクログロブリンである。
本発明の別の特定の実施形態において、本発明のキットは、表１および表２に記載の遺伝子によりコードされるタンパク質または前記タンパク質の任意の変異体と特異的に結合することが可能な抗体またはそのフラグメントからなる抗体のセットを含んでなる。特定の実施形態において、前記キットは、１個または数個の構成性発現遺伝子によりコードされるタンパク質と特異的に結合することが可能な抗体またはそのフラグメントをさらに含んでなる。
本明細書において用いる本発明の遺伝子サインまたは遺伝子のサインという用語は、表１および表２に記載の遺伝子に関する。本発明者らが示すデータ（実施例４参照）によれば、本発明の遺伝子のサインまたは遺伝子サインにより、従来の方法によるよりも多くの患者が低リスク（すなわち、良好予後）群に割り当てられる。そこで、本発明者らは、本発明の方法により不良予後患者と分類された患者は、ザンクトガレンおよびＮＩＨの臨床基準による不良予後患者よりも転移の割合が高い傾向にあることを実証した。従って、別の態様において、本発明は、乳癌と診断された患者の予後診断のためのまたは乳癌と診断された対象の処置の選択のための本発明によるキットの使用に関する。
別の態様において、本発明は、原発腫瘍の転移傾向を予測するための遺伝子マーカーを選択するための方法に関し、その方法は、次の工程：
ｉ）腫瘍を自然発生する傾向を示す遺伝子操作非ヒト動物の腫瘍サンプルにおいて遺伝子発現が基準値に対して変化している遺伝子を判定する工程；
ｉｉ）工程ｉ）で同定された遺伝子に対応するヒトの相同遺伝子を同定する工程；および
ｉｉｉ）原発腫瘍から転移を起こしている患者の原発腫瘍サンプルにおける遺伝子発現が、転移を起こしていない患者の原発腫瘍におけるその遺伝子の発現に対して変化している、工程ｉｉ）で同定された遺伝子を選択する工程
を含む。
工程ｉ）により遺伝子発現が変化している遺伝子を判定するために、第１に前記動物からサンプルを得るが、好ましくは、前記サンプルは腫瘍組織サンプルである。本発明の実施例１には本発明の方法の特定の実施形態を記載する。よって、特定の実施形態において、前記動物の前記腫瘍組織サンプルから全ＲＮＡが抽出され、前記腫瘍サンプルにおいて遺伝子発現が基準値に対して変化している遺伝子を判定するために前記ＲＮＡが解析される。特定の実施形態において、前記基準値は前記動物の非腫瘍組織サンプルにおける遺伝子発現値である。前記発現値は、例えば、本説明の実施例１において説明するように、前記非ヒト動物モデルの遺伝子発現アレイにおける遺伝子発現シグナルからもたらされる値から得ることができる。よって、前記値は、Affymetrix社のＧＣＯＳ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）というソフトウェアによるＣＥＬ（ＣＥＬフォーマット）形式のファイルの値に相当する。
本発明の遺伝子マーカーを選択するための方法の特定の実施形態において、前記非ヒト動物はＴｐ５３遺伝子の遺伝子発現が阻害される動物である。別の特定の実施形態において、前記動物においてｐＲｂ遺伝子の遺伝子発現がさらに阻害される。Ｔｐ５３およびＲｂ１遺伝子はそれぞれ腫瘍抑制遺伝子ｐ５３およびｐＲｂをコードする。ｐ５３およびｐＲｂ遺伝子の欠損がある（ｐ５３−およびｐＲｂ−）前記動物モデルは、浸潤性の高い表皮癌を自然発生する。従って、特定の実施形態において、前記動物は表皮癌を自然発生する非ヒト動物である。
原発腫瘍の転移傾向を予測するための遺伝子マーカーを選択するための方法の工程ｉｉ）を実施するために、工程ｉ）で同定された遺伝子に対応するヒトの相同遺伝子が同定される。そのためには、当業者には公知の相同遺伝子をマッピングするための従来技術が用いられる。特に、本発明者らは、ＡＩＬＵＮ(Array Information Library Universal Navigator)ウェブユーティリティー(Chen R, et al. Nat Methods 2007;4(11):879)を利用することによって、非ヒト動物のAffymetrix社プローブ識別名を、識別名Ｕ１３３ｐｌｕｓ ２．０およびＵ１３３Ａでの検索を通じてヒト遺伝子記号とともにマッピングした。
前記方法の最終工程において、原発腫瘍から転移を起こしている患者の原発腫瘍サンプルにおける遺伝子発現が、転移を起こしていない患者の原発腫瘍におけるその遺伝子の発現に対して変化している、工程ｉｉ）で同定された遺伝子が選択される。
本発明の特定の実施形態において、工程ｉｉｉ）は、以上に記述したとおりに比例ハザード回帰分析によって行われる。より具体的な実施形態において、前記回帰分析はＣｏｘ型分析である。好ましい実施形態において、前記Ｃｏｘ型手法では遠隔転移は予後変数として確立されている。本発明のさらに好ましい実施形態において、前記遠隔転移は５年または１０年時点での遠隔転移である。
本発明者らは、Ｗａｌｄ検定(Wald A. Transactions of the American Mathematical Society 1943;54:426-482; Silvey SD. Annals of Mathematical Statistics 1959; 30:389-407)をさらに適用し、本説明の実施例２において説明するように、各遺伝子に、Ｗａｌｄ統計量値、対応するＰ値、およびＦＤＲ(false discovery rate)法により補正されたＰ値を割り当てて、前記係数が０である（予後変数とは関係していない）という帰無仮説を解析した。ＦＤＲ制御は、多重比較を補正するために多重仮説検定において用いられる当業者には公知の統計的方法である。
本発明の特定の実施形態において、工程ｉｉｉ）による前記原発腫瘍は乳癌腫瘍である。
特定の実施形態において、工程ｉｉｉ）による前記遺伝子の発現の判定は、前記遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、または前記ｍＲＮＡのフラグメント、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、または前記ｃＤＮＡのフラグメント、またはそれらの混合物の定量を含む。
より具体的な実施形態において、工程ｉｉｉ）による遺伝子の発現レベルの定量は、定量的多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＤＮＡもしくはＲＮＡアレイによって行われる。
特定の実施形態において、工程ｉｉｉ）による遺伝子の発現レベルの定量は、前記遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルの定量を含む。より具体的な実施形態において、タンパク質のレベルの前記定量は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡまたはタンパク質アレイによって行われる。
次の実施例により本発明を説明するが、本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。
実施例１
マウス表皮腫瘍の解析
本発明において用いる動物モデルは、Ｔｐ５３遺伝子の対立遺伝子において（ｐ５３−モデル）、またはＴｐ５３およびＲｂ１対立遺伝子において同時に（ｐ５３−モデル；ｐＲｂ−モデル）、ｌｏｘＰ配列が必須のエキソンの両側に配置されているマウスと交配したＫ１４Ｃｒｅマウス（それらのマウスは重層上皮の基底層においてＣｒｅリコンビナーゼを発現する）である(Martinez-Cruz AB. et al. Cancer Res 2008; 68(3):683-692)。Ｔｐ５３およびＲｂ１はそれぞれ腫瘍抑制遺伝子ｐ５３およびｐＲｂをコードする。そのため、それらのマウスは重層上皮における遺伝子欠損モデルである。両方のモデルは、浸潤性の高い低分化型または未分化型表皮扁平上皮癌を自然発生する。
ｐ５３が欠損している（ｐ５３−）（７個の腫瘍）およびｐ５３およびｐＲｂが欠損している（ｐ５３−／ｐＲｂ−）（８個の腫瘍）マウスにおいて生じた凍結表皮癌のＲＮＡを精製した。成体動物（８週齢、５つの対照サンプル）の、ＲＮＡｌａｔｅｒに保存していた正常皮膚のＲＮＡを対照として得た。ＲＮＡ群の完全性はバイオアナライザーシステム(Agilent)を用いることによってチェックした。ＲＮＡサンプルは総てマイクロアレイ解析の品質基準を満たした（ＲＩＮ値(RNA Integrity number)６より大きい）。Affymetrix社ＧｅｎｅＣｈｉｐ、Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＭＯＥ４３０ ２．０とのハイブリダイゼーションは、サラマンカの癌研究センターゲノム部門(the Genomic Department of the Cancer Research Center of Salamanca)において標準的なAffymetrix社プロトコールを用いて行った。発現値は、ＲＭＡ(Robust Multichip Average)法(Bolstad BM, et al. Bioinformatics 2003; 19(2):185-193; Irizarry RA, et al. Biostatistics 2003; 4(2) :249-264)によって、Affymetrix社ＧＣＯＳソフトウェア（ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）による（蛍光スキャニングからもたらされる）ＣＥＬファイルから抽出した。品質基準を満たした総てのハイブリダイゼーションを、ＲＬＥ(Relative Log Expression)およびＮＵＳＥ(Normalized Unsealed Standard Error)のグラフを用いるＲＭＡＥｘｐｒｅｓｓコンピュータプログラムに入れた。
正常組織と比べたマウス腫瘍の差次的遺伝子発現の解析を、フリーＭｕｌｔｉｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｖｉｅｗｅｒ ４．０ソフトウェア（ＭｅＶ ４）(Saeed Al, et al. Biotechniques 2003; 34(2):374-378)においてスチューデントｔ−検定（Ｔ−検定）およびＳＡＭ(Significant Analysis of Microarrays)(Tusher VG, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2001; 98(9):5116-5121)によって行った。プローブが２つの基準を満たした場合にそのプローブを選択した：ｉ）False Discovery Rate法により補正された確率Ｐ値またはＦＤＲ＜３ｘ１０−７によるＴ−検定解析(Benjamini Y, Hochberg Y. Journal of the Royal Statistical Society B 1995; 57:289-300)；およびｉｉ）ＦＤＲ＜１ｘ１０−３によるＳＡＭ解析。差次的に発現された合計６８２のプローブを選択した。腫瘍において３７１のプローブは正常組織と比べて過剰発現され、３１１のプローブは負に調節された。Ａｉｌｕｎウェブユーティリティー(Chen R, et al. Nat Methods 2007; 4(11):879)を利用して、用いたチップのAffymetrix社識別名（ＭＯＥ４３０ ２．０）を、相同のヒト遺伝子記号に対してマッピングし、結果として４２７個のヒト遺伝子となった。
実施例２
ｐ５３サインに基づく乳癌転移予測指標の二段抽出
２．１ 転移に関するｐ５３サインを示す遺伝子の選択
Affymetrix社Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ版Ｕ１３３ＡまたはＵ１３３Ｐｌｕｓ ２．０ ＧｅｎｅＣｈｉｐを用いて得られた、ヒト原発乳房腫瘍のマイクロアレイとのハイブリダイゼーションについての未加工データおよびそれらの対応する臨床データを、ＮＣＢＩのＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）ウェブページデータベースから、識別名ＧＳＥ７３９０(Desmedt C. et al. Clin Cancer Res 2007; 13(11) :3207-3214)（以下、Desmedtデータセットという研究）およびＧＳＥ６５３２(Loi S. et al. J Clin Oncol 2007;25(10):1239-1246)（以下、Loiデータセットという研究）を用いてダウンロードした。ＣＥＬファイルを得て、ＲＭＡＥｘｐｒｅｓｓプログラムを用いてシグナル強度値を抽出した。ＲＬＥおよびＮＵＳＥのグラフにより、ＲＭＡによる最適正規化基準を満たさなかったいくつかの腫瘍マイクロアレイの確認が可能であった。該当するＣＥＬファイルは後の解析から外した。
Desmedtデータセットを訓練セットとして用い、品質の低いアレイを除いた後、健常リンパ節（Ｎ−）を含む１９１腫瘍を含めた（補助全身療法を受けていない患者の、エストロゲン受容体を発現するサンプルと発現しないサンプル（それぞれ、ＥＲ＋またはＥＲ−）の両方を含む）（表５）。
Ｃｏｘ型比例ハザード回帰分析は、ＧＥＰＡＳウェブページ(www.gepas.org)上で実行されるサバイバルユーティリティー(Vaquerizas JM. et al. Nucleic Acids Res 2005;33 (Web Server issue) :W616-620)を利用して、マウス腫瘍の差次的発現の解析によりマッピングされた４２７個のヒト遺伝子に対応する７０７個のＵ１３３Ａプローブ（Ｕ１３３Ｐｌｕｓ ２．０にも存在する）について、５年時点での遠隔転移（ＤＭ）を用いて行った。
要するに、Ｃｏｘ分析では、各プローブについてＣｏｘ回帰係数を割り当て、遺伝子発現がＤＭの発生と正比例して関係しているプローブは＞０となり、その発現がＤＭと反比例して関係している場合には、それは＜０となる。さらに、Ｗａｌｄ検定(Wald A. Transactions of the American Mathematical Society 1943;54:426-482; Silvey SD. Annals of Mathematical Statistics 1959; 30:389-407)を適用し、各プローブに、Ｗａｌｄ統計量値、対応するＰ値、およびＦＤＲ法により補正されたＰ値を割り当てて、前記係数が０である（ＤＭとは関係していない）という帰無仮説を解析する。次の解析には、Ｗａｌｄ統計量値＞３または＜−３のプローブを選択した。これらの解析の目的は、ヒト乳癌の５年および１０年時点でのＤＭＤＭ予測能力をチェックすることである。
２．２ 転移予測のための数学的モデルの開発
各腫瘍の「リスク値」（ＲＶ）を記載した遺伝子に基づいて計算するために式を得た：
（式中、ｓｉは、Ｃｏｘ型回帰分析のＷａｌｄ統計量であり；
ｘｉは、Affymetrix社プローブの発現値ｌｏｇ２である（平均＝１；標準偏差＝１））
表６は、本発明のサインの遺伝子とｓｉの対応値を示している。
前記式は、各遺伝子の発現値と、以上に説明したＣｏｘモデルによる各遺伝子のＷａｌｄ統計量値との積の合計に基づいて各サンプルに数値（ＲＶ）を割り当てる（表７参照）。
上記のＲＶ式によって、Desmedtデータセットの１９１個の腫瘍のＲＶ値を得た。５年時点でのＤＭの変数を打ち切り従属変数として用いてＲＶについて受信者動作曲線(Receiver Operating Curves)（ＲＯＣ）を計算した。図１に示すように、表１および表２に記載の遺伝子のサインに基づくＲＶは、腫瘍群における成功率１００％（１００％感度）により５年時点での転移事象の不在（以下、良好予後群という）を、そして残存腫瘍における成功率４０．１％（４０．１％特異度）により転移の存在（不良予後群という）を予測することが可能である。
Desmedt腫瘍の特徴の詳細な解析では、グレード３ ＥＲ−であるもの（４６個のサンプル）は正確に予測されないことが分かった（データは示していない）。残存腫瘍のＲＯＣ曲線では、本発明の遺伝子のサインは感度値１００％を維持するが、特異度は５１．６％まで実質的に高まることが示された（図１、表７）。
得られた結果は、本発明の遺伝子サインを、ヒト乳癌における５年時点でのＤＭの最適予測指標として用いることができることを示している。
よって、以上に記載した式から、本発明者らは、患者が良好予後群に属するか不良予後群に属するかを判定することができた。この方法は、リスク値（ＲＶ）を計算するための式と、１４２個のサンプルからなるDesmedt腫瘍群の５年時点でのＤＭのＲＯＣ曲線（図１、パネルＣ）に基づく。ＲＯＣ曲線によれば、前記予測指標は感度１００で特異度最大であろう（ＲＶ＝−３９，２）。
実施例３
外部腫瘍群における予測指標の検証
検証用の外部腫瘍群または試験データセットとしてLoi腫瘍群、すなわちLoiデータセットを用いた。Loiデータセットは、ｉ）タモキシフェンで処置したまたは処置していない患者の腫瘍；ｉｉ）手術時にリンパ節転移している（Ｎ＋）またはリンパ節転移していない（Ｎ−）患者の腫瘍；およびｉｉｉ）ＥＲ−またはＥＲ＋腫瘍：を含む。Loi腫瘍群は、Desmedtデータセット（Ｎ−のみ、タモキシフェンで処置していない）よりも多様な範囲の乳癌サンプルを含む。Loiデータセットには、本来、Affymetrix社Ｕ１３３Ａ ＧｅｎｅＣｈｉｐとＵ１３３Ｂ ＧｅｎｅＣｈｉｐの両方を用いて解析した３２７個のサンプルが含まれている。また、Loiデータセットは、Ｕ１３３Ｐｌｕｓ ２．０チップを用いて解析した８７個の腫瘍も含む。予測のためのゲノムサインは、Ｕ１３３Ａ ＧｅｎｅＣｈｉｐ内に存在しＵ１３３Ｂ ＧｅｎｅＣｈｉｐ内には存在しないプローブを含むため（表６）、Ｕ１３３Ｂ ＧｅｎｅＣｈｉｐを用いて行った解析は捨てた。しかしながら、Ｕ１３３Ｐｌｕｓ ２．０チップを用いて解析した８７個のサンプルは、このチップがＵ１３３Ａプローブの総てを含むことから、処理する。ＲＭＡによる正規化後、４００個の腫瘍が以上に説明した品質基準を満たした（ＮＵＳＥおよびＲＬＥのグラフ）。
腫瘍総てのサイン遺伝子について、発現値をｌｏｇ２スケールで抽出した。新たな腫瘍の発現値とDesmedtデータセットのＣｏｘ分析において計算されたＷａｌｄ統計量値（表６）を用いて、以上に記載した式によりリスク値（ＲＶ）を計算した。ホルモン処置、腫瘍グレード、ＥＲの有無、経時的追跡調査による遠隔転移の有無、またはリンパ節の状態についてのデータがない腫瘍は捨てた（９４個のサンプル）。残った３０６個の腫瘍から、Desmedtデータセットにおいてゲノム予測指標が役に立っていない腫瘍、すなわち、グレード３ ＥＲ−腫瘍（１９個のサンプル）は除いた。残った２８７個の腫瘍において、特徴が類似している患者の群によりゲノム予測指標の精度を解析した。
３．１． 本発明の遺伝子サインは、ホルモン療法を受けなかった健常リンパを有する乳癌患者における遠隔転移のゲノム予測指標である。
まず、Desmedt研究の腫瘍の特徴と類似した特徴、すなわち、タモキシフェンで処置していない患者、Ｎ−結節、および腫瘍直径≦５ｃｍ、を有する腫瘍を解析し、この解析は患者の年齢とは関係ないものとした（８６個のサンプル、臨床的特徴については表８を参照）。
以上に記載した良好または不良予後に関する式のルールによるゲノムリスクの計算に基づき、本発明の遺伝子のサインは、５年および１０年時点でのＤＭの良い予測指標である。これを受けて、Ｃｏｘ比例ハザード分析によって、良好予後プロフィールを有する患者と不良予後プロフィールを有する患者との相対リスク（ＲＲ）を計算した（表９）。
単変量解析によれば、両患者群間のＤＭを起こすＲＲは、５年時点では１９．９（信頼区間ＣＩ９５％ ２．６〜１５４．４、Ｐ＝０．００４）または１０年時点では８．２（ＣＩ９５％ ２．３〜２８．７、Ｐ＝０．００１）である。前記ハザード分析が多変量である、すなわち、前記モデルに臨床データ（患者の年齢、腫瘍の大きさ、腫瘍グレード、ＥＲ状態）を含める場合には、５年時点でのＲＲ１４．９（ＣＩ９５％ １．８〜１２３．７、Ｐ＝０．０１２）および１０年時点での７．３（ＣＩ９５％ １．９〜２８．５、Ｐ＝０，００４）を得る。多変量解析においてこれらのＲＲは統計的に有意であり、そしてそれは、表１および表２に記載の遺伝子のサインが他の臨床的指標とは無関係のゲノム予測指標であることを示していることに注目することが重要である（表９および表１０）。
両患者群において生存確率も計算した（表１１）。従って、良好予後群では５年時点での生存確率は９６．１％（±２．２）であり、１０年時点では９２．３％（±４．３）である。不良予後群では５年時点での確率は７０．１％（±６．２）であり、１０年時点では４９．２％（±８．７）である。両群間の生存の違いは重要であり、その違いは５年時点では２６％、１０年時点では４３％である。
３．２． 本発明の遺伝子サインは、タモキシフェンによるホルモン療法を受けたリンパ節転移がある乳癌患者における遠隔転移のゲノム予測指標である。
次に、腫瘍直径≦５ｃｍを有する、ホルモン療法を受け腫瘍摘出時にリンパ節転移があった（Ｎ＋）患者に対しても本発明の予測サインが有効であるかどうかをチェックし、患者の年齢と関係なく行った、（１０８個のサンプル、臨床的特徴については表８参照）。第３．１節に記載したものと同様に、患者は２つのリスク群に分けた：不良予後および良好予後。単変量および多変量Ｃｏｘ分析を行って、両群間の５年または１０年時点でのＤＭを起こす相対リスクをチェックした（表９および表１０）。その結果より、単変量解析において、ＲＲは、５年時点では４．２（ＣＩ９５％ １．２〜１４．６、Ｐ＝０．０２１）、または１０年時点では４．７（ＣＩ９５％ １．６〜１３．５、Ｐ＝０．００４）であることが分かる。Ｃｏｘモデルに臨床的指標を含めた（患者の年齢、腫瘍の大きさ、腫瘍グレード）場合には、ゲノム予測指標がこれらのパラメーターと無関係であることが証明され、２つの予後群間のＲＲを維持し、５年時点では３．９（ＣＩ９５％ １．１〜１４．７、Ｐ＝０．０４２）、１０年時点では４．２（ＣＩ９５％ １．３〜１３、Ｐ＝０．０１３）であった（表９および表１０）。
両患者群において生存確率も計算した（表１１）。従って、良好予後群では５年時点での生存確率は９４．２％（±２．８）であり、１０年時点では８８．８％（±５．３）である。不良予後群では５年時点での確率は７６．３％（±４）であり、１０年時点では５８．２％（±６．１）である。両群間の生存の違いは５年時点では１７．９％、１０年時点では３０．６％であり、そのような違いも重要である。
最後に、腫瘍直径≦５ｃｍを有する、ホルモン療法により処置し腫瘍摘出時に局所転移がなかったLoi研究内患者亜群において、ゲノムサインの予測能力を、患者の年齢と関係なく（８９個のサンプル、総てＥＲ＋）解析した。その結果より、ゲノムリスクによって定義される２つの群は単変量解析によるＲＲが５年時点では約２．５または１０年時点では１．９であるという事実にも関わらず、その差は統計的に有意ではないことが分かった（データは示していない）。
全体として、その結果は、本発明の遺伝子サインは、５ｃｍ未満の腫瘍、ＥＲ＋腫瘍、ＥＲ−腫瘍（グレード１および２）において、Ｎ−患者（ホルモン処置を行っていない）において、およびＮ＋患者（タモキシフェンで処置した）において、５年および１０年時点でのＤＭのリスクについての良い予測指標であることを示している。さらに、これらの患者において、その予測指標は、患者の年齢、ＥＲ状態、腫瘍グレード、および腫瘍の大きさとは無関係である。
実施例４
本発明の遺伝子サインと臨床的予測指標との比較
カプラン・マイヤー曲線を用いて、良好または不良予後患者群（図２、８６名のＮ−患者、タモキシフェンで処置していない；図３、１０８名のＮ＋患者、タモキシフェンで処置した）の無ＤＭ生存を、本発明の遺伝子サインに基づく基準によって（図２Ａおよび図３Ａ）、あるいはザンクトガレン(Goldhirsch A, et al. J Clin Oncol 2001;19(18):3817-3827)（図２Ｂおよび図３Ｂ）の、またはＮＩＨ（国立衛生研究所、米国）(Eifel P, et al. J Natl Cancer Inst 2001;93(13):979-989)（図２Ｄおよび図３Ｄ）（表１２参照）の合意の臨床的予測基準によって比較した。
ザンクトガレンおよびＮＩＨの基準では、いくつかの組織学的および臨床的特徴に基づいて患者を高リスクまたは低リスクに分類する。この比較は、本発明の予後サインにより、伝統的な方法によるよりも多くの患者が低リスク（または良好予後）群に割り当てられる（タモキシフェンで処置していない、Ｎ−の患者についてはザンクトガレンの基準による２１％およびＮＩＨの基準による１３％に対して、５６％；タモキシフェンで処置した、Ｎ＋の患者についてはザンクトガレンの基準による１０％およびＮＩＨの基準による２％に対して３２％）ことを示している。ゲノムサインによる不良予後患者はザンクトガレンおよびＮＩＨの臨床基準による不良予後患者よりもＤＭの割合が高い傾向にある。この結果は、現在用いられている両臨床基準群では臨床的に有意な数の患者が不良予後群に誤って分類されることを示している。さらに、ザンクトガレンの基準により定義された不良予後群は、良好な予後のゲノムサインおよび良好な結果を示した多くの患者を含んでいる（図２Ｃおよび図３Ｃ）。ＮＩＨの基準により特定された高リスク群内でも同様の亜群が確認された（図２Ｅおよび図３Ｅ）。
ザンクトガレンおよびＮＩＨ両方の亜群が、タモキシフェンで処置していない、Ｎ−の患者（８６名の患者の亜群）の間で不良予後群内に不十分に分類される患者を含んでいることを考えれば、現在の臨床診療において過剰治療を受ける患者がいると思われる。加えて、総てのＮ＋患者はホルモン療法を受けていた（１０８名の患者の亜群）ため、ホルモン処置を行わない場合にゲノム予測がいかに必要であるかを判断することはできない。しかしながら、その結果は、本発明の遺伝子サインが、リンパ節転移がある患者におけるタモキシフェン処置に対する反応についての良い予測指標であることを示している。
全Loiデータセット（ｎ＝１９１）における、またはグレード３ ＥＲ−サンプルを除くLoiデータセット（ｎ＝１４２）における、本発明の遺伝子サインを予測する受信者動作曲線（ＲＯＣ）を示す図である。パネルＡおよびＣは５年時点での遠隔転移（ＤＭ）の予測を示し、パネルＥは５年間の全生存の予測を示す。パネルＢおよびＤは１０年時点での遠隔転移（ＤＭ）の予測を示し、パネルＥは１０年間の全生存の予測を示す。パネルＡの最大特異度（４０．１％）と感度（１００％）のポイントのＲＶを良好な予後と不良な予後にサンプルを分ける閾値として選択した（ＲＶ＝３９．２）（円）。 タモキシフェンで処置していない、Loiデータセット内のＮ−の患者（８６個の腫瘍、直径≦５ｃｍ）の生存曲線または予後予測を示す図である。 タモキシフェンで処置した、Loiデータセット内のＮ＋の患者（１０８個の腫瘍、直径≦５ｃｍ）の生存曲線または予後予測を示す図である。 Desmedtデータセットにおける本発明の遺伝子サインを示す図である。左のパネルは、グレード３ ＥＲ−を除くDesmedt腫瘍（１４２個のサンプル）における、本発明のサインのプローブとハイブリダイズする遺伝子配列の遺伝子の発現マップを示す。列は遺伝子を表し、行はサンプルを表す。遺伝子は表２に従ってＷａｌｄ統計量値の値が減少するとおりに左から右へ配列される。発現値はｌｏｇ２として示される（平均＝０、標準偏差＝１）。 右のパネルは、本発明の遺伝子のサインを用いた、またはザンクトガレン(St. Gallen)（ＳＧ）、ＮＩＨ、ノッティンガム予後指標(Nottingham Prognostic Index)（ＮＰＩ）、アジュバントオンライン(Adjuvant Online)（ＡＯＬ）、およびVeridexの７６−遺伝子ゲノムサイン(the 76-gene genomic signature)の基準を用いた予測結果を示す。薄灰色のサンプルは良好な予後を示し；濃灰色のサンプルは不良な予後を示す。不良予後サンプルにおいて発現がより高い３７プローブの存在を観察することができる。ＥＲ状態（ＥＲ＋は黒色、ＥＲ−は白色）と５年または１０年時点でのＤＭの存在（転移有は白色、転移無は黒色）も示されている。遺伝子はAffymetrix社プローブ識別名と、ＮＣＢＩ遺伝子記号の両方により表される。 Loiデータセットにおける本発明の遺伝子サインを示す図である。Ａ）左のパネルは、グレード３ ＥＲ−を除く、Ｎ−でありタモキシフェンで処置していないLoi腫瘍（８６個のサンプル）における、前記プローブとハイブリダイズする遺伝子配列の遺伝子の発現マップを示す。列は遺伝子を表し、行はサンプルを表す。遺伝子は表２に従ってＷａｌｄ統計量値の値が減少するとおりに左から右へ配列される。発現値はｌｏｇ２として示される（平均＝０、標準偏差＝１）。 右のパネルは、本発明の遺伝子のサイン、またはザンクトガレン（ＳＧ）およびＮＩＨの基準を用いた予測結果を示す。薄灰色のサンプルは良好な予後を示し；濃灰色のサンプルは不良な予後を示す。不良予後サンプルにおいて発現がより高い３７プローブの存在を観察することができる。ＥＲ状態（ＥＲ＋は黒色、ＥＲ−は白色）と５年または１０年時点でのＤＭの存在（転移有は白色、転移無は黒色）も示されている。遺伝子はAffymetrix社プローブ識別名と、ＮＣＢＩ遺伝子記号の両方により表される。 Ｂ）このパネルはパネルＡと似ているが、Ｎ＋でありホルモン療法を受けたLoiデータセットの１０８名の患者の群のものである。 ネズミ腫瘍ｐ５３−およびｐ５３−；ｐＲｂ−と正常皮膚間の比較により選抜した遺伝子のランキングを示す図である。マウス腫瘍において過剰発現される遺伝子を、遺伝子発現の相対的変化の大きさのとおりに配列し（８０．３〜１．２倍まで、パネルＡ）、またはスチューデントｔ−検定により計算したＰ値により配列している（パネルＣ）。左列の黒色は２倍を超えて増加した遺伝子を示す。中央列の濃灰色はＳＡＭ検定の差次的発現基準も満たした遺伝子を示す。右列にはヒトにおける本発明の遺伝子のサインの、相当するマウス遺伝子の範囲内での位置を示している。遺伝子名を濃灰色にした遺伝子は悪性のヒト乳房腫瘍において過剰発現され；薄灰色の遺伝子は悪性腫瘍において減少する。 マウス腫瘍において発現が減少する遺伝子を、遺伝子発現の相対的変化の大きさのとおりに配列し（３７５．８〜１．２倍まで、パネルＢ）、またはスチューデントｔ−検定により計算したＰ値により配列している（パネルＤ）。左列の黒色は２倍を超えて負に調節された遺伝子を示す。中央列の濃灰色はＳＡＭ検定の差次的発現基準も満たす遺伝子を示す。右列にはヒトにおける遺伝子のサインの、相当するマウス遺伝子の範囲内での位置を示している。遺伝子名を濃灰色にした遺伝子は悪性のヒト乳房腫瘍において過剰発現され；薄灰色の遺伝子は悪性腫瘍において減少する。

Claims (33)

  1. 乳癌と診断された対象の予後を判定するまたは乳癌と診断された対象の処置を選択するためのin vitro方法であって、前記対象の腫瘍組織サンプルにおいて表１および表２に記載の遺伝子の発現レベルを判定することを含んでなり、ここで、基準値に対しての、表１に記載の遺伝子の発現の増加および表２に記載の遺伝子の発現の減少が、予後の悪化または化学療法により処置すべき前記対象であることの指標となる、方法。
  2. 表１および表２に記載の遺伝子の発現レベルの定量が、前記遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、もしくは前記ｍＲＮＡのフラグメント、前記遺伝子の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、もしくは前記ｃＤＮＡのフラグメント、またはそれらの混合物の定量を含んでなる、請求項１に記載の方法。
  3. 表１および表２に記載の遺伝子の発現レベルの定量が、定量的多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＤＮＡもしくはＲＮＡアレイによって行われる、請求項１または２に記載の方法。
  4. 表１および表２に記載の遺伝子の発現レベルの前記判定が、表３および表４に記載のプローブを含んでなるＤＮＡアレイによって行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記予後の判定が、表１および表２に記載の遺伝子の発現レベルによる前記予後の比例ハザード回帰分析を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記比例ハザード回帰分析が、Ｃｏｘ型分析である、請求項５に記載の方法。
  7. 遠隔転移が、前記Ｃｏｘ型分析において予後変数として確立される、請求項６に記載の方法。
  8. 前記遠隔転移が、５年または１０年時点での遠隔転移である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記予後の判定が、下記式：
    （式中、ｘｉは、表１および表２に記載の前記遺伝子の各々の発現レベルのｌｏｇ２値であり；かつｓｉは、請求項６〜８に記載の、表１および表２に記載の前記遺伝子の各々のＣｏｘ型回帰分析のＷａｌｄ統計量の値である）
    を適用することにより行われ、
    ここで、前記値が０より大きい場合は、それが、前記患者が予後の悪化を呈することまたは化学療法により処置すべき前記患者であることの指標となり、前記値が０より小さい場合は、それが、前記患者が良好な予後を呈することまたは化学療法により処置する必要がない前記患者であることの指標となる、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 表１および表２に記載の遺伝子の発現レベルの定量が、前記遺伝子によりコードされるタンパク質またはその変異体のレベルの定量を含んでなる、請求項１に記載の方法。
  11. タンパク質のレベルの定量が、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、またはタンパク質アレイによって行われる、請求項１０に記載の方法。
  12. 表１および表２に記載の遺伝子の発現レベルを検出することが可能な、試薬。
  13. （ｉ）表１および表２に記載のプローブのヌクレオチド配列またはそれらの転写産物を含んでなる核酸のセット、あるいは
    （ｉｉ）表１および表２に記載のプローブとハイブリダイズするヌクレオチド配列の遺伝子によりコードされるタンパク質の１つと特異的に結合することが可能な各抗体またはフラグメントからなる、抗原を検出することが可能な抗体またはそのフラグメントのセット
    を含んでなる、請求項１２に記載の試薬。
  14. 前記核酸がＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡのプローブおよび／またはプライマーである、請求項１３に記載の試薬。
  15. 請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の少なくとも１つの試薬を含んでなる、キット。
  16. 前記キットが、核酸のセットを含んでなるＤＮＡまたはＲＮＡアレイであり、前記核酸のセットが、表１および表２のプローブのヌクレオチド配列、またはそのフラグメント、またはそれらの転写産物を含んでなる、請求項１５に記載のキット。
  17. １個または数個の構成性発現遺伝子の核酸分子をさらに含んでなる、請求項１６に記載のキット。
  18. 表１および表２に記載の遺伝子によりコードされるタンパク質または前記タンパク質の任意の変異体と特異的に結合することが可能な抗体またはそのフラグメントからなる抗体のセットを含んでなる、請求項１７に記載のキット。
  19. １個または数個の構成性発現遺伝子によりコードされるタンパク質と特異的に結合することが可能な抗体またはそのフラグメントをさらに含んでなる、請求項１８に記載のキット。
  20. 乳癌と診断された患者の予後診断または乳癌と診断された対象の処置の選択のための、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のキットの使用。
  21. 原発腫瘍の転移傾向を予測するための遺伝子マーカーを選択するための方法であって、下記工程：
    ｉ）腫瘍を自然発生する傾向を示す遺伝子操作非ヒト動物の腫瘍サンプルにおいて、発現が基準値に対して変化している遺伝子を判定する工程；
    ｉｉ）工程ｉ）で同定された遺伝子に対応するヒトの相同遺伝子を同定する工程；および
    ｉｉｉ）原発腫瘍から転移を起こしている患者の原発腫瘍サンプルにおける遺伝子発現が、転移を起こしていない患者の原発腫瘍におけるその遺伝子の発現に対して変化している、工程ｉｉ）で同定された遺伝子を選択する工程
    を含んでなる、方法。
  22. 前記非ヒト動物が、Ｔｐ５３遺伝子の遺伝子発現が阻害される動物である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記動物が、ｐＲｂ遺伝子の阻害された遺伝子発現をさらに呈する、請求項２２に記載の方法。
  24. 工程（ｉ）において得られたサンプルが、表皮癌サンプルである、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記工程ｉｉｉ）が、比例ハザード回帰分析によって行われる、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記回帰分析が、Ｃｏｘ型分析である、請求項２５に記載の方法。
  27. 遠隔転移が、前記Ｃｏｘ型手法で予後変数として確立される、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記遠隔転移が、５年または１０年時点での遠隔転移である、請求項２７に記載の方法。
  29. 工程ｉｉｉ）において分析された前記原発腫瘍が、乳癌腫瘍または膠芽腫瘍である、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 工程ｉｉｉ）による前記遺伝子の発現の判定が、前記遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、もしくは前記ｍＲＮＡのフラグメント、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、もしくは前記ｃＤＮＡのフラグメント、またはそれらの混合物の定量を含んでなる、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 工程ｉｉｉ）による遺伝子の発現レベルの定量が、定量的多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＤＮＡもしくはＲＮＡアレイによって行われる、請求項３０に記載の方法。
  32. 工程ｉｉｉ）による遺伝子の発現レベルの定量が、前記遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルの定量を含んでなる、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
  33. タンパク質のレベルの定量が、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡまたはタンパク質アレイによって行われる、請求項３２に記載の方法。
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