JP2008518620A - 乳癌の治療反応の予後および予測の分子指標 - Google Patents

Abstract

本発明は、エストロゲン受容体（ＥＳＲ１）陽性でリンパ節陰性の乳癌などの乳癌における臨床診断の指針となりうる定量的分子指標に関する。具体的には、本発明は、補助療法として治療薬による治療を受けていない患者において、その発現の変化が外科的に摘出された乳癌の再発の尤度を示す一定の遺伝子に関する。さらに、本発明は、（ａ）タモキシフェンなどの抗エストロゲン治療剤に対する有益な反応の尤度、および（ｂ）化学療法に対して生じる尤度のある有益な反応の大きさを判定するために、連続型変数として測定する、ＥＳＲ１遺伝子など、一定の遺伝子の発現を定量的測定法の利用に関する。

Description

発明の分野
本発明は、例えば、エストロゲン受容体（ＥＳＲ１）陽性、リンパ節陰性乳癌などの乳癌の臨床診断の指針となりうる定量的分子指標に関する。具体的には、本発明は、補助療法として治療薬による治療を受けていない患者において、その発現の変化が外科的に摘出された乳癌の再発の尤度を示す一定の遺伝子に関する。また、本発明は、（ａ）タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）などの抗エストロゲン治療剤に対する有益な反応の尤度、および（ｂ）化学療法に対して生じる尤度のある有益な反応の大きさを判定するために、連続型変数として測定する、ＥＳＲ１遺伝子など、一定の遺伝子の発現を定量的測定法の利用に関する。

関連技術の説明
遺伝子発現の研究
癌専門医は、「標準的な療法」として特徴づけられる化学療法薬のさまざまな組み合わせ、および特定の癌の治療に有効との表示はないが、その癌に効能があるとの証拠がある、いくつかの薬剤など、利用可能な治療選択肢をいくつか有している。良好な治療成果を得る尤度を最大にするには、転移性疾患のリスクが最も大きい患者を同定して、利用できる最適な癌治療に割り当てることが必要である。具体的には、「標準的な療法」治療薬、例えば、シクロスホファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、アントラサイクリン、タキサン、および抗エストロゲン薬、例えば、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）などに対する患者の反応の尤度を決定することが重要である。なぜなら、これらは限定的な効能しかなく、しばしば重度の一連の副作用を有するからである。したがって、利用可能な薬剤を必要とし、それに反応する尤度が最も高い患者と最も低い患者とを識別すれば、患者をより賢明に選択することができ、それによって、これらの薬剤がもたらす正味の恩恵を増大させ、また、正味の罹患率および毒性を低下させることができるであろう。

現在、臨床治療で用いられている診断検査は単一被検体法（ｓｉｎｇｌｅ ａｎａｌｙｔｅ）であるため、何十もの異なる標識間の関係を知ることの潜在的な価値は把握されていない。さらに、診断検査はしばしば免疫組織化学に基づいているが、それらは定量的ではない。免疫組織化学による検査は、検査機関ごとに異なった結果が出るが、これは、一つには試薬が正規化されておらず、また一つには解釈が主観的であることによる。ＲＮＡによる検査は、非常に定量的なものとなる尤度があるが、常法により調製したサンプル、すなわち、ホルマリンで固定してパラフィンに包埋（ＦＰＥ）した腫瘍サンプルの中ではＲＮＡが破壊されるとの認識があり、また、患者の新鮮な検査用組織サンプルを採取して保存するのは不便であるため、いままで用いられてこなかった。

過去２０年間にわたり、分子生物学および生化学によって、その活性が腫瘍細胞の挙動、分化状態、および一定の治療薬に対する感受性または耐性に影響を及ぼす何百もの遺伝子が明らかにされてきた。しかし、少数の例外はあるものの、これらの遺伝子の状態は、薬物療法について日常的な臨床的判断を行う目的で利用されては来なかった。この２、３年、いくつかのグループによって、何千もの遺伝子のマイクロアレイ遺伝子発現解析による、さまざまな癌型の分類に関する研究が発表されている（例えば、Ｇｏｌｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：５３１−５３７（１９９９）；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊａｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１３７９０−１３７９５（２００１）；Ｃｈｅｎ−Ｈｓｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １７（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ３１６−Ｓ３２２（２００１）；Ｒａｍａｓｗａｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１５１４９−１５１５４（２００１）；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：２２３２−２２３８ （２０００）；Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１１４６２−１１４（２００１）；Ｓｏｒｌｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１０８６９−１０８７４（２００１）；Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：８３７５−８３８０（２００１）参照）。しかし、主には、マイクロアレイには新鮮であるか冷凍された組織ＲＮＡが必要とされるが、そのようなサンプルは、同定された分子的特徴を臨床評価できるほど十分な量存在しないという理由から、これらの研究によっても、臨床診察において日常的に使用できる試験法は未だに得られていない。

この３年で、ＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて、ホルマリン固定したパラフィン包埋（ＦＰＥ）組織の中で、数百もの遺伝子の遺伝子発現をプロファイルすることが可能となった。非常に高感度で、正確、かつ再現性のある方法が説明されてきた（非特許文献１）。数千もの保管されているＦＰＥ臨床組織サンプルが、例えば、生存率、薬物療法歴などの関連臨床記録とともに存在するため、今や、このような組織の中での遺伝子発現を定量的に測定することができるようになり、あるいくつかの遺伝子の発現を、患者の予後および治療に対する反応の尤度に関連づける迅速な臨床研究が可能となっている。臨床徴候には歴史性があるため、過去の臨床研究で作成されたデータを用いることによって迅速に結果を得ることができる。これに対し、例えば、新たに集めた癌患者について生存期間の研究を行ないたければ、一般的には、統計学的に十分な数の死亡例が生じるまで何年間も待つ必要があるだろう。

乳癌の予後および予測
合衆国では、乳癌が女性の間で最も普通の癌であり、４０〜５９歳の女性の癌死亡の主な原因となっている。

現在、乳癌では、ほんのわずかな分子検査法が日常的に臨床上使用されているにすぎない。エストロゲン受容体（ＥＳＲ１）タンパク質およびプロゲステロン受容体（ＰＧＲ）タンパク質についての免疫組織化学的アッセイ法が、タモキシフェン（ＴＡＭ）などの抗エストロゲン薬による治療の対象となる患者を選択するための基礎として利用されている。また、インサイツハイブリダイゼーション法においてＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ２）免疫化学法または蛍光法（それぞれタンパク質およびＤＮＡを測定する）を用いて、Ｈｅｒ２アンタゴニスト薬、例えばトラスツズマブ（登録商標Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）による治療の対象となる患者を選択する。

予後、および化学療法に対する反応を予測のための現在の検査法は不十分であるため、乳癌の治療戦略は、癌専門医の間で異なっている（Ｓｃｈｏｔｔ ａｎｄ Ｈａｙｅｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．ＰＭＩＤ１５５０５２７４（２００４）；非特許文献２）。一般に、腫瘍がＥＳＲ１陽性であることが分かっているリンパ節陰性患者は、ＴＡＭなどの抗エストロゲン薬による治療を受け、腫瘍がＥＳＲ１陰性であることが分かっている患者は化学療法による治療を受ける。しばしば、ＥＳＲ１陽性患者は、抗エストロゲン薬に加えて化学療法も処方され、癌再発の危険を適度に減らすために化学療法による有毒な副作用を受け入れる。毒性には、神経障害、嘔気やその他の胃腸症状、脱毛、および認知障害が含まれる。再発乳癌は通常、転移性があり、かつ治療に反応しにくいため、再発を恐れられている。明らかに、再発の実質的な危険性がある患者を（すなわち、予後に関する情報を提供するために）同定し、また化学療法に反応する尤度のある患者を（すなわち、予測に関する情報を提供するために）同定する必要が存在する。同様に、再発の顕著な危険性のない患者、または化学療法に反応する見込みのない患者を、これらの毒性薬に不必要に曝すべきではないから、このような患者を同定する必要も存在する。

乳癌においては、予後因子は治療予測因子とは異なる。予後因子は、乳癌の自然史に関連した変数であって、かつて乳癌を発症した患者の再発率と結果に影響を与える変数である。予後不良に関係した臨床的要素には、例えば、リンパ節の関与、腫瘍サイズの増大、および高悪性度の腫瘍が含まれる。予後因子は、患者を、異なった再発基礎的リスクをもつサブグループに分類するためにしばしば用いられる。それに対し、治療予測因子は、予後とは別に、例えば、抗エストロゲン薬または化学療法などの治療に対して個々の患者が有益な反応を示す尤度に関連した変数である。

開業医が、十分な根拠のあるリスク便益分析に基づいて、個々の患者の必要に合った、賢明な治療法選択を行なうのを補助することができる、正確で定量的な予後因子および予測因子が大いに必要とされている。
Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（２００４）１６４：３５−４２ Ｈａｙｅｓ，Ｂｒｅａｓｔ（２００３）１２：５４３−９

一つの態様において、本発明は、乳癌患者における疾患の結果の予後を予測する方法であって、
（ａ）患者から採取した癌細胞を含む生体サンプルにおいて、以下の変数：
（ｉ）増殖グループスコア、
（ｉｉ）侵襲グループスコア、
（ｉｉｉ）増殖グループ閾値スコア、および
（ｉｖ）遺伝子ＣＣＮＢ１、ＢＩＲＣ５、ＭＹＢＬ２、ＰＧＲ、ＳＴＫ６、ＭＫＩ６７、ＧＳＴＭ１、ＧＡＰＤ、ＲＰＬＰＯ、およびＭＭＰ１１の１つ以上のもののＲＮＡ転写物、またはその発現産物の発現レベル、
の１つ以上のものの値を定量的に測定することを含み、
（ｂ１）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の１つ以上のものの値、および／または各遺伝子ＣＣＮＢ１、ＢＩＲＣ５、ＭＹＢＬ２、ＳＴＫ６、ＭＫＩ６７、ＧＡＰＤ、およびＭＭＰ１１のうちの１つ以上の遺伝子のＲＮＡ転写産物、またはそれに対応する発現産物の増加分１単位ごとに、その患者が、疾患の結果不良のリスクを比例して増加させていると同定され、また
（ｂ２）各遺伝子ＰＧＲ、ＧＳＴＭ１、およびＲＰＬＰＯのうちの１つ以上の遺伝子のＲＮＡ転写産物、またはそれに対応する発現産物の発現レベルの増加分１単位ごとに、その患者が、疾患の結果不良のリスクを比例して低下させていると同定されるが、
ここで
増殖グループのスコア＝（ＢＩＲＣ５＋ＭＫＩ６７＋ＭＹＢＬ２＋ＣＣＮＢ１＋ＳＴＫ６）／５；
侵襲グループのスコア＝（ＣＴＳＬ２＋ＭＭＰ１１）／２；
増殖グループ閾値スコアは、増殖グループのスコアが６．５よりも小さければ、６．５に等しく、増殖グループのスコアが６．５以上であれば、増殖グループのスコアと同一であり、式中、
等式の中の遺伝子記号は、各遺伝子のＲＮＡ転写物、またはその発現産物の発現レベルを表わし、また、
上記いずれかの変数に存在する遺伝子は、適用可能な腫瘍型において、０．５よりも大きいピアソン係数で上記腫瘍型において上記遺伝子とともに同時発現する別の遺伝子によって置換することができる方法に関する。

患者は、ヒトなどの高等霊長類を含む哺乳動物であってよく、好ましくはヒト患者である。

疾患の結果は、患者全体の生存率、無再発生存率、無遠位再発生存率など、さまざまな形で表わすことができる。

具体的な実施形態において、予後は、患者が該乳癌の外科的切除後に、さらなる治療を受けないことを前提としている。

別の実施形態において、発現レベルを、１つ以上の参照遺伝子、またはその発現産物の発現レベルに対して正規化させるが、ここで、参照遺伝子は、例えば、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤ、ＧＵＳ、ＲＰＬＰＯ、およびＴＦＲＣからなる群から選択することができる。

さらに別の実施形態において、発現レベルを、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤ、ＧＵＳ、ＲＰＬＰＯ、およびＴＦＲＣの発現レベルの平均値に対して基準化する。

特定の実施例において、該疾患の結果の定量値は、一連の期間にわたって（ｏｖｅｒ ａ ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ）測定した変数の値に直接比例している。

さらなる実施形態において、本方法は、増殖スコア、任意には、増殖グループ閾値スコアと侵襲グループのスコアのどちらか一方または両方を測定することを含む。

本発明の方法は、（ｉｖ）に挙げた各遺伝子、またはそれらの発現産物の少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも７つ、または少なくとも８つの発現レベルを測定することを含むことが可能である。

特定の実施形態において、この方法は、（ｉｖ）に挙げた各遺伝子のすべて、またはそれらの発現産物の発現レベルを測定することを含む。

乳癌は、例えば、リンパ節陰性および／またはＥＳＲ１陽性であってよい。

本発明の方法は、同一の患者に、化学療法、ホルモン療法および／または放射線療法の前後に１回以上施すことができる。

患者は、疾患の結果不良のリスクが増大していると判定されれば、そのような判定が行われた後に、化学療法、ホルモン療法および／または放射線療法の治療を受けることができるが、ここで化学療法は、術後補助化学療法および術前補助化学療法など、臨床診療で用いられる全ての化学療法を含む。

特定の実施形態において、この化学療法はタキサン誘導体、例えば、ドセタキセルまたはパクリタキセルの投与を含む。

別の実施形態において、この化学療法はアントラサイクリン誘導体、例えば、ドキソルビシンの投与を含む。

さらに別の実施形態において、この化学療法はトポイソメラーゼ阻害剤、例えば、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、２０−Ｓ−カンプトテシン、９−ニトローカンプトテシン、９−アミノ−カンプトテシンまたはＧＩ１４７２１１の投与を含む。

さらなる実施形態において、ホルモン療法はＴＡＭの投与を含む。

さらに別の実施形態において、このホルモン療法は抗エストロゲン薬の投与を含むが、これは、エストロゲン受容体に対するエストロゲンの結合の拮抗剤であるか、または、アロマターゼ阻害剤など、エストロゲン生合成の阻害剤であってもよい。このような抗エストロゲン薬の具体的な代表例には、トレミフェン、アナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）、およびメガステロールアセテート（ｍｅｇａｓｔｅｒｏｌ ａｃｅｔａｔｅ）などがある。

本発明の方法によって測定を行った生体サンプルは固形腫瘍由来のサンプル、すなわち癌細胞を含む組織サンプルであってよい。

この組織は、例えば、固定され、パラフィン包埋されているか、新鮮なものか、または冷凍されたものでもよく、細針生検、コア生検、またはその他の型の生検に由来するものでもよい。具体的な実施形態において、組織サンプルは、細針吸引、気管支洗浄、経気管支生検によって得られる。

さらなる実施形態において、遺伝子発現レベルは定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定される。

さらに別の実施形態において、発現産物の発現レベルは、免疫組織化学法によるか、プロテオミクス技術によって測定される。

なおさらなる実施形態において、本発明の方法はさらに、予後を要約したレポートを作成する工程を含む。

別の態様において、本発明は、抗エストロゲン薬による治療に対する、ＥＳＲ１陽性乳癌患者の有益な反応の尤度を定量的に測定するための方法であって、該患者から得られた、癌細胞を含む生体サンプルにおいて、次の変数：
（ｉ）ＥＳＲ１グループのスコア、および
（ｉｉ）以下の各遺伝子、ＥＳＲ１、ＳＣＵＢＥ２、ＴＦＲＣ、およびＢＣＬ２の１つ以上のもののＲＮＡ転写産物、またはそれらの発現産物の発現レベル
の１つ以上のものを定量的に測定する方法を含み、
ＥＳＲ１グループのスコア、ＥＳＲ１、ＳＣＵＢＥ２、またはＢＣＬ２の数値の増加分１単位ごとに、患者が抗エストロゲン薬による治療に対して有益な反応を示す尤度が比例して増加すると同定され、また、ＴＦＲＣの数値の増加分１単位ごとに、患者が抗エストロゲン薬による治療に対して有益な反応を示す尤度が低下すると同定される方法に関する。

一つの実施形態において、ＥＳＲ１グループのスコア、あるいはＥＳＲ１遺伝子またはその発現産物の発現レベルを測定する。

別の実施形態において、ＥＳＲ１遺伝子またはその発現産物の発現レベルを測定する。

例えば、抗エストロゲン薬は、タモキシフェン、トレミフェン、アナストロゾール、およびメガストロールアセテートからなる群から選択することができる。

別の実施形態において、抗エストロゲン薬はＴＡＭである。

本発明の治療予測法は、治療法の推奨など、患者のための報告書を作成する工程を含むことができる。

さらなる実施形態において、患者のＥＳＲ１発現が、同じ検査で、ある割合のＥＲ陽性で節陰性の乳癌患者について測定された発現値よりも高い場合には、化学療法を用いない抗エストロゲン薬治療が推奨され、また、この患者は、その他の点では低リスクグループに属することが知られる。

別の実施形態において、前記変数はＥＳＲ１のＲＮＡ転写物またはその発現産物の発現レベルである。

さらなる実施形態において、この方法は患者の再発スコアを決定する工程を含む。

特定の実施形態において、再発スコアを決定した後に、患者のＥＳＲ１発現がゼロではないが、特定の割合のＥＲ陽性で節陰性の乳癌患者について同じ検査で測定された発現値よりも低く、それ以外では、その患者は、高再発リスクグループに入っていることが分かっている場合には、化学療法を含む治療法が推奨される。

さらに別の態様において、本発明は、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、表１に挙げた遺伝子の１つ以上のものの発現を定量化するための、一組の遺伝子特異的プローブおよび／またはプライマーを含むキットに関する。

具体的な実施形態において、遺伝子特異的プローブは、表７に挙げたプローブからなる群から選択される。

別の実施形態において、遺伝子特異的プライマーは、表７に挙げたフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなる群から選択される。

さらに別の実施形態において、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって増幅されるアンプリコンを、表８に挙げたアンプリコンから選択する。

さらに別の実施形態において、本発明のキットは、腫瘍サンプルからＲＮＡを発現させるための１種類以上の試薬、および／または、１つ以上の容器を含むことができる。ただし、この容器は、例えば、作成済みマイクロアレイ、緩衝液、ヌクレオチド三リン酸、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、プローブ、またはプライマーを含むことができる。このキットは、さらに、その構成成分を使用するための指示書、例えば、乳癌の予測または予後予測に使用するための指示書を有するラベルまたは添付文書を含むことができる。

Ａ．定義
本明細書において使用する専門用語および科学用語は、別段の定義がない限り、本発明が属する技術分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４）；およびＷｅｂｓｔｅｒ’ｓ Ｎｅｗ Ｗｏｒｌｄ（ＴＭ）Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．，２００３が、本出願で使用される用語の多くに対する一般的な手引きを当業者に提供している。本発明の目的上、以下の用語を下記に定義する。

「有益な反応」という用語は、例えば全体的生存、無進行生存、無再発生存、および無再遠隔再転移生存など、当技術分野において普通に用いられる指標など、患者の状態のいずれかの指標の改善を意味する。無再発生存（ＲＦＳ）は、手術の時から、最初に局所的、領域的、または遠位的に再発するまでの時間（年数）を意味する。無遠位再発生存期間（ＤＦＲＳ）は、手術から最初の解剖学的遠隔転移までの時間（年数）を意味する。これらの指標の実際の計算法は、打ち切りとなるか、または考慮されない事象の定義に応じて研究ごとに異なる。

「マイクロアレイ」という用語は、ハイブリダイズ可能なアレイ要素、好ましくはポリヌクレオチドプローブが、基質上に規則正しく並べられたものを意味する。

「ポリヌクレオチド」という用語は、単数で用いられても複数で用いられても、一般にポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味し、未修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであろう。したがって、例えば、本明細書で定義されたポリヌクレオチドには、一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖および二本鎖の領域を含むＤＮＡ、一本鎖および二本鎖のＲＮＡ、一本鎖および二本鎖の領域を含むＲＮＡ、ならびに一本鎖、もしくは、より一般的には二本鎖であるか、または一本鎖もしくは二本鎖の領域を含んでいるＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれるが、これらに限定されない。さらに、本明細書において使用する「ポリヌクレオチド」という用語は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三重鎖領域を意味する。このような領域の中にある鎖は、同じ分子に由来するものでも、異なる分子に由来するものでもよい。この領域は、これら１つ以上の分子の全部を含むことができるが、より一般的には、分子のいくつかのものの一領域のみを含む。三重らせん領域の分子の１つは、しばしばオリゴヌクレオチドである。「ポリヌクレオチド」という用語は、具体的にはｃＤＮＡを含む。この用語は、１つ以上の修飾塩基を含むＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）およびＲＮＡを含む。したがって、安定性のため、またはその他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書で意図されている用語としての「ポリヌクレオチド」である。さらに、例えばイノシンなどの稀な塩基または、例えばトリチウム化した塩基などの修飾塩基を含むＤＮＡもしくはＲＮＡも、本明細書で定義する「ポリヌクレオチド」という用語の範囲内に含まれる。一般に「ポリヌクレオチド」という用語は、非修飾ポリヌクレオチドを化学的、酵素的および／または代謝的に修飾した形態のもの、および、ウイルス、ならびに単純細胞および複雑型細胞を含む細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学形物質態を含む。

「オリゴヌクレオチド」という用語は、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖または二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、および二本鎖ＤＮＡなど、比較的短いポリヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチド、例えば一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドは、化学的な方法によって、例えば市販されているオリゴヌクレオチド自動合成装置を用いて合成される。しかし、インビトロ組換えＤＮＡ介在法、および細胞および生物においてＤＮＡを発現させるなど、その他の種々の方法によってオリゴヌクレオチドを製造することができる。

「遺伝子発現」という用語は、ＤＮＡ遺伝子配列の情報が、転写ＲＮＡ（初期非スプライスＲＮＡ転写物または成熟型ｍＲＮＡ）またはそれにコードされたタンパク質産物に転換されることをいう。遺伝子発現は、遺伝子またはサブ配列の全ＲＮＡまたはタンパク質産物の量を測定してモニターすることができる。

「遺伝子増幅」という語句は、遺伝子または遺伝子断片の複数のコピーが特定の細胞または細胞株の中で形成される過程を意味する。複写された領域（増幅ＤＮＡ鎖）は、しばしば「アンプリコン」と呼ばれる。しばしば、産生されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量、すなわち遺伝子発現レベルは、発現した特定の遺伝子でできたコピーの数に比例して増加する。

予後因子は乳癌の自然史に関連した変数であり、いったん患者が乳癌を発症すると、患者の再発率および結果に影響する。予後不良に関連する臨床的指標には、例えばリンパ節転移、腫瘍サイズの増大、および高悪性度の腫瘍などがある。予後因子は、さまざまな基礎的再発リスクをもつサブグループに分類するためにしばしば用いられる。それに対し、治療予測因子は、予後とは別に、例えば、抗エストロゲン薬または化学療法などの治療に対して個々の患者が有益な反応を示す尤度に関連した変数である。

本明細書では「予後」という用語を用いて、癌の自然史における、癌に起因する死亡または、例えば乳癌などの腫瘍性疾患の再発および転移拡散など、癌の進行の尤度を意味する。予後因子は、例えば乳癌などの腫瘍性疾患の自然史に関連した変数であり、いったん患者が前記腫瘍性疾患、例えば乳癌などを発症すると、患者の再発率および結果に影響する。これとの関連で、「自然結果」は、さらなる治療を受けない場合の結果を意味する。例えば乳癌のケースでは、「自然結果」は、外科的切除後さらなる治療（例えば化学療法または放射線治療など）を受けない場合の結果を意味する。予後因子は、さまざまな基礎的リスク、例えば基礎的再発リスクをもつサブグループに分類するためにしばしば用いられる。

本明細書では「予測」という用語を用いて、患者が薬剤または薬剤セットに対して好ましい反応をするか否かの尤度、およびその反応の程度も意味する。したがって、治療予測因子は、予後に依存しない、特定の治療法に対する個々の患者の反応の尤度に関する変数である。本発明の予測法を臨床的に用いて、具体的な患者のために最も適切な治療モダリティーを選択して、治療法を決定することができる。本発明の予測法は、患者が、例えばＴＡＭ療法単独または化学療法および／または放射線療法と併用など、坑エストロゲン療法などの治療計画に好ましく反応する尤度があるかどうかを予測するのに役に立つ手段である。

本明細書では「長期」生存という用語を用いて、外科手術またはその他の治療の後、少なくとも３年間、より好ましくは少なくとも８年間、最も好ましくは少なくとも１０年間生存することを意味する。

本明細書で用いる「腫瘍」という用語は、悪性か良性かを問わず、全ての腫瘍性細胞の成長ならびに増殖、ならびに全ての前癌性および癌性の細胞および組織を意味する。

「癌」および「癌性」という用語は、一般に無秩序な細胞増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を意味するか、表現している。癌の例には、乳癌、卵巣癌、大腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵癌、子宮頸癌、肝臓癌、膀胱癌、泌尿器癌、甲状腺癌、腎臓癌、腫瘍型、黒色腫、および脳腫瘍などがあるが、これらに限定されない。

癌の「病理」は、患者の健康を脅かす全ての現象を含む。これには、異常または制御不能な細胞の成長、転移、隣接細胞の正常な機能に対する干渉、異常なレベルでのサイトカインまたはその他の分泌産物の放出、炎症反応または免疫反応の抑制または悪化、新生組織形成、前悪性腫瘍、悪性腫瘍、例えばリンパ節など、周囲または遠隔の組織または器官への浸潤などがあるが、これらに限定されない。

本発明に関連して、いずれかの特定の遺伝子セットの中に挙げられた遺伝子の「少なくとも１つ」、「少なくとも２つ」、「少なくとも３つ」、「少なくとも４つ」、「少なくとも５つ」などという場合、リストされた遺伝子のいずれか１つ、またはいくつか、および全ての組み合わせを意味する。

本明細書においては、例えば「節陰性」乳癌など、「節陰性」癌という用語を用いて、リンパ節に転移していない癌を意味する。

「スプライシング」および「ＲＮＡスプライシング」という用語は互換的に用いられ、イントロンを除去し、エクソンを結合して、連続したコード配列をもち、真核細胞の細胞質の中に入って行く成熟型ｍＲＮＡを産生するＲＮＡプロセシングを意味する。

理論上、「エクソン」という用語は、成熟型ＲＮＡ産物に相当する、分断された遺伝子の分節（セグメント）を意味する（Ｂ．Ｌｅｗｉｎ．Ｇｅｎｅｓ ＩＶ Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｍａｓｓ．１９９０）。理論上、「イントロン」という用語は、転写はされるが、その両側にあるエクソンと一緒にスプライシングされて、転写産物の中から除去される、ＤＮＡのセグメントを意味する。操作上、エクソン配列は、参照配列番号によって定義された遺伝子のｍＲＮＡ配列の中に存在する。操作上、イントロン配列は、遺伝子のゲノムＤＮＡの中にある介在配列であり、エクソン配列によって囲まれ、５’および３’境界にＧＴおよびＡＧスプライスコンセンサス配列を有している。

Ｂ．詳細な説明
本発明の実施には、別段の記載がないかぎり、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、および生化学の従来技術を用いられるが、それらは当技術分野の範囲内にある。そのような技術は、例えば”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）； ”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；”Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；”Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”， ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｄ． Ｍ． Ｗｅｉｒ＆Ｃ． Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ， ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，１９８７）；”Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ”（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， １９８７）；”ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”， （Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）などの文献において十分に説明されている。

Ｂ．１．発明の一般的説明
過去２年間Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，Ｉｎｃ およびその共同研究者ら（Ｅｓｔｅｂａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ａｍ Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２２：ｐａｇｅ ８５０，２００３（ａｂｓｔｒａｃｔ ３４１６）；Ｃｏｂｌｅｉｇｈ ｅｔ ａｌ．Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２２：ｐａｇｅ ８５０，２００３（ａｂｓｔｒａｃｔ ３４１５）；Ｓｏｕｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ａｍ Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２２：ｐａｇｅ ８６２，２００３（ａｂｓｔｒａｃｔ ３４６６））によって、再発リスクを表わす分子署名（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を見出すことを目的として、初期乳癌における遺伝子発現の予備的臨床治験がいくつか報告された。これらの研究は、関連した臨床記録を有する凍結したパラフィン包埋（ＦＰＥ）サンプルの中で、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて２５０個の候補遺伝子マーカーの試験を行うものであった。３つの研究の全てにわたり、多様な患者集団を通して、再発リスクに一貫して関係した遺伝子を同定できるか否かを調べるために解析が行われた。これら一変量の結果の基づき、多重遺伝子モデルをデザインして、３つの研究の全てにわたり解析した。１６個の癌関連遺伝子および５個の参照遺伝子からなる単一多重遺伝子測定法が開発されて、臨床評価研究において前向きに試験された。これら２１個のｍＲＮＡ種の測定値を利用して、１００点満点制で再発リスクを読み出す、再発スコア（ＲＳ）と呼ばれるアルゴリズムが作成された。

この再発スコア検査およびアルゴリズムの臨床評価試験を行うために、前向きに定められたエンドポイントを用いる盲検臨床試験が実行された。この評価試験では、米国乳房・腸外科補助療法プロジェクト（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ Ｂｏｗｅｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ）（ＮＳＡＢＰ）研究Ｂ−１４臨床治験集団の無作為治療群および登録治療群におけるＴＡＭ単独による治療を受けた患者に注目した（Ｆｉｓｈｅｒ Ｂ，Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ Ｊ Ｐ，Ｒｅｄｍｏｎｄ Ｃ Ｋ，ｅｔ ａｌ：Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ＴＡＭ−ｔｒｅａｔｅｄ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ： Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ Ｂｏｗｅｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＮＳＡＢＰ）Ｂ−１４．Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８６：５２７−５３７（１９９４））。Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，Ｉｎｃ．およびＮＳＡＢＰは、これらの患者に由来する６６８個の乳癌組織サンプルについて２１個の遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ測定を行い、各患者の再発スコアを算出した。

再発スコアの予め設定されたカットオフ値により、患者を、遠位再発の低リスク、中リスク、高リスクという３つの群に分類した。ＲＴ−ＰＣＲ測定によって、低リスク、中リスク、高リスクと分類された６６８人の患者の比率はそれぞれ５１％、２３％、および２７％であった。１０年間の遠位再発率のカプラン・マイヤー推定値および９５％信頼区間は、低リスク群、中リスク群、および高リスク群について、それぞれ６．８％（４．０％、９．６％）、１４．３％（８．３％、２０．３％）、３０．５％（２３．６％、３７．４％）であり、低リスク群の比率は、高リスク群の比率より有意に低かった（ｐ＜０．００１）。遠位再発を再発スコア、年齢、および腫瘍サイズに関連付ける多変量コックス（Ｃｏｘ）モデルでは、再発スコアが、年齢や腫瘍サイズを上回る、有意な（ｐ＜０．００１）予測力を提供する。この研究によって、再発スコアが、ＥＳＲ１陽性の腫瘍を有しＴＡＭによる治療を受けた患者における遠位再発の強力な予測因子であることが確認された（Ｐａｉｋ ｅｔ ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ８２，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １：ｐａｇｅ Ｓ１０，２００３（Ａｂｓｔｒａｃｔ １６））。

本明細書に開示した発明は、一部は、ＮＳＡＢＰのＢ−１４臨床試験（Ｂ−１４）のプラセボ治療群の患者についての研究や、また、一部には、Ｂ−１４プラセボ治療群の患者を、ＮＳＡＢＰのＢ−１４試験の無作為治療群および登録治療群でＴＡＭ療法を受けた患者と比較した結果によるものである。１６個の癌関連遺伝子および５個の参照遺伝子の発現を定量化するためのＲＴ−ＰＣＲ測定法を用いて、プラセボ治療を受けた患者由来の乳癌組織を定量的に解析した。

定量的遺伝子発現解析の結果、予後の分子指標が同定された。ＮＳＡＢＰのＢ−１４試験のプラセボ治療群における遺伝子発現と無遠位再発生存との関係の解析に基づいて、患者にさらなる治療を施さなければ、その発現レベルが結果の指標となる、一組の遺伝子が同定された。結果は、生存、無再発生存および無遠位再発生存など、さまざまな測定値に表出するが、それらは全て本発明の範囲内にある。

同定した予後遺伝子および遺伝子群を、単独あるいは特定の組み合わせで用いて、特定の患者の結果の尤度を予測することができる。予後指標には、具体的には増殖グループ（ＢＩＲＣ５＋ＭＫＩ＋ＭＹＢＬ２＋ＣＣＮＢ１＋ＳＴＫ６）、侵襲グループ（ＣＴＳＬ２＋ＭＭＰ１１）、および個別の遺伝子、ＣＣＮＢ１、ＢＩＲＣ５、ＭＹＢＬ２、ＰＧＲ、ＳＴＫ６、ＭＫＩ、ＧＳＴＭ１、ＧＡＰＤ、ＲＰＬＰ０、ならびにＭＭＰ１１の１つ以上を含む。

別の態様において、本明細書に開示した遺伝子発現解析の結果、Ｂ−１４のプラセボ治療群の未治療患者と、またＢ−１４の登録治療群および無作為治療群のＴＡＭ治療患者とにおける、遺伝子発現と遠位再発との関係の解析に基づいて、例えばＴＡＭなどの坑エストロゲン薬に対する有益な反応の分子指標を同定することができた。

プラセボコホート群および治療コホート群の複合集団における遺伝子発現と無遠位再発生存との関係の相互作用解析に基づいて、一組の遺伝子および遺伝子群を同定したが、その発現レベルはＴＡＭ療法に対する有益な反応を示すものである。これらの遺伝子および遺伝子群を単独あるいは特定の組み合わせで用いて、個別の患者について、ＴＡＭ、または別の坑エストロゲン薬による治療に対する有益な反応を予測することができる。具体的には、これらの遺伝子／遺伝子群はＥＳＲ１グループ（ＥＳＲ１＋ＰＧＲ＋ＢＣＬ２＋ＳＣＵＢＥ２）、ならびに個別の遺伝子、ＥＳＲ１、ＳＣＵＢＥ２、ＴＦＲＣ、およびＢＣＬ２のうち１つ以上のものである。

本発明の重要な発見は、ＥＳＲ１の量的レベルが、１４ポイントの発現スケールにわたる連続型変数として、ＴＡＭが有益である尤度と関係していることである。従って、ＥＳＲ１遺伝子の発現レベルが高いほど、反応の見込みが大きくなることから、個別の患者に対して、この治療剤の利益を受ける尤度を量的に推定する値を提供することが可能である。この情報はいく通りかに利用することができる。ＴＡＭ療法およびその他の坑エストロゲン療法に対して有益な反応を示す確率を、従来利用可能であったものよりも細かく評価することが可能となる。ＴＡＭは、子宮癌、深部静脈血栓、肺塞栓症、および白内障など、顕著な副作用を有している（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ２００２）。同様に、その他の坑エストロゲン薬、例えばトレミフェン（登録商標Ｆａｒｅｓｔｏｎ、Ｏｒｉｏｎ，Ｃｏｒｐ．）、アナストロゾール（登録商標Ａｒｉｍｉｄｅｘ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、およびメガステロールアセテートなども重篤な副作用を有している。本発明の結果として、患者および彼らの癌専門医は今や、ＴＡＭ療法、またはその他の坑エストロゲン療法が適切かどうかを判断する際に、ＥＳＲ１スコアを用いてリスクと利益を評価することができる。

臨床診断では、通常、ＥＳＲ１の発現（主にタンパク質の量を免疫化学的に測定して決定される）を用いて、「ＥＳＲ１陽性」の状態か「ＥＳＲ１陰性」の状態かに基づいて、患者をＴＡＭにより治療すべきか否かを決定するが、本発明の根底をなす発見は、従来の診断基準によって既に「ＥＳＲ１陽性」であると規定された患者に関するものである。本発明により、この患者集団において、ＴＡＭ治療、またはその他の坑エストロゲン薬による治療に対して有益な反応が示される尤度を測定することができる。

ＥＳＲ１の発現レベルを再発スコア（後述）と一緒に用いて、各患者にＴＡＭ（または別の坑エストロゲン薬）単独を処方するか、ＴＡＭ（または別の坑エストロゲン薬）と化学療法を併用して処方すべきかを決定することができる。

さらに、本発明では、ＴＡＭ治療、またはその他の坑エストロゲン薬による治療による有益さが高度、中度、または低度であると予測する正確なＥＳＲ１切点によって、特定の検査法を設計することが可能になるが、その例は下記の実施例に示されている。

本発明のさまざまな実施形態において、開示した遺伝子の発現レベルを測定するために、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、連続遺伝子発現解析（ＳＡＧＥ）、および超並列的配列解析（ＭＰＳＳ）など、さまざまな技術的アプローチが利用可能であるが、これについては下記に詳述する。具体的な実施形態において、各遺伝子の発現レベルは、エクソン、イントロン、タンパク質エピトープ、およびタンパク質活性など、その遺伝子の発現産物のさまざまな特徴と関連づけて測定することが可能である。

Ｂ．２．遺伝子発現プロファイリング
一般に、遺伝子発現プロファイリングの方法は、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション解析に基づく方法、およびポリヌクレオチドの配列決定に基づく方法という２つの大きなグループに分けることができる。当技術分野において知られている、サンプル中でのｍＲＮＡ発現を定量化するために最も一般的に用いられる方法には、ノーザンブロット法ならびにインサイツハイブリダイゼーション法（Ｐａｒｋｅｒ＆Ｂａｒｎｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０６：２４７−２８３（１９９９））、ＲＮＡ分解酵素保護アッセイ（Ｈｏｄ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：８５２−８５４（１９９２））、および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ法）（Ｗｅｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：２６３−２６４（１９９２））などがある。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖、またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖など、特異的な二重鎖を認識することができる抗体を使用することも可能である。シーケンシングによる遺伝子発現解析のための代表的な方法には、連続遺伝子発現解析法（ＳＡＧＥ）、および超並列的配列解析法（ＭＰＳＳ）による遺伝子解析法などがある。

腫瘍形成に通常含まれる２つの生物学的過程は、遺伝子増幅とＤＮＡメチル化である。この２つの過程の結果、腫瘍の形成または進行にとって重要な遺伝子の異常発現が生じる。従って、遺伝子増幅およびＤＮＡメチル化をモニターする方法が、遺伝子発現プロファイリングの代替的方法と考えることができる。

遺伝子増幅は、細胞性癌遺伝子の高度発現を引き起こすことがある、多くの癌における一般的な変化である（Ｍｅｌｔｚｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．１９：９３（１９８６））。乳癌においては、ＥＲＢＢ２遺伝子の増幅とＥＲＢＢ２の過剰発現との間には充分な相関関係がある（Ｎａｇａｉ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ ８：２９（１９９３），Ｓａｖｉｎａｉｎｅｎ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６０：３３９（２００２））。ＥＲＢＢ２遺伝子の増幅は、その過剰発現を引き起こすが、予後不良と相関し（Ｐｒｅｓｓ，Ｍ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１５：２８９４（１９９７），Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：７０７（１９８９））、標準的な化学療法と併用した場合の坑ＨＥＲ２療法に対する反応を予測できる（Ｓｅｉｄｍａｎ，Ａ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９：１８６６（２００１））。

ＤＮＡメチル化も、広範囲の遺伝子の発現上昇または発現低下を引き起こす、癌における一般的な変化であることが分かっている（Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．Ａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５：２４６３（１９９６））。一般的に、プロモーター領域および調節因子の中にあるＣｐＧアイランドの低メチル化によって、多くの癌細胞含む遺伝子の発現の低下がもたらされる（Ｈａｎａｄａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８２：１８２０（１９９３），Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｐ．ａｎｄ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．Ｎａｔｕｒｅ ３０１：８９（１９８３））。ＤＮＡメチル化は、多くの癌における特異的な遺伝子発現の量に相関しているため、腫瘍の発現プロファイリングの有用な代替法として役に立つ（Ｔｏｙｏｔａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９７：２８２３（２００１），Ａｄｏｒｊａｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１０：ｅ２１（２００２））。

ａ．逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
上記の技術の中で、最も感度が高く、かつ最もフレキシブルな定量化法はＲＴ−ＰＣＲであり、これを用いて、さまざまなサンプル集団、正常な組織および腫瘍組織、薬物療法の有無などにおけるｍＲＮＡの量を比較したり、遺伝子発現のパターンを特徴づけたり、密接に関係するｍＲＮＡ同士を識別したり、また、ＲＮＡ構造を解析したりすることができる。

第一の工程は、ｍＲＮＡを標的サンプルから単離することである。出発物質は一般に、ヒトの腫瘍もしくは腫瘍細胞株、および、それらに対応する正常組織もしくは細胞株から単離した全ＲＮＡである。すなわち、健康なドナーに由来するＤＮＡプールを用いて、乳房、肺、大腸、前立腺、脳、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、睾丸、卵巣、子宮などの多様な原発腫瘍、腫瘍、または腫瘍細胞株からＲＮＡを単離することができる。ｍＲＮＡの由来源が原発腫瘍であれば、ｍＲＮＡを、例えば冷凍または保存されているパラフィン包埋固定（例えばホルマリン固定）組織サンプルから抽出することができる。

ｍＲＮＡ抽出の一般的な方法は当技術分野においてよく知られており、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９７）など、分子生物学の標準的な教科書に記載されている。パラフィン包埋組織からＲＮＡを抽出する方法は、例えばＲｕｐｐ ａｎｄ Ｌｏｃｋｅｒ，Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．５６：Ａ（１９８７）、およびＤｅ Ａｎｄｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８：４２０４４（１９９５）に開示されている。特に、ＲＮＡ単離は、例えばＱｉａｇｅｎなどの製造業者から購入した精製キット、緩衝液セット、およびタンパク質分解酵素を用いて、メーカーの指示書に従って行うことができる。例えばＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニカラムを用いて、培養細胞由来の全ＲＮＡを単離することができる。その他の市販されているＲＮＡ単離キットには、商標ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（登録商標ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、およびＰａｒａｆｆｉｎ Ｂｌｏｃｋ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）などがある。ＲＮＡ Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を用いて、組織サンプルから全ＲＮＡを単離することができる。腫瘍から調製したＲＮＡは、例えば塩化セシウム密度勾配遠心法によって単離することができる。

ＲＮＡがＰＣＲの鋳型として用いることができないため、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングの最初の工程では、ＲＮＡの鋳型をｃＤＮＡに逆転写し、その後、それをＰＣＲ反応で指数関数的に増幅させる。２つの最も広く使用されている逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス（ａｖｉｌｏ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）の逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）、およびモロニーマウス白血病ウイルスの逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。逆転写工程は、一般的に、環境と発現プロファイリングの目的に応じて、特異的なプライマー、ランダムなヘキサマー、またはオリゴ−ｄＴプライマーを用いて開始される。例えば、メーカーの指示書に従ってＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、抽出したＲＮＡを逆転写することができる。次に、得られたｃＤＮＡを以後のＰＣＲ反応の鋳型として用いることができる。

ＰＣＲ工程では、多様な耐熱性ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼを用いることができるが、一般的には、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するが３’−５’校正エンドヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用する。すなわち、登録商標ＴａｑＭａｎ ＰＣＲは一般的に、ＴａｑまたはＴｔｈのポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性を利用して、その標的アンプリコンに結合したハイブリダイゼーションプローブを加水分解するが、同等の５’ヌクレアーゼ活性を有する任意の酵素を用いることもできる。２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲ反応に典型的なアンプリコンを作成する。第３のオリゴヌクレオチド、またはプローブを設計して、この２つのＰＣＲプライマーの間にあるヌクレオチド配列を検出する。このプローブは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素によっては伸長不能であり、レポーター蛍光色素およびクエンチャー蛍光色素によって標識されている。この２つの色素がプローブ上にあるときのように近接していると、レポーター色素からレーザー誘起された発光が、クエンチャー色素によって消光される。増幅反応過程で、ＴａｑＤＮＡはプローブを鋳型依存的に切断する。得られたプローブ断片を溶液中で分離すると、放出されたレポーター色素からのシグナルは、第２の蛍光プローブの消光作用を受けない。合成された新しい分子毎に１つのレポーター色素分子が遊離されるため、消失されないレポーター色素を検出することで、データの定量的解釈の根拠が提供される。

市販の機器、例えばＡＢＩの商標ＰＲＩＳＭ ７７００ 商標Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）、またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）などを用いて、登録商標ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲを行うことができる。好ましい実施形態において、リアルタイム定量的ＰＣＲ装置、例えばＡＢＩ 商標ＰＲＩＳＭ ７７００ 商標Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ上で５’ヌクレアーゼ処理を実行する。このシステムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子装置（ＣＣＤ）、カメラ、およびコンピューターから構成されている。このシステムはサーモサイクラー上で９６ウエルフォーマットにてサンプルを増幅する。増幅の過程で、レーザー誘起蛍光シグナルがＣＣＤで検出される。このシステムは、装置を動かし、データを解析するためのソフトウエアを含む。

５’ヌクレアーゼ測定データは、まず、Ｃ_Ｔ、すなわちサイクル閾値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）として表示される。上記したように、蛍光値はすべてのサイクルの間記録され、増幅反応においてその時点まで増幅された産物の量を示している。蛍光シグナルが統計学的に有意であるとして記録された最初の時点が、サイクル閾値（Ｃ_Ｔ）である。

誤差、およびサンプル間の変動の影響を最小にするために、ＲＴ−ＰＣＲは、通常１つ以上の参照遺伝子を内部標準として用いて行なわれる。理想的な内部標準は、異なった組織でも定常的な量発現され、実験処理による影響を受けない。遺伝子発現パターンを正規化するために最も頻繁に使用されるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤ）およびβ−アクチン（ＡＣＴＢ）のｍＲＮＡである。

ＲＴ−ＰＣＲ技術のより新しい改変型はリアルタイム定量ＰＣＲ法であるが、これは二重標識した蛍光原性プローブ（すなわち登録商標ＴａｑＭａｎプローブ）によってＰＣＲ産物の蓄積を測定する。リアルタイムＰＣＲは、各標的配列に対する内部競合配列を正規化のために用いる競合的定量ＰＣＲ法とも、サンプル中に含まれる正規化遺伝子、またはＲＴ−ＰＣＲ用のハウスキーピング遺伝子を用いる比較定量的ＰＣＲと相性がよい。詳細は、例えばＨｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９８６−９９４（１９９６）参照。

ｍＲＮＡの単離、精製、プライマー伸長、および増幅など、ＲＮＡ由来源として固定されたパラフィン包埋組織を用いて遺伝子発現をプロファイリングするための代表的なプロトコルの工程については、さまざまな雑誌論文｛例えばＴ．Ｅ．Ｇｏｄｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ２：８４−９１（２０００）；Ｋ．Ｓｐｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８：４１９−２９（２００１）；Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６４：３５−４２（２００４）｝に記載されている。要するに、代表的な工程は、パラフィン包埋腫瘍組織サンプルを厚さ約１０μｍの切片に切断することから開始する。次に、ＲＮＡを抽出し、タンパク質およびＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度を分析してから、必要ならばＲＮＡ修復および／または増幅工程を含ませてもよく、遺伝子特異的プロモーターを用いてＲＮＡを逆転写し、続いてＲＴ−ＰＣＲを行う。

ｂ．マイクロアレイ
マイクロアレイ技術を用いて、示差的遺伝子発現を同定するか確認することもできる。すなわち、乳癌関連遺伝子の発現プロファイルを、マイクアレイ技術を用いて新鮮な腫瘍組織またはパラフィン包埋腫瘍組織の中で測定することができる。この方法では、対象となるポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む）をマイクロチップ基質の上にプレートするか並べる。次に、並べた配列を、対象とする細胞または組織に由来する特異的なＤＮＡプローブとハイブリダイズさせる。ＲＴ−ＰＣＲ法と同様に、ｍＲＮＡ源は一般的に、ヒトの腫瘍または腫瘍細胞株、およびそれらに対応する正常な組織または細胞株から単離した全ＲＮＡである。このように、ＲＮＡは多様な原発腫瘍または腫瘍細胞株から単離することができる。ｍＲＮＡ源が原発腫瘍の場合には、ｍＲＮＡを、例えば冷凍または保存したパラフィン包埋され固定（例えばホルマリン固定）された組織サンプルから抽出することができるが、これらは、普段の診療において日常的に調製され保存されている。

マイクロアレイ技術の特定の実施形態において、ｃＤＮＡクローンをＰＣＲ増幅した挿入断片を高密度で基板に適用する。好ましくは、少なくとも１０，０００個のヌクレオチド配列を基板に適用する。それぞれ１０，０００個の成分をマイクロチップの上に固定した、マイクロアレイ化遺伝子はストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションさせるのに適している。対象とする組織から抽出したＲＮＡの逆転写により蛍光ヌクレオチドを取り込んで、蛍光標識されたｃＤＮＡを作成することができる。基板に適用された標識ｃＤＮＡプローブは、アレイ上のＤＮＡの各スポットに特異的にハイブリダイズする。チップをストリンジェントな条件で洗浄して、非特異的に結合したプローブを除去してから、共焦点レーザー顕微鏡法によるか、例えばＣＣＤカメラなどの別の検出法によってスキャンする。各アレイ要素のハイブリダイゼーションを定量化すると、対応するｍＲＮＡの存在量を判定することができる。２つのＲＮＡ源から作成され、２色の蛍光によって別々に標識されたｃＤＮＡプローブは、対にしてアレイにハイブリダイズさせる。したがって、特定の遺伝子それぞれに対応する、２つの由来源から得た転写物の相対的存在量が同時に測定される。ハイブリダイゼーションの規模が小さいために、多数の遺伝子の発現パターンを簡便かつ迅速に評価することができる。このような方法は、１細胞あたり数コピーしか発現しない稀少な転写物を検出したり、少なくとも約２倍の発現レベル差を再現性良く検出したりするのに必要な感度を有することが示されている（Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３（２）：１０６−１４９（１９９６））。マイクロアレイ解析は、例えばＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎＣｈｉｐ技術、またはＩｎｃｙｔｅのマイクロアレイ技術を用いて、メーカーの指示書に従って市販の機器によって行うことができる。

遺伝子発現の大量解析を行うためのマイクロアレイ法の開発によって、多様な腫瘍型において癌の分類および結果予測の分子マーカーを系統的に探し出すことが可能になっている。

ｃ．遺伝子発現の連続解析（ＳＡＧＥ）
遺伝子発現の連続解析（ＳＡＧＥ）は、各転写物に対する個別のハイブリダイゼーションプローブを提供する必要なしに、非常に多くの転写物を同時かつ定量的に解析することを可能にする方法である。まず、各転写物の中のユニークな部位からタグを得られれば、転写物をユニークに識別するのに十分な情報を含む短い配列タグ（約１０〜１４ｂｐ）を作成する。そして、多くの転写物を一緒に連結させて、シーケンシングすることができる長い連続的な分子を形成させて、複数のタグの同一性を同時に明らかにする。各タグの存在量を測定し、かつ各タグに対応する遺伝子を同定することによって、任意の転写物集団の発現パターンを定量的に評価することができる。詳細については、例えばＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４８４−４８７ （１９９５）およびＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ８８：２４３−５１（１９９７）参照。

ｄ．および超並列的配列解析（ＭＰＳＳ）法による遺伝子発現解析
この方法は、Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：６３０−６３４（２０００）に記載されているが、非ゲル性分子署名シーケンシングを、直径５μｍの別々のマイクロビーズ上で何百万もの鋳型をインビトロでクローニングすることと組む合わせたシーケンシング法である。まず、インビトロでのクローニングによってＤＮＡ鋳型のビーズライブラリーを作成する。次に、鋳型を含むマイクロビーズの平面アレイを高密度（一般的には３×１０^６マイクロビーズ／ｃｍ^２よりも大きい）でフローセルの中で集合させる。各マイクロビーズの上にある、クローニングされた鋳型の自由端を、ＤＮＡ断片の分離を必要としない蛍光性の分子署名シーケンシングによって同時に解析する。この方法は、１回の操作で、酵母菌ｃＤＮＡライブラリーに由来する何十万もの遺伝子署名配列を、同時かつ正確に提供することが示されている。

ｅ．ｍＲＮＡの単離、精製および増幅に関する一般的説明
ｍＲＮＡの単離、精製、プライマー伸長、および増幅など、ＲＮＡ源として固定パラフィン包埋組織を用いて遺伝子発現をプロファイリングするための代表的なプロトコルの工程が、さまざまな発行済み雑誌論文に記載されている（例えばＴ．Ｅ．Ｇｏｄｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ２：８４−９１［２０００］；Ｋ．Ｓｐｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８：４１９−２９［２００１］）。要すれば、代表的な工程は、パラフィン包埋腫瘍組織サンプルを厚さ約１０μｍの切片に切断することから開始する。次に、ＲＮＡを抽出し、タンパク質およびＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度を分析してから、必要ならばＲＮＡ修復および／または増幅工程を含ませてもよく、遺伝子特異的プロモーターを用いてＲＮＡを逆転写し、続いてＲＴ−ＰＣＲを行う。最後に、データを解析して、癌再発の予測された尤度に応じて、検査した腫瘍サンプルの中で同定された特徴的な遺伝子発現パターンに基づいて、患者に利用可能な最良の治療法の選択肢を同定する。

ｆ．乳癌遺伝子セット、被測定遺伝子サブ配列、および遺伝子発現データの臨床応用
本発明の重要な態様は、乳癌組織による一定の遺伝子の測定された発現を用いて、予後情報、または予測情報を提供することである。この目的のためには、測定されたＲＮＡ量の違い、および使用されたＲＮＡの品質の変動を補正することが必要である。従って、本アッセイ法は、一般的に、下記の実施例に示すように、例えばβ−アクチン、ＧＡＰＤ、ＧＵＳ、ＲＰＬＯ、およびＴＦＲＣなど、よく知られたハウスキーピング遺伝子を含む一定の正規化遺伝子の発現を測定して、これを取り込む。あるいは、標準は、被測定遺伝子全部、またはその大規模なサブセットのシグナルの平均値または中央値（Ｃ_Ｔ）に基づ区ことも可能である（包括的正規化法（ｇｌｏｂａｌ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｐｐｒｏａｃｈ））。以下、別段の記載がない限り、遺伝子発現は正規化された発現を意味する。

ｇ．イントロンに基づくＰＣＲプライマーおよびプローブの設計
本発明の一つの態様によれば、増幅すべき遺伝子の中に存在するイントロン配列に基づいて、ＰＣＲプライマーおよびプローブを設計する。従って、プライマー／プローブ設計の第一工程は、遺伝子の中にあるイントロン配列を描きだすことである。これは、例えばＫｅｎｔ，Ｗ．Ｊ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１２（４）：６５６−６４（２００２）によって開発されたＤＮＡ ＢＬＡＴソフトウエアなど、公開されたソフトウエアによるか、その変法を含むＢＬＡＳＴソフトウエアによって行うことができる。この後の工程は、ＰＣＲプライマーおよびプローブを設計する確立した方法に従う。

非特異的シグナルを避けるためには、プライマーおよびプローブを設計する際に、反復配列をマスクすることが重要である。これは、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅを通じてオンラインで入手可能なＲｅｐｅａｔ Ｍａｓｋｅｒプログラムを用いて容易に行うことができるが、このプログラムは、反復要素のライブラリーに対してＤＮＡ配列をスクリーニングして、反復要素がマスクされているクエリー配列を返す。そして、マスクされたイントロン配列を使用して、例えばＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；ＭＧＢ ａｓｓａｙ−ｂｙ−ｄｅｓｉｇｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；一般ユーザーおよび生物学者プログラマーのためにＷＷＷ上に置かれたＰｒｉｍｅｒ３（Ｓｔｅｖｅ Ｒｏｚｅｎ ａｎｄ Ｈｅｌｅｎ Ｊ．Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ（２０００））など、市販されているか、さもなければ公開されているプライマー／プローブ設計用パッケージを用いて、プライマーおよびプローブの配列を設計することができる。Ｋｒａｗｅｔｚ Ｓ，Ｍｉｓｅｎｅｒ Ｓ（ｅｄｓ）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ３６５−３８６）記載。

ＰＣＲプライマー設計において最も重要だと考えられている要素は、プライマー長、融解温度（Ｔｍ）、およびＧ／Ｃ含量、特異性、相補的プライマー配列、および３’末端配列などである。通常、最適なＰＣＲプライマーは一般的に長さが１７〜３０塩基あり、約２０〜８０％、例えば５０〜６０％のＧ＋Ｃ塩基を含む。融解温度は５０と８０℃の間であり、例えば約５０〜７０℃が一般には好ましい。

ＰＣＲプライマーおよびプローブ設計のさらなるガイドラインについては、例えばＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｃ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，”Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｆｏｒ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ” ｉｎ：ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５，ｐｐ．１３３−１５５；Ｉｎｎｉｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ，”Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲｓ” ｉｎ：ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９４，ｐｐ．５−１１；ａｎｄ Ｐｌａｓｔｅｒｅｒ，Ｔ．Ｎ．Ｐｒｉｍｅｒｓｅｌｅｃｔ：Ｐｒｉｍｅｒ ａｎｄ ｐｒｏｂｅ ｄｅｓｉｇｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：５２０−５２７（１９９７）参照。これらの全ての開示は参照して本明細書に明確に組み込まれる。

Ｂ．３ アルゴリズムおよび統計学的方法
本発明では、同時継続出願第１０／８８３，３０３号に記載された一定のアルゴリズムおよび統計学的方法を利用する。

定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いてｍＲＮＡ量を測定する場合には、ｍＲＮＡ量をＣ_Ｔ（閾値サイクル）単位で表示する（Ｈｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９８６−９９４（１９９６））。参照ｍＲＮＡのＣ_Ｔの合計を平均したものを０などの固定した数に設定して、被検ｍＲＮＡの各測定Ｃ_Ｔ値を、この固定した点に対して相対的に与える。例えば、ある患者の腫瘍サンプルについて、５つの参照遺伝子のＣ_Ｔの平均が３１であり、被検遺伝子ＸのＣ_Ｔが３５であることが分かった場合、遺伝子Ｘについて報告される値は−４（すなわち、３１−３５）である。

ｍＲＮＡ量を定量的に測定した後の最初の工程として、腫瘍サンプルで同定された遺伝子と、癌の分子的病理に関連していることが知られている遺伝子をサブセットにグループ化する。すなわち、増殖に関連していることが知られている遺伝子は「増殖グループ」（軸（ａｘｉｓ）すなわちサブセット）を構成する。癌の侵襲に関連していることが知られている遺伝子は「侵襲グループ」（軸すなわちサブセット）を構成する。主要な成長因子受容体経路に関係する遺伝子は、「成長因子グループ」（軸すなわちサブセット）を構成し、ＧＲＢ７グループとも呼ばれる。エストロゲン受容体（ＥＳＲ１）を介した活性化またはシグナル伝達に関与することが知られている遺伝子は「エストロゲン受容体（ＥＲ）グループ」（軸すなわちサブセット）を構成するなどである。このサブセットのリストは、当然ながら無制限である。生成されるサブセット（軸）は、具体的な癌、例えば、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌などによって異なる。通常、その発現が互いに相関することが知られている遺伝子、または同一の経路に関係することが知られている遺伝子は一緒にグループ化される。

次の工程では、サブセットにおける各ｍＲＮＡについて測定された腫瘍量に、癌再発のリスクに対する相対的セット内寄与を反映する係数を掛けて、この積を、そのサブセットにおけるｍＲＮＡ量とそれらの係数とのその他の積に加えて、例えば、増殖項、侵襲項、成長因子項などの項を得る。例えば、リンパ節陰性で侵襲性の乳癌の場合には、成長因子項は、（０．４５から１．３５）×ＧＲＢ７＋（０．０５から０．１５）×ＥｒｂＢ２となり、例えば、０．９×ＧＲＢ７＋０．１×ＥＲＢＢ２となる（下記実施例参照）。

全体的な再発スコアに対する各項の寄与は、係数を使用することで重み付される。例えば、リンパ節陰性で侵襲性の乳癌の場合には、成長因子項の係数は０．２３と０．７０の間となりうる。

さらに、成長因子項や増殖項など、いくつかの項については、更なる工程が行われる。項と再発リスクの間の関係が非線形的な場合には、項の非線形的な関数変換、例えば閾値が使用される。したがって、リンパ節陰性で侵襲性の乳癌では、成長因子項が＜８の場合には、その値は８と定められる。

得られた項の合計が再発スコア（ＲＳ）となり、疾患の通常の経過で癌を再発させる尤度を予測できる。

本発明のアルゴリズムによって作成されるＲＳスケールは、さまざまな方法で調整することができる。すなわち、範囲を、例えば、スケールが０から１０、０から５０、または０から１００にわたるように選択することができよう。

例えば、下記の実施例で説明する具体的なスケーリング法では、スケール化された再発スコアを、０から１００というスケールで計算している。便宜上、１０Ｃ_Ｔ単位を各測定Ｃ_Ｔ値に加え、スケール化されていないＲＳを既述したように計算する。スケール化されていないＲＳとスケール化されたＲＳを計算するための等式を下記実施例に示す。

再発スコア、または再発スコアを計算するために用いられる変数をする際に、０．５よりも大きいピアソン係数で検定された特定の癌における第一の遺伝子とともに、該腫瘍タイプ（乳癌など）の少なくとも３０人以上の異なった患者サンプルのセットの中で同時発現する別の遺伝子によって置換することができる。同様に、本発明の予後法および予測法に含まれる個別の遺伝子、または遺伝子グループ（サブセット）に含まれる遺伝子を、０．５よりも大きいピアソン係数で検定された特定の癌における第一の遺伝子とともに同時発現する別の遺伝子で置換することができる。

Ｂ．４ 坑エストロゲン薬療法
エストロゲンは、乳癌など、いくつかの癌、特にエストロゲン受容体（ＥＳＲ１）を発現する癌の増殖を促進することが知られている。エストロゲンの作用を遮断するか、そのような患者、特にＥＳＲ１陽性乳癌患者におけるエストロゲン量を低下させるためにいくつかの療法が開発されている。

坑エストロゲン薬は一般に、エストロゲン受容体へのエストロゲンの結合のアンタゴニストとして分類することができ、またはアロマターゼ阻害剤のようなエストロゲン生合成の阻害剤である。

最も普通に用いられる坑エストロゲン薬はＴＡＭであり、これはエストロゲン受容体に結合するエストロゲンの仲間に属し、乳癌の外科的切除後、および／または化学療法もしくは放射療法の後の５年間、１日１回経口摂取する。手術後に補助療法としてＴＡＭを用いると癌再発リスクを低下させることが臨床研究で示されているが、ＥＳＲ１陽性患者のこの療法に対する反応はさまざまであり、反応性についての明確な予測因子で利用できるものは存在していない。

その他の坑エストロゲン薬には、ＴＡＭと同様に乳房組織および乳癌に対するエストロゲンの作用を遮断するラロキシフェン、ＴＡＭと近縁関係にあり、転移性乳癌を有する閉経後の女性にとって選択肢となりうるクエン酸トレミフェンなどがある。

アロマターゼ阻害剤であるアナストロゾールは、エストロゲンがその受容体を活性化させるのを阻害することによって作用し、エストロゲンの産生に必要な酵素を遮断する。アナストロゾールは現在、進行性乳癌がＴＡＭ療法の間またはその後でも成長し続ける女性にとっての選択肢である。

メガストロールアセテート（ｍｅｇａｓｔｒｏｌ ａｃｅｔａｔｅ）は一般的に進行性乳癌のホルモン療法に用いられ、通常、癌がＴＡＭに反応できない女性に用いられる。

全ての治療法は、重篤な副作用や、患者の反応について信頼のおける予測因子がないために制限されており、内科医は、特定の治療法を薦める前にリスク−利益分析を行うことができるようになろう。

Ｂ．５ 癌化学療法
癌治療に用いる化学療法剤は、それらの作用メカニズムに応じて、いくつかのグループに分けることができる。化学療法剤には、ＤＮＡまたはＲＮＡに直接ダメージを与えるものがある。このような化学療法剤はＤＮＡの複製を混乱させて、複製を完全に停止させるか、ナンセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを産生させる。このカテゴリーには、例えばシスプラチン（登録商標Ｐｌａｔｉｎｏｌ）、ダウノルビシン（登録商標Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ）、ドキソルビシン（登録商標Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、およびエトポシド（登録商標ＶｅＰｅｓｉｄ）などがある。別のグループの癌化学療法剤は、ヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの形成を妨害して、ＲＮＡ合成および細胞複製を遮断する。このクラスの薬剤の例には、メトトレキサート（登録商標Ａｂｉｔｒｅｘａｔｅ）、メルカプトプリン（登録商標Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ）、フルオロウラシル（登録商標Ａｄｒｕｃｉｌ）、およびヒドロキシウレア（登録商標Ｈｙｄｒｅａ）などがある。第３のクラスの化学療法剤は紡錘体の合成および崩壊をもたらし、その結果、細胞分裂を妨げる。このクラスの薬剤には、ビンブラスチン（登録商標Ｖｅｌｂａｎ）、ビンクリスチン（登録商標Ｏｎｃｏｖｉｎ）、およびパシタキセル（登録商標Ｔａｘｏｌ）、ならびにトセタキセル（登録商標Ｔａｘｏｔｅｒｅ）などのタキセン（ｔａｘｅｎｅ）などがある。トセタキセルは米国において現在、それ以前の化学療法に失敗した局部進行性または転移性の乳癌患者、およびそれ以前の白金を用いた化学療法に失敗した局部進行性または転移性の非小細胞性肺癌患者を治療するために承認されている。これら全て、およびその他の化学療法剤に対する患者の反応を予測することは特に本発明の範囲内に含まれる。

特定の実施形態において、化学療法はタキサン誘導体による治療を含む。タキサンには、癌治療に広く用いられているパクリタキセル（登録商標Ｔａｘｏｌ）およびドセタキセル（登録商標Ｔａｘｏｔｅｒｅ）などがあるが、これらに限定されるものではない。前述したように、タキサンは、細胞機能において重要な役割を果たしている、微小管と呼ばれる細胞構造に影響を与える。正常な細胞増殖において、細胞が分裂を開始するときに微小管が形成される。いったん細胞が分裂をやめると、微小管は分解されるか破壊される。タキサンは微小管が分解されるのを阻止し、それによって癌細胞の分裂を遮断する。

別の特定の実施形態において、化学療法は、例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、およびアクラシノマイシンなどのアントラサイクリン誘導体による治療を含む。

更なる特定の実施形態において、化学療法は、例えばカンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、２０−Ｓ−カンプトテシン、９−ニトロ−カンプトテシン、９−アミノ−カンプトテシン、またはＧＩ１４７２１１などのトポイソメラーゼ誘導体による治療を含む。

これら、およびその他の化学療法剤のいずれかの組み合わせによる治療が具体的に考えられている。

ほとんどの患者は、癌切除手術の直後から化学療法を受ける。この方法は一般に補助療法と呼ばれている。しかし、手術前にも、いわゆる術前補助化学療法のように化学療法を施すことができる。術前補助化学療法の利用は、進行して手術不能な乳癌の治療から始まっているが、その他の型の癌の治療でも承認を受けている。いくつかの臨床治験において術前補助化学療法の有効性がテストされている。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ Ｂｏｗｅｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｂ−１８多施設試験（ＮＳＡＢ Ｂ−１８）において（Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １５：２００２−２００４（１９９７）；Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １６：２６７２−２６８５（１９９８））、アドリアマイシンおよびシクロホスファミドを組み合わせて術前補助化学療法を実施した（「ＡＣ療法」）。別の臨床治験においては、５−フルオロウラシル、エピルビシン、およびシクロホスファミドの組み合わせを用いて術前補助化学療法を実施した（「ＦＥＣ療法」）（ｖａｎ Ｄｅｒ Ｈａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９：４２２４−４２３７（２００１））。新たな臨床治験でも、タキサン含有術前補助投薬計画が用いられている。例えばＨｏｌｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８３：１７９７−１８０５（１９９１）およびＭｏｌｉｔｅｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２４：Ｓ１７−１０−Ｓ−１７−１４（１９９９）参照。乳癌のための術前補助化学療法のさらなる情報については、Ｃｌｅａｔｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃａｎｃｅｒ ９：１８３−１９５（２００２）参照。

Ｂ．６ 本発明のキット
本発明の方法で用いる材料は、よく知られた手順に従って作成されるキットを調製するのに適したものである。従って、本発明は、予後の結果または治療に対する反応を予測するために、開示された遺伝子の発現を定量化するための、遺伝子特異的または遺伝子選択的なプライマーおよび／またはプローブを含むことができる薬剤を含むキットを提供する。このようなキットは任意で、腫瘍サンプル、特に固定パラフィン包埋組織サンプルからＲＮＡを抽出するための試薬、および／またはＲＮＡ増幅用試薬を含むことができる。さらに、本キットは任意で、本発明の方法においてそれらを使用することに関連した識別するための指示書、またはラベル、または説明書とともに試薬を含むことができる。本キットは容器（本方法を自動実行する際に用いるのに適したマイクロタイタープレートなど）を含むことができ、それぞれの容器は、本方法で利用する、例えば作成済みマイクロアレイ、緩衝液、適当なヌクレオチド三リン酸（例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ；またはｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ、およびＵＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびに１つ以上の本発明のプライマーおよびプローブ（例えば、ＲＮＡポリメラーゼと反応するプロモーターに結合した適当な長さのポリ（Ｔ）を１つ以上含むことができる。予後情報または予測情報を推定または定量化するのに用いられる数学的アルゴリズムもまさしくキットの成分となる尤度がある。

また、本発明によって提供される方法は、全体または一部を自動化することができる。

また、本発明の全ての態様は、高いピアソン相関係数によって証明されたように、開示された遺伝子とともに同時発現される限られた数の追加的遺伝子を、例えば、開示遺伝子に加えて、および／またはその代わりに予後テストまたは予測テストに含まれるように実施することができる。

ここまで本発明を説明してきたが、本発明は、以下の実施例を参照することで、より容易に理解されるが、これらは例示のために提示されるものであって、いかなる意味でも本発明を制限するものではない。

遺伝子発現と予後診断との関係に関する研究、および初期乳癌患者におけるタモキシフェンに対する有益な応答
方法
本研究では、ＮＳＡＢＰ研究Ｂ−１４：「原発性乳癌に罹患し腋窩部リンパ節陰性の患者であって、その腫瘍がエストロゲン受容体に対して陽性である患者においてタモキシフェンを評価するための臨床試験」から得られた組織およびデータを用いる。この試験の結果は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｂ，Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ ＪＰ，Ｒｅｄｍｏｎｄ ＣＫ，ｅｔ ａｌ：Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ＴＡＭ−ｔｒｅａｔｅｄ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ：Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ Ｂｏｗｅｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＮＳＡＢＰ）Ｂ−１４．Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８６：５２７−５３７（１９９４）で報告されている。

１．１ 研究Ｂ−１４では、研究を開始時にプラセボ単独で処理した４５０人までの患者に由来する固定パラフィン包埋乳癌組織サンプルを解析した。評価可能な患者毎に、１６種類の癌関連遺伝子および５種類の参照用遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲによって定量的に測定した。疾患の再発と、（ａ）再発スコア、（ｂ）特定の遺伝子グループにおける遺伝子の発現、または（ｃ）各遺伝子の発現との関係を評価した。

１．２ 組み入れ基準
１．２．１ ＮＳＡＢＰ研究Ｂ−１４：「原発性乳癌に罹患し腋窩部リンパ節陰性の患者であって、その腫瘍がエストロゲン受容体に対して陽性である患者においてタモキシフェンを評価するための臨床試験」に登録されていること。

１．２．２ 研究のプラセボ対照試験部分において、プラセボまたはＴＡＭに対して無作為化されていること。

１．２．３ 追跡治療によって臨床的に適格であること
１．３ 除外基準
１．３．１ ＮＳＡＢＰ保存データ中に、初期診断から利用可能な腫瘍区がないこと。

１．３．２ Ｈ＆Ｅスライドを検査して測定しても、総括的に腫瘍がないか、ほんの僅かしかないこと（グループ１）。

１．３．３ ＲＴ−ＰＣＲ解析するにはＲＮＡが足りない（＜２７５ｎｇ）こと。

１．３．４ ５つの参照遺伝子に対する非正規化Ｃ_Ｔの平均値が３５よりも大きいこと。

１．４ 遺伝子パネル
１．４．１ 表１に列挙された１６の癌関連遺伝子および５つの参照遺伝子の解析を、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて行った。

１．４．２ 患者生存率
無遠位再発生存期間（ＤＲＦＳ）は、手術から最初の遠隔転移までの時間（年単位）に基づく。対側性疾患、他の二次原発癌、および遠隔転移前の死亡は、打ち切りとなる場合と見なす。一次解析では、同側性乳癌再発、局所的胸壁再発、および局所的再発は無視し、発症とも打ち切り事象ともみなさない。

１．４．３ 遺伝子発現
表１に列挙された２１の遺伝子の発現レベルを、ＧＨＩアッセイ法による値として報告した。遺伝子発現値を、参照遺伝子の平均値に対して正規化した。各癌関連遺伝子について、ＲＴ−ＰＣＲによってサイクル閾値（Ｃ_Ｔ）を得、表１に列挙した５つで一組の遺伝子に対して正規化した。参照遺伝子は、さまざまなサンプル状況および処理条件下同様、乳癌において比較的不変であることが知られているため、外部からの作用に対して正規化するのに役立つ。参照−正規化発現測定値は、一般的に０から１５の範囲であり、１単位の増加は、通常、ＲＮＡ量が２倍増加したことを示す。

１．４．４ 癌関連遺伝子および参照遺伝子

１．４．５ 再発スコア
０から１００までのスケールによる再発スコア（ＲＳ）は、以下の参照−正規化発現測定値から得られる：

そして、このＲＳ_ｕ（スケールなしの再発スコア）を、０から１００までの間に再スケール化する：

コックス（Ｃｏｘ）比例ハザードモデルに基づき、癌の再発と再発スコアとの相関関係を連続型変数として評価した。この評価法は、さらに増殖グループ、ＧＲＢ７グループ、ＥＳＲ１グループ、侵襲グループ、および１６の癌関連遺伝子のそれぞれを連続型変数として含んでいた。

予後遺伝子を同定するための主な目的は、未治療患者群において、遺伝子発現と無遠位再発生存期間（ＤＲＦＳ）および全生存期間（ＯＳ）との間の関係を調査することであった。ＤＲＦＳは、手術から最初の遠隔転移までの時間（年単位）に基づくものであったが、但し、対側性疾患、他の二次原発癌、および遠隔転移前の死亡は、打ち切り事象と見なし、同側性乳癌再発、局所的胸壁再発、および局所的再発は無視した。主効果コックス比例ハザードモデル（Ｄ．Ｒ．Ｃｏｘ（１９７２）Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ Ｌｉｆｅ−Ｔａｂｌｅｓ（ｗｉｔｈ ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ）．Ｊ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃ．Ｂ，３４：１８７−２２０）を利用して、標準的な臨床的予後変数、例えば、年齢、臨床的腫瘍サイズ、および腫瘍異型度を超える、遺伝子発現の更なる寄与度を比較した。遺伝子発現変数を除外した縮小モデルを、対象となる遺伝子変数を含む競合完全モデル（ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ ｆｕｌｌ ｍｏｄｅｌ）と比較する、尤度比検定法と呼ばれるテスト（Ｒｏｎａｌｄ Ｆｉｓｈｅｒ（１９２２）“Ｏｎ ｔｈｅ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ”，Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒｏｙａｌ．Ｓｏｃ．，ｓｅｒｉｅｓ Ａ，２２２：３２６，１９２２；Ｌｅｏｎａｒｄ Ｓａｖａｇｅ（１９６２），Ｔｈｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ（１９６２））を用いて、統計的に有意な予後遺伝子を同定した。

乳癌における治療予測遺伝子を同定するための本発明者らの主な目的は、治療患者群において、遺伝子発現とＤＲＦＳおよびＯＳとの間の関係を調査することであった。そのような解析を行うため、治療患者群および未治療患者群の両群からのデータを、純粋に予後的な遺伝子から治療予測遺伝子を区別するために利用した。タモキシフェン（ＴＡＭ）反応に対する治療予測遺伝子を同定するために、ＮＳＡＢＰ研究Ｂ−１４からプラセボ患者およびＴＡＭ治療患者の両方を包含した。どちらの研究においても、コックス比例ハザードモデルを用いて、治療効果と遺伝子発現との間の相互作用を調べた。治療効果が遺伝子発現レベルに依存している場合、すなわち、遺伝子発現が治療予測因子であれば、治療効果と遺伝子発現との間には相互作用が存在する。ここで再び、尤度比検定法を用いて、治療相互作用（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）による遺伝子発現を除外した縮小モデルと、治療相互作用による遺伝子発現を包含する競合完全モデルとを比較して、統計的に有意な予測治療遺伝子を同定した。

結果
表２では、ＮＳＡＢＰ Ｂ−１４試験の未治療患者（プラセボ治療群）の解析から、遺伝子および遺伝子群（軸方向）の発現の変動に対する再発のハザード率（Ｈ．Ｒ．）が報告されている。

表２に示すように、１３の変数（遺伝子および遺伝子群）が、ｐ＜０．１で再発Ｈ．Ｒ．と相関していた。上記のとおり、これらの相関関係は、未治療患者に関するものであるから、これらの変数は、統計的に有意な予後因子である。予後変数は、以下の通りである：増殖グループ；ＣＣＮＢ１；ＢＩＲＣ５；ＭＹＢＬ２；ＰＧＲ；ＳＴＫ６；ＭＫＩ６７；ＧＳＴＭ１；ＧＡＰＤ；侵襲グループ；ＲＰＬＰ０；増殖閾値；ＭＭＰ１１。増殖グループ、侵襲グループ、および増殖閾値は、再発スコアアルゴリズムの確定した要素である。

これらの予後因子のうち次の１０の因子で発現が上昇したことと、Ｈ．Ｒ．の増加は相関していた：増殖グループ；ＣＣＮＢ１；ＢＩＲＣ５；ＭＹＢＬ２；ＳＴＫ６；ＭＫＩ６７；ＧＡＰＤ；侵襲グループ；増殖閾値；ＭＭＰ１１。これらの１０の予後不良マーカーのうち７つは、増殖している細胞を特徴付ける遺伝子または遺伝子セットである。これらのうち、増殖グループは、（再発スコアアルゴリズムで定義されているところでは、）Ｐ値に関して最も高い変数である。１３の予後因子のうち、発現が上昇した以下の３つは、Ｈ．Ｒ．の減少と相関する：ＰＧＲ、ＧＳＴＭ１、およびＲＰＬＰ０。

表２に示した結果は、統計学上有意なだけでなく、Ｈ．Ｒ．の大きさでも有意である。どのマーカーでも、Ｈ．Ｒ．が１．０から２倍変化すると、Ｈ．Ｒ．を５０％変化させること、および、各ＨＲ値は、患者集団における平均的発現に対し、マーカー変数の発現を２倍変化させるという影響があることを表していることに注意されたい。したがって、例えば、表２では、増殖グループまたはＣＣＮＢ１の発現が２倍増加する毎に、Ｈ．Ｒ．が約５０％増加すること（９５％信頼限界は約２０％から約９０％の範囲）が示されている。

表３は、ＮＳＡＢＰ Ｂ−１４のプラセボ治療群およびＴＡＭ治療群の両群の結果を用いた、ＴＡＭに対する感受性または抵抗性を予測する変数を同定するために行われた相互作用解析結果を報告するものである。

表のとおり、５つの変数（遺伝子および遺伝子群）が、ｐ＜０．１でＴＡＭに対する反応と相関している。これらはＥＳＲ１、ＳＣＵＢＥ２、ＥＳＲ１グループ、ＴＦＲＣ、およびＢＣＬ２である。これらのうち最も有意性が高いのはＥＳＲ１である。ＥＳＲ１の発現が２倍増加する毎に、ＴＡＭ治療を受けた患者の再発に対するＨ．Ｒ．は、約２５％減少する（９５％信頼限界は約１２％から約３７％の範囲）。これらのデータを、ＴＡＭに対する患者の反応の尤度を示す連続型定量的指標として用いることができる。これを図１に図示する。臨床的に使用されているアッセイ法、したがって、ＴＡＭ処方の候補に基づいて、ＮＳＡＢＰ Ｂ−１４の患者はすべてＥＲ陽性に分類されたことは強調されるべきである。今回のデータは、この「ＥＲ陽性」集団の中では、患者が、ＥＳＲ１スコアに応じて予測可能なさまざまな程度の恩恵を受けることを明らかにしている。

ＥＳＲ１発現とＴＡＭによる治療効果の尤度との間のこの関係も、高度、中度、および低度のＥＳＲ１発現という基準に応じて表すことができる。ＥＳＲ１発現は、四分位、三分位、またはその他の分位で表すことができる。例えば、本発明者らによるＮＳＡＢＰ Ｂ−１４患者集団の研究で得られたデータは、四分位にＥＳＲ１発現を分割するために以下の参照−正規化Ｃ_Ｔ切点を提供する：

図２に、これら３つの患者グループの間におけるＴＡＭの絶対的な有効性を、ＥＳＲ１発現の関数として示す（棒グラフを通る水平線は、９５％の信頼限界を表わす）。

図のように、ＴＡＭは、ＥＳＲ１を高レベルで発現する患者の３分の２で実質的で絶対的な有効性をもつが、ＥＳＲ１発現の三分位の最下位に分類された患者では影響はずっと少ない。

同様に、ＥＳＲ１発現とＴＡＭ便益の間の関係は、ＥＳＲ１発現を四分位に分けた関数として表すことができる。図３は、ＴＡＭ治療の絶対的有効性を、ＥＳＲ１発現の四分位の関数として表している（棒グラフを通る水平線は９５％の信頼限界を表わす）。ＥＳＲ１発現に関する切点は、ＮＳＡＢＰ Ｂ−１４患者集団の解析結果から得られた参照−正規化Ｃ_Ｔ値である図に示すように、ＥＳＲ１発現の四分位の最下位に分類された患者は、ＴＡＭによる恩恵をほとんど受けない。

ＥＳＲ１の発現データを再発スコアと一緒に使用して、患者にＴＡＭ療法またはＴＡＭ＋化学療法を処方すべきか否かを同時に決定することができる。ＮＳＡＢＰ Ｂ１４の両治療群の解析から得られたデータを示す表６は、このことを具体的に示しており、また、これらのデータをもたらすフォーマットも示している。この表をどのように利用できるかを例示するために、ＲＳによって規定されたところでは低再発リスクのカテゴリーに含まれる患者は、百分位の上位７５位でＥＳＲ１を発現するが、論理的にはＴＡＭ単独で治療すべき候補者である。再発リスクは低いが、ＥＳＲ１発現が百分位の下から２５位の患者であって、ＴＡＭの副作用が特に懸念される患者は、合理的には、ＴＡＭ療法が適当でない患者と見なされよう。百分位の上位２５位よりも上でＥＲを発現する高リスク患者は、論理的には、ＴＡＭおよび化学療法で治療すべき候補者である。

（各欄中の数字は、表示されたカテゴリーで測定されたＢ−１４患者の数）
以下の参照−正規化ＥＳＲ１カットオフ点に基づいている：

以下の図は、どのようにして表５を抗エストロゲンおよび／または化学療法による患者の治療を決定するために利用できるかを示している。

本開示を通じて引用されている文献はすべて、参照されて明示的に本明細書に組み込まれる。

当業者は、本発明を実施する際に、本明細書に記載された方法および材料と同様または同等のものがあることを認識できる。実際、本発明は、決して、記載された方法および材料に限定されるものではない。本発明は、具体的実施形態と考えられるものに関して説明されているが、当然のことながら、本発明は、そのような実施形態に限定されるものではない。それとは反対に、本発明は、添付された請求の範囲の趣旨と範囲に含まれる、さまざまな変更物および等価物もカバーするものである。例えば、本開示は、乳癌患者のＴＡＭによる治療に対する有益な反応を予測するのに役立つ遺伝子または遺伝子群を同定することで説明されているが、別の抗エストロゲン薬による治療に対する患者の反応を判定するための類似の方法、および、別のタイプの癌に関する同様の遺伝子、遺伝子セット、および方法も、具体的には、本明細書の範囲に含まれる。

ＥＳＲ１の定量的測定値の関数として、１０年目で無遠位発症のＴＡＭ療法を受けた患者の比率の絶対的増加を示す。 ＥＳＲ１発現の関数として、タモキシフェン（ＴＡＭ）療法の絶対的有益性を示す。棒グラフを通る水平線は９５％の信頼限界を表わす。 ＥＳＲ１の発現が該当する四分位値の関数として、（ＴＡＭ）療法の絶対的有益性を示す。棒グラフを通る水平線は９５％の信頼限界を表わす。ＥＳＲ１発現の四分位値を規定する切点は、ＮＳＡＢＰ Ｂ−１４患者集団の解析結果から得られた参照−正規化Ｃ_Ｔ値に基づいている。

Claims (75)

1. 乳癌患者における疾患の結果の予後を予測する方法であって、
   （ａ）該患者から採取した癌細胞を含む生体サンプルにおいて、以下の変数：
   （ｉ）増殖グループスコア、
   （ｉｉ）侵襲グループスコア、
   （ｉｉｉ）増殖グループ閾値スコア、および
   （ｉｖ）各遺伝子ＣＣＮＢ１、ＢＩＲＣ５、ＭＹＢＬ２、ＰＧＲ、ＳＴＫ６、ＭＫＩ６７、ＧＳＴＭ１、ＧＡＰＤ、ＲＰＬＰＯ、およびＭＭＰ１１のうちの１つ以上の遺伝子のＲＮＡ転写物、またはそれらの発現産物の発現レベル、
   の１つ以上の変数の値を定量的に決定する工程を包含し、
   （ｂ１）上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の１つ以上の値、および／または各遺伝子ＣＣＮＢ１、ＢＩＲＣ５、ＭＹＢＬ２、ＳＴＫ６、ＭＫＩ６７、ＧＡＰＤ、およびＭＭＰ１１のうちの１つ以上の遺伝子のＲＮＡ転写産物、またはそれらに対応する発現産物の増加分１単位ごとに、該患者が、疾患の結果不良のリスクを比例して増加させていると同定され、そして
   （ｂ２）各遺伝子ＰＧＲ、ＧＳＴＭ１、およびＲＰＬＯのうちの１つ以上の遺伝子のＲＮＡ転写産物、またはそられに対応する発現産物の発現レベルの増加分１単位ごとに、該患者が、疾患の結果不良のリスクを比例して低下させていると同定され、
   ここで
   増殖グループのスコア＝（ＢＩＲＣ５＋ＭＫＩ６７＋ＭＹＢＬ２＋ＣＣＮＢ１＋ＳＴＫ６）／５；
   侵襲グループのスコア＝（ＣＴＳＬ２＋ＭＭＰ１１）／２；
   増殖グループ閾値スコアは、増殖グループのスコアが６．５よりも小さければ、６．５に等しく、増殖グループのスコアが６．５以上であれば、増殖グループのスコアと同一であり、式中、
   等式中の遺伝子記号は、各遺伝子のＲＮＡ転写物、またはその発現産物の発現レベルを表わし、かつ、
   全ての各遺伝子または上記いずれかの変数に存在する遺伝子は、適用可能な腫瘍型において、０．５以上のピアソン係数で該腫瘍型において該遺伝子とともに同時発現する別の遺伝子によって置換され得る、方法。
2. 前記患者がヒト患者である、請求項１記載の方法。
3. 前記疾患の結果が、患者の全生存で表される、請求項２記載の方法。
4. 前記疾患の結果が、無再発生存で表される、請求項２記載の方法。
5. 前記疾患の結果が、無遠位再発生存で表される、請求項２記載の方法。
6. 前記予後が、前記乳癌の外科的切除後、前記患者が更なる治療を受けないことを前提とする、請求項２記載の方法。
7. 前記発現レベルが、１つ以上の参照遺伝子、またはそれらの発現産物の発現レベルに対して正規化される、請求項２記載の方法。
8. 前記参照遺伝子が、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤ、ＧＵＳ、ＲＰＬＰＯ、およびＴＦＲＣからなる群から選択される、請求項７記載の方法。
9. 前記発現レベルが、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤ、ＧＵＳ、ＲＰＬＰＯ、およびＴＦＲＣの発現レベルの平均値に対して正規化される、請求項７記載の方法。
10. 前記疾患の結果の定量値が、一連の期間にわたって測定した変数の値に直接比例する、請求項２記載の方法。
11. 前記増殖スコアを決定することを含む、請求項２記載の方法。
12. 前記増殖グループ閾値スコアを決定することを含む、請求項１１記載の方法。
13. 前記侵襲グループスコアを決定することを含む、請求項１２記載の方法。
14. （ｉｖ）に記載された各遺伝子の少なくとも２つ、またはそれらの発現産物の発現レベルを決定することを含む、請求項２記載の方法。
15. （ｉｖ）に記載された各遺伝子の少なくとも３つ、またはそれらの発現産物の発現レベルを決定することを含む、請求項２記載の方法。
16. （ｉｖ）に記載された各遺伝子の少なくとも４つ、またはそれらの発現産物の発現レベルを決定することを含む、請求項２記載の方法。
17. （ｉｖ）に記載された各遺伝子の少なくとも５つ、またはそれらの発現産物の発現レベルを決定することを含む、請求項２記載の方法。
18. （ｉｖ）に記載された各遺伝子の少なくとも６つ、またはそれらの発現産物の発現レベルを決定することを含む、請求項２記載の方法。
19. （ｉｖ）に記載された各遺伝子の少なくとも７つ、またはそれらの発現産物の発現レベルを決定することを含む、請求項２記載の方法。
20. （ｉｖ）に記載された各遺伝子の少なくとも８つ、またはそれらの発現産物の発現レベルを決定することを含む、請求項２記載の方法。
21. （ｉｖ）に記載された各遺伝子の少なくとも９つ、またはそれらの発現産物の発現レベルを決定することを含む、請求項２記載の方法。
22. （ｉｖ）に記載された各遺伝子のすべて、またはそれらの発現産物の発現レベルを決定することを含む、請求項２記載の方法。
23. 前記乳癌がリンパ節陰性である、請求項２記載の方法。
24. 前記乳癌がＥＳＲ１陽性である、請求項２３記載の方法。
25. 前記決定が１回以上行われる、請求項２記載の方法。
26. 前記決定が、化学療法、ホルモン療法、および／または放射線療法の前後に行われる、請求項２５記載の方法。
27. 前記患者が、不良な疾患結果のリスクを高めていると決定される、請求項２記載の方法。
28. 決定後、前記患者が、化学療法、ホルモン療法、および／または放射線療法による治療を受ける、請求項２７記載の方法。
29. 前記化学療法が、術前補助化学療法である、請求項２８記載の方法。
30. 前記化学療法が、タキサン誘導体を投与することを含む、請求項２９記載の方法。
31. 前記タキサン誘導体がドセタキセルまたはパクリタキセルである、請求項３０記載の方法。
32. 前記タキサン誘導体がドセタキセルである、請求項３１記載の方法。
33. 前記化学療法が、アントラサイクリン誘導体を投与することを含む、請求項２９記載の方法。
34. 前記アントラサイクリン誘導体がドキソルビシンである、請求項３３記載の方法。
35. 前記化学療法が、トポイソメラーゼ阻害剤を投与することを含む、請求項２９記載の方法。
36. 前記トポイソメラーゼ阻害剤が、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、２０−Ｓ−カンプトテシン、９−ニトローカンプトテシン、９−アミノーカンプトテシン、およびＧＩ１４７２１１からなる群から選択される、請求項３５記載の方法。
37. 前記ホルモン療法が、ＴＡＭを投与することを含む、請求項２８記載の方法。
38. 前記ホルモン療法が、トレミフェン、アナストロゾール、およびメガストロールアセテートからなる群から選択される抗エストロゲン薬を投与することを含む、請求項２８記載の方法。
39. 前記生体サンプルが、癌細胞を含む組織サンプルである、請求項１記載の方法。
40. 前記組織が固定パラフィン包埋されているか、または新鮮であるか、または凍結されている、請求項３９記載の方法。
41. 前記組織が、細針生検、コア生検、またはその他のタイプの生検に由来する、請求項４０記載の方法。
42. 前記組織サンプルが、細針吸引、気管支洗浄、経気管支生検によって得られる、請求項４０記載の方法。
43. 前記発現レベルが、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定される、請求項１記載の方法。
44. 前記発現産物の発現レベルが、免疫組織化学法によって決定される、請求項１記載の方法。
45. 前記発現産物の発現レベルが、プロテオミクス技術によって決定される、請求項１記載の方法。
46. 予後を要約したレポートを作成する工程を含む、請求項２記載の方法。
47. 抗エストロゲン薬による治療に対する、ＥＳＲ１陽性乳癌患者の有益な反応の尤度を定量的に決定するための方法であって、該患者から得られた、癌細胞を含む生体サンプルにおいて、次の変数：
    （ｉ）ＥＳＲ１グループのスコア、および
    （ｉｉ）以下の各遺伝子、ＥＳＲ１、ＳＣＵＢＥ２、ＴＦＲＣ、およびＢＣＬ２の１つ以上の遺伝子のＲＮＡ転写産物、またはそれらの発現産物の発現レベル
    の１つ以上を定量的に決定することを含み、
    ＥＳＲ１グループのスコア、ＥＳＲ１、ＳＣＵＢＥ２、またはＢＣＬ２の変数の増加分１単位ごとに、該患者が抗エストロゲン薬による治療に対して有益な反応を示す尤度が比例して増加すると同定され、かつ、ＴＦＲＣの変数の増加分１単位ごとに、該患者が抗エストロゲン薬による治療に対して有益な反応を示す尤度が比例して低下すると同定される、方法。
48. 前記ＥＳＲ１グループのスコア、またはＥＳＲ１遺伝子もしくはその発現産物の発現レベルが決定される、請求項４７記載の方法。
49. 前記ＥＳＲ１遺伝子またはその発現産物の発現レベルが決定される、請求項４８記載の方法。
50. 前記抗エストロゲン薬が、タモキシフェン、トレミフェン、アナストロゾール、およびメガステロールアセテートからなる群から選択される、請求項４７記載の方法。
51. 前記抗エストロゲン薬がタモキシフェンである、請求項５０記載の方法。
52. 治療法の推奨などの前記患者のための報告書を作成する工程を含む、請求項４７記載の方法。
53. 一方の軸に沿って、連続型変数として、またはＥＳＲ１発現の範囲としてかのいずれかでＥＳＲ１の発現レベルが表示され、他方の軸に沿って、連続型変数として、またはリスクの範囲としてかのいずれかで、癌再発の尤度が表示されている表またはグラフを参考にすることによって、抗エストロゲン単独、化学療法単独、または化学療法＋抗エストロゲンによる治療が推奨される、請求項５２記載の方法。
54. 前記発現範囲が、乳癌患者のＥＳＲ１値の集団内で四分位値になっている、請求項５３記載の方法。
55. 前記リスク範囲が、低度、中度、高度の範囲になっている、請求項５３記載の方法。
56. 高ＥＳＲ１および低リスクというカテゴリーの患者が、抗エストロゲン薬を単独投与される、請求項５３記載の方法。
57. 低ＥＳＲ１および高リスクというカテゴリーの患者が、化学療法を単独投与される、請求項５３記載の方法。
58. 中度ＥＳＲ１および高リスクというカテゴリーの患者が、抗エストロゲン薬および化学療法を投与される、請求項５３記載の方法。
59. ５つ以上の遺伝子の発現レベルに基づく診断テストに基づくと、ある患者が低リスクグループに含まれることが分かる、請求項５３記載の方法。
60. 前記テストが測定された再発スコアである、請求項５９記載の方法。
61. 前記変数が、ＥＳＲ１のＲＮＡ転写物、またはその発現産物の発現レベルである、請求項５３記載の方法。
62. 前記患者の再発スコアを決定する工程をさらに含む、請求項４７記載の方法。
63. 前記抗エストロゲン薬が、タモキシフェン、トレミフェン、アナストロゾール、およびメガステロールアセテートからなる群から選択される、請求項６２記載の方法。
64. 前記抗エストロゲン薬がタモキシフェンである、請求項６３記載の方法。
65. 請求項５３に基づいて、治療法の推奨などの患者のための報告書を作成する工程をさらに含む、請求項６２記載の方法。
66. 定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、表１に列挙した遺伝子の１つ以上のものの発現を定量化するための一組の遺伝子特異的プローブおよび／またはプライマーを含む、キット。
67. 前記遺伝子特異的プローブが、表７に列挙したプローブからなる群から選択される、請求項６６記載のキット。
68. 前記遺伝子特異的プライマーが、表７に列挙したフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなる群から選択される、請求項６６記載のキット。
69. 前記定量的ＲＴ−ＰＣＲで使用されるアンプリコンが、表８に列挙したアンプリコンからなる群から選択される、請求項６６記載のキット。
70. 腫瘍サンプル由来のＲＮＡの発現のための１種類以上の試薬をさらに含む、請求項６６記載のキット。
71. １個以上の容器を含む、請求項６６記載のキット。
72. 予後情報または予測情報を与える１つ以上のアルゴリズムを含む、請求項６６記載のキット。
73. 前記１個以上の容器が、作成済みマイクロアレイ、緩衝液、ヌクレオチド三リン酸、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、プローブ、またはプライマーを含む、請求項７１記載のキット。
74. 構成成分を使用するための指示書を有するラベルまたは添付文書を含む、請求項６６記載のキット。
75. 前記指示書が、乳癌の予測または予後診断に使用するための指示を含む、請求項７４記載のキット。

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