CN104004844A - 乳腺癌21基因联合检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
乳腺癌21基因联合检测试剂盒及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了乳腺癌21基因联合检测的试剂盒，本发明的PCR扩增引物由包括21对引物对所组成，可以联合检测21个基因相关表达量：Ki67,STK15,Survivin,CCNB1,MYBL2,MMP11,CTSL2,GRB7,HER2,GSTM1,CD68,BAG1,ER,PGR,BCL2,SCUBE2,ACTB,GAPDH,PRLPO,GUS,TFRC。本发明所涉及的21对引物产出片段都小于100bp，大大提高了石蜡标本提取mRNA逆转录后PCR的效率；预混了21基因的所有引物，省去了实验者设计和合成21对基因的时间和精力；无需再添加21基因的相应引物，预混在母液中大大减小了反应孔的误差。本试剂盒操作简单，只需加入模板就能在定量PCR仪上检测，大大缩短了检测实验时间。本发明适用于单样品和多样品，都能快速得到结果，能很好的满足科研和临床检测需求。
Description
技术领域
本发明属于医学分子生物学领域，涉及一种试剂盒，具体为一种针对乳腺癌21基因联合检测的试剂盒。
背景技术
近几年来，随着基因组学的研究深入，针对雌激素受体阳性患者的“21基因检测”(Oncotype Dx)已经被证实比临床病理学指标更能准确预测雌激素受体阳性、腋下淋巴结阴性且降低服用他莫昔芬患者的远处转移风险。该检测是唯一由美国临床肿瘤学会(ASCO)和美国国立综合癌症网络(NCCN)指南联合推荐的多基因检测。这21个基因包括16个肿瘤相关基因及5个参考基因。其中肿瘤相关基因包括：增殖相关基因(Ki-67、STK15、Survivin、Cyclin B1、MYBL2)、侵袭相关基因(Stromelysin3、Cathepsin L2)、Her-2相关基因(GRB7、Her-2)、激素相关基因(ER、PR、Bcl-2、SCUBE2)、GSTM1、BAG1、CD68。而5个参考基因则为Beta-actin、GAPDH、RPLPO、GUS和TFRC。
而目前21基因的检测主要是是通过从病人的石蜡标本中提取mRNA后进行RT-QPCR的方法来检测各个基因的表达再量化为复发风险评分(RS)。在检测实验时，一个real time PCR反应体系中引物的用量极少不到1μl。而PCR反应本身就是灵敏度极高的实验，如此多的基因配成反应孔在检测实验操作时极易产生误差，且操作过程繁琐耗时多。如何能得到相应基因的精确CT值及能减少实验时间和减小实验误差成了亟待解决的问题。
发明内容
为克服上述存在的问题和技术的不足，本发明提供了一种快速有效的乳腺癌21基因联合检测试剂盒，其能很好的满足科研和临床检测需求。
本发明解决其技术问题采用的技术方案：
一种乳腺癌21基因联合检测试剂盒，其特征是21个基因为Ki67,STK15,Survivin,CCNB1,MYBL2,MMP11,CTSL2,GRB7,HER2,GSTM1,CD68,BAG1,ER,PGR,BCL2,SCUBE2,ACTB,GAPDH,PRLPO,GUS,TFRC；
所述试剂盒包括以下扩增21个基因的引物对：
引物对1：Ki-67：
F:5' CTCCACAGTCAGACCCAG 3'
R:5' GCACGCTAAGAGTTCTCC 3'；
引物对2：STK15：
F:5' AGGCTCAGCGGGTCTTGT 3'
R:5' AACCGGCTTGTGACTGGA 3'；
引物对3：Survivin：
F:5' TACGCCTGTAATACCAGCAC 3'
R:5' AAGCGCAACCGGACGAAT 3'；
引物对4：Cyclin B1：
F；5' CGGGAAGTCACTGGAAAC 3'
R:5' CTCCTGCAACAACCTGAA 3'；
引物对5：MYBL2：
F:5' AGGGAGGACAGACAATGCT 3'
R:5' CTTTGGACTCGCTCAAGAA 3'；
引物对6：MMP11：
F:5' GGTGGCAGCCCATGAATT 3'
R:5' GGTAGCGAAAGGTGTAGAAGG 3'；
引物对7：CTSL2：
F:5' TACAGCCAAGGGAAACAT 3'
R:5' GAAAGCAACCCATCATCT 3'；
引物对8：GRB7：
F:5' CCCACTGACTTCGGTTTCT 3'
R:5' GTGCGGCTCTGCTCATCT 3'；
引物对9：HER2：
F:5' GAGTCCATGCCCAATCCC 3'
R:5' CCCACGTCCGTAGAAAGGT 3'；
引物对10：ER：
F:5' TGCCAAGGAGACTCGCTAC 3'
R:5' AGCCCTCACAGGACCAGA 3；
引物对11：PGR：
F:5' GCTGCGGTGGAGGTTGAGGA 3'
R:5' ACCCAGAGCCCGAGGTTTGC 3'；
引物对12：BCL2,：
F:5' CTTCGCCGAGATGTCCAG 3'
R:5' CCAGTTCACCCCGTCCCT 3'；
引物对13：SCUBE2：
F:5' ATGGGAGGAGCTGCCTTGA 3'
R:5' CGCCGTTTCACCCGTTTA 3'；
引物对14：GSTM1：
F:5' GACGCTCCTGATTATGACA 3'
R:5' TCAAGTAGGGCAGATTGG 3'；
引物对15：BAG1：
F:5' ATCTTGGAGGAGATTGACA 3'
R:5' AGGAATGCCTGAACCTTT 3'；
引物对16：CD68：
F:5' CTTTGCTGCCATCCTTCA 3'
R:5' TTGTGGCTCTTGGTAGTCC 3'；
引物对17：ACTB：
F:5' TTCCAGCCTTCCTTCCTG 3'
R:5' CTTTGCGGATGTCCACGT 3'；
引物对18：GAPDH：
F:5' ATCATCAGCAATGCCTCC 3'
R:5' TCCTTCCACGATACCAAAG 3'；
引物对19：PRLPO：
F:5' GGTCATCCAGCAGGTGTT 3'
R:5' CCTCCAGGAAGCGAGAAT 3'；
引物对20：GUS：
F:5' CCACGGTGTCAACAAGCA 3'
R:5' ACCAAGCCAGCGAAGCAG 3'；
引物对21：TFRC：
F:5' CACCATCTCGGTCATCAG 3'
R:5' TCCATATTCCCAAACAGC 3'。
本发明还提供了乳腺癌21基因联合检测试剂盒的制备方法，步骤如下：
(1)21对基因引物的设计和合成：根据primer5设计引物，目的片段都小于100bp，大大保证了石蜡标本mRNA逆转录后的PCR效率，21对基因引物由如下序列表中SEQ ID NO：1-SEQID NO：21所组成的引物对所组成：
增殖相关基因(Ki-67、STK15、Survivin、Cyclin B1、MYBL2)
引物对1：Ki-67：
F:5' CTCCACAGTCAGACCCAG 3'
R:5' GCACGCTAAGAGTTCTCC 3'；
引物对2：STK15：
F:5' AGGCTCAGCGGGTCTTGT 3'
R:5' AACCGGCTTGTGACTGGA 3'；
引物对3：Survivin：
F:5' TACGCCTGTAATACCAGCAC 3'
R:5' AAGCGCAACCGGACGAAT 3'；
引物对4：Cyclin B1：
F:5' CGGGAAGTCACTGGAAAC 3'
R:5' CTCCTGCAACAACCTGAA 3’；
引物对5：MYBL2：
F:5' AGGGAGGACAGACAATGCT 3'
R:5' CTTTGGACTCGCTCAAGAA 3’；
侵袭相关基因(Stromelysin3、Cathepsin L2)
引物对6：Stromelysin-3(MMP11)：
F:5' GGTGGCAGCCCATGAATT 3'
R:5' GGTAGCGAAAGGTGTAGAAGG 3’；
引物对7：Cathepsin L2(CTSL2)：
F:5' TACAGCCAAGGGAAACAT 3'
R:5' GAAAGCAACCCATCATCT 3’；
Her-2相关基因(GRB7、HER2)
引物对8：GRB7：
F:5' CCCACTGACTTCGGTTTCT 3'
R:5' GTGCGGCTCTGCTCATCT 3’；
引物对9：HER2：
F:5' GAGTCCATGCCCAATCCC 3'
R:5' CCCACGTCCGTAGAAAGGT 3’；
激素相关基因(ER、PR、Bcl-2、SCUBE2)
引物对10：ER：
F:5' TGCCAAGGAGACTCGCTAC 3'
R:5' AGCCCTCACAGGACCAGA 3；
引物对11：PGR：
F:5' GCTGCGGTGGAGGTTGAGGA 3'
R:5' ACCCAGAGCCCGAGGTTTGC 3’；
引物对12：BCL2,：
F:5' CTTCGCCGAGATGTCCAG 3'
R:5' CCAGTTCACCCCGTCCCT 3’；
引物对13：SCUBE2：
F:5' ATGGGAGGAGCTGCCTTGA 3'
R:5' CGCCGTTTCACCCGTTTA 3’；
其它(GSTM1、BAG1、CD68)
引物对14：GSTM1：
F:5' GACGCTCCTGATTATGACA 3'
R:5' TCAAGTAGGGCAGATTGG 3’；
引物对15：BAG1：
F:5' ATCTTGGAGGAGATTGACA 3'
R:5' AGGAATGCCTGAACCTTT 3’；
引物对16：CD68：
F:5' CTTTGCTGCCATCCTTCA 3'
R:5' TTGTGGCTCTTGGTAGTCC 3’；
参考相关基因(ACTB、GAPDH、RPLPO、GUS、TFRC)
引物对17：ACTB：
F:5' TTCCAGCCTTCCTTCCTG 3'
R:5' CTTTGCGGATGTCCACGT 3’；
引物对18：GAPDH：
F:5' ATCATCAGCAATGCCTCC 3'
R:5' TCCTTCCACGATACCAAAG 3’；
引物对19：RPLPO：
F:5' GGTCATCCAGCAGGTGTT 3'
R:5' CCTCCAGGAAGCGAGAAT 3’；
引物对20：GUS：
F:5' CCACGGTGTCAACAAGCA 3'
R:5' ACCAAGCCAGCGAAGCAG 3’；
引物对21：TFRC：
F:5' CACCATCTCGGTCATCAG 3'
R:5' TCCATATTCCCAAACAGC 3’；
以上引物均由上海生工生物公司合成；
(2)预混液的配制：在普通荧光定量PCR试剂盒的基础上引入这21对引物；制成每个引物对应的21管一定剂量反应预混液，包含定量PCR反应所需的全部组分和引物，制成成品反应液。成品反应液中采用热启动性质的高纯度DNA聚合酶，保证特异性。引物在低温都能保存很长时间且较稳定。因此只要加入模板就能直接在荧光定量PCR仪上检测，大大加速实验的进程且避免了逐个去配制各基因的反应液时的误差；
(3)根据单个样品检测时所需反应液的量的比例，计算出检测100份样品所需的预混液用量，配制到一个可以封闭的棕色管子中，混匀，保存，即得本发明的试剂盒；
(4)试剂盒中成品反应液的性能检测：将上述配制好的试剂盒储存在一定条件下，在即时，1天，1周，1个月，2个月，3个月的时间段用同一模板来做定量PCR，将得到的CT值算出RS值，统计每次的结果是否有差异性。
本发明有益的效果是：
1、本发明所涉及的21对引物产出片段都小于100bp，大大提高了石蜡标本提取mRNA逆转录后PCR的效率。
2、该发明预混了21基因的所有引物，省去了实验者设计和合成21对基因的时间和精力。
3、本试剂盒操作简单，只需加入模板就能在定量PCR仪上检测，将大大缩短了检测实验时间
4、本试剂盒无需再添加21基因的相应引物，成品反应液中已包含，大大减小了反应孔的误差
5、本发明适用于单样品和多样品，都能快速得到结果，能很好的满足科研和临床检测需求。
附图说明
图1：石蜡标本样品1、2、3，提取得到的RNA电泳图。
图2：成品反应液性能检测。成品反应液制成后即时检测样品1统计分析的RS值。检测结果高风险：RS＞31。
图3：成品反应液性能检测。成品反应液制成保存1天后检测样品1统计分析的RS值。检测结果高风险：RS＞31。
图4：成品反应液性能检测。成品反应液制成保存1周后检测样品1统计分析的RS值。检测结果高风险：RS＞31。
图5：成品反应液性能检测。成品反应液制成保存1月后检测样品1统计分析的RS值。检测结果高风险：RS＞31。
图6：成品反应液性能检测。成品反应液制成保存2月后检测样品1统计分析的RS值。检测结果高风险：RS＞31。
图7：成品反应液性能检测。成品反应液制成保存3月后检测样品1统计分析的RS值。检测结果高风险：RS＞31。
图8：成品反应液性能检测。成品反应液检测样品2统计分析的RS值。检测结果中风险：18＜RS＜31。
图9：成品反应液性能检测。成品反应液检测样品3统计分析的RS值。检测结果低风险：RS＜18。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合举例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的举例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明在普通的荧光定量PCR试剂盒的基础上，加入已知的21个基因的引物，预混成21管反应液。每个基因引物对应相应的预混液管，并标明。再进行预混液性能检测。具体步骤如下：
(1)志愿者乳腺癌石蜡标本mRNA的提取，分别得到样品1、2、3：(采用QIAGEN公司FFPE Kit)
1.首先用刀片，修剪蜡块。
2.在石蜡切片机上切成蜡片5μm，取5～10张。
3.马上把组织片放入到1.5ml EP管中，盖上盖子。
4.加入1ml二甲苯脱蜡，漩涡振荡10s，10000rpm，离心8min。
5.离心弃去二甲苯，加入无水乙醇洗脱。如果脱蜡还没有完全，再加入二甲苯重复上面的步骤。
6.加入240μl Buffer PKD，漩涡振荡。加入10μl的蛋白酶K，轻柔上下颠倒
7.在56℃孵育15min，然后80℃孵育15min。
8.转移液体到一个新的2ml离心管中。
9.在冰上孵育3min。13500rpm离心15min。
10.将上清转移到一个新的离心管中，不要碰到下面的沉淀。
11.加入1/10上清液体积的DNase Booster Buffer，然后加入10μl DNase I原液。颠倒管子，离心，使壁上的液体至底部。
12.室温放置15min。
13.加入320μl Buffer RBC，彻底混合溶解。
14.加入1200μl无水乙醇，立即进行下一步。
15.吸出700μl的样品，包括沉淀物，移到一个RNeasy MinElute spin column套在2ml EP离心管上，盖上盖子，≥10000rpm，离心15s。
16.重复17，直到全部的样品都穿过了RNeasy MinElute spin column。
17.加入500μl的Buffer RPE到RNeasy MinElute spin column中，盖上盖子，≥10000rpm，离心15s，倒去废液。
18.加入500μl的Buffer RPE到RNeasy MinElute spin column中，盖上盖子，≥10000rpm，离心2min，洗膜，倒去废液
19.将RNeasy MinElute spin column放到一个新的2ml离心管中，打开盖子，离心5min。倒去废液。
20.再将RNeasy MinElute spin column放到一个新的1.5ml EP管中。加入14–30μl RNase-freewater，正好布满膜上。盖上盖子，离心1min，洗提RNA。(电泳结果见图1)
(2)将提取好的mRNA逆转录成cDNA：(TaKaRa试剂盒DRR047A)
A：基因组DNA的去除反应
B：反转录反应
将上述逆转录好的cDNA在-20℃储存好备用。
(3)预混液的配制：(采用TaKaRa试剂盒DRR420A为基础制备预混液，(单个样品所需反应液的比例))
(4)根据单个样品检测时所需反应液的量的比例，计算出检测100份样品所需的预混液用量，配制到一个可以封闭的棕色管子中，混匀，保存，即得本发明的试剂盒；
(5)试剂盒中成品反应液的性能检测：
将上述配制好的试剂盒储存在一定条件下，在即时，1天，1周，1个月，2个月，3个月的时间段分别取含有各个基因引物的成品反应液18μl+2μl上述制备好的样品cDNA，混匀后在定量PCR仪上检测，观察和分析结果。RS：复发风险评分(RS)，从0至100范围。复发预测：低风险：RS≤18；中风险：18＜RS＜31；高风险：RS≥31。
PCR反应程序：
以上仅为本发明的具体实施例，对本领域技术人员来说，对本发明的技术方案及发明构思加以等同替换或改变都应属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州美中疾病基因研究院有限公司
<120> 乳腺癌21基因联合检测试剂盒及其制备方法
<130>
<160> 42
<170> PatentIn version 3.3
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ctttgcggat gtccacgt 18
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
atcatcagca atgcctcc 18
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
tccttccacg ataccaaag 19
<210> 37
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
ggtcatccag caggtgtt 18
<210> 38
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
cctccaggaa gcgagaat 18
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
ccacggtgtc aacaagca 18
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
accaagccag cgaagcag 18
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
caccatctcg gtcatcag 18
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
tccatattcc caaacagc 18
Claims (2)
1.一种乳腺癌21基因联合检测试剂盒，其特征是21个基因为Ki67, STK15, Survivin, CCNB1, MYBL2, MMP11, CTSL2, GRB7, HER2, GSTM1, CD68, BAG1, ER, PGR, BCL2, SCUBE2, ACTB, GAPDH, PRLPO, GUS, TFRC；
所述试剂盒包括以下扩增21个基因的引物对：
引物对1：Ki-67：
F: 5' CTCCACAGTCAGACCCAG 3'
R: 5' GCACGCTAAGAGTTCTCC 3'；
引物对2：STK15：
F: 5' AGGCTCAGCGGGTCTTGT 3'
R: 5' AACCGGCTTGTGACTGGA 3'；
引物对3：Survivin：
F: 5' TACGCCTGTAATACCAGCAC 3'
R: 5' AAGCGCAACCGGACGAAT 3'；
引物对4：Cyclin B1：
F; 5' CGGGAAGTCACTGGAAAC 3'
R: 5' CTCCTGCAACAACCTGAA 3'；
引物对5：MYBL2：
F: 5' AGGGAGGACAGACAATGCT 3'
R: 5' CTTTGGACTCGCTCAAGAA 3'；
引物对6：MMP11：
F: 5' GGTGGCAGCCCATGAATT 3'
R: 5' GGTAGCGAAAGGTGTAGAAGG 3'；
引物对7： CTSL2：
F: 5' TACAGCCAAGGGAAACAT 3'
R: 5' GAAAGCAACCCATCATCT 3'；
引物对8：GRB7：
F: 5' CCCACTGACTTCGGTTTCT 3'
R: 5' GTGCGGCTCTGCTCATCT 3'；
引物对9：HER2：
F: 5' GAGTCCATGCCCAATCCC 3'
R: 5' CCCACGTCCGTAGAAAGGT 3'；
引物对10：ER：
F: 5' TGCCAAGGAGACTCGCTAC 3'
R: 5' AGCCCTCACAGGACCAGA 3；
引物对11：PGR：
F: 5' GCTGCGGTGGAGGTTGAGGA 3'
R: 5' ACCCAGAGCCCGAGGTTTGC 3'；
引物对12：BCL2,：
F: 5' CTTCGCCGAGATGTCCAG 3'
R: 5' CCAGTTCACCCCGTCCCT 3'；
引物对13：SCUBE2：
F: 5' ATGGGAGGAGCTGCCTTGA 3'
R: 5' CGCCGTTTCACCCGTTTA 3'；
引物对14：GSTM1：
F: 5' GACGCTCCTGATTATGACA 3'
R: 5' TCAAGTAGGGCAGATTGG 3'；
引物对15：BAG1：
F: 5' ATCTTGGAGGAGATTGACA 3'
R: 5' AGGAATGCCTGAACCTTT 3'；
引物对16：CD68：
F: 5' CTTTGCTGCCATCCTTCA 3'
R: 5' TTGTGGCTCTTGGTAGTCC 3'；
引物对17：ACTB：
F: 5' TTCCAGCCTTCCTTCCTG 3'
R: 5' CTTTGCGGATGTCCACGT 3'；
引物对18：GAPDH：
F: 5' ATCATCAGCAATGCCTCC 3'
R: 5' TCCTTCCACGATACCAAAG 3'；
引物对19：PRLPO：
F: 5' GGTCATCCAGCAGGTGTT 3'
R: 5' CCTCCAGGAAGCGAGAAT 3'；
引物对20：GUS：
F: 5' CCACGGTGTCAACAAGCA 3'
R: 5' ACCAAGCCAGCGAAGCAG 3'；
引物对21：TFRC：
F: 5' CACCATCTCGGTCATCAG 3'
R: 5' TCCATATTCCCAAACAGC 3'。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征是，所述试剂盒的制备方法包括以下步骤：
（1）预混液的配制：在普通荧光定量PCR试剂盒的基础上引入这21对引物，制成每个引物对应的21管一定剂量反应预混液，包含定量PCR反应所需的全部组分和引物，制成成品反应液，成品反应液中采用热启动性质的高纯度DNA聚合酶；
（2）根据单个样品检测时所需反应液的量的比例，计算出检测100份样品所需的预混液用量，配制到一个可以封闭的棕色管子中，混匀，保存，即得所述试剂盒；
（3）试剂盒中成品反应液的性能检测：将上述配制好的试剂盒储存在一定条件下，在即时，1天，1周，1个月，2个月，3个月的时间段用同一模板来做定量PCR，将得到的CT值算出RS值，统计每次的结果是否有差异性。
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