CN106978492A - 一种用于检测乳腺癌21基因表达水平的多重荧光pcr检测试剂盒 - Google Patents
一种用于检测乳腺癌21基因表达水平的多重荧光pcr检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于检测乳腺癌21基因表达水平的多重荧光PCR检测试剂盒，一种用于检测乳腺癌21基因表达水平的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：依次包括检测Ki‑67、STK15、Survivin、stromelysin 3、Cathepsin L2、Cyclin B1、GRB7、HER‑2、MYBL2、ER、PR、BCL2、SCUBE2、GSTM1、BAG1、CD68、GAPDH、Beta‑actin、RPLPO、GUS和TFRC的第一至第二十一引物组以及相应的第一至第二十一检测探针。本发明的试剂盒采用多重荧光PCR扩增技术，以石蜡包埋组织切片中提取的RNA为检测样本，能够检测乳腺癌肿瘤组织中21个不同基因的表达水平，辅助临床医生评估早期乳腺癌患者的化疗收益和复发风险。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测乳腺癌21基因表达水平的多重荧光PCR检测试剂盒。
背景技术
肿瘤基因的调节通过基因表达(转录和翻译)来完成。基因表达模式包括基因的正向调节和负向调节，它决定着其相关蛋白的表达量。乳腺癌21基因检测检测恶性肿瘤组织中一组特异基因的表达，对预测预后、复发、瘤灶转移乃至指导治疗提供信息，最终目的是为患者的个体化治疗提供帮助。多参数基因表达试验同时检测多种肿瘤基因的表达产物。结果以积分的形式表示，积分用于对肿瘤可能发生的生物学行为的预测。乳腺癌21基因检测是指检测乳腺癌肿瘤组织中21个不同基因的表达水平，包含16个乳腺癌相关基因和5个参考基因(如下表)，这个检测能够提供个体化的治疗效果预测和10年复发风险的预测。通过检测检测21个基因，观察他们之间的相互作用来判断肿瘤特性，从而可预测乳腺癌复发指数以及接受化疗的效益比。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测乳腺癌21基因表达水平的多重荧光PCR检测试剂盒。
本发明的技术方案如下：
一种用于检测乳腺癌21基因表达水平的多重荧光PCR检测试剂盒，依次包括检测Ki-67、STK15、Survivin、stromelysin 3、Cathepsin L2、Cyclin B1、GRB7、HER-2、MYBL2、ER、PR、BCL2、SCUBE2、GSTM1、BAG1、CD68、GAPDH、Beta-actin、RPLPO、GUS和TFRC的第一至第二十一引物组以及相应的第一至第二十一检测探针，且第一至第二十一检测探针的5’端修饰有荧光报告基团，3’端修饰有荧光猝灭基团；其中，
第一引物组包括21-MKI67-F和21-MKI67-R，分别包括如SEQ ID NO 01和02所示的序列，第一检测探针为21-MKI67-P，包括如SEQ ID NO 03所示的序列；
第二引物组包括21-AURKA-F和21-AURKA-R，分别包括如SEQ ID NO 04和05所示的序列，第二检测探针为21-AURKA-P，包括如SEQ ID NO 06所示的序列；
第三引物组包括21-BIRC5-F和21-BIRC5-R，分别包括如SEQ ID NO 07和08所示的序列，第三检测探针为21-BIRC5-P，包括如SEQ ID NO 09所示的序列；
第四引物组包括21-MMP11-F和21-MMP11-R，分别包括如SEQ ID NO 10和11所示的序列，第四检测探针为21-MMP11-P，包括如SEQ ID NO 12所示的序列；
第五引物组包括21-CTSV-F和21-CTSV-R，分别包括如SEQ ID NO 13和14所示的序列，第五检测探针为21-CTSV-P，包括如SEQ ID NO 15所示的序列；
第六引物组包括21-CCNB1-F和21-CCNB1-R，分别包括如SEQ ID NO 16和17所示的序列，第六检测探针为21-CCNB1-P，包括如SEQ ID NO 18所示的序列；
第七引物组包括21-GRB7-F和21-GRB7-R，分别包括如SEQ ID NO 19和20所示的序列，第七检测探针为21-GRB7-P，包括如SEQ ID NO 21所示的序列；
第八引物组包括21-ERBB2-F和21-ERBB2-R，分别包括如SEQ ID NO 22和23所示的序列，第八检测探针为21-ERBB2-P，包括如SEQ ID NO 24所示的序列；
第九引物组包括21-MYBL2-F和21-MYBL2-R，分别包括如SEQ ID NO 25和26所示的序列，第九检测探针为21-MYBL2-P，包括如SEQ D NO 27所示的序列；
第十引物组包括21-ESR1-F和21-ESR1-R，分别包括如SEQ ID NO 28和29所示的序列，第十检测探针为21-ESR1-P，包括如SEQ ID NO 30所示的序列；
第十一引物组包括21-PGR-F和21-PGR-R，分别包括如SEQ ID NO 31和32所示的序列，第十一检测探针为21-PGR-P，包括如SEQ ID NO 33所示的序列；
第十二引物组包括21-BCL2-F和21-BCL2-R，分别包括如SEQ ID NO 34和35所示的序列，第十二检测探针为21-BCL2-P，包括如SEQ ID NO 36所示的序列；
第十三引物组包括21-SCUBE2-F和21-SCUBE2-R，分别包括如SEQ ID NO 37和38所示的序列，第十三检测探针为21-SCUBE2-P，包括如SEQ ID NO 39所示的序列；
第十四引物组包括21-GSTM1-F1和21-GSTM1-R，分别包括如SEQ ID NO 40和41所示的序列，第十四检测探针为21-GSTM1-P，包括如SEQ D NO 42所示的序列；
第十五引物组包括21-BAG1-F和21-BAG1-R，分别包括如SEQ D NO 43和44所示的序列，第十五检测探针为21-BAG1-P，包括如SEQ D NO 45所示的序列；
第十六引物组包括21-CD68-F和21-CD68-R，分别包括如SEQ ID NO 46和47所示的序列，第十六检测探针为21-CD68-P，包括如SEQ ID NO 48所示的序列；
第十七引物组包括21-GAPDH-F和21-GAPDH-R，分别包括如SEQ ID NO 49和50所示的序列，第十七检测探针为21-GAPDH-P，包括如SEQ ID NO 51所示的序列；
第十八引物组包括21-Beta-actin-F和21-Beta-actin-R，分别包括如SEQ ID NO52和53所示的序列，第十八检测探针为21-Beta-actin-P，包括如SEQ ID NO 54所示的序列；
第十九引物组包括21-RPLP0-F和21-RPLP0-R，分别包括如SEQ ID NO 55和56所示的序列，第十九检测探针为21-RPLP0-P，包括如SEQ ID NO 57所示的序列；
第二十引物组包括21-GUSB-F和21-GUSB-R，分别包括如SEQ ID NO 58和59所示的序列，第二十检测探针为21-GUSB-P，包括如SEQ ID NO 60所示的序列；
第二十一引物组包括21-TFRC-F和21-TFRC-R，分别包括如SEQ ID NO 61和62所示的序列，第二十一检测探针为21-TFRC-P，包括如SEQ ID NO 63所示的序列；
该多重荧光PCR检测试剂盒的反应体系的组成如下：
第一至第二十一引物组中的至少一引物组
相应的检测探针
1×PCR缓冲液
MgCl2
dNTPs
Taq酶
H2O
模板；
该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的反应条件均为：95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒，64℃退火20秒，72℃延伸15秒，15个循环；95℃变性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸10秒，30个循环；后30个循环在退火时检测荧光信号。
在本发明的一个优选实施方案中，所述模板为自石蜡包埋组织切片中提取的RNA。
在本发明的一个优选实施方案中，所述第一至第二十一引物组以及相应的第一至第二十一检测探针分为第一至第八检测组，所述多重荧光PCR检测试剂盒的反应体系的组成如下：
第一至第八检测组中的其中之一
1×PCR缓冲液
MgCl2
dNTPs
Taq酶
H2O
模板。
进一步优选的，
所述第一检测组包括第一至第三引物组以及第一至第三检测探针；
所述第二检测组包括第四至第六引物组以及第四至第六检测探针；
所述第三检测组包括第七至第九引物组以及第七至第九检测探针；
所述第四检测组包括第十至第十二引物组以及第十至第十二检测探针；
所述第五检测组包括第十三至第十四引物组以及第十三至第十四检测探针；
所述第六检测组包括第十五至第十六引物组以及第十五至第十六检测探针；
所述第七检测组包括第十七至第十八引物组以及第十七至第十八检测探针；
所述第八检测组包括第十九至第二十一引物组以及第十九至第二十一检测探针。
在本发明的一个优选实施方案中，所述荧光报告基团包括FAM、HEX和ROX，所述荧光猝灭基团包括BHQ1和BHQ2。
在本发明的一个优选实施方案中，所述反应体系的具体组成如下：
本发明的有益效果：本发明的试剂盒采用多重荧光PCR扩增技术，以石蜡包埋组织切片中提取的RNA为检测样本，能够准确、简单、快速地同时检测乳腺癌肿瘤组织中21个不同基因的表达水平，辅助临床医生评估早期乳腺癌患者的化疗收益和复发风险。
附图说明
图1为本发明实施例1的多重荧光PCR反应程序图。
图2为本发明实施例1中多重荧光PCR检测21基因高表达水平对照样品检测曲线图。
图3为本发明实施例2中多重荧光PCR检测21基因低表达水平的样品检测曲线图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
依次包括检测Ki-67、STK15、Survivin、stromelysin 3、Cathepsin L2、CyclinB1、GRB7、HER-2、MYBL2、ER、PR、BCL2、SCUBE2、GSTM1、BAG1、CD68、GAPDH、Beta-actin、RPLPO、GUS和TFRC的第一至第二十一引物组以及相应的第一至第二十一检测探针，且第一至第二十一检测探针的5’端修饰有荧光报告基团，3’端修饰有荧光猝灭基团，所述荧光报告基团包括FAM、HEX和ROX，所述荧光猝灭基团包括BHQ1和BHQ2；其中，
第一引物组包括21-MKI67-F和21-MKI67-R，分别包括如SEQ ID NO 01和02所示的序列，第一检测探针为21-MKI67-P，包括如SEQ D NO 03所示的序列；
第二引物组包括21-AURKA-F和21-AURKA-R，分别包括如SEQ ID NO 04和05所示的序列，第二检测探针为21-AURKA-P，包括如SEQ ID NO 06所示的序列；
第三引物组包括21-BIRC5-F和21-BIRC5-R，分别包括如SEQ ID NO 07和08所示的序列，第三检测探针为21-BIRC5-P，包括如SEQ D NO 09所示的序列；
第四引物组包括21-MMP11-F和21-MMP11-R，分别包括如SEQ ID NO 10和11所示的序列，第四检测探针为21-MMP11-P，包括如SEQ ID NO 12所示的序列；
第五引物组包括21-CTSV-F和21-CTSV-R，分别包括如SEQ ID NO 13和14所示的序列，第五检测探针为21-CTSV-P，包括如SEQ ID NO 15所示的序列；
第六引物组包括21-CCNB1-F和21-CCNB1-R，分别包括如SEQ ID NO 16和17所示的序列，第六检测探针为21-CCNB1-P，包括如SEQ D NO 18所示的序列；
第七引物组包括21-GRB7-F和21-GRB7-R，分别包括如SEQ ID NO 19和20所示的序列，第七检测探针为21-GRB7-P，包括如SEQ ID NO 21所示的序列；
第八引物组包括21-ERBB2-F和21-ERBB2-R，分别包括如SEQ D NO 22和23所示的序列，第八检测探针为21-ERBB2-P，包括如SEQ D NO 24所示的序列；
第九引物组包括21-MYBL2-F和21-MYBL2-R，分别包括如SEQ ID NO 25和26所示的序列，第九检测探针为21-MYBL2-P，包括如SEQ ID NO 27所示的序列；
第十引物组包括21-ESR1-F和21-ESR1-R，分别包括如SEQ ID NO 28和29所示的序列，第十检测探针为21-ESR1-P，包括如SEQ ID NO 30所示的序列；
第十一引物组包括21-PGR-F和21-PGR-R，分别包括如SEQ ID NO 31和32所示的序列，第十一检测探针为21-PGR-P，包括如SEQ ID NO 33所示的序列；
第十二引物组包括21-BCL2-F和21-BCL2-R，分别包括如SEQ ID NO 34和35所示的序列，第十二检测探针为21-BCL2-P，包括如SEQ ID NO 36所示的序列；
第十三引物组包括21-SCUBE2-F和21-SCUBE2-R，分别包括如SEQ ID NO 37和38所示的序列，第十三检测探针为21-SCUBE2-P，包括如SEQ ID NO 39所示的序列；
第十四引物组包括21-GSTM1-F1和21-GSTM1-R，分别包括如SEQ ID NO 40和41所示的序列，第十四检测探针为21-GSTM1-P，包括如SEQ ID NO 42所示的序列；
第十五引物组包括21-BAG1-F和21-BAG1-R，分别包括如SEQ ID NO 43和44所示的序列，第十五检测探针为21-BAG1-P，包括如SEQ D NO 45所示的序列；
第十六引物组包括21-CD68-F和21-CD68-R，分别包括如SEQ ID NO 46和47所示的序列，第十六检测探针为21-CD68-P，包括如SEQ ID NO 48所示的序列；
第十七引物组包括21-GAPDH-F和21-GAPDH-R，分别包括如SEQ ID NO 49和50所示的序列，第十七检测探针为21-GAPDH-P，包括如SEQ ID NO 51所示的序列；
第十八引物组包括21-Beta-actin-F和21-Beta-actin-R，分别包括如SEQ ID NO52和53所示的序列，第十八检测探针为21-Beta-actin-P，包括如SEQ ID NO 54所示的序列；
第十九引物组包括21-RPLP0-F和21-RPLP0-R，分别包括如SEQ ID NO 55和56所示的序列，第十九检测探针为21-RPLP0-P，包括如SEQ ID NO 57所示的序列；
第二十引物组包括21-GUSB-F和21-GUSB-R，分别包括如SEQ ID NO 58和59所示的序列，第二十检测探针为21-GUSB-P，包括如SEQ ID NO 60所示的序列；
第二十一引物组包括21-TFRC-F和21-TFRC-R，分别包括如SEQ ID NO 61和62所示的序列，第二十一检测探针为21-TFRC-P，包括如SEQ D NO 63所示的序列；
该多重荧光PCR检测试剂盒的反应体系的组成如下：
第一至第二十一引物组中的至少一引物组
相应的检测探针
1×PCR缓冲液
MgCl2
dNTPs
Taq酶
H2O
模板；
该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的反应条件均为：95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒，64℃退火20秒，72℃延伸15秒，15个循环；95℃变性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸10秒，30个循环；后30个循环在退火时检测荧光信号。
所述模板为自石蜡包埋组织切片中提取的RNA。
所述第一至第二十一引物组以及相应的第一至第二十一检测探针分为第一至第八检测组，所述多重荧光PCR检测试剂盒的反应体系的组成如下：
第一至第八检测组中的其中之一
1×PCR缓冲液
MgCl2
dNTPs
Taq酶
H2O
模板。
所述第一检测组包括第一至第三引物组以及第一至第三检测探针；
所述第二检测组包括第四至第六引物组以及第四至第六检测探针；
所述第三检测组包括第七至第九引物组以及第七至第九检测探针；
所述第四检测组包括第十至第十二引物组以及第十至第十二检测探针；
所述第五检测组包括第十三至第十四引物组以及第十三至第十四检测探针；
所述第六检测组包括第十五至第十六引物组以及第十五至第十六检测探针；
所述第七检测组包括第十七至第十八引物组以及第十七至第十八检测探针；
所述第八检测组包括第十九至第二十一引物组以及第十九至第二十一检测探针。
所述反应体系的具体组成如下：
上述引物及探针具体序列如下表所示：
实施例1
本实施例以人类乳腺癌21基因表达水平为检测对象，通过本发明中的特异引物的优化组合以及荧光探针，从而实现准确、简单、快速地同时检测21基因表达水平。
以21个基因DNA质粒为对照模板，建立多重荧光PCR检测21基因表达水平的反应体系，最终以循环次数Ct值计算RS值作为结果判断的标准。
上述多重荧光PCR扩增反应体系分8管配制，，各管检测的突变见下表：
| 管号 | FAM荧光信号 | HEX荧光信号 | ROX荧光信号 |
| 1 | Ki-67 | STK15 | Survivin |
| 2 | stromelysin 3 | Cathepsin L2 | Cyclin B1 |
| 3 | GRB7 | HER-2 | MYBL2 |
| 4 | ER | PR | BCL2 |
| 5 | SCUBE2 | GSTM1 | N/A |
| 6 | BAG1 | CD68 | N/A |
| 7 | GAPDH | Beta-actin | N/A |
| 8 | RPLPO | GUS | TFRC |
具体为：
1号管配制体系：
2号管配制体系：
3号管配制体系：
| 序号 | 物料 | 物料浓度 | 用量(μL) |
| 1 | 1×PCR缓冲液 | 1× | 10 |
| 2 | MgCl2 | 25mM | 8 |
| 3 | dNTPs | 10mM | 5 |
| 4 | 21-GRB7-F | 50μM | 2 |
| 5 | 21-GRB7-R | 50mM | 0.1 |
| 6 | 21-GRB7-P | 50mM | 0.1 |
| 7 | 21-ERBB2-F | 50mM | 0.1 |
| 8 | 21-ERBB2-R | 50mM | 0.1 |
| 9 | 21-ERBB2-P | 50mM | 0.1 |
| 10 | 21-MYBL2-F | 50mM | 0.1 |
| 11 | 21-MYBL2-R1 | 50mM | 0.1 |
| 12 | 21-MYBL2-P | 50mM | 0.1 |
| 13 | Taq酶 | 5U | 0.5 |
| 14 | H2O | 纯化水 | 18.6 |
| 15 | cDNA模板 | —— | 5 |
| 16 | 总体积 | —— | 50 |
4号管配制体系：
5号管配制体系：
| 序号 | 物料 | 物料浓度 | 用量(μL) |
| 1 | 1×PCR缓冲液 | 1× | 10 |
| 2 | MgCl2 | 25mM | 8 |
| 3 | dNTPs | 10mM | 5 |
| 4 | 21-SCUBE2-F | 50μM | 2 |
| 5 | 21-SCUBE2-R | 50mM | 0.1 |
| 6 | 21-SCUBE2-P | 50mM | 0.1 |
| 7 | 21-GSTM1-F1 | 50mM | 0.1 |
| 8 | 21-GSTM1-R | 50mM | 0.1 |
| 9 | 21-GSTM1-P | 50mM | 0.1 |
| 10 | Taq酶 | 5U | 0.5 |
| 11 | H2O | 纯化水 | 18.9 |
| 12 | cDNA模板 | —— | 5 |
| 13 | 总体积 | —— | 50 |
6号管配制体系：
7号管配制体系：
| 序号 | 物料 | 物料浓度 | 用量(μL) |
| 1 | 1×PCR缓冲液 | 1× | 10 |
| 2 | MgCl2 | 25mM | 8 |
| 3 | dNTPs | 10mM | 5 |
| 4 | 21-GAPDH-F | 50μM | 2 |
| 5 | 21-GAPDH-R | 50mM | 0.1 |
| 6 | 21-GAPDH-P | 50mM | 0.1 |
| 7 | 21-Beta-actin-F | 50mM | 0.1 |
| 8 | 21-Beta-actin-R | 50mM | 0.1 |
| 9 | 21-Beta-actin-P | 50mM | 0.1 |
| 10 | Taq酶 | 5U | 0.5 |
| 11 | H2O | 纯化水 | 18.9 |
| 12 | cDNA模板 | —— | 5 |
| 13 | 总体积 | —— | 50 |
8号管配制体系：
以上试剂组分：1×PCR缓冲液，MgCl2，Taq酶，dNTP均购自中国大连宝生物公司。
所述荧光PCR的反应条件如图1所示：95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒，60℃退火20秒，72℃延伸10秒，15个循环；95℃变性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸10秒，30个循环，后30个循环在退火时检测FAM、HEX和ROX荧光信号。
检测FAM、HEX和ROX荧光信号的Ct值，是采用Mx3000P荧光PCR扩增仪或Mx3005P荧光PCR扩增仪或ABI 7500荧光PCR扩增仪。一次可检测12份样品(包括阴阳性对照)。根据荧光PCR扩增仪显示的每个基因的Ct值，计算出每个样本的RS值，根据RS值的大小判断样本结果，如图2和图3所示。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
<110> 厦门飞朔生物技术有限公司
<120> 一种用于检测乳腺癌21基因表达水平的多重荧光PCR检测试剂盒
<160> 63
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<213> 人工序列
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ttgatcacgc cagactttgc t 21
Claims (6)
1.一种用于检测乳腺癌21基因表达水平的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：依次包括检测Ki-67、STK15、Survivin、stromelysin 3、Cathepsin L2、Cyclin B1、GRB7、HER-2、MYBL2、ER、PR、BCL2、SCUBE2、GSTM1、BAG1、CD68、GAPDH、Beta-actin、RPLPO、GUS和TFRC的第一至第二十一引物组以及相应的第一至第二十一检测探针，且第一至第二十一检测探针的5’端修饰有荧光报告基团，3’端修饰有荧光猝灭基团；其中，
第一引物组包括21-MKI67-F和21-MKI67-R，分别包括如SEQ ID NO 01和02所示的序列，第一检测探针为21-MKI67-P，包括如SEQ ID NO 03所示的序列；
第二引物组包括21-AURKA-F和21-AURKA-R，分别包括如SEQ ID NO 04和05所示的序列，第二检测探针为21-AURKA-P，包括如SEQ ID NO 06所示的序列；
第三引物组包括21-BIRC5-F和21-BIRC5-R，分别包括如SEQ ID NO 07和08所示的序列，第三检测探针为21-BIRC5-P，包括如SEQ ID NO 09所示的序列；
第四引物组包括21-MMP11-F和21-MMP11-R，分别包括如SEQ ID NO 10和11所示的序列，第四检测探针为21-MMP11-P，包括如SEQ ID NO 12所示的序列；
第五引物组包括21-CTSV-F和21-CTSV-R，分别包括如SEQ ID NO 13和14所示的序列，第五检测探针为21-CTSV-P，包括如SEQ ID NO 15所示的序列；
第六引物组包括21-CCNB1-F和21-CCNB1-R，分别包括如SEQ ID NO 16和17所示的序列，第六检测探针为21-CCNB1-P，包括如SEQ ID NO 18所示的序列；
第七引物组包括21-GRB7-F和21-GRB7-R，分别包括如SEQ ID NO 19和20所示的序列，第七检测探针为21-GRB7-P，包括如SEQ ID NO 21所示的序列；
第八引物组包括21-ERBB2-F和21-ERBB2-R，分别包括如SEQ ID NO 22和23所示的序列，第八检测探针为21-ERBB2-P，包括如SEQ ID NO 24所示的序列；
第九引物组包括21-MYBL2-F和21-MYBL2-R，分别包括如SEQ ID NO 25和26所示的序列，第九检测探针为21-MYBL2-P，包括如SEQ ID NO 27所示的序列；
第十引物组包括21-ESR1-F和21-ESR1-R，分别包括如SEQ ID NO 28和29所示的序列，第十检测探针为21-ESR1-P，包括如SEQ ID NO 30所示的序列；
第十一引物组包括21-PGR-F和21-PGR-R，分别包括如SEQ ID NO 31和32所示的序列，第十一检测探针为21-PGR-P，包括如SEQ ID NO 33所示的序列；
第十二引物组包括21-BCL2-F和21-BCL2-R，分别包括如SEQ ID NO 34和35所示的序列，第十二检测探针为21-BCL2-P，包括如SEQ ID NO 36所示的序列；
第十三引物组包括21-SCUBE2-F和21-SCUBE2-R，分别包括如SEQ ID NO 37和38所示的序列，第十三检测探针为21-SCUBE2-P，包括如SEQ ID NO 39所示的序列；
第十四引物组包括21-GSTM1-F1和21-GSTM1-R，分别包括如SEQ ID NO 40和41所示的序列，第十四检测探针为21-GSTM1-P，包括如SEQ ID NO 42所示的序列；
第十五引物组包括21-BAG1-F和21-BAG1-R，分别包括如SEQ ID NO 43和44所示的序列，第十五检测探针为21-BAG1-P，包括如SEQ ID NO 45所示的序列；
第十六引物组包括21-CD68-F和21-CD68-R，分别包括如SEQ ID NO 46和47所示的序列，第十六检测探针为21-CD68-P，包括如SEQ ID NO 48所示的序列；
第十七引物组包括21-GAPDH-F和21-GAPDH-R，分别包括如SEQ ID NO 49和50所示的序列，第十七检测探针为21-GAPDH-P，包括如SEQ ID NO 51所示的序列；
第十八引物组包括21-Beta-actin-F和21-Beta-actin-R，分别包括如SEQ ID NO 52和53所示的序列，第十八检测探针为21-Beta-actin-P，包括如SEQ ID NO 54所示的序列；
第十九引物组包括21-RPLP0-F和21-RPLP0-R，分别包括如SEQ ID NO 55和56所示的序列，第十九检测探针为21-RPLP0-P，包括如SEQ ID NO 57所示的序列；
第二十引物组包括21-GUSB-F和21-GUSB-R，分别包括如SEQ ID NO 58和59所示的序列，第二十检测探针为21-GUSB-P，包括如SEQ ID NO 60所示的序列；
第二十一引物组包括21-TFRC-F和21-TFRC-R，分别包括如SEQ ID NO 61和62所示的序列，第二十一检测探针为21-TFRC-P，包括如SEQ ID NO 63所示的序列；
该多重荧光PCR检测试剂盒的反应体系的组成如下：
第一至第二十一引物组中的至少一引物组
相应的检测探针
1×PCR缓冲液
MgCl2
dNTPs
Taq酶
H2O
模板；
该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的反应条件均为：95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒，64℃退火20秒，72℃延伸15秒，15个循环；95℃变性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸10秒，30个循环；后30个循环在退火时检测荧光信号。
2.如权利要求1所述的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述模板为自石蜡包埋组织切片中提取的RNA。
3.如权利要求1所述的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述第一至第二十一引物组以及相应的第一至第二十一检测探针分为第一至第八检测组，所述多重荧光PCR检测试剂盒的反应体系的组成如下：
第一至第八检测组中的其中之一
1×PCR缓冲液
MgCl2
dNTPs
Taq酶
H2O
模板。
4.如权利要求3所述的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：
所述第一检测组包括第一至第三引物组以及第一至第三检测探针；
所述第二检测组包括第四至第六引物组以及第四至第六检测探针；
所述第三检测组包括第七至第九引物组以及第七至第九检测探针；
所述第四检测组包括第十至第十二引物组以及第十至第十二检测探针；
所述第五检测组包括第十三至第十四引物组以及第十三至第十四检测探针；
所述第六检测组包括第十五至第十六引物组以及第十五至第十六检测探针；
所述第七检测组包括第十七至第十八引物组以及第十七至第十八检测探针；
所述第八检测组包括第十九至第二十一引物组以及第十九至第二十一检测探针。
5.如权利要求1所述的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述荧光报告基团包括FAM、HEX和ROX，所述荧光猝灭基团包括BHQ1和BHQ2。
6.如权利要求1至5中任一权利要求所述的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述反应体系的具体组成如下：
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