CN107858427B

CN107858427B - miR-429在制备乳腺癌诊断和检测试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN107858427B
Application number: CN201710997165.4A
Authority: CN
Inventors: 戴文珠; 刘宁; 毕明瑜; 唐文如; 罗瑛; 盛苗苗
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2017-10-24
Filing date: 2017-10-24
Publication date: 2021-03-02
Anticipated expiration: 2037-10-24
Also published as: CN107858427A

Abstract

本发明公开了一种miR‑429的新用途，即在制备乳腺癌诊断和检测试剂盒中的应用，所述miR‑429核苷酸序列为UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU；本发明提供了检测miR‑429含量的引物（包括反转录的颈环引物和real‑time PCR的一对前后向引物），可得到稳定可靠的检测结果；本发明提供的检测引物对miR‑429表达水平的检测敏感度高、检测准确，可大大提高对乳腺癌的检测准确性；本发明可为个性化治疗方案提供理论基础和实际应用方法，且能够为乳腺癌药物的开发提供新的药物靶点。

Description

miR-429在制备乳腺癌诊断和检测试剂盒中的应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及miR-429在制备乳腺癌诊断和检测试剂盒中的应用。

背景技术

乳腺癌是全世界女性中排名第一位的恶性肿瘤。近年来，全世界大约有22.9％的女性被诊断出乳腺癌，而中国发病率就占总新发病例的12.2％，其中因患乳腺癌死亡人数占全世界乳腺癌死亡人数的9.6%。尽管现今的药物靶向性和治疗手段都有突破性的提高，但乳腺癌患者的复发、侵袭转移现象依旧常见，致使晚期乳腺癌患者为死亡人数的主要占比。所以早发现、早治疗可以减缓患者癌症的发展进程，从而降低癌症引发的死亡发生率。

现今，人们越来越重视探索与癌症复发、转移与之相关的潜在分子标记物用于早期诊断，而microRNA则是一种重要的分子标记物。

microRNA是一类长度约22nt的内源性RNA，其能够识别特定的目标信使RNA(messenger RNA，mRNA)，并在转录后水平通过促进靶mRNA的降解和（或）抑制翻译过程，发挥调控基因表达的作用，进而参与调节肿瘤细胞的发育、增殖、分化与凋亡的过程，在肿瘤发生、发展等过程中起重要调控作用。

microRNA性质稳定、含量丰富、易于定量检测，且与疾病的发生发展存在显著的相关性。相对于目前早期诊断方法，microRNA检测可达到无伤口、准确，作为预后的分子标记可具有指导临床个体化治疗的优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种miRNA的新用途， miRNA（miR-429）在作为乳腺癌的标志物中的应用，即miR-429在制备乳腺癌诊断和检测试剂盒中的应用，所述miR-429核苷酸序列为UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU；本发明检测快速方便、准确率高，可以实现乳腺癌早期诊断。

miR-429在临床诊断乳腺癌中的应用，通过荧光定量检测miR-429在不同组织中的表达情况，将miR-429作为乳腺癌早期诊断的分子标志物。

本发明所述检测试剂盒包括常规RNA提取试剂、用于配置反转录反应体系的试剂包括多聚腺苷酸聚合酶、反转录酶、反转录缓冲液、无核酸酶纯水和检测所需的反转录引物；用于配置real-time PCR反应体系的试剂包括SYBR Green、正反向检测引物和纯水。

所述miR-429的反转录引物Primer-RT序列如下：

5’- GTCGTATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACGGTT-3；利用该引物反转录出的cDNA进行实时荧光定量PCR，可以非常灵敏的检测样本的miR-429表达水平。

所述miR-429的real-time PCR检测引物为:

。

另外，在本领域技术范围内，通过该引物进行的miR-429的检测，可以应用于实验检测乳腺癌细胞株上，也可以用于临床检测乳腺癌组织或血清中。

本发明具有以下有益效果：

（1）本发明通过大数据临床样本筛选，筛选出miR-429作为检测乳腺癌的标志物方面的应用，为乳腺癌的检测提供了一种新的检测标志物；miR-429的检测简单，常规的分子生物实验室即可完成；需要仪器为实时荧光定量PCR仪，常规实验室基本都能购买，大大提高了检测的实用性；

（2）相对于用Taqman探针法对miRNA的定量检测，该发明提供的检测方法成本大大降低，性价比高；

（3）本发明提供的检测引物对miR-429表达水平的检测敏感度高、检测准确，可大大提高对乳腺癌的检测准确性。

附图说明

图1是利用TCGA的乳腺癌病人数据做出的p<0.01的microRNA的生存曲线图；

图2是结合TCGA的数据，做出的关于miR-429的ROC曲线图；

图3是检测提取的总RNA经过1%的琼脂糖凝胶电泳检测图，三条条带从上到下依次是28S、18S、5S rRNA；

图4是miR-429荧光定量PCR的溶解曲线图；

图5是内参U6及miR-429在实时定量PCR中的扩增曲线图；

图6是miR-429在原发性乳腺癌组织及正常组织的表达量图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1：miR-429的筛选

在TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库中下载1083位乳腺癌病人及104正常人的microRNA表达数据，经过单因素方差分析（使用SPSS 20），以P值筛选出差异表达的microRNA68个（见表1）。

表1

microRNA高低表达数据结合病人的生存时间的临床数据制作生存曲线，以p<0.01为标准，筛选出13个microRNA（let-7c（P=0.046）、miR-1247（P=0.018）、miR-1258（P=0.012）、miR-148b-3p（P=0.006）、miR-190b（P=0.028）、miR-193a（P=0.017）、miR-195（P=0.009）、miR-204（P=0.01）、miR-365-1（P=0.001）、miR-356-2（P<0.001）、miR-379（P=0.007）、miR-99a（P=0.032）），表明这些miRNA的高低表达与病人的生存时间相关（见图1）。

后用microRNA高低表达数据结合病人的死亡情况，检测microRNA的特异性及敏感性，做Roc分析曲线（图2），得到这个良好的乳腺癌的microRNA标志物miR-429，其AUC=0.936表明其特异性及敏感性高。

实施例2：miR-429在乳腺癌的检测中的应用

1、收集于云南省第一人民医院的乳腺癌病人样品69例；手术切除后，组织放于液氮中保存。

2、总RNA提取和反转录

（1）总RNA提取

总RNA的提取采用TRIzol（sigma）提取法；操作步骤如下：

①取0.1g左右的病人乳腺组织加入1mL TRIzol中，在低温环境中迅速震荡研磨充分，室温静置10分钟，使其充分裂解，13000rpm离心5分钟，然后将管中的上清液转移至新1.5mLEP管（若样品为富含脂肪的组织，需将上层油脂去除）；

②加入200μL氯仿，盖紧管盖，剧烈混匀，室温静置10分钟，使其自然分相；

③4℃，12000rpm离心15分钟，混合物会分成三层：下层红色为苯酚-氯仿有机相，中间层和无色上层水相，RNA主要集中在水相；

④将上清转入一新1.5mLEP管（注意不要吸到中间层和下层），加入0.5mL的异丙醇，上下翻转混匀后，-20℃放置30分钟；

⑤4℃，12000rpm离心，10分钟，弃掉上清；

⑥向EP管内加入1mL 75%乙醇，上下颠倒混匀，洗涤。4℃，12000rpm离心3分钟；重复步骤⑥；

⑦用枪头小心吸弃多余液体，静置干燥3分钟，用适量RNase-Free ddH₂O溶解RNA沉淀，必要时可用移液枪轻轻地吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后-80℃保存。

（2）RNA质量检测

①琼脂糖凝胶检测RNA质量：称量1g琼脂糖，加入100mL 1×TBE，微波炉加热至完全溶解，待冷却至60℃左右时加入5μL 10mg/mL的EB溶液，倒胶，放置一段时间后待胶凝固后；取2μL RNA样品加2μL的上样缓冲液，将混合样点在琼脂糖凝胶孔内，120V、200mA，15分钟电泳检测，观察电泳条带（如图3），可以看到三条清晰的条带，从上到下依次是28S、18S、5S rRNA；

②RNA浓度与纯度检测：取2μL待测RNA溶液，于多功能分光光度仪测定RNA的浓度与纯度；RNA纯度=OD260/OD280，纯度处于1.8~2.0之间为合格的RNA样品，可进行反转录。若纯度值低于1.8，是有蛋白质污染；若纯度值高于2.0，是有其他核酸污染。

（3）miRNA的反转录及定量

用反转录试剂盒（GoScript™ Reversion Transcription Mixes），按下列组分进行配置反转录反应液（表2）；

表2 miRNA的反转录体系

；

反转录的反应条件设置如下：

①42℃，15分钟②70℃，15分钟③4℃，∞

体系反应完成后，反转录产物保存于-20℃保存。

（4）用实时荧光定量PCR方法来检测miR-429和内参基因U6基因的表达量，在ABI7300荧光定量PCR仪中进行反应；反应体系10μL，各试剂用量如下（表3）：

表3.

将配好的反应体系依次分装至荧光定量PCR反应特定的96孔板中，设置扩增程序后进行扩增反应；扩增程序条件为（表4）：

表4.

；

每个样品做3个复孔检测；反应循环结束后，用溶解曲线图来检测RT-PCR的产物纯度；结果见图4，从图中可看出，呈现单一的溶解峰，则说明，在同样的温度下，产生了相同的产物，则说明real-time PCR过程中所用来扩增miR-429的引物特异性好。图5为miR-429及内参U6的扩增曲线，显示3个复孔的检测一致率高，检测结果可信。

3、基因表达数据分析

基因的表达量分析：用2^-△△Ct法有效性数据进行统计学分析。目的基因的相对表达量为2^-△△Ct，其中miRNA是以U6为内参基因，以对照组目标基因与内参基因的Ct差值平均值做为参照值，公式如下：△△Ct=实验组（目的基因Ct值-管家基因Ct值）-对照组（目的基因Ct值-管家基因Ct值）上述公式计算了每一个样本目标基因的表达量，通过内参基因校正后，数据用平均值±标准误（M±SE）表示。用其数据分析方法，计算出miR-429的表达量。图6为检测69例病人其正常组织与其肿瘤组织的miR-429的表达情况所作出的散点图，可显示在肿瘤组织中miR-429的表达量比正常组织中的表达量高。在我们收集的样品中再次证明了miR-429可作为乳腺癌的标志物。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> miR-429在制备乳腺癌诊断和检测试剂盒中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人(human)

<400> 1

uaauacuguc ugguaaaacc gu 22

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

gtcgtatcca gtgcacgctc cgaggtattc gcactggata cgacacggtt 50

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

ccgcgctaat actgtctgg 19

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

gtgcacgctc cgaggt 16

Claims

1.miR-429在制备乳腺癌诊断和检测试剂盒中的应用，所述miR-429核苷酸序列为UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其包括反转录引物和real-time PCR检测引物；

所述miR-429的反转录引物为:

5’- GTCGTATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACGGTT-3’；

所述miR-429的real-time PCR检测引物为:

。