CN107076709A

CN107076709A - 确定循环rna的分布谱的方法

Info

Publication number: CN107076709A
Application number: CN201580059730.1A
Authority: CN
Inventors: 钟文婉; J·艾诗; K·弗拉克
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2014-09-03
Filing date: 2015-09-03
Publication date: 2017-08-18
Also published as: US20170284975A1; WO2016036949A1

Abstract

本公开内容提供了基于循环RNA所在的载体的类型来对循环RNA进行快速分级的方法。本公开内容还提供了，本公开内容的方法可用于通过鉴定与病症相关的特定微RNA生物标志物来在受试者中诊断该病症。

Description

确定循环RNA的分布谱的方法

相关申请的交叉引用

本申请依据35U.S.C.§119要求于2014年9月3日提交的临时申请号62/045,503的优先权，其公开内容通过引用并入本文。

政府许可权

本发明是由国家科学基金会(National Science Foundation)授予的授权号CHE-1057113和DGE-0813967的政府支持下进行的。政府在本发明中享有一定的权利。

技术领域

本公开内容提供了基于循环微RNA、病毒RNA和长非编码RNA(long-non-codingRNA，lncRNA)的相关载体分子来对其进行快速分级的方法。本公开内容还提供了，本公开内容的方法可用于通过鉴定与病症和特定载体相关的特定微RNA、lncRNA和病毒RNA标志物来在受试者中诊断病症。

背景技术

已认为循环微RNA是用于疾病诊断的良好生物标志物，因为其可被病变的细胞，例如癌细胞特异性分泌。考虑到微RNA在调节基因表达中的关键作用，微RNA的活性分泌可与疾病发展密切相关。

通常，从患者的血清提取总微RNA，并分析表达谱以观察是否能用模式指示疾病阶段。但是，尽管已进行了大量筛选，但是这样的模式并尚未揭示非常令人信服的miRNA标志物。

发明内容

本公开内容提供了一种用于确定样品中循环RNA的分布的分级方法，其包括：将从受试者获得的生物流体样品分级成至少包含外泌体级分、蛋白质级分和脂蛋白级分的级分，其中每个级分包含RNA载体；以及确定或定量各所述级分中的RNA以产生所述样品中所述RNA针对所述RNA载体的分布谱。在一个实施方案中，所述分级通过进行非对称流场流分级(asymmetrical flow field-flow fractionation)(AF4)并收集多份洗脱液来进行。在另一个实施方案中，所述分级通过基于芯片的微流体系统来进行。在前述任一实施方案的另一个实施方案中，所述生物流体样品是血清样品。在另一个实施方案中，使用厚度为约0.350mm且顶端到顶端长度(tip-to-tip length)为约275mm的、入口三角形宽度为约20mm且出口宽度为约5mm的梯形分离通来分级血清样品。在另一个实施方案中，积聚壁的表面积为约3160mm²，分子量截止值为10kDA。在另一个实施方案中，所述多份洗脱液在20至25分钟的时间内作为1分钟洗脱液进行收集。在另一个实施方案中，从所述多份洗脱液产生所述生物流体样品的至少6个级分。在另一个实施方案中，所述6个级分由合并在6个单独且非重叠的时间段内收集的1分钟洗脱液获得。在另一个实施方案中，所述6个级分中的每一个都富集具有特定流体动力学直径的RNA载体蛋白质。在另一个实施方案中，所述级分富集蛋白质、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和外泌体。在另一个实施方案中，通过深度测序或RT-qPCR来确定或定量所述RNA。在前述任意实施方案的另一个实施方案中，所述RNA包括微RNA或lncRNA，或病毒RNA。在另一个实施方案中，所述微RNA或lncRNA或病毒RNA是与疾病或病症相关的生物标志物。在另一个实施方案中，所述病症是癌症。在另一个实施方案中，所述癌症是乳腺癌。在前述任意实施方案的一个实施方案中，所述RNA为包含SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8和/或9的序列的微RNA。在另一个实施方案中，所述RNA选自由以下各项组成的组：let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、let-7i、miR-1、miR-100、miR-101、miR-103、miR-105、miR-106a、miR-106b、miR-107、miR-10a、miR-10b、miR-122a、miR-124a、miR-125a、miR-125b、miR-126、miR-126*、miR-127、miR-128a、miR-128b、miR-129、miR-130a、miR-130b、miR-132、miR-133a、miR-133b、miR-134、miR-135a、miR-135b、miR-136、miR-137、miR-138、miR-139、miR-140、miR-141、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-143、miR-144、miR-145、miR-146a、miR-146b、miR-147、miR-148a、miR-148b、miR-149、miR-150、miR-151、miR-152、miR-153、miR-154、miR-154*、miR-155、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-17-3p、miR-17-5p、miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d、miR-182、miR-182*、miR-183、miR-184、miR-185、miR-186、miR-187、miR-188、miR-189、miR-18a、miR-18a*、miR-18b、miR-190、miR-191、miR-191*、miR-192、miR-193a、miR-193b、miR-194、miR-195、miR-196a、miR-196b、miR-197、miR-198、miR-199a、miR-199a*、miR-199b、miR-19a、miR-19b、miR-200a、miR-200a*、miR-200b、miR-200c、miR-202、miR-202*、miR-203、miR-204、miR-205、miR-206、miR-208、miR-20a、miR-20b、miR-21、miR-210、miR-211、miR-212、miR-213、miR-214、miR-215、miR-216、miR-217、miR-218、miR-219、miR-22、miR-220、miR-221、miR-222、miR-223、miR-224、miR-23a、miR-23b、miR-24、miR-25、miR-26a、miR-26b、miR-27a、miR-27b、miR-28、miR-296、miR-299-3p、miR-299-5p、miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-301、miR-302a、miR-302a*、miR-302b、miR-302b*、miR-302c、miR-302c*、miR-302d、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30b、miR-30c、miR-30d、miR-30e-3p、miR-30e-5p、miR-31、miR-32、miR-320、miR-323、miR-324-3p、miR-324-5p、miR-325、miR-326、miR-328、miR-329、miR-33、miR-330、miR-331、miR-335、miR-337、miR-338、miR-339、miR-33b、miR-340、miR-342、miR-345、miR-346、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-361、miR-362、miR-363、miR-363*、miR-365、miR-367、miR-368、miR-369-3p、miR-369-5p、miR-370、miR-371、miR-372、miR-373、miR-373*、miR-374、miR-375、miR-376a、miR-376a*、miR-376b、miR-377、miR-378、miR-379、miR-380-3p、miR-380-5p、miR-381、miR-382、miR-383、miR-384、miR-409-3p、miR-409-5p、miR-410、miR-411、miR-412、miR-421、miR-422a、miR-422b、miR-423、miR-424、miR-425、miR-425-5p、miR-429、miR-431、miR-432、miR-432*、miR-433、miR-448、miR-449、miR-450、miR-451、miR-452、miR-452*、miR-453、miR-455、miR-483、miR-484、miR-485-3p、miR-485-5p、miR-486、miR-487a、miR-487b、miR-488、miR-489、miR-490、miR-491、miR-492、miR-493、miR-493-3p、miR-494、miR-495、miR-496、miR-497、miR-498、miR-499、miR-500、miR-501、miR-502、miR-503、miR-504、miR-505、miR-506、miR-507、miR-508、miR-509、miR-510、miR-511、miR-512-3p、miR-512-5p、miR-513、miR-514、miR-515-3p、miR-515-5p、miR-516-3p、miR-516-5p、miR-517*、miR-517a、miR-517b、miR-517c、miR-518a、miR-518a-2*、miR-518b、miR-518c、miR-518c*、miR-518d、miR-518e、miR-518f、miR-518f*、miR-519a、miR-519b、miR-519c、miR-519d、miR-519e、miR-519e*、miR-520a、miR-520a*、miR-520b、miR-520c、miR-520d、miR-520d*、miR-520e、miR-520f、miR-520g、miR-520h、miR-521、miR-522、miR-523、miR-524、miR-524*、miR-525、miR-525*、miR-526a、miR-526b、miR-526b*、miR-526c、miR-527、miR-532、miR-542-3p、miR-542-5p、miR-544、miR-545、miR-548a、miR-548b、miR-548c、miR-548d、miR-549、miR-550、miR-551a、miR-552、miR-553、miR-554、miR-555、miR-556、miR-557、miR-558、miR-559、miR-560、miR-561、miR-562、miR-563、miR-564、miR-565、miR-566、miR-567、miR-568、miR-569、miR-570、miR-571、miR-572、miR-573、miR-574、miR-575、miR-576、miR-577、miR-578、miR-579、miR-580、miR-581、miR-582、miR-583、miR-584、miR-585、miR-586、miR-587、miR-588、miR-589、miR-590、miR-591、miR-592、miR-593、miR-594、miR-595、miR-596、miR-597、miR-598、miR-599、miR-600、miR-601、miR-602、miR-603、miR-604、miR-605、miR-606、miR-607、miR-608、miR-609、miR-610、miR-611、miR-612、miR-613、miR-614、miR-615、miR-616、miR-617、miR-618、miR-619、miR-620、miR-621、miR-622、miR-623、miR-624、miR-625、miR-626、miR-627、miR-628、miR-629、miR-630、miR-631、miR-632、miR-633、miR-634、miR-635、miR-636、miR-637、miR-638、miR-639、miR-640、miR-641、miR-642、miR-643、miR-644、miR-645、miR-646、miR-647、miR-648、miR-649、miR-650、miR-651、miR-652、miR-653、miR-654、miR-655、miR-656、miR-657、miR-658、miR-659、miR-660、miR-661、miR-662、miR-663、miR-7、miR-9、miR-9*、miR-92、miR-93、miR-95、miR-96、miR-98、miR-99a、miR-99b及其任意组合。在另一个实施方案中，所述基于芯片的微流体系统包括：微流体芯片，所述微流体芯片包括至少3个通道，至少3个储存器和样品储存器，其中所述通道与所述至少3个储存器和样品储存器流体连通；第一珠试剂，所述第一珠试剂包含磁珠和与抗原或外泌体相互作用的抗体；以及第二珠试剂，所述第二珠试剂包含带阳离子电荷的珠。在另一个实施方案中，所述抗体是抗CD63抗体。在另一个实施方案中，所述方法包括：(i)向样品储存器添加血清：(a)向样品储存器添加第一珠试剂；向样品储存器施加磁场并用磁场将第一珠试剂移动通过至少3个通道中的第一通道至至少3个储存器中的第一储存器；在第一储存器中破裂外泌体；移除第一珠试剂；向第一储存器添加第二珠试剂；(b)向样品储存器添加GuHCl、KCl和洗涤剂以使RNA与蛋白质解离；向样品储存器添加第二珠试剂以结合RNA；将第二珠试剂移动通过至少3个通道中的第二通道至所述至少3个储存器中的第二储存器；以及(c)向样品储存器添加硫氰酸胍、洗涤剂和乙醇以使RNA与脂蛋白解离；向样品储存器添加第二珠试剂以结合RNA；将第二珠试剂移动通过至少3个通道中的第三通道至所述至少3个储存器中的第三储存器；(ii)从第一、第二和第三储存器的每一个提取RNA。在另一个实施方案中，所述方法还包括能够破坏蛋白质-RNA相互作用或脂蛋白复合物的试剂。在另一个实施方案中，所述试剂是表面活性剂、有机溶剂、离液盐的混合物。

本公开内容还提供了一种用于诊断受试者是否患有病症的方法，其包括在一个或更多个健康受试者和一个或更多个患有所述病症的受试者之间比较通过使用前述任意实施方案的方法获得的循环RNA的分布，其中差异鉴定疾病或病症的风险。

本公开内容还提供了一种用于进行本文中所述的任一种方法的试剂盒，其中所述试剂盒被隔室化(compartmentalized)以包含用于进行所述方法的试剂和装置。在另一个实施方案中，所述试剂盒包含微流体装置、第一珠试剂、第二珠试剂和能够破坏蛋白质-RNA相互作用或能够破坏脂蛋白复合物的试剂。

本公开内容提供了基于相关载体的类型来快速分级循环微RNA(miRNA)的方法。将分级的miRNA收集，鉴定并通过RT-qPCR定量。然后获得各靶向miRNA的分布谱。本文中公开的方法以快速分级、高回收率并且具有破坏miRNA和其载体之间的结合的低可能性为特征。此外，本公开内容的方法能够实现不同载体中miRNA的位置的综合谱分析，这可揭示用于病症诊断的更灵敏且特异性的微RNA标志物。分布谱包含用于解释微RNA的分泌和运输途径以及其在疾病发展中的作用的更丰富的信息。比较从健康受试者和患有疾病的患者收集的循环miRNA的分布谱不仅可以揭示哪些miRNA与病症相关，而且还可基于哪种载体与miRNA相关来指示病症的阶段。

在一个具体实施方案中，本公开内容提供了一种用于确定样品中循环miRNA的分布的快速分级方法，其包括：通过对从受试者获得的血清样品进行非对称流动场流分级(AF4)并收集多种洗脱液来分级该样品；将多份洗脱液合并成级分，其中各级分富集不同的miRNA载体；定量各收集级分中miRNA组的水平以生成样品中miRNA针对载体的分布谱；以及确定样品中循环miRNA的分布。在另一个实施方案中，使用厚度为约0.350mm且顶端至顶端长度为约275mm的、入口三角形宽度约20mm且出口宽度约5mm的梯形分离通道来分级血清样品。在又一个实施方案中，AF4积聚壁的表面积为约3160mm²，分子量截止值为10kDA。在另一个实施方案中，多份洗脱液在20至25分钟的时间内作为1分钟的洗脱液被收集。在另一个实施方案中，从多份洗脱液产生血清样品的至少6个级分。在另一个实施方案中，所述6个级分由合并在6个单独且非重叠的时间段内收集的1分钟洗脱液获得。在另一个实施方案中，所述6个级分中的每一个富集具有特定流体动力学直径的miRNA载体蛋白质。

在一特定实施方案中，本公开内容的方法包括富集选自高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和外泌体的miRNA载体蛋白的级分。在另一个实施方案中，本文中公开的方法包括通过使用RT-qPCR来定量miRNA。

在一个具体实施方案中，本公开内容的方法包括为与病症相关的生物标志物的miRNA组，所述病症例如癌症、糖尿病、肥胖、癫痫、肝病(例如NASH或NAFLD)、冠状动脉病、阿尔茨海默病、多囊性卵巢综合征、子宫内膜异位、肾病(例如，微小病变疾病、局灶性节段性肾小球硬化症)。在另一个实施方案中，本公开内容的方法包括与乳腺癌相关的生物标志物的微RNA组，例如包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8和/或9的序列的那些微RNA。

在一特定实施方案中，本文中公开的方法可用于诊断受试者是否患有病症，其包括：将通过使用本公开内容的方法获得的循环RNA分布与通过使用相同方法获得的来自一个或更多个健康受试者和一个或更多个患有该病症的受试者的循环微RNA的分布进行比较。

附图说明

图1A至E提供了使用外泌体分离物来优化AF4流动谱。(A)3.0mL/分钟横流速和0.3mL/分钟检测器流速的恒流速。(B)AF4后收集(横流关闭)。(C-E)在30分钟(C)、20分钟(D)和15分钟(E)内将横流速从3.0mL/分钟缓降至零横流速。所有样品的吸光度检测均在280nm下测量。所有分离物均由健康人男性库血清制备。(F)描绘了显示对应于不同级分的miRNA水平的图，各级分与不同的RNA载体或载体组相关，对于每种miRNA标志物，级分F1至F6对应于从左到右的列。

图2A至B示出了(A)蛋白质和纳米颗粒标准物的AF4；以及(B)外泌体分离物和脂蛋白复合物标准物的AF4。所有样品通过在280nm下的吸光度来检测。外泌体分离物由健康人男性库血清制备。

图3显示在AF4分离开始时添加5-分钟恒流区提高外泌体分离物中分析物的分辨率。该方法的AF4流动谱包括5分钟的3.0mL/分钟横流速和0.3mL/分钟检测器流速，之后将横流速从3.0mL/分钟以15分钟缓降至零流速。吸光度检测在280nm下进行。

图4A至B示出了(A)在掺加HDL或LDL之前和之后血清的分级图(fractogram)(280nm下的UV吸收)；和(B)在DiO染色之后血清和外泌体提取物的分级图(用480ex/510em通过荧光检测)的比较。

图5示出了来自健康个体(对照)和BC患者(病例)的血清样品的分级图。表格示出了各收集级分的时间范围，以及各级分的峰洗脱时间的RSD值。N/A意指级分中没有明显的峰。

图6A至D提供了健康血清样品的(A)吸光度和(B)经DiO染色的荧光分级图。黑色-对照1，红色-对照2。来自BC患者的血清样品的(C)吸光度和经(D)DiO染色的荧光分数图。黑色–病例#1，红色–病例#2。所有的吸光度测量均在280nm下进行。所有的荧光分级图均在485nm的激发和510nm的发射下测量。样品使用优化的AF4分级方案进行分级。

图7A至B提供了(A)AF4级分中的所选脂蛋白的谱计数结果；和(B)所收集级分中CD-63的ELISA检测。

图8示出了从纯血清或AF4级分的hsa-miR-16的回收。

图9A至C示出了(A)从一个乳腺癌患者(病例#1)收集的血清中8种受试miRNA的分布谱；(B)对照和病例之间的miRNA拷贝的平均Log值的变化(计数每组中所有四个测试-2个样本，2个重复)。“*”标记出显示在健康供体(对照组)与BC患者(病例)之间具有p<0.05的显著差异的那些；和(C)如本文指出的通过对某些分级中miR-16、-17、-375和-122的miRNA量进行PCA获得的主成分1相对于主成分2的评分图。任意圆圈示出了对照组和病例组之间的分离。

图10A至C提供了对于各级分的每个样品的RT-qPCR分析。(A)对照1、(B)对照2和(C)病例2。基于每个样品中存在的cel-mir-67的拷贝数来归一化针对每个的计算拷贝数。Y轴是miRNA的拷贝数的对数值。

图11示出了芯片上miRNA分布谱分析技术的总体设计的示意图。

图12示出了用于本公开内容的方法和系统的示例性微流体装置。示出了总共3个通道，每个通道专用于一种类型的载体。第一通道用于提取蛋白质结合的RNA，第二通道用于脂蛋白缔合的RNA，第三通道用于外泌体RNA。为了防止不期望且非特异性的RNA或血清组分吸附，可用八甲基硅氧烷改性装置表面以具有高疏水性和惰性。

图13示出了制造本公开内容的微流体装置的方法。

图14示出了用于从样品获得外泌体级分的珠及其设计的实例。

图15示出了用于获得蛋白质和脂蛋白级分的珠及其设计的实例。

图16A至D示出了不同的分离迹线。(A)用于分析外泌体的由荧光检测器收集的AF4分离迹线(分级图)，所述外泌体如在我们的微芯片谱分析技术中所进行的通过免疫珠(虚线)分离和通过Invitrogen试剂盒(实线)分离。

(B)上图：通过AF4在血清分离期间收集的级分(通过UV吸收进行检测)。将收集的洗脱液干燥并收集蛋白质用于通过ELISA进行CD63定量，结果显示在下面的柱形图中。量为三次重复测量的平均值，误差棒是标准偏差。(C)通过免疫珠分离方法和Invitrogen试剂盒制备的外泌体中CD63浓度的比较。(D)在用破裂溶液处理之前(实线)和之后(方形点)通过免疫珠分离的外泌体的分级图。荧光检测通过DiO染色和480ex/510em的荧光进行。

图17示出了在用蛋白质破坏溶液处理之前(实线)和之后(方形点)以及通过脂蛋白破坏溶液(点划线)的去外泌体血清的分级图。实线块突出了HDL标准物将被洗脱的位置，方形点块表示LDL标准物的洗脱窗口。荧光检测通过DiO染色和480ex/510em的荧光进行。

图18示出了使用本公开内容的基于珠的提取方法以及商业试剂盒的血清中掺加的miRNA的百分比回收的比较，所述商业试剂盒包括具有不同持续时间的TRIzol LS试剂、GeneJet RNA纯化试剂盒和PureLink RNA试剂盒，所述试剂盒全部均由Thermo Fisher发售。

图19A至C示出了由芯片上和基于AF4的分布谱分析获得的以及由使用抗体缀合的磁珠免疫捕获获得的miRNA拷贝的比较。在比较中选择四种miRNA。(A)购自Sigma的健康血清的、从微芯片上的通道1和从AF4分离的级分1中回收的蛋白质结合的miRNA。(B)通过微芯片上的通道3、通过Invitrogen总外泌体分离试剂盒和在来自AF4分离的级分6中回收的外泌体miRNA。来自AF4和来自Invitrogen试剂盒的外泌体用TRIzol LS试剂进行处理。(C)在微芯片上的通道2中获得的脂蛋白缔合miRNA，加上从AF4分离的级分2-5获得的脂蛋白缔合miRNA和用与抗HDL/LDL IgG缀合的免疫珠获得的脂蛋白缔合miRNA。

图20A至D示出了从一个患者(A)和一个健康个体(B)收集的血清的分布谱。(C)所有7个病例中的平均miRNA含量与来自3个对照的平均值的比值，其见于全部三个级分中(白色、灰色和黑色柱)，相比见于所有级分的总miRNA含量中的比值(图案化)。(D)所有样品的PC1相对于PC2的评分图。病例示为黑色圆圈，对照为红色三角形。

具体实施方式

除非上下文清楚地另外指出，否则本文和所附权利要求书中使用的单数形式“a/an(一)”和“所述”包括复数指示物。因此，例如，提及“级分”包括多个这样的部分，并且提及“miRNA”包括提及本领域技术人员已知的一种或更多种miRNA及其等同物等。

而且，除非另外声明，否则使用“或/或者”表示“和/或”。类似地，“包含”、“包括”是可互换的并非旨在是限制性的。

应进一步了解，在多个实施方案的描述使用术语“包括/包含”的情况下，本领域技术人员将理解，在一些具体情况下，可使用语言“基本上由...组成”或“由...组成”来选择性地描述实施方案。

除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文中所述的那些类似或等同的许多方法和试剂均可用于实施所公开的方法和组合物，但是现在描述了示例性方法和材料。

本文中提及的所有公开均通过引用全部并入本文，并入目的在于说明和公开可与本文中的描述联合使用的方法。对于一个或更多个公开中所述的与本公开内容中明确定义的术语相似或相同的任何术语，在所有方面均以本公开内容中明确提供的术语的定义为准。

细胞通过很多不同的途径来与其周围环境通讯，包括细胞-细胞相互作用、细胞-基质相互作用、激素、生长因子、细胞因子、激素等。细胞之间的长程效应可通过分泌通过血流传送以对远端细胞起作用的因子的过程来进行。最近，有证据表明，例如外泌体的囊泡能够介导这样的通讯。

癌症的早期检测可提高患者的存活率，但成功强烈地依赖于特异性且敏感性的生物标志物的可用性。用于癌症诊断的一类有前景生物标志物是微RNA(miRNA)和长非编码RNA(lncRNA)。miRNA与靶mRNA结合并抑制靶转录物的翻译或诱导靶转录物的降解。抑制肿瘤抑制基因的miRNA的过表达可干扰抗致癌途径，而靶向癌基因的miRNA的缺失或表观遗传沉默可提高致癌效力。还认识到，与mRNA谱相比，miRNA谱更准确地反映人癌症的发育谱系和组织来源。与蛋白质相比，miRNA具有更简单的结构和更不复杂的合成后加工，并且可通过高灵敏PCR方法来检测。更有吸引力的是，miRNA可释放到循环系统中，并且以可通过例如RT-PCR的灵敏技术检测的水平稳定存在。越来越多的证据表明，循环miRNA在癌症患者和健康对照之间表现出不同的模式，其中一些分泌型miRNA的模式在癌症起始的早期阶段改变。由于与其他活检方法相比，认为从循环体液(例如血液、尿液、唾液等)取样方便且非侵入性，因此越来越多的研究工作致力于获得循环miRNA的综合特征，并验证其作为生物标志物的效用。

微RNA与某些载体，例如蛋白质、脂蛋白颗粒(例如HDL)和外泌体(由细胞释放的直径为约30nm至100nm的膜囊泡)结合。所述载体与微RNA如何分泌以及在循环系统中如何转运高度相关。因此，RNA，特别是载体，而不是总量，与疾病发展直接相关。此外，目前用于分级血清或血浆中与载体结合的循环RNA的方法仅基于尺寸排阻层析或超速离心。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是用于控制基因表达和活性的生物过程。最近，已报道RNAi分子(例如miRNA)存在于外泌体、高-密度脂蛋白和低-密度脂蛋白(Vickers等,2011)(HDL/LDL)、大细胞外囊泡(称为微囊泡)中，并与Argonaut 2(AGO2)(Arroyo等,2011；Li等,2012；Turchinovichet等,2011)相关。

miRNA是长度为18至24个核苷酸(nt)的小非编码RNA，其在转录后控制基因表达。其通过Drosha和Dicer核酸内切酶的顺序作用合成，并装载到RISC(RNA诱导的沉默复合物)中靶向mRNA(Bartel,2009；Maniataki和Mourelatos,2005)。

miRNA通过miRNA相关RISC(由Dicer、TRBP和AG02蛋白组成)与靶mRNA的序列特异性相互作用和配对来工作(Bartel,2009)。这种作用抑制翻译和/或引起mRNA去稳定(Filipowicz,2005)。miRNA及其mRNA靶标的互补程度决定mRNA沉默的过程，通过mRNA去稳定/降解或通过抑制翻译(Ambros,2004；Bartel,2009)。如果miRNA和靶mRNA序列之间完全互补，则RISC复合物起作用来切割结合的mRNA以进行降解Ambros,2004；Bartel,2009)。如果没有绝对互补，则如在动物细胞中的miRNA的大多数情况下一样，阻止进行翻译来实现基因沉默(Ambros,2004；Bartel,2009)。

为了实现有效的miRNA介导的基因沉默，miRNA必须与RLC(RISC装载复合物)蛋白Dicer、TRBP和AGO2形成复合物。在RLC中，Dicer和TRBP需要在前体miRNA(pre-miRNA)通过输出蛋白-5从细胞核出来之后对前体miRNA进行加工以产生miRNA并与AG02结合。与成熟miRNA结合的AG02构成最小的RISC，并且随后可与Dicer和TRBP解离。单链miRNA自身并入RISC中非常差，并且因此不能有效地被定向其靶mRNA进行转录后调控。

外泌体由细胞在体内和体外释放。术语“外泌体”意指从受试者获得的样品(例如，生物流体)中存在的基于脂质的微米颗粒或纳米颗粒。术语外泌体在本领域中还称为微泡、纳米囊或细胞外囊泡。在一些实施方案中，外泌体的直径在约20nm至约90nm。外泌体从多种不同的哺乳动物细胞类型分泌或脱落。外泌体是将生物大分子从产生位点运载到微环境或远离起源的远端位点的靶位点的小膜结合囊泡。外泌体内容物的含量随产生其的细胞类型以及改变细胞的正常状态的环境因素(例如病毒感染)而变化。已经显示，外泌体包含病毒RNA、病毒蛋白、病毒miRNA、细胞miRNA等(Singh等,Viruses,7(6):3204-25,2015；Hubert等,Future Virol.,10(4):357-370,2015)。

长非编码RNA(lncRNA)包括具有低蛋白质编码潜能的长度大于200个核苷酸的RNA分子。尽管传统上被视为转录噪声，但是其现在显现为例如蛋白质合成、RNA成熟/转运、染色质重塑以及转录激活和/或抑制程序的细胞功能的重要调节子。已证明，其可影响例如干细胞多能性、细胞周期和DNA损伤响应的生物过程。作为其重要调控功能的指示，已经在数种类型的癌症中观察到一些lncRNA的异常表达和功能(参见例如美国专利公开No.2013/0178428，其公开内容通过引用并入本文)。

循环微RNA(miRNA)是可用于诊断癌症、糖尿病、肥胖、癫痫、肝病(例如，NASH或NAFLD)、冠状动脉疾病、阿尔茨海默病、多囊性卵巢综合征、子宫内膜异位和肾病(例如，微小病变疾病、局灶性节段性肾小球硬化症)的潜在生物标志物。类似地，长非编码RNA(lncRNA)分子由于对基因表达具有影响而已与多种疾病相关。已经发现，这些RNA分子与例如蛋白质、脂蛋白颗粒和外泌体的多种载体结合。可能地，与特定载体相关的miRNA和lncRNA而非整体量与疾病状况(例如癌症、心血管、肾脏、子宫内膜异位等)相关。

使用循环miRNA作为诊断剂的一个障碍是：不是所有的循环miRNA都与癌症发生或疾病相关。癌症/疾病不相关的miRNA可由血液细胞分泌，或者在细胞死亡之后脱落。然后，其可导致个体间miRNA丰度的差异较大并在定量期间补充癌症相关miRNA的信号。已经知道，无细胞的miRNA在细胞外环境和体液中被多种类型的载体保护避免核酸酶。载体可以是属于RNA诱导的沉默复合物(RISC)的蛋白质，例如Argonaute(AGO)2和GW182；可介导细胞内通讯的脂蛋白(高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL))颗粒；或者认为是来自恶性细胞的miRNA的一个输出途径的囊泡，例如外泌体。虽然恶性细胞的活性miRNA分泌可能是细胞途径调节异常的结果，但目的输出和摄取可能与肿瘤进程和转移有关。因此，为了更好地消除癌症不相关的miRNA并揭示更多的特异性miRNA标志物，从癌细胞特异性分泌的载体分离miRNA可提供一种解决方案。因此，循环miRNA的研究近来一直集中于HDL和外泌体。

此外，与多种载体相关的病毒RNA(vRNA)可用于确定感染的存在、病毒载量或感染状态(例如，活跃或潜伏)。

本文中使用的“RNA载体”指存在于受试者的流体或组织中并且在受试者中结合或携带RNA的大分子。在一个实施方案中，RNA载体不是细胞(“非细胞的”)(例如，不是干细胞、实质细胞或其他细胞)。“结合”意指与RNA载体共价或非共价缔合(例如，包封在外泌体中、通过H键的连接或其他电荷缔合等)。RNA载体的实例包括蛋白质(例如属于RISC复合物的Argonaute(AGO)2和GW182)、脂质、脂蛋白(例如高密度脂蛋白(HDL)和/或低密度脂蛋白(LDL))、细胞外囊泡(例如，外泌体)等。本文中使用的术语“RNA”指miRNA、lncRNA和病毒RNA中的一种或更多种。

术语“样品”或“生物样品”意指从哺乳动物受试者获得的任何生物流体(例如含有血液、血浆、尿、唾液、母乳、眼泪、阴道分泌物或羊膜液的组合物)。

尽管包封在外泌体中的miRNA可提供疾病状态信息，但是本文中公开的方法已经发现，与其他载体结合的RNA也与疾病发展高度相关，因为不同的载体由不同的途径分泌并被转运到不同的位置。因此，不同载体之间RNA的实际分布模式指示疾病的阶段和疾病诊断。通过使用本公开内容的方法，可分析单独载体中的RNA量，从而鉴定特异性微RNA、lncRNA和vRNA疾病状态。

纯HDL或外泌体通常通过超速离心和免疫亲和捕获来获得。超速离心可以提供良好的尺寸/密度分辨率，但是其需要大的样品体积、非常繁琐且耗时，并且通常提供低回收。免疫亲和捕获易于进行并提供高特异性，但一次只能靶向一种类型的载体。在miRNA载体的一项研究中，用尺寸排阻色谱(size exclusion chromatography，SEC)分级血清以揭示外泌体和无外泌体的循环miRNA的存在。在另一项研究中，使用SEC来进一步表征通过超速离心分离的HDL。然而，在SEC中，只能在小尺寸范围内实现良好的分离分辨率，生物分子与柱材料的相互作用是成问题的，并且生物复合物或囊泡结构在通过填充柱后的完整性是有问题的。

尽管从纯HDL或外泌体回收RNA有可能除去正常细胞脱落的癌症/疾病不相关RNA，但是实际上关于那些载体在癌症和疾病诊断中更为重要尚没有得出结论。因此，研究所有类型载体中的RNA分布对于回答这一问题具有重要意义。

本公开内容提供了一种用于使用(i)非对称流动场流分级(AF4)(或其改进形式，参见例如美国专利公开号No.2009/0301942，其通过引用并入本文)或(b)基于珠的微流体/基于芯片的方法来在来自受试者的流体(例如，血清)中快速分离不同RNA载体的方法。与SEC和超速离心相比，非对称流动场流分级(AF4)和基于珠的微流体方法更为温和并且更好地保持RNA与其载体之间的结合。由于其不相互作用的分离能力，AF4和珠基微流体方法可用于分离蛋白质-RNA、脂蛋白-RNA和含有RNA的外泌体的完整大分子复合物。

A4F设备及其变体在多个公开中进行了描述，包括Giddings等(Science,260：1456-1465,1993)和Carl-Gustav Wahlund等(“Properties of an asymmetrical flowfield-flow fractionation channel having one permeable wall,”AnalyticalChemistry 59,1332-39,1987)。

一般来说，A4F单元包括(1)容纳液体可渗透的釉料的底部装配结构，所述釉料通常由经烧结的不锈钢颗粒制成；(2)位于釉料上方的可渗透膜；(3)包含腔的厚度为约75μm至800μm的间隔件；以及(4)通常容纳例如玻璃的材料的透明板的顶部装配结构。所得夹层结构用螺钉、螺栓、胶或其他工具固定在一起。间隔件中的大致矩形或棺形的腔用作其中将发生分离的通道。顶部装配结构通常包含穿过顶板的三个孔，其被称为端口并且集中在通道上方且允许配件附接于其的三个孔。这些端口是：(a)位于通道开始附近并且通过其泵送载体液体(“流动相”)的流动相入口端口，(b)非常接近入口端口并且在其下游的样品端口，在样品端口中，将待分离样品的等分试样引至通道，以及(c)经分级的等分试样经其离开通道的出口端口，其在入口端口和样品端口的下游。

A4F通道用于分离包括血清蛋白质、脂质等的颗粒，并且横跨从几纳米到数十微米的尺寸范围。由这样的颗粒组成的样品等分试样的分离进而取决于矩形或棺形腔的长度、宽度和厚度。另外，其取决于通道流速、横流与通道流之比、温度，液体黏度、pH、离子性、颗粒自身的物理组成以及位于釉料上方的可渗透膜的类型。通过适当地编程通道流与横流之比的时间变化，可以显着改善不同颗粒种类的分离，并且通常可在同一运行中分离注入的样品等分试样中存在的大范围颗粒尺寸。实际上，对于待分离的每一类颗粒，可通过凭经验改变前述因素来开发最佳分离。对于特定AF4装置不能改变的唯一变量是通道长度。

以往，A4F的通道长度已为约25cm至30cm，其中最大宽度为约1cm至3cm，所述最大宽度沿其长度逐渐变细并且以与出口端口的宽度相当的宽度处结束。最近的研究表明，更短长度的通道将提供一定的益处，并在此基础上。

AF4已被用于分析血清中的外泌体。因此，AF4是用于基于不同miRNA载体的流体动力学直径来快速分离不同miRNA载体，使得能够筛选不同载体之间的RNA分布的可用方法。比较从健康个体和癌症患者获得的分布谱可有助于揭示哪些类型的载体与癌症发展更相关，并且因此当使包封在这些载体中的miRNA作为标志物时增强诊断的灵敏性和特异性。

因此，AF4可用于分离人血清中的不同载体。在一个实施方案中，AF4用于分离RNA载体。然后，可分离在这样的载体上(或内)的RNA。例如，收集并定量洗脱的RNA以获得其在不同分子载体之间的分布谱。图1F示出了对由从A4F获得的与不同RNA载体或载体组相关之不同级分获得的不同miRNA获得的信息。

本公开内容还提供了基于主要载体来进行RNA的快速分级的装置。与用于miRNA分级的现有分离技术相比，本公开内容的方法和组合物更加快速且更易进行，需要较小的样品体积且可以以较高的自动化程度进行以避免由人操作者引入的变化，并且更适于处理大量的患者样品。本公开内容提供了用于综合筛选不同载体之间循环RNA的分布的方法和装置。这样的方法和装置有利于发现用于疾病诊断的特异性RNA生物标志物，并且有助于了解循环RNA的生物发生和功能，从而有助于更好的诊断、治疗和预后。

虽然基于AF4的方法通过将载体分离成多个级分来提供综合的分布谱分析，但是从大的洗脱体积回收RNA费力且耗时。另外，不同载体之间的分辨率提高将提供更好的定量。为了进一步提高样品回收、工作效率、载体分辨率和分析通量同时降低样品消耗，开发了基于微芯片的分布谱分析技术。该技术将外泌体的免疫捕获与蛋白质-RNA结合的基于洗涤剂的破坏组合以在微芯片上的三个微通道中单独分离与蛋白质结合的、与脂蛋白复合物缔合的和包封在外泌体中的RNA。初步装置和方法中的总分离过程在最低人工样品处理下花费约1.5小时，并且仅需要25μL或更少的血清。处理的体积和时间两方面都得到改进。洗脱的RNA具有良好质量并且可通过RT-实时PCR或其他RNA检测技术来定量。

因此，本公开内容进一步描述了使用微流体/芯片系统来分离RNA载体。在一个实施方案中，使用流体装置，其包括至少一个通道(例如，2、3、4、5个或更多个通道)、用于接受生物样品(例如，血清)的样品储存器以及包含珠和/或可用于去除和储存可与样品中的RNA载体或RNA结合的珠的至少一个珠储存器。

基于微芯片的RNA分布谱分析方法以快速、高通量且半自动的方式定量与三种公认的载体结合的循环RNA。芯片上的三个通道利用免疫亲和化学试剂单独地产生蛋白质结合的RNA、脂蛋白缔合的RNA和外泌体的RNA。如下文更充分描述的，芯片上方法的确产生预期的分布谱分析，并且所获得的谱可用于区分从癌症患者和健康个体收集的血清样品。

图12示出了本公开内容的一个示例性微流体装置10。在基底20上形成通道40和多个储存器30、50、60、70、80。储存器30、50、60、70、80通过通道40流体连接。例如，样品储存器30通过通道40与一个或更多个洗涤储存器50流体连接。装置10包括用于容纳磁性或非磁性(例如二氧化硅)珠的一个或更多个珠储存器80。珠可被功能化以包含与样品中组分的表面上的抗原结合的抗体或与样品中的期望靶标杂交的核酸。该装置还可包括外泌体/囊泡破裂储存器60。该储存器用作破裂含有RNA组分的囊泡的位置。该装置包括洗脱储存器70，其用于允许从样品提取RNA以用于通过例如RT-PCR进行进一步处理。

通道40和储存器30、50、60、70、80包含不同的流体/缓冲液。例如，通道40可包含油(例如硅油、矿物油等)，而储存器30、50、60、70、80可包含由在油中的水基缓冲液形成的液滴。以这种方式，可在不同的储存器30、50、60、70、80中分离不同的反应组分，同时通过通道40保持流体连接。

装置10可使用常用的微流体制造技术来制造。图13示出了制造装置10的一个实施方案。在该过程中，使用光掩模和UV固化粘合剂来定义PDMS模具的粘合区域。UV光仅固化期望区域中的粘合剂，并且未经固化的粘合剂被去除(参见图13，步骤1)。然后，添加PDMS层并固化。去除PDMS层，并在PDMS中开期望的孔(参见图13，步骤2)。然后，施加PDMS模具并将PDMS模具粘合到玻璃基底(参见图13，步骤3；还参见例如图12中的20)。

在操作期间，将样品(例如血清)提供到样品储存器30中。为了防止miRNA或其他因子(例如，血清组分)在通道或孔的表面上的不期望和非特异性吸附，可用八甲基硅氧烷物质改性表面以封闭表面并使通道和孔具有疏水性和惰性。再次参照图12，将样品储存器30中的样品提取成例如3个级分(外泌体、脂蛋白和蛋白质)。使用经针对外泌体表面抗原的抗体标记的磁珠将外泌体级分拉入下部通道40中(参见图14)。使用磁体将经免疫珠标记的外泌体通过通道40拉入破裂储存器60，在此可在乙醇和硫氰酸胍中破裂外泌体。然后，移除磁性免疫珠，并使具有阳离子表面电荷的磁性二氧化硅珠(参见图15)与经破裂的外泌体内容物接触。阳离子带电珠吸引并结合破裂储存器60中存在的阴离子带电RNA分子。然后，珠可将结合的RNA分子拉入提取储存器70。然后，通过使样品与磁珠接触获得样品的蛋白质级分，所述磁珠(a)选择性地与靶蛋白结合(使用例如抗AGO2抗体)，或(b)可在通过表面活性剂/离液盐混合物破坏蛋白质-RNA相互作用之后通过静电吸引、H键和/或疏水相互作用吸附RNA。然后，将珠通过通道40拖至洗脱储存器70。然后，通过使样品与与磁珠接触获得样品的脂蛋白级分，所述磁珠(a)选择性地与脂蛋白上的表位结合(使用例如抗氧化磷脂抗体)，或(b)可在通过表面活性剂/有机溶剂/离液盐溶液破坏脂蛋白复合物之后通过静电吸引、H键和/或疏水相互作用与RNA结合。然后，将珠通过通道40拖至洗涤储存器70。洗脱储存器70包含促使RNA从珠释放的缓冲液(例如超纯水)。然后，可从每个洗脱储存器70分离RNA并进行RT-PCR和测序，从而提供RNA序列-载体信息。

例如，对于血清蛋白结合RNA的提取，使用在约0.6MKCl、约0.01％吐温20和约4.5M盐酸胍中的约400μg的1μm裸磁性二氧化硅珠。对于血清脂蛋白结合RNA的提取，使用在约1MKCl、约0.11％吐温20、约3M盐酸胍、约2.5M硫氰酸胍和约10％EtOH中的约400μg的1μm裸磁性二氧化硅珠。对于血清外泌体，将捕获的外泌体在包含约50％EtOH/3M硫氰酸胍的溶液中孵育，除去捕获珠并添加约400μg磁性二氧化硅珠、约0.1％吐温20和约0.6M KCl。

本文中公开了基于微RNA所在的位置来快速分级微RNA的方法。本公开内容的方法采用非对称流动场流分级来分离血清中的微RNA载体。然后，可收集洗脱的级分。例如，如果收集总共6个级分，则每个级分将包含特定载体(例如，级分#3富集高密度脂蛋白(HDL)颗粒，级分#6富集外泌体)的富集群。从洗脱的级分，可提取并定量来自每个级分的微RNA。在本文中提供的实验中，进一步发现，来自级分的定量的微RNA在健康个体与患有病症的个体之间显示出显著差异。但是，如果将这些级分合并，则定量的miRNA总和在健康受试者与患有病症的个体之间未显示出显著差异。

在一个具体实施方案中，本文中公开的方法利用AF4或微流体方法分级整个血清。通过利用本公开内容的方法，收集离散的洗脱级分；从每个部分提取总RNA；并通过RT-qPCR定量每个级分中8种所选择的miRNA的量。或者，所提取的RNA可进行深度测序。还提取并鉴定每个级分中洗脱的蛋白质以揭示每个级分中富集的载体的身份。对在每个级分中miRNA的精确定量产生分布谱。将从健康个体的血清获得的分布谱与来自患有乳腺癌的患者的那些进行比较。

本文中使用的术语“深度测序”指允许每个碱基被读取数百次、通常至少约500次、更通常至少约1000次并且甚至更通常至少约1500次的核酸序列测序。深度测序方法实现靶向测序方法中的更大覆盖度(深度)。“深度测序”、“深度覆盖”或“深度”指对所测序的每个核苷酸具有高覆盖量。高覆盖度不仅允许检测核苷酸变化，而且还允许检测遗传样品中每个单碱基的异质性程度。此外，深度测序能够同时检测小的插入缺失(indel)和大的缺失、定位确切的断点、计算缺失异质性并监测拷贝数变化。在一些方面，深度测序策略，如由Myllykangas和Ji,Biotechnol Genet Eng Rev.27：135-58(2010)所提供的，可用于本公开内容的方法。

发现，通过使用本公开内容的方法，特定级分中一些miRNA的量在健康个体和乳腺癌患者之间显示出比总体量更明显的差异，表明这样的miRNA当存在于某种类型中的载体时可为用于癌症诊断的更特异性且敏感的生物标志物。了解载体可有助于提高对癌细胞的miRNA标志物的差异分泌及其它们在循环系统中的转运途径背后的基本原理的了解。这样的信息可有助于解释它们的功能并且帮助发现更有效的治疗方法。因此，与目前用于收集并定量与载体结合的miRNA的基于SEC的分级方法相比，本公开内容的方法允许综合筛选血清中分布的miRNA，并同时评价不同载体的量。因此，本公开内容的方法提供丰富的信息，其不仅可用于发现与疾病相关(例如指示特定癌症阶段)的生物标志物，而且还用于了解循环微RNA的分泌和转运的动力学。

为了例示本公开内容的一个实施方案，对两组人样品(一组来自健康个体(对照))，另一组来自癌症患者(病例))的研究已经揭示，不同类型的miRNA载体(例如脂蛋白颗粒和外泌体)在AF4分离之后可富集在单独的洗脱级分。与总和值相比，一些级分中8种被选择的miRNA的量在“对照”和“病例”之间也显示出较大变化。此外，与对总miRNA量的分析相比，对分布谱的统计学分析揭示更多潜在的miRNA标志物。

分级来自两个健康个体(对照)或来自两个癌症患者(病例)的血清。收集富集不同类型的miRNA载体(例如脂蛋白颗粒和外泌体)的6个级分。通过RT-qPCR获得每个级分中8种所选择的miRNA的量以产生其在载体之间的分布谱。与总和值相比，在分级结果中检测到对照和病例之间miRNA量的更大变化。对分布谱的统计学分析还证明，特定级分中4种miRNA的量在对照与病例之间显示出显著差异。相反，如果对miRNA的总量进行相同的统计学分析，只有2种miRNA显示出显著差异。此外，主成分分析揭示用分级的miRNA量将对照和病例良好分离。因此，本文中公开的方法允许综合筛选载体中循环miRNA的分布。获得的分布谱扩大了健康个体和癌症患者之间的miRNA表达差异，有利于发现用于癌症诊断的特异性miRNA生物标志物。

以下实施例旨在举例说明而不是限制本公开内容。虽然该实施例是可使用的典型实施例，但是可替代性地使用本领域技术人员已知的其它操作。

实施例

实施例1

化学品和生物材料.HDL和低密度脂蛋白(LDL)购自CalBioChem(EMD Millipore,Billerica,MA)。Trizol LS试剂，3,3'-双十八烷基氧杂羰基花青高碘酸盐(DiO)和总外泌体分离试剂盒购自Invitrogen(Life Technologies)。微RNA标准品购自Integrated DNATechnologies(Coralville,IA)。对每个miRNA链具有特异性的TaqMan MicroRNA Assays购自Applied Biosystems(Life Technologies)。用于制备1×PBS(pH 7.4的10mM磷酸盐、137mM NaCl、2.7mM KCl和1.0mM MgCl₂)的AF4运行缓冲液的所有化学物质、乙二醇、二甲基亚砜、盐酸胍、RNA级糖原、2-丙醇和氯仿均购自Thermo Fisher(Pittsburgh,PA)。用作AF4标准品的所有单一蛋白质均购自Sigma-Aldrich(St.Luis，MO)。Taq 5×主混合物购自NewEngland Biolabs。

血清样品.用于外泌体提取和分离方法优化的血清样品是来自Sigma-Aldrich的混合的健康男性血清。用于分布谱研究的血清样品来自经机构审查委员会批准的方案的自愿同意的患者(女性)。乳腺癌患者均患有浸润性导管癌并且是ER/PR/HER2阳性的(ER雌激素受体；PR-孕酮受体；HER2-人表皮生长因子受体)。

通过AF4的血清分级.本研究中使用由Postnova Analytics(Salt Lake City,UT)制造的AF2000系统。梯形分离通道为0.350mm厚(间隔物的厚度)，并且其顶端到顶端长度为275mm，入口三角形宽度为20mm且出口宽度为5mm。进样回路体积为20μL。积聚壁的表面积为3160mm²，其由分子量截止值(MWCO)值为10kDa的再生纤维素超滤膜(Postnova Analytics)制成。离开AF4的洗脱液通过SPD-20A吸光度检测器(Shimadzu)，然后通过级分收集器(Bio-Rad)。用于所有样品的运行缓冲液均为上述1×PBS。

在血清分级期间，使用八分钟的初始聚焦步骤，其中横流(通过膜壁离开通道的流)为3.00mL/分钟，顶端流(从入口进入通道的流)为0.30mL/分钟的速度且聚焦流(在入口进一步向下的位置进入以使分析物聚焦到窄样品区的流)为3.00mL/分钟。在聚焦之后，存在1分钟的过渡期，在此顶端流增加到3.30mL/分钟，聚焦流减小到零。在此之后，使顶端流量保持在3.30mL/分钟持续5分钟，然后在15分钟内降至0.30mL/分钟。在每种情况下，均使横流减小至使检测器流(从出口离开通道的流)在0.30mL/分钟。使用级分收集器(Bio-rad)以每分钟的时间间隔进行逐步收集。然后，将每个样品的这些1分钟收集物合并为6个级分，其中级分#1(F1)包含从6分钟至9分钟收集的洗脱液，F2从9分钟至13分钟，F3从13分钟至16分钟，F4从16分钟至19分钟，F5从19分钟至23分钟，F6从23分钟至28分钟。

用于方法优化的蛋白质和颗粒标准品.蛋白质标准品以及来自Sigma的纯HDL和LDL在细胞色素C、白蛋白、转铁蛋白、IgG或甲状腺球蛋白的0.1mg/mL溶液中制备。将50-nm聚苯乙烯珠以0.1μM的浓度悬浮。使用外泌体沉淀试剂盒(Invitrogen)制备外泌体。简言之，将全血清与外泌体分离试剂以5∶1的v/v比孵育20分钟。然后，将样品在4℃下离心以使外泌体沉淀。除去上清液，并将外泌体重悬于1×PBS中，得到2×浓缩溶液。将外泌体以原样在系统中运行，或者在室温下用DiO(终浓度为5μM)预孵育20分钟。使用相同的流动程序但没有5-分钟恒流窗口来分析所有标准品。

蛋白质的LC-MS/MS鉴定.在LC-MS/MS分析之前，对蛋白质样品进行胰蛋白酶消化。添加碳酸氢铵以达到约50mM的终浓度。使用标准的DTT/IAA还原烷基化方案来还原并烷基化样品。向样品添加胰蛋白酶，并在37℃下进行消化过夜。消化之后，使用C18ZipTip(Millipore)纯化样品，并在50％乙腈/0.1％三氟乙酸中洗脱。洗脱之后，将样品干燥并重悬于0.1％TFA中。然后，使用与Finnegan LTQ(Thermo)接合的Waters 2695分离模块对这些样品进行纳米LC-MS/MS分析。

将原始数据上传到蛋白质勘探搜索引擎(Protein Prospector search engine)(由旧金山的加利福尼亚大学在线提供)用于进行肽和蛋白质鉴定。使用用于每种蛋白质的鉴定肽的数量进行谱计数以用于相对蛋白质定量(保留重复)。此外，对低丰度的目的蛋白进行特定检索。

从收集的级分进行RNA和蛋白质提取.向每个级分掺加0.31fmol秀丽隐杆线虫(C.elegans)miRNA,cel-miR-67，并使用LS试剂(Invitrogen)进行苯酚-氯仿提取。将每个级分分成数份约450μL的等分试样，每份等分试样用1mL Trizol LS试剂均化，之后添加300μL氯仿。在相分离之后，将含RNA的水相与RNA级糖原混合并通过异丙醇(IPA)沉淀RNA。将RNA沉淀用80％乙醇洗涤一次，干燥，然后将相同级分的所有沉淀合并，之后经历另一轮的IPA沉淀和乙醇洗涤。然后，将级分干燥并保存在-20℃直至进行RT-qPCR分析。使用IPA沉淀含蛋白质的有机相，并用在以乙醇中的0.3M盐酸胍洗涤。干燥之后，将蛋白质沉淀在水中重构。

微RNA分析.为了获得足够的miRNA量，在每个重复中对每份血清进行两次收集。一次收集用于定量hsa-miR-16、miR-191、let-7a、miR-17、miR-155和miR-375，其中将miRNA沉淀在31μL TE缓冲液中重构。另一次收集用于定量hsa-miR-21和miR-122；并且在16μL中进行miRNA沉淀的重构。使用在进行RNA提取之前掺加到每个级分中的cel-miR-67作为内标以校正提取期间的样品损失，并使用由标准miRNA反应制备的外标校准曲线来获得每个样品中的绝对miRNA数量。

从单收集分析全部六条高丰度链(hsa-miR-16、miR-191、let-7a、miR-17、miR-155和miR-375)。剩余的两条链(hsa-miR-21和miR-122)从另一次单收集分析。在逆转录之前，将冻干的miRNA沉淀在31μL(用于高丰度链)或16uL(用于低丰度链)中重构。在每个RT反应中，将5μL样品与3μL逆转录主混合物和2μL用于到达miRNA链的相应RT引物(TaqMan逆转录探针)混合。主混合物由1.1μL无核酸酶水、1μL的10×缓冲液混合物、0.13μL的RNA酶抑制剂、0.1μL的dNTP混合物和0.67μL逆转录酶组成(所有组分均在TaqMan逆转录试剂盒中提供)。在混合之后，在RT混合物的顶部铺层5μL硅油，并在Perkin-Elmer 2400GeneAmp PCR系统上进行逆转录。RT反应由16℃下的30分钟退火步骤、42℃下的32分钟转录步骤和85℃下的5分钟变性步骤组成。

在RT之后，对样品进行定量PCR(qPCR)。在qPCR板上，将1μL的RT产物与9μL的qPCR主混合物混合，终体积为10μL。作为覆盖层，向每份样品的顶部添加5μL硅油以限制蒸发损失。主混合物由以下组成：4.9μL无核酸酶水、1μL乙二醇、0.1μL的DMSO、0.5μL的25mM氯化镁、2μL的Taq 5×主混合物和0.5μL的TaqMan微RNA测定20×qPCR试剂(包含miRNA RT产物特异性的正向和反向PCR引物，以及RT产物特异性的TaqMan荧光探针)。将每个样品以一式三份铺板，对应于所分析样品(高相对于低丰度)的任何标准物也如此。在Bio-Rad CFX实时仪器上进行qPCR分析：在95℃下90秒钟的初始活化步骤，之后是59℃下50秒的初始退火步骤，然后接着是40个循环的PCR，对于每个循环，进行95℃下的30秒变性和53℃下的70秒退火/延伸。使用Cel-miR-67作为内源标准品来解释提取期间的样品损失，使用标准校准曲线来归一化并定量miRNA水平。

外泌体检测的ELISA.添加到微量滴定板(Thermo,Microfluor 2包被的,平底)孔中的6个收集级分中每一级分的蛋白质的总量为约22ng，并用1×PBS稀释至50μL。将ELISA板在4℃下孵育过夜以使蛋白质吸附到孔的底部。然后，弃掉蛋白质溶液，并将板用200μL的1×PBS洗涤两次(用于测定的所有洗涤缓冲液均为1×PBS)，之后每个孔添加200μL的在1×PBS中含有5％无脂奶的封闭缓冲液。在室温下在温和摇动下孵育2小时之后，倾倒封闭缓冲液，并将孔洗涤两次。接下来，向孔添加100μL的经1×PBS以1∶5000稀释的一抗(小鼠抗人CD63，目录号#ab8219,Abcam,Cambridge,MA)，之后在室温下再孵育2小时。4次洗涤之后，添加100μL第二抗体，经1∶25000稀释的、HRP缀合的兔抗小鼠IgG(目录号#ab97046,Abcam)，并在室温下在轻轻摇动下孵育1小时。将板洗涤4次，之后添加30μL的Perice ECL底物(ThermoFisher)，并孵育5分钟。检测所得化学发光。在同一板上进行两次重复。对于标准曲线，在相同板中添加梯度浓度的人CD63(Sino Biology)的两个重复。在吸附步骤中，空白仅包含1×PBS。

miRNA载体的AF4分离.由于蛋白质和外泌体之间在流体动力学直径(dh)方面的差异较大，因此需要优化AF4分离条件以在合理的时间内洗脱所有载体，同时维持不同物类之间的适度分辨率。特别地，由于例如外泌体的大颗粒的扩散速率慢，因此其洗脱可需要很长时间。在恒定的通道/横流条件下，进样通过总外泌体分离试剂盒制备的外泌体，但在30分钟内未洗脱，除非逐渐关闭横流(参见图1A至B)。表明，如果将横流在15分钟内逐渐降低到零，则实现外泌体与较小血清成分之间更佳的分辨率以及快速洗脱外泌体且限制峰拖尾(见图1C)。使用该流动程序，具有不同dh的蛋白质标准品在不同的时间洗脱：白蛋白(Mw67kDa，dh～4nm)、IgG(Mw 150kDa，dh～8nm)和甲状腺球蛋白(Mw 660kDa，dh～16nm)，以及聚苯乙烯纳米颗粒(dh＝50±7nm，代表平均外泌体直径)(参见图2A)；HDL(dh～7～10nm)、LDL(dh～21-28nm)和外泌体也如此(图2B)。结果支持，主要血清载体可以以单一蛋白质<HDL<LDL<外泌体(按洗脱时间排序)的顺序洗脱。为了进一步提高较大脂蛋白颗粒和外泌体之间的分离分辨率，使用5-分钟恒流期，即将横流在3.0mL/分钟维持5分钟，然后开始缓降(参见图3)。当解析单一蛋白质和HDL时，这一条件也提供了轻微的改善。然后，将这种新方法用于后续实验。

通过经优化的AF4方法来分级从Sigma购买的全部人血清。向血清参加纯HDL和LDL以确定其精确洗脱窗口(参见图4A)。HDL在10分钟至15分钟内洗脱，LDL在17分钟和23分钟之间洗脱。此外，在AF4分级之前，将血清或外泌体提取物用DiO的亲脂性染料染色。DiO在水中是弱荧光的，但当引入到脂质膜中时，发出具有高光稳定性的强荧光。用荧光检测(λ_入射＝490nm；λ_发射为510nm)获得的分级图进一步证实，具有脂质膜的结构主要在17分钟后被洗脱(参见图4B)。

患者血清的分级和每个级分中洗脱的载体的确认.一旦已知用于洗脱已知miRNA载体的大致窗口，则将从2位健康女性(对照，称为对照#1和#2)和2位乳腺癌(BC)患者(病例，病例#1和#2)收集的血清样品(参见图5)分级。收集6个级分以提高每个级分中富集的miRNA载体的纯度。通过从上述研究获得的HDL、LDL和外泌体的相对洗脱时间来确定每个级分的收集窗口(图5中的插入表格)。分离是高度可重现的：使用所收集的所有8个分级图(四个血清样品，每个具有两个重复)，每个级分中峰的洗脱时间的相对标准偏差(RSD)<8％(参见图6A和6C)。对所有4个受试血清样品进行DiO染色，并确定具有丰富脂质结构的载体例如HDL、LDL和外泌体的可重现洗脱(参见图6B和6D)。通过UV吸收和DiO染色偶联荧光检测获得的高度可重现的分离谱有助于确定这些样品之间在常规蛋白质(由血清白蛋白和IgG的峰强度表示)和脂质(由通过DiO染色检测到的两个主要峰表示)含量方面的相似性。这可确保，在miRNA分布谱中检测到的差异来源于BC的存在，而不是来源于载体丰度的差异。此外，高重现性极大地简化了柱后收集：将级分收集器编程为自动地每一分钟收集洗脱液，并将在期望时间窗口内的级分合并用于后续的miRNA和蛋白质提取。

为了确定每个级分中富集的载体的身份，收集在F1至F6中洗脱的蛋白质，通过胰蛋白酶消化，并通过LC-MS/MS分析。通过谱计数来评价洗脱的蛋白质的相对丰度，所述谱计数计算针对特定蛋白质收集的质谱的数目。在一个样品中鉴定到的所有谱中特定蛋白质的谱数的百分比应与其在混合物中的相对丰度半定量地成比例。在多个级分中发现属于不同脂蛋白复合物的载脂蛋白，例如载脂蛋白A-1(ApoA-I)、A-II(ApoA-II)和B-100(ApoB)(参见图7A)。作为HDL的标志物的ApoA-I发现于F2-F6中，可能是因为其与所有的脂蛋白复合物均相关，并且甚至在外泌体中。HDL的另一标志物蛋白质ApoA-II存在于F2-F4级分中，并且还在F3中富集。考虑到文献中报道的HDL的尺寸范围(即7～10nm)，得出的结论，异质高密度脂蛋白(HDL)颗粒在F2、F3和F4中洗脱。ApoB是LDL以及极低密度脂蛋白(VLDL)的标志物蛋白质并且发现于F4-F6中，其中大多数在F5中洗脱。因此，LDL应该在F5中富集，与图2B和图4A中所示的纯LDL的迁移窗口匹配。

LC-MS/MS未鉴定到外泌体的标志物蛋白质，这可能是由于高度丰富的血清蛋白质例如IgG和白蛋白产生的信号抑制。相反，通过ELISA在每个级分中均检测到外泌体的标志物蛋白质CD-63(参见图7B)。约20ng的从每个级分提取的蛋白质(通过二喹啉甲酸测定确定)吸附到微量滴定板的底部。通过抗CD63抗体和经HRP标记的二抗检测CD-63。在F6中检测到显著量的CD63(～6ng/20ng)。如从标准分析得出结论，F6为外泌体主要所在的位置。

总之，上述结果指出，F1主要含有白蛋白或具有MW<100kDa的蛋白质。HDL和LDL分别应在F3和F5中富集，外泌体主要在F6中但也可在F5中。VLDL与F6中与外泌体共洗脱。尽管使用目前的分离方法观察到多个载体的共洗脱(例如F4中HDL和LDL的重叠以及F6中外泌体和VLDL的共洗脱)，但是在特定级分中富集特定载体应已允许观察载体之间miRNA的一般分布。更高的分辨率确实将提高分布谱分析的准确性，并且可通过在每一轮分离中注入较低量的血清来实现，但需要多次收集，增加分析中的总劳动，这不是有利的选择。通过使用较高的横流来增加分离力也可有益于分离分辨率，但由于膜吸附而损失更多miRNA的风险也增加了。因此，在后续实验中使用当前的分级条件。结果表明，粗分布谱足以区分癌症患者与健康对照，以及揭示对分化重要的链和特定载体。

血清中miRNA的分布.将总RNA沉淀并在水中重构以通过RT-PCR进行定量。如上所述，测试来自两组供体(全部女性)的血清。分析来自健康个体的血清(对照#1和#2)以及来自乳腺癌患者的那些(病例#1和#2)，每个具有两次重复测量。通过RT-qPCR定量8种miRNA。其序列以及其包括在研究中的基本原理说明列于表1中。

表1：微RNA链信息

通过定量来自Sigma的血清中的miR-16来评价该方法中miRNA的回收。将通过TRIzol试剂从全部20μL血清直接提取的miR-16的总含量与从用注射相同血清体积获得的所有AF4级分回收的总和miRNA量进行比较。实现高达98％的回收(参见图8)，表明AF4通道内的膜吸附不会引起显著的miRNA损失。在20μL血清中测试的每种miRNA的所得拷贝数的范围通常为10⁴至10¹⁰。miR-375和-122相比其他链以远远更低的丰度存在，或者甚至在一些级分中未检测到。

分离步骤中的高重现性以及miRNA提取和定量中的仔细处理确保高分析重现性：对于大多数链，两次重复测量中总miRNA含量的对数值的RSD为<5％，除miR-375、-21和-122之外，其可变化高达15％。结果与以前的报道一致，在个体之间，甚至在同一健康组：对照或在BC病例中的两个样品之间观察到miRNA量的较大变化。评价所有血清样品中总miRNA量的RSD指出，与其他miRNA种类相比，miR-16和-17在个体之间具有相对更稳定的表达。它们的RSD低于15％。然而，如果基准值为约10⁶，则该RSD已对应于miRNA拷贝数的约10倍的改变。对于miR-122，在同一组内的两个样品之间观察到接近120％的RSD值。

由于每个级分富集特定类型的miRNA载体，因此在每个级分中发现的拷贝数对应于该特定载体中的miRNA水平。不同的miRNA在载体之间显示出不同的分布模式，如病例#1的分布谱所表明(参见图9A；其他样品的分布谱示于图10中)。在该样品中，在F4-F6中发现较高量的miR-16、-17和-122。F1-F3中甚至没有可检测的miR-122。因此，这三种miRNA应主要位于该血清样品中的脂蛋白复合物和外泌体中。相比之下，Let-7a、miR-155和miR-191在所有级分之间具有相当平坦的分布。每种miRNA的主要载体类型可与其在离开细胞时所采用的主要途径相关，并且可能与其生物功能相关。通过在miRNA定量之前分级载体，本公开内容的方法提供了关于miRNA在血清中如何存在的丰富信息，其可进一步被探索以解决miRNA分泌和转运的基本原理。

然后，在对照和BC样品之间比较在每个级分中发现的miRNA拷贝数。图9B示出了BC样品中平均miRNA拷贝数相对于对照样品中的平均miRNA拷贝数的对数比率；即，对于每种miRNA，Log(BC/对照)。如果在BC病例中的miRNA水平低于对照，则可获得负Log(比)值，反之亦然。Log(病例/对照)的绝对值越大表明这两组之间的差异越明显。使用来自所有级分的总miRNA量获得的Log(病例/对照)(显示为红色柱)也包括在内。总和代表miRNA研究中的可用标准方法得到的结果，其中定量每种miRNA的总体表达水平。图9B清楚地表明，与所有受试miRNA的总和值相比，在一些级分中观察到BC和对照样品之间的更大差异，除miR-155和-191之外。这些结果提示，一些载体中的miRNA量变化在区分癌症患者与健康对照方面比在整个血清中的总体量更敏感。这一猜测得到以下统计学分析的支持。

miRNA分布谱的统计学分析.为了了解分布谱是否可显示健康供体和BC患者之间的差异，以及是否可发现更可靠的miRNA生物标志物，对于表1中列出的8种miRNA，使用R3.0.2将其在每个级分中的量拟合在方程1的线性混合效应模型中。

Y_ijk＝μ+b_i+b_j(i)+ε_ijk (方程1)

其中i＝1,2(患者组的#)，

j＝1,2(每组中的样品#)

k＝1,2(重复),

b_i:第i组的效应(固定的,对照组为1,BC病例组为2)，

b_j(i):第i组中第j样品的效应(随机的，对照#1为1(1)，对照#2为2(1)，病例#1为1(2)，病例#2为2(2))

b_j(i)和ε_ijk是独立的。

对于给定级分中的miRNA，Y为观察到的miRNA拷贝数的对数值。例如，对于F1中的miR-16，Y111是来自对照#1的两个重复之一的miRNA拷贝数的对数值。当比较健康供体与BC患者时，这种线性混合效应模型解释，样品间差异以及样品内差异σ²，即测试假设H₀:b₁＝b₂＝0。使用似然比检验来对8种miRNA中每一种的每个级分测试这一假设。为了与标准方法进行比较，还对每种miRNA的所有级分的总和进行相同的测试。特定级分(F5和F6中的miR-16、F4中的miR-17、F4中的miR-375和F4中的miR-122)中更多的miRNA链(miR-16、miR-17、miR-375和miR-122)在健康供体和BC患者之间产生水平为0.05的显著差异，如参见图9B中“*”符号标记的，而如果使用总和值，则仅miR-16和17显示出显著差异。

令人感兴趣的是观察到，F4或F6中的miRNA量显示在区别病例与对照中最为重要。而F6主要包含外泌体，F4富集HDL和LDL。则可能的是，虽然所有四种标志物均可能在诊断乳腺癌中具有价值，但其可能由癌细胞通过不同的途径释放。miR-16可在外泌体中分泌；但是与外泌体级分相比，在脂蛋白复合物中的miR-17、-375和-122可能与乳腺癌的发展更相关。这突出了测试多种载体而非仅一种载体中miRNA量的必要性。

为了可视化F5和F6中miR-16、F4中miR-17、F4中miR-375和F4中miR-122的量在区别健康供体和BC患者中的有效性，使用XLSTAT 2014(Addinsoft^TM)进行主成分分析(PCA)。将各级分中每种miRNA的含量作为变量考虑。例如，F6中的miR-16含量是一个变量，并且命名为miR-16-F6。在研究中进行总共8次观察，每个样本的两次重复计数为两次独立观察。PCA表明，在miR-16-F5、miR-16-F6、17-F4、375-F4和122-F4上分别具有载荷-0.436、-0.598、-0.167、-0.258、0.599的第一主成分可潜在地将健康供体与BC患者分开，如图9C中的评分图所示的。事实上，第一主成分已经占总变化的87.1％。然后，利用包含更大量的健康对照和癌症患者的样品组的分析得出关于这些潜在标志物在癌症诊断中能力的肯定结论。

实施例2

微芯片制造.简言之，如图13中一般性所示制造微芯片。通过将3"×1"载玻片(0.5mm厚)和经固化的PDMS基底结合在一起来制造微芯片平台。为了制造PDMS基底，制备了总共三种主体。首先，仅包含通道特征的第一主体，主体-1，由基于硫醇烯(thiolene)的光学粘合剂NOA81通过开放式方法而制造。在该方法中，通过用准直的UV光源(365nm,～8.3mW/cm²)照射5秒来在载玻片(经等离子体处理)和PDMS工作台之间预固化NOA81。主体-1的厚度由放置在载玻片和PDMS台之间的间隔物(～400μm)确定，并且特征由光掩模定义。在短暂的UV暴露之后，从PDMS台缓慢移出载玻片，其中在表面上具有基于预固化的NOA81的通道特征。使用注射器通过用乙醇、乙醇/丙酮混合物(1∶1)和再次乙醇顺序冲洗来除去未暴露的粘合剂。通过UV暴露照射经风干的载玻片持续345秒，后固化步骤旨在增加NOA81对玻璃的粘附。在50℃下进行后续的12小时热固化以延长结构的寿命。在此之后，将主体-1通过1,7-二氯-八甲基四硅氧烷处理以在装置的主模上产生不粘表面，并用于模制用于制备主体-2的PDMS基底。将PDMS基底在60℃下固化4小时，然后剥离主体-1，在井的位置打孔以形成主体-2。在使主体-2附着在经等离子体处理的载玻片上之后，在不混入任何气泡的情况下向通道和井中注入NOA81，在UV下固化1300秒，并在50℃下热老化12小时。通过小心地移出PDMS主体-2，完成在表面上具有低通道特征和高柱结构二者的主体3，然后可将主体3用于复制用于miRNA提取的微芯片的PDMS基底。最后通过将形成的PDMS基底通过等离子体氧化共价结合在薄载玻片来获得芯片。如下甲基化装置的通道：洗涤并用1M NaOH孵育10分钟，用水、乙醇洗涤并随后干燥，之后进行1,7-二氯-八甲基四硅氧烷试剂(在乙醇中10％v/v)孵育。然后，将该芯片用乙醇冲洗并干燥。

微珠的制备.使用碳二亚胺交联来使平均直径为350nm的聚苯乙烯磁性微珠与山羊抗小鼠IgG缀合(参见，例如图14)。向悬浮于50mM MES缓冲液(pH～5.5)中的1mg(20mg/mL)微珠中添加10mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合物。孵育30分钟之后，除去活化缓冲液，并将珠用偶联缓冲液(1×PBS，pH～7.2)洗涤2次。然后，向以10mg/ml的终浓度重悬于偶联缓冲液中的珠添加适量的抗小鼠IgG。将混合物在4℃下混合孵育过夜。然后，将珠用偶联缓冲液洗涤两次，随后重悬于25mM甘氨酸缓冲液((pH～7.2)中，并在室温下孵育30分钟。在用包含1％BSA的1×PBS洗涤两次之后，将珠分散在储存缓冲液(具有0.01％BSA的1×PBS)中至25mg/ml的期望浓度。在使用之前，将微珠与1×PBS中终浓度为10mg/ml的小鼠抗人CD63IgG混合，之后在4℃下混合孵育过夜。在结合之后，将珠用1×PBS洗涤3×并储存在PBS储存缓冲液中。

miRNA的提取.芯片布局示于图12中。示出了三个用于提取的通道，每个通道连接数个井/储存器，并填充有硅油。这些井预先装载有液滴形式的合适水溶液。通道1和2具有洗涤、洗脱和珠收集储存器，并且用于分离蛋白质-结合的miRNA和脂蛋白-结合的miRNA。通道3用于分离外泌体miRNA。与其他两个通道一样，通道3包括常规的洗涤、洗脱和珠收集储存器，但还包括更多的两个井；一个用于外泌体纯化和破裂以及PS-珠装载。

通过将25μL血清和100μg与抗人CD63IgG缀合的免疫珠添加到样品储存器来开始提取。将样品上下吸移3至5次以充分混合，并在室温下孵育30分钟。然后，使用微流体芯片下面的永久磁体，珠移向通道3，通过洗涤储存器，然后进入破裂储存器。洗涤储存器包含1×PBS，并且破裂储存器容纳30μL由75％EtOH和2M硫氰酸胍以及1％吐温-20组成的溶液。在破裂储存器中孵育15分钟后，将珠移入连接的珠储存器中，然后向井中添加20μL的9MGuHCl和4μL的6M KCl，随后添加200μg的1μm磁性二氧化硅珠。在混合和另外一轮15分钟的孵育之后，二氧化硅珠行进至包含无RNA酶的超纯水的洗脱储存器中，混合，并孵育15分钟以卸载miRNA，之后将二氧化硅珠移出到相应的珠储存器中。

开始蛋白质和脂蛋白结合的miRNA的提取，同时分离外泌体miRNA。从血清中移出外泌体之后，向样品储存器中添加30μL的9M GuHCl、6μL的6M KCl和0.1％吐温20。接着，添加200μg的2μL水中的磁性二氧化硅珠，充分混合，并孵育15分钟。随后，将二氧化硅珠磁力拖入通道1中。一旦携带蛋白质结合的miRNA的二氧化硅珠离开样品储存器，添加60μL的6M硫氰酸胍、1μL的10％吐温20、15μL的100％乙醇和200μg二氧化硅珠，充分混合，并孵育15分钟。此时，珠将提取脂蛋白结合的miRNA并移动到通道2。在通道1和2中，二氧化硅珠移动通过洗涤和洗脱储存器，并最终收集在相应的珠储存器中。

从芯片中移出对应于外泌体、蛋白质和脂蛋白结合的miRNA级分的三种洗脱液，并用对每种靶miRNA具有特异性的商业Taqman miRNA引物测定试剂盒通过RT-qPCR定量。

外泌体分离和破裂以释放外泌体miRNA的确定.如下确定外泌体的提取：用非对称流动场流分级(AF4)分析提取的样品并比较微流体芯片提取中和通过Invitrogen外泌体分离试剂盒制备的外泌体中的CD63量。AF4根据分析物的水合尺寸来对其进行分离。所有样品通过UV-Vis吸光检测，还用DiO染料染色并通过荧光检测以说明富集脂质的部分。如图16a中所示，通过芯片上免疫提取和通过Invitrogen试剂盒制备的两个样品均在晚于20分钟的洗脱时间时显示出显著峰，其中通过ELISA在洗脱液中检测到显著量的CD63(图16b)。通过Invitrogen试剂盒制备的样品还具有在10分钟至17分钟之间洗脱的的相对较小的峰，这可能是离心期间共沉淀的脂蛋白结构。通过免疫珠分离的样品中的外泌体峰在比通过Invitrogen试剂盒制备的更晚的时间出现。在本公开内容方法中发现的CD63浓度为7.04ng/μL(图16c)，与级分6-8中发现的总CD63浓度充分匹配；并且用Invitrogen试剂盒浓度为5.28ng/μL，与级分4-5中的总CD63一致。本发明的方法产生比Invitrogen试剂盒更大的从血清的外泌体回收率，并且产生相对较大的外泌体级分。从图16b还可以注意到，级分7中存在洗脱的大的外泌体，这在AF4方法中没有收集到。

一旦外泌体被分离，用含有75％EtOH的溶液对其进行处理。高有机含量破坏外泌体的膜结构，并且释放包封的miRNA。图16d显示，在处理之后，当通过AF4进行分析时，外泌体峰消失。由于DiO染料仅在疏水环境中发出强荧光，因此荧光信号的显著降低表明缺乏完整的疏水结构和外泌体破裂的成功。

miRNA-蛋白质复合物的破坏的确定.一旦去除外泌体，样品中的剩余miRNA与脂蛋白复合物或者与蛋白质(例如AGO2)结合。蛋白质-RNA相互作用依赖于RNA上带负电荷的磷酸基团与蛋白质上带正电荷的伯胺之间的H-键合和静电相互作用。RNA和蛋白质二者的变性剂的存在将确定地影响蛋白质-RNA复合物的稳定性，释放蛋白质结合的miRNA。为了破坏更紧密的脂蛋白复合物，应采用较高浓度或较强的变性剂。选择的变性剂为两种离液盐盐酸胍(GuHCl)和硫氰酸胍(GuSCN)、表面活性剂吐温20和有机溶剂EtOH的组合。为了实现从同一血清样品连续提取蛋白质和脂蛋白结合的miRNA，将去外泌体的血清使用包含约0.5MKCl、0.0015％吐温20和4M盐酸胍的温和溶液处理以释放与蛋白质结合的miRNA。一旦通过二氧化硅珠去除这些miRNA，就提供更多的吐温20和更强的硫氰酸胍(GuSCN)以及EtOH变性剂来分解脂蛋白复合物的紧密结构并释放缔合的miRNA。最终混合物包含大约0.25M KCl、1.8M GuHCl、2.5M GuSCN和10％EtOH。再次，使用DiO染色和AF4分析来可视化HDL和LDL复合物的完整性。在任何处理之前，经DiO染料染色的血清当注射到AF4系统中时产生两个大峰(图17)。一旦用温和的变性溶液处理，第一峰的荧光强度显著降低。如初步研究中表明的，该峰表示免疫球蛋白的洗脱，其也被DiO染色。其荧光的失去表明其折叠被打断，满足温和变性溶液的功能的预期。此外，在将血清与包含GuSCN和EtOH的更强变性溶液孵育之后，痕迹变得平坦，并且在分级图中未检测到明显的荧光峰(图17)，指明脂蛋白结构被破坏。

通过二氧化硅珠提取游离的miRNA.外泌体、脂蛋白复合物和简单蛋白质-RNA复合物的破坏从其载体释放miRNA。然后，使释放的miRNA与二氧化硅珠结合。基于二氧化硅的DNA或RNA提取已得到广泛应用。通常来说，使用例如GuHCl的离液盐来减弱核酸在水溶液中的水合作用并促进与二氧化硅表面的疏水相互作用。还可包括KCl以通过在二氧化硅表面上的已电离硅烷醇基团和RNA的磷酸骨架之间形成盐桥来增强结合。两者都存在于蛋白质-RNA破坏的温和变性溶液中，或者在外泌体破坏之后随二氧化硅珠添加。任何提取操作均可能由于结合平衡和扩散而遭受样品损失。为了评价微流体芯片方法的回收率，使用Trizol试剂和两种其他商业试剂盒GeneJet试剂盒(Thermo Scientific目录#K0731)和PureLink试剂盒(Ambion，目录12183020)进行的总miRNA提取。这些代表从生物样品提取RNA的常用方法。按照生产商的方案，使用商业试剂盒仅回收在血清中掺加的cel-miR-67的很小部分(图18)。这可能是由于与不提供与颗粒的大相互作用表面的mRNA和基因组DNA相比，miRNA的长度短。芯片上提取方法得到13.5％的最高平均回收率，这可归因于与商业试剂盒或试剂相比，其最小的人工操作和液体转移。

分级效果评价.上述结果表明，与常规的RNA提取方法，所述分级方法不导致更多的样品损失并且花费远远更少的时间，同时单独获得与三种不同载体结合的miRNA。为了进一步评价分级效果，将从芯片上提取回收的miRNA量与由AF4法获得的那些进行比较。通过AF4方法获得的级分1和级分6分别表示蛋白质结合的miRNA(图19a中的灰色柱)和外泌体miRNA(图19b中的灰色柱)，并将其量与用微芯片方法获得的在通道1和3中的(图19a和c中的白色柱)进行比较。还采用Invitrogen总外泌体分离试剂盒来获得外泌体，并通过TRIzol提取获得外泌体miRNA(图19b中的图案化柱)。认为用AF4方法从级分2-5中回收的miRNA量为脂蛋白结合的miRNA，并与在通道2中提取的miRNA进行比较(图19c)。最后，通过与抗HDL/LDL IgG缀合的免疫珠分离HDL/LDL复合物，通过TRIzol提取miRNA，并添加到比较中。测试了四种miRNA：miR-17、miR-21、miR-155和miR-191。

如图19中所示，与AF4方法相比，芯片上提取方法从每种类型的载体回收相当或更高量的miRNA。通过AF4的分离产生多至数mL的大洗脱体积，使后续用TRIzol进行miRNA回收变得更加困难且耗时(>1天)并且产率较低。相比之下，芯片上提取开始于25μL血清，最终体积不超过150μL，并且该方法可在1.5小时内完成。对于外泌体miRNA，图16a中所示的级分7在AF4方案的本设计中未被收集，并且在该级分中洗脱的较大外泌体中包封的miRNA未被提取。所有这些促成微芯片方法的更高的miRNA回收率。外泌体miRNA的芯片上提取产生比Invitrogen总外泌体分离试剂盒更高量的miRNA(图19b中的白色柱相对于图案化柱)。这可能是由于，本公开内容的方法能够回收更多的大外泌体，而具有更少的来自脂蛋白复合物的污染，如图16a中当使用AF4来分析外泌体尺寸分布和纯度时所述。感兴趣的是，对于脂蛋白缔合的miRNA，使用微芯片方法和通过免疫捕获获得相当的miRNA量(图19c中的白色柱相对于图案化柱)。在不使用昂贵的抗体和复杂的亲和捕获的情况下，通过多种化学物质分离脂蛋白结合的miRNA，出乎意料地简单但有效的方法，并且对于所有四种受试miRNA链产生相当(如果不是更高)的回收率。

人血清的分析.获得来自人受试者的7份血清样品。这些样品收集自乳腺癌患者。此外，从Innovative Research Inc.购得健康血清，与每个癌症受试者的年龄和种族相匹配，作为对照。一个病例和一个对照的miRNA分布谱提供在图20a和b中。可以看出，每种miRNA在三种主要载体之间在其分布方面显示出不同的模式，这与它们如何分泌和转运相关。通过将来自所有(n＝7)病例的每个级分中的平均miRNA含量与来自所有(n＝3)对照的进行比较，在各级分中鉴定到与使用总miRNA含量的变化相比更大的变化(图20c)。图20c中的图案化柱表示病例和对照之间在总miRNA含量方面的变化。这些变化通常在±0.5的范围内，表明miRNA含量的倍数变化小于10，由于个体之间的差异较大，这在人样品中miRNA表达谱的大规模分析中被认为是不可靠的。相比之下，经分级miRNA水平的大部分变化超出±1的范围。例如，患者样品中蛋白质结合的miR-16和-155的水平比在健康个体中发现低超过100倍。脂蛋白缔合的miR-105的水平在癌症患者中甚至超过1000倍低。在病例中鉴定到外泌体Let-7a和miR-375含量相对于对照近100倍的增加。感兴趣的是，对所有样品的分布谱进行主成分分析(PCA)在由前两个主成分获得的散点图上产生了在所有病例和所有对照之间明确分组(图20d)。这两个主成分总结了超过78％的数据集中的全部差异。相比之下，使用总miRNA含量或外泌体miRNA分级，在PCA之后在病例和对照之间未观察到明确的分离。这些结果充分表明，与常规方法相比，分布谱分析可揭示癌症患者和健康个体之间的更大变化。

本文中已经描述了很多实施方案。尽管如此，应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行多种修改。因此，其他实施方案也在所附权利要求书的范围内。

序列表

<110> 加利福尼亚大学董事会

<120> 确定循环RNA的分布谱的方法

<130> 00013-084WO1

<140> 尚未分配

<141> 2015-09-03

<150> US 62/045,503

<151> 2014-09-03

<160> 9

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cel-MiR-67内标

<400> 1

cgcucauucu gccgguuguu aug 23

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人 (Homo sapiens)

<400> 2

ugagguagua gguuguauag uu 22

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人

<400> 3

uagcagcacg uaaauauugg cg 22

<210> 4

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人

<400> 4

caacggaauc ccaaaagcag cug 23

<210> 5

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人

<400> 5

caaagugcuu acagugcagg uag 23

<210> 6

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人

<400> 6

uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23

<210> 7

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人

<400> 7

uuuguucguu cggcucgcgu ga 22

<210> 8

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人

<400> 8

uagcuuauca gacugauguu ga 22

<210> 9

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人

<400> 9

uggaguguga caaugguguu ug 22

Claims

1.一种用于确定样品中循环RNA的分布的分级方法，其包括：

将从受试者获得的生物流体样品分级成至少包含外泌体级分、蛋白质级分和脂蛋白级分的级分，其中每个级分包含RNA载体；

确定或定量每个所述级分中的RNA以产生所述样品中所述RNA针对RNA载体的分布谱。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述分级是通过对所述样品进行非对称流动场流分级(AF4)并收集多个洗脱液。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述分级是通过基于芯片的微流体系统。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物流体样品是血清样品。

5.根据权利要求2所述的方法，其中使用厚度为约0.350mm且顶端到顶端长度为约275mm的、入口三角形宽度为约20mm且出口宽度为约5mm的梯形分离通道来分级血清样品。

6.根据权利要求5所述的方法，其中积聚壁

的表面积为约3160mm²，分子量截止值为10kDA。

7.根据权利要求2所述的方法，其中所述多个洗脱液是在20分钟至25分钟的时间段内作为1分钟洗脱液被收集的。

8.根据权利要求2所述的方法，其中从所述多个洗脱液产生所述生物流体样品的至少6个级分。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述6个级分由合并在6个单独且非重叠的时间段内收集的1分钟洗脱液产生。

10.根据权利要求9所述的方法，其中每个所述6个级分富集具有特定流体动力学直径的RNA载体蛋白质。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述级分富集蛋白质、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和外泌体。

12.根据权利要求1所述的方法，其中通过深度测序或RT-qPCR来确定或定量所述RNA。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述RNA包括微RNA或lncRNA、或病毒RNA。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述微RNA或lncRNA或病毒RNA是与疾病或病症相关的生物标志物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述病症是癌症。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。

17.根据权利要求1所述的方法，其中RNA组为包含序列SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8和/或9的微RNA。

18.根据权利要求1所述的方法，其中RNA组选自由以下各项组成的组：let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、let-7i、miR-1、miR-100、miR-101、miR-103、miR-105、miR-106a、miR-106b、miR-107、miR-10a、miR-10b、miR-122a、miR-124a、miR-125a、miR-125b、miR-126、miR-126*、miR-127、miR-128a、miR-128b、miR-129、miR-130a、miR-130b、miR-132、miR-133a、miR-133b、miR-134、miR-135a、miR-135b、miR-136、miR-137、miR-138、miR-139、miR-140、miR-141、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-143、miR-144、miR-145、miR-146a、miR-146b、miR-147、miR-148a、miR-148b、miR-149、miR-150、miR-151、miR-152、miR-153、miR-154、miR-154*、miR-155、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-17-3p、miR-17-5p、miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d、miR-182、miR-182*、miR-183、miR-184、miR-185、miR-186、miR-187、miR-188、miR-189、miR-18a、miR-18a*、miR-18b、miR-190、miR-191、miR-191*、miR-192、miR-193a、miR-193b、miR-194、miR-195、miR-196a、miR-196b、miR-197、miR-198、miR-199a、miR-199a*、miR-199b、miR-19a、miR-19b、miR-200a、miR-200a*、miR-200b、miR-200c、miR-202、miR-202*、miR-203、miR-204、miR-205、miR-206、miR-208、miR-20a、miR-20b、miR-21、miR-210、miR-211、miR-212、miR-213、miR-214、miR-215、miR-216、miR-217、miR-218、miR-219、miR-22、miR-220、miR-221、miR-222、miR-223、miR-224、miR-23a、miR-23b、miR-24、miR-25、miR-26a、miR-26b、miR-27a、miR-27b、miR-28、miR-296、miR-299-3p、miR-299-5p、miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-301、miR-302a、miR-302a*、miR-302b、miR-302b*、miR-302c、miR-302c*、miR-302d、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30b、miR-30c、miR-30d、miR-30e-3p、miR-30e-5p、miR-31、miR-32、miR-320、miR-323、miR-324-3p、miR-324-5p、miR-325、miR-326、miR-328、miR-329、miR-33、miR-330、miR-331、miR-335、miR-337、miR-338、miR-339、miR-33b、miR-340、miR-342、miR-345、miR-346、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-361、miR-362、miR-363、miR-363*、miR-365、miR-367、miR-368、miR-369-3p、miR-369-5p、miR-370、miR-371、miR-372、miR-373、miR-373*、miR-374、miR-375、miR-376a、miR-376a*、miR-376b、miR-377、miR-378、miR-379、miR-380-3p、miR-380-5p、miR-381、miR-382、miR-383、miR-384、miR-409-3p、miR-409-5p、miR-410、miR-411、miR-412、miR-421、miR-422a、miR-422b、miR-423、miR-424、miR-425、miR-425-5p、miR-429、miR-431、miR-432、miR-432*、miR-433、miR-448、miR-449、miR-450、miR-451、miR-452、miR-452*、miR-453、miR-455、miR-483、miR-484、miR-485-3p、miR-485-5p、miR-486、miR-487a、miR-487b、miR-488、miR-489、miR-490、miR-491、miR-492、miR-493、miR-493-3p、miR-494、miR-495、miR-496、miR-497、miR-498、miR-499、miR-500、miR-501、miR-502、miR-503、miR-504、miR-505、miR-506、miR-507、miR-508、miR-509、miR-510、miR-511、miR-512-3p、miR-512-5p、miR-513、miR-514、miR-515-3p、miR-515-5p、miR-516-3p、miR-516-5p、miR-517*、miR-517a、miR-517b、miR-517c、miR-518a、miR-518a-2*、miR-518b、miR-518c、miR-518c*、miR-518d、miR-518e、miR-518f、miR-518f*、miR-519a、miR-519b、miR-519c、miR-519d、miR-519e、miR-519e*、miR-520a、miR-520a*、miR-520b、miR-520c、miR-520d、miR-520d*、miR-520e、miR-520f、miR-520g、miR-520h、miR-521、miR-522、miR-523、miR-524、miR-524*、miR-525、miR-525*、miR-526a、miR-526b、miR-526b*、miR-526c、miR-527、miR-532、miR-542-3p、miR-542-5p、miR-544、miR-545、miR-548a、miR-548b、miR-548c、miR-548d、miR-549、miR-550、miR-551a、miR-552、miR-553、miR-554、miR-555、miR-556、miR-557、miR-558、miR-559、miR-560、miR-561、miR-562、miR-563、miR-564、miR-565、miR-566、miR-567、miR-568、miR-569、miR-570、miR-571、miR-572、miR-573、miR-574、miR-575、miR-576、miR-577、miR-578、miR-579、miR-580、miR-581、miR-582、miR-583、miR-584、miR-585、miR-586、miR-587、miR-588、miR-589、miR-590、miR-591、miR-592、miR-593、miR-594、miR-595、miR-596、miR-597、miR-598、miR-599、miR-600、miR-601、miR-602、miR-603、miR-604、miR-605、miR-606、miR-607、miR-608、miR-609、miR-610、miR-611、miR-612、miR-613、miR-614、miR-615、miR-616、miR-617、miR-618、miR-619、miR-620、miR-621、miR-622、miR-623、miR-624、miR-625、miR-626、miR-627、miR-628、miR-629、miR-630、miR-631、miR-632、miR-633、miR-634、miR-635、miR-636、miR-637、miR-638、miR-639、miR-640、miR-641、miR-642、miR-643、miR-644、miR-645、miR-646、miR-647、miR-648、miR-649、miR-650、miR-651、miR-652、miR-653、miR-654、miR-655、miR-656、miR-657、miR-658、miR-659、miR-660、miR-661、miR-662、miR-663、miR-7、miR-9、miR-9*、miR-92、miR-93、miR-95、miR-96、miR-98、miR-99a、miR-99b及其任意组合。

19.根据权利要求3所述的方法，其中所述基于芯片的微流体系统包括：

微流体芯片，所述微流体芯片包括：

至少3个通道；

至少3个储存器；以及

样品储存器，

其中所述通道与所述至少3个储存器和样品储存器流体连接；

第一珠试剂，所述第一珠试剂包含磁珠和与抗原或外泌体相互作用的抗体；以及

第二珠试剂，所述第二珠试剂包含带阳离子电荷的珠。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述抗体是抗CD63抗体。

21.根据权利要求19所述的方法，其中所述方法包括：

(i)向所述样品储存器添加血清；

(a)向所述样品储存器添加所述第一珠试剂；向所述样品储存器施加磁场并用所述磁场将所述第一珠试剂移动通过所述至少3个通道中的第一通道至所述至少3个储存器中的第一储存器；在所述第一储存器中破裂外泌体；移除所述第一珠试剂；向所述第一储存器添加第二珠试剂；

(b)向所述样品储存器添加GuHCl、KCl和洗涤剂以使RNA与蛋白质解离；向所述样品储存器添加所述第二珠试剂以结合RNA；将所述第二珠试剂移动通过所述至少3个通道中的第二通道至所述至少3个储存器中的第二储存器；以及

(c)向所述样品储存器添加硫氰酸胍、洗涤剂和乙醇以使RNA与脂蛋白解离；向所述样品储存器添加所述第二珠试剂以结合RNA；将所述第二珠试剂移动通过所述至少3个通道中的第三通道至所述至少3个储存器中的第三储存器；

(ii)从所述第一储存器、第二储存器和第三储存器的每一个中提取RNA。

22.根据权利要求19所述的方法，其进一步包括能够破坏蛋白质-RNA相互作用或脂蛋白复合物的试剂。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述试剂是表面活性剂、有机溶剂、离液盐的混合物。

24.一种用于诊断受试者是否患有病症的方法，其包括：

在健康受试者和患有所述病症的受试者之间比较通过使用权利要求1所述的方法获得的循环RNA的分布，其中差异鉴定疾病或病症的风险。

25.一种用于进行权利要求1所述的任一种方法的试剂盒，其中所述试剂盒被隔室化以包含用于进行所述方法的试剂和装置。

26.根据权利要求25所述的试剂盒，其包含微流体装置、第一珠试剂、第二珠试剂以及能够破坏蛋白质-RNA相互作用或能够破坏脂蛋白复合物的试剂。