CN101386848A - 细胞微粒子所载微小核糖核酸及其制备研究方法和应用 - Google Patents

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曾科
张辰宇
李丽民
张峻峰
陈熹
刘丹青
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Abstract

细胞微粒子(Microparticle，MP)所载微小核糖核酸(microRNA，miRNA)及其制备方法和应用属于生物技术制药技术领域。本发明提供一种用于评价受试者生理和/或病理状态的微小核糖核酸的组合，所述组合包含受试者血清/血浆微粒子中稳定存在且可检测的全部微小核糖核酸。同时提供一种制备含有特定微小核糖核酸的细胞微粒子并利用该类微粒子对其他细胞及组织进行基因水平调控及修饰的实验方法。所述组合、方法能够用于各类疾病的检测及治疗，包括各种肿瘤、各种急慢性传染病和其它急慢性疾病的诊断与鉴别诊断、疾病并发症的发生和恶性疾病复发的预测、疗效评价，以及药物活性成分的筛选、药效评价以及司法鉴定和违禁药品检测等方面，具有检出谱系广、灵敏度高、检测成本低、取材方便、样本易存放等优点。

Description

细胞微粒子所载微小核糖核酸及其制备研究方法和应用
一技术领域
本发明属于生物技术制药技术领域，具体涉及细胞微粒子所载微小核糖核酸的制备方法及其在疾病治疗方面的应用。
二背景技术
微小核糖核酸，英文名为microRNA，是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链小核糖核酸分子。它们在进化上高度保守，并与动物的许多正常生理活动，如生物个体发育、组织分化、细胞凋亡以及能量代谢等密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。最近的研究发现慢性淋巴细胞性白血病以及Burkitt淋巴瘤中的几种微小核糖核酸的表达水平均有不同程度的下调；分析比较人肺癌、乳腺癌组织中的微小核糖核酸表达时，发现有若干组织特异性微小核糖核酸的表达水平相对于正常组织发生了变化。也有研究证明微小核糖核酸影响了心肌肥厚、心衰、动脉粥样硬化等心血管疾病的发生和发展，并且与II型糖尿病等代谢性疾病有密切关联。这些实验结果提示微小核糖核酸表达及特异性变化与疾病发生和发展之间存在着必然联系。
由于微小核糖核酸在基因转录后的表达调控中起着超乎想象的重要作用，因此它与疾病存在以下的关联性：首先，微小核糖核酸的变化可能是疾病的结果，这是因为当疾病(如癌症)发生时，会导致染色体片段的丢失、基因的突变或者染色体片段的剧烈扩增，若微小核糖核酸正好位于这一变化区段内，那么其表达量将发生极其显著的变化。其次，微小核糖核酸的变化也可能是病因，这是因为疾病的抑制因子以及促进因子都可能是微小核糖核酸的靶位点，当微小核糖核酸本身先发生了紊乱表达，比如本来抑制疾病促进因子的微小核糖核酸表达量降低了，或者抑制疾病抑制因子的微小核糖核酸表达量升高了，其最终结果都会导致下游一系列基因表达的变化以及某些通路的整体紊乱，进而诱发疾病发生。因此，理论上微小核糖核酸分子不仅可以作为一类新的疾病标志物，它的特异性变化必然与疾病产生发展相关联。同时微小核糖核酸还可以作为潜在的药物作用靶点，通过抑制疾病过程中上调的微小核糖核酸和过表达下调的微小核糖核酸，将有可能极大地缓解疾病的发生和发展。
微小核糖核酸作为潜在的药物手段，目前还存在一些未解决的问题。除微小核糖核酸的靶基因不清楚外，递送微小核糖核酸的特异性差及效率低是防碍其应用的主要原因。本发明人在以微小核糖核酸作为疾病标志物的相关领域的研究中已发现人体血清及血浆中存在稳定的微小核糖核酸，而且这种微小核糖核酸和人体的病生理状况，包括恶性肿瘤的发生，免疫缺陷，以及炎症的形成等有密切关系。基于对血清中微小核糖核酸的系统研究，我们首次提出血清中微小核糖核酸作为全新的疾病检测指针(该发明已申请了专利)。进一步研究血清中微小核糖核酸的来源，我们发现大部分的血清微小核糖核酸来自于血清中的细胞微粒子(microparticles)。这些细胞微粒子大小不一，分布在10-100纳米范围(见图1)。值得注意的是血清中的细胞微粒子并不仅仅来自血细胞，而是包括人体其它组织的细胞，如血管内皮细胞以及肺，肝等组织。原则上不同的细胞释放不同的膜微粒子，而微粒子的膜表成分(包括特异性表面受体及膜脂结构)与对应细胞的质膜成分相同，而且所包载的微小核糖核酸种类也和对应细胞的微小核糖核酸相同。由于血清中的细胞膜微粒子来自人体不同的细胞(不仅是血细胞)且包含和特定细胞/组织相关的微小核糖核酸，检测血清中细胞膜微粒子内微小核糖核酸的变化就可以得到整个机体的病变情况；更重要的是细胞微粒子带有源头细胞表面特有的受体蛋白或膜脂结构，与对应的靶细胞有高亲和性，因而可以选择性地递送微小核糖核酸到靶细胞/组织，从而大大提高微小核糖核酸调控细胞功能的作用。在病理状况下，肿瘤细胞和外侵病源体可分泌或诱导细胞分泌微粒子，这些微粒子包载特异微小核糖核酸，并专一结合免疫细胞，将微小核糖核酸传递给免疫细胞从而沉默免疫细胞功能，从而使肿瘤及病源体免受攻击。显然，由于细胞微粒子(或类似微粒子的膜脂囊泡结构)本身具有和特定组织及细胞结合的特异性，其所载微小核糖核酸也呈现较强的靶向性、稳定性及高效率，它在疾病的诊断及治疗方面有重大应用前景。
三发明内容
目前，对疾病的诊断仅仅局限于血清/血浆中的各种生化指标，还没有关于血清/血浆微小核糖核酸的任何报道，更没有关于细胞微粒子(或类似微粒子的膜脂囊泡结构)所载微小核糖核酸的用途的任何报道。
基于细胞微粒子载有微小核糖核酸这一发现，本发明人将研究目光锁定在细胞微粒子(或类似微粒子的膜脂囊泡结构)所载微小核糖核酸的靶向性、稳定性及高效率以及它在疾病的治疗方面的重大应用前景。
本发明人通过分离和研究细胞微粒子所载微小核糖核酸，寻找一类可用于疾病治疗的靶向高效率的微小核糖核酸包载体。我们采用了两种试验手段：一是直接分离天然包含有微小核糖核酸的细胞微粒子，它们存在于血清，血浆以及所有细胞培养液中。二是特异性诱导不同细胞产生包含有不同微小核糖核酸的细胞微粒子。同时由于微小核糖核酸分子是一类新型疾病标志物，因此希望通过对血清/血浆微小核糖核酸是否存在，能否被检测及其与疾病的相关性的研究，建立一种利用血清/血浆中稳定存在的微小核糖核酸及其特异性变化来进行各种疾病的早期诊断，疾病鉴定和病程监控，恶性疾病复发及预后、并发症发生的预测，药效判定，用药指南，个体化治疗，中药有效成份筛选，种群分类等研究的新技术。
本发明需要解决的问题包括：(1)分析鉴定人及小鼠，大鼠等各种动物中血清/血浆中细胞微粒子所包含的微小核糖核酸分子分布及特异性；(2)研究各种临床疾病(包括各种肿瘤；各种急慢性传染病，如病毒性疾病：病毒性流感、病毒性肝炎、艾滋病、SARS等，细菌性疾病：结核、细菌性肺炎等，以及其它各种病原微生物导致的急慢性传染病；其它急慢性疾病，如呼吸系统疾病，免疫系统疾病，血液与造血系统疾病，例如心脑血管疾病的循环系统疾病，内分泌代谢系统疾病，消化系统疾病，神经系统疾病，泌尿系统疾病，生殖系统疾病和运动系统疾病)的发病过程中血清/血浆细胞微粒子种类及其所包含微小核糖核酸的特异性变化；(3)将筛选到的在疾病及正常生理状态下差异表达程度大的一类血清/血浆微小核糖核酸分子用于血清/血浆微小核糖核酸检测技术的研制，来制备应用于疾病诊断等领域的生物芯片和诊断试剂盒。(4)在体外制备载有特异微小核糖核酸的细胞微粒子，然后将其导入体内，利用细胞微粒子的稳定性及靶向能力将特定的微小核糖核酸传递到特定细胞/组织，从而达到组织功能改善或疾病治疗的效果。
本发明提供一种具有较高靶向性、稳定性及高效率并在疾病的诊断和治疗方面具有重大应用前景的微小核糖核酸：细胞微粒子(或类似微粒子的膜脂囊泡结构)所载微小核糖核酸。该类微小核糖核酸包含受试者血清/血浆中全部细胞微粒子所载的微小核糖核酸以及体外培养细胞和组织分泌的细胞微粒子载的微小核糖核酸。其研究的技术方案主要包括以下几个部分：
1.细胞微粒子的制备
血清/血浆及细胞培养液中细胞微粒子的分离主要是三种方法：
(1)分级离心法。先将血清/血浆或细胞培养液(3000转/分钟)离心30分钟除去各类细胞及碎片，然后将上清超速离心(80000转/分钟)4小时，取沉淀便是血清/血浆总的细胞微粒子；
(2)免疫吸附法。将细胞特异性的抗体吸附在组织培养皿上或直接用免疫磁珠，将除去各类细胞及碎片后的血清/血浆或细胞培养液直接和培养皿或免疫磁珠温育(30分钟或1小时)，不同细胞的细胞微粒子可直接被吸附和回收；
(3)过滤法。将除去各类细胞及碎片后的血清/血浆或细胞培养液直接放在带有100kD滤膜的浓缩离心管，在4000转/分钟进行离心，细胞微粒子将留在离心管内被浓缩获得。
2.本发明还提供一种评价受试者的生理和/或病理状态的方法，该方法包括测定受试者血清/血浆中稳定存在且可检测的各类细胞微粒子所载有的微小核糖核酸。在上述组合或方法中，所述受试者血清/血浆中各类细胞微粒子及所载有的全部微小核糖核酸可以为人血清/血浆中的全部成熟体微小核糖核酸，具体包括中性粒细胞微粒子、单核白细胞微粒子、血小板微粒子、淋巴细胞微粒子、红细胞微粒子以及血管内皮细胞微粒子等，微小核糖核酸包括let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、let-7i、miR-1、miR-100、miR-101、miR-103、miR-105、miR-106a、miR-106b、miR-107、miR-10a、miR-10b、miR-122a、miR-124a、miR-125a、miR-125b、miR-126、miR-126*、miR-127、miR-128a、miR-128b、miR-129、miR-130a、miR-130b、miR-132、miR-133a、miR-133b、miR-134、miR-135a、miR-135b、miR-136、miR-137、miR-138、miR-139、miR-140、miR-141、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-143、miR-144、miR-145、miR-146a、miR-146b、miR-147、miR-148a、miR-148b、miR-149、miR-150、miR-151、miR-152、miR-153、miR-154、miR-154*、miR-155、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-17-3p、miR-17-5p、miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d、miR-182、miR-182*、miR-183、miR-184、miR-185、miR-186、miR-187、miR-188、miR-189、miR-18a、miR-18a*、miR-18b、miR-190、miR-191、miR-191*、miR-192、miR-193a、miR-193b、miR-194、miR-195、miR-196a、miR-196b、miR-197、miR-198、miR-199a、miR-199a*、miR-199b、miR-19a、miR-19b、miR-200a、miR-200a*、miR-200b、miR-200c、miR-202、miR-202*、miR-203、miR-204、miR-205、miR-206、miR-208、miR-20a、miR-20b、miR-21、miR-210、miR-211、miR-212、miR-213、miR-214、miR-215、miR-216、miR-217、miR-218、miR-219、miR-22、miR-220、miR-221、miR-222、miR-223、miR-224、miR-23a、miR-23b、miR-24、miR-25、miR-26a、miR-26b、miR-27a、miR-27b、miR-28、miR-296、miR-299-3p、miR-299-5p、miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-301、miR-302a、miR-302a*、miR-302b、miR-302b*、miR-302c、miR-302c*、miR-302d、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30b、miR-30c、miR-30d、miR-30e-3p、miR-30e-5p、miR-31、miR-32、miR-320、miR-323、miR-324-3p、miR-324-5p、miR-325、miR-326、miR-328、miR-329、miR-33、miR-330、miR-331、miR-335、miR-337、miR-338、miR-339、miR-33b、miR-340、miR-342、miR-345、miR-346、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-361、miR-362、miR-363、miR-363*、miR-365、miR-367、miR-368、miR-369-3p、miR-369-5p、miR-370、miR-371、miR-372、miR-373、miR-373*、miR-374、miR-375、miR-376a、miR-376a*、miR-376b、miR-377、miR-378、miR-379、miR-380-3p、miR-380-5p、miR-381、miR-382、miR-383、miR-384、miR-409-3p、miR-409-5p、miR-410、miR-411、miR-412、miR-421、miR-422a、miR-422b、miR-423、miR-424、miR-425、miR-425-5p、miR-429、miR-431、miR-432、miR-432*、miR-433、miR-448、miR-449、miR-450、miR-451、miR-452、miR-452*、miR-453、miR-455、miR-483、miR-484、miR-485-3p、miR-485-5p、miR-486、miR-487a、miR-487b、miR-488、miR-489、miR-490、miR-491、miR-492、miR-493、miR-493-3p、miR-494、miR-495、miR-496、miR-497、miR-498、miR-499、miR-500、miR-501、miR-502、miR-503、miR-504、miR-505、miR-506、miR-507、miR-508、miR-509、miR-510、miR-511、miR-512-3p、miR-512-5p、miR-513、miR-514、miR-515-3p、miR-515-5p、miR-516-3p、miR-516-5p、miR-517*、miR-517a、miR-517b、miR-517c、miR-518a、miR-518a-2*、miR-518b、miR-518c、miR-518c*、miR-518d、miR-518e、miR-518f、miR-518f*、miR-519a、miR-519b、miR-519c、miR-519d、miR-519e、miR-519e*、miR-520a、miR-520a*、miR-520b、miR-520c、miR-520d、miR-520d*、miR-520e、miR-520f、miR-520g、miR-520h、miR-521、miR-522、miR-523、miR-524、miR-524*、miR-525、miR-525*、miR-526a、miR-526b、miR-526b*、miR-526c、miR-527、miR-532、miR-542-3p、miR-542-5p、miR-544、miR-545、miR-548a、miR-548b、miR-548c、miR-548d、miR-549、miR-550、miR-551a、miR-552、miR-553、miR-554、miR-555、miR-556、miR-557、miR-558、miR-559、miR-560、miR-561、miR-562、miR-563、miR-564、miR-565、miR-566、miR-567、miR-568、miR-569、miR-570、miR-571、miR-572、miR-573、miR-574、miR-575、miR-576、miR-577、miR-578、miR-579、miR-580、miR-581、miR-582、miR-583、miR-584、miR-585、miR-586、miR-587、miR-588、miR-589、miR-590、miR-591、miR-592、miR-593、miR-594、miR-595、miR-596、miR-597、miR-598、miR-599、miR-600、miR-601、miR-602、miR-603、miR-604、miR-605、miR-606、miR-607、miR-608、miR-609、miR-610、miR-611、miR-612、miR-613、miR-614、miR-615、miR-616、miR-617、miR-618、miR-619、miR-620、miR-621、miR-622、miR-623、miR-624、miR-625、miR-626、miR-627、miR-628、miR-629、miR-630、miR-631、miR-632、miR-633、miR-634、miR-635、miR-636、miR-637、miR-638、miR-639、miR-640、miR-641、miR-642、miR-643、miR-644、miR-645、miR-646、miR-647、miR-648、miR-649、miR-650、miR-651、miR-652、miR-653、miR-654、miR-655、miR-656、miR-657、miR-658、miR-659、miR-660、miR-661、miR-662、miR-663、miR-7、miR-9、miR-9*、miR-92、miR-93、miR-95、miR-96、miR-98、miR-99a和miR-99b。微小核糖核酸的数量包括随研究的进展而新增加的微小核糖核酸。
上述测定受试者血清/血浆中各细胞微粒子所载的全部微小核糖核酸的方法选自：RT-PCR方法、Real-time PCR方法、Northern blotting方法、RNaseprotection assay、Solexa sequencing technology以及生物芯片方法中的一种或几种。
其中所述RT-PCR方法包括以下步骤：
(1)通过分级离心以及免疫磁珠技术分别分离血清/血浆以及细胞培养液中总的细胞微粒子和各类特定细胞微粒子，然后提取受试者血清/血浆中总的细胞微粒子和各类细胞微粒子的RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；
(2)用微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；
(3)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；
(4)EB染色后在紫外灯下观察结果。
所述Real-time PCR方法包括以下步骤：
(1)通过分级离心以及免疫磁珠技术分别分离血清/血浆中总的细胞微粒子和各类细胞微粒子，然后以血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；
(2)用微小核糖核酸设计引物；
(3)加入荧光探针进行PCR反应；
(4)检测并比较血清/血浆样本相对于正常血清/血浆中细胞微粒子所载微小核糖核酸的量的变化。
3.本发明还提供一种用于评价受试者的生理或病理状态的试剂盒，该试剂盒包含测定受试者血清/血浆中稳定存在且可检测的全部微小核糖核酸的工具。所述试剂盒可以包含人血清/血浆中的全部成熟体微小核糖核酸的引物，具体包括let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、let-7i、miR-1、miR-100、miR-101、miR-103、miR-105、miR-106a、miR-106b、miR-107、miR-10a、miR-10b、miR-122a、miR-124a、miR-125a、miR-125b、miR-126、miR-126*、miR-127、miR-128a、miR-128b、miR-129、miR-130a、miR-130b、miR-132、miR-133a、miR-133b、miR-134、miR-135a、miR-135b、miR-136、miR-137、miR-138、miR-139、miR-140、miR-141、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-143、miR-144、miR-145、miR-146a、miR-146b、miR-147、miR-148a、miR-148b、miR-149、miR-150、miR-151、miR-152、miR-153、miR-154、miR-154*、miR-155、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-17-3p、miR-17-5p、miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d、miR-182、miR-182*、miR-183、miR-184、miR-185、miR-186、miR-187、miR-188、miR-189、miR-18a、miR-18a*、miR-18b、miR-190、miR-191、miR-191*、miR-192、miR-193a、miR-193b、miR-194、miR-195、miR-196a、miR-196b、miR-197、miR-198、miR-199a、miR-199a*、miR-199b、miR-19a、miR-19b、miR-200a、miR-200a*、miR-200b、miR-200c、miR-202、miR-202*、miR-203、miR-204、miR-205、miR-206、miR-208、miR-20a、miR-20b、miR-21、miR-210、miR-211、miR-212、miR-213、miR-214、miR-215、miR-216、miR-217、miR-218、miR-219、miR-22、miR-220、miR-221、miR-222、miR-223、miR-224、miR-23a、miR-23b、miR-24、miR-25、miR-26a、miR-26b、miR-27a、miR-27b、miR-28、miR-296、miR-299-3p、miR-299-5p、miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-301、miR-302a、miR-302a*、miR-302b、miR-302b*、miR-302c、miR-302c*、miR-302d、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30b、miR-30c、miR-30d、miR-30e-3p、miR-30e-5p、miR-31、miR-32、miR-320、miR-323、miR-324-3p、miR-324-5p、miR-325、miR-326、miR-328、miR-329、miR-33、miR-330、miR-331、miR-335、miR-337、miR-338、miR-339、miR-33b、miR-340、miR-342、miR-345、miR-346、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-361、miR-362、miR-363、miR-363*、miR-365、miR-367、miR-368、miR-369-3p、miR-369-5p、miR-370、miR-371、miR-372、miR-373、miR-373*、miR-374、miR-375、miR-376a、miR-376a*、miR-376b、miR-377、miR-378、miR-379、miR-380-3p、miR-380-5p、miR-381、miR-382、miR-383、miR-384、miR-409-3p、miR-409-5p、miR-410、miR-411、miR-412、miR-421、miR-422a、miR-422b、miR-423、miR-424、miR-425、miR-425-5p、miR-429、miR-431、miR-432、miR-432*、miR-433、miR-448、miR-449、miR-450、miR-451、miR-452、miR-452*、miR-453、miR-455、miR-483、miR-484、miR-485-3p、miR-485-5p、miR-486、miR-487a、miR-487b、miR-488、miR-489、miR-490、miR-491、miR-492、miR-493、miR-493-3p、miR-494、miR-495、miR-496、miR-497、miR-498、miR-499、miR-500、miR-501、miR-502、miR-503、miR-504、miR-505、miR-506、miR-507、miR-508、miR-509、miR-510、miR-511、miR-512-3p、miR-512-5p、miR-513、miR-514、miR-515-3p、miR-515-5p、miR-516-3p、miR-516-5p、miR-517*、miR-517a、miR-517b、miR-517c、miR-518a、miR-518a-2*、miR-518b、miR-518c、miR-518c*、miR-518d、miR-518e、miR-518f、miR-518f*、miR-519a、miR-519b、miR-519c、miR-519d、miR-519e、miR-519e*、miR-520a、miR-520a*、miR-520b、miR-520c、miR-520d、miR-520d*、miR-520e、miR-520f、miR-520g、miR-520h、miR-521、miR-522、miR-523、miR-524、miR-524*、miR-525、miR-525*、miR-526a、miR-526b、miR-526b*、miR-526c、miR-527、miR-532、miR-542-3p、miR-542-5p、miR-544、miR-545、miR-548a、miR-548b、miR-548c、miR-548d、miR-549、miR-550、miR-551a、miR-552、miR-553、miR-554、miR-555、miR-556、miR-557、miR-558、miR-559、miR-560、miR-561、miR-562、miR-563、miR-564、miR-565、miR-566、miR-567、miR-568、miR-569、miR-570、miR-571、miR-572、miR-573、miR-574、miR-575、miR-576、miR-577、miR-578、miR-579、miR-580、miR-581、miR-582、miR-583、miR-584、miR-585、miR-586、miR-587、miR-588、miR-589、miR-590、miR-591、miR-592、miR-593、miR-594、miR-595、miR-596、miR-597、miR-598、miR-599、miR-600、miR-601、miR-602、miR-603、miR-604、miR-605、miR-606、miR-607、miR-608、miR-609、miR-610、miR-611、miR-612、miR-613、miR-614、miR-615、miR-616、miR-617、miR-618、miR-619、miR-620、miR-621、miR-622、miR-623、miR-624、miR-625、miR-626、miR-627、miR-628、miR-629、miR-630、miR-631、miR-632、miR-633、miR-634、miR-635、miR-636、miR-637、miR-638、miR-639、miR-640、miR-641、miR-642、miR-643、miR-644、miR-645、miR-646、miR-647、miR-648、miR-649、miR-650、miR-651、miR-652、miR-653、miR-654、miR-655、miR-656、miR-657、miR-658、miR-659、miR-660、miR-661、miR-662、miR-663、miR-7、miR-9、miR-9*、miR-92、miR-93、miR-95、miR-96、miR-98、miR-99a和miR-99b的引物。
由于通过血液及血浆样品中各细胞微粒子所载微小核糖核酸的测定和与正常样品比较，可迅速得知哪些微小核糖核酸发生变化，尤其是产生变化的微小核糖核酸来源于哪些特定组织及细胞。具体而言，在上述组合和方法中，所述评价受试者的生理和/或病理状态为测定受试者给予待测物后的生理和/或病理状态，具体用于筛选待测物的预防和/或治疗疾病的活性；所述评价受试者的生理和/或病理状态为诊断和/或鉴别诊断受试者的疾病；所述评价受试者的生理和/或病理状态为评价对受试者的疾病进行治疗的有效性；所述评价受试者的生理和/或病理状态为对受试者发生疾病进行预测，所述发生疾病具体为疾病并发症的发生和/或恶性疾病的复发；上述组合、方法还可用于检测受试者服用违禁药品的情况。
上述疾病包括各种肿瘤；各种急慢性传染病，例如病毒性流感、病毒性肝炎、艾滋病、SARS的病毒性疾病，例如结核、细菌性肺炎的细菌性疾病，以及其它各种病原微生物导致的急慢性传染病；其它急慢性疾病，例如呼吸系统疾病，免疫系统疾病，血液与造血系统疾病，如心脑血管疾病的循环系统疾病，内分泌系统代谢性疾病，消化系统疾病，神经系统疾病，泌尿系统疾病，生殖系统疾病和运动系统疾病。
4.本发明通过RT-PCR、Real-time PCR、Northern blotting、RNaseprotection assay、Solexa sequencing technology等方法分析并鉴定人及小鼠、大鼠等各种动物血清/血浆中的细胞微粒子包载微小核糖核酸分子。通过比较在不同疾病状况下细胞微粒子种类及其包载微小核糖核酸分子的变化，发现疾病发生及发展的分子机制和特异性标志物(分子探针)。通过研究在体外诱导不同细胞微粒子的产生及和靶向细胞相互作用的机制，进一步验证细胞微粒子及其包载微小核糖核酸分子在调节细胞间信号传导，组织生长发育，疾病诊断和治疗等方面的应用价值。
具体的血清/血浆以及细胞培养液中细胞微粒子所载的微小核糖核酸的制备及分析如下：
RT-PCR方法：收集血清/血浆以及细胞培养液，将血清/血浆以及细胞培养液进行逆转录反应制备cDNA样品或使用Trizol试剂提取血清/血浆及细胞培养液微粒子总RNA再进行逆转录反应制备cDNA样品；通过成熟体微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；EB染色后在紫外灯下观察结果并拍照。
Real-time PCR方法：收集血清/血浆以及细胞培养液，将血清/血浆以及细胞培养液进行逆转录反应制备cDNA样品或使用Trizol试剂提取血清/血浆及细胞液微粒子总RNA再进行逆转录反应制备cDNA样品；通过成熟体微小核糖核酸设计PCR的引物并加入荧光探针EVA GREEN进行PCR反应；分析处理数据并比较结果。
Northern blotting方法：收集血清/血浆以及细胞培养液；通过Trizol试剂提取血清/血浆及细胞液微粒子总RNA；进行变性PAGE电泳和膜转移实验；制备同位素标记微小核糖核酸探针；进行膜杂交反应；同位素信号检测如磷屏扫描检测结果。
Solexa sequencing technology：收集血清/血浆以及细胞培养液；通过Trizol试剂提取血清/血浆及细胞液微粒子总RNA；进行PAGE电泳回收17-27nt RNA分子；将adaptor prime酶联在小RNA分子的3’与5’端；进行RT-PCR反应后并进行测序；数据分析与处理。
通过上述的RT-PCR，Real-time PCR，Northern blotting，RNaseprotection assay和Solexa sequencing technology等技术分析在不同疾病状况下血清/血浆中细胞微粒子所包含微小核糖核酸的变化趋势及变化量，以及它们与不同疾病的相关性。
本发明与现有疾病诊断及治疗技术相比具有显著的优越性，目前对疾病进行临床诊断的传统生物化学及分子生物学技术还比较繁琐和粗糙。近年来发展起来的有可能用于疾病诊断的新型技术有基因芯片和蛋白质(抗体)芯片技术等。基因芯片所测量的mRNA水平变化并不能完全反映真正的蛋白质水平的改变。因为蛋白质的生物活性与转录后修饰如糖基化，磷酸化等密切相关。并且，对于许多疾病检测而言，基因芯片技术无法检测体液和血液中标志物分子。蛋白质(抗体)芯片技术和蛋白质组学技术也有其局限性。人体内特别是血清/血浆中含有数以万计的蛋白和多肽片断，它们浓度分布广，明确报道的蛋白很少，定量化的就更少了。在这数量庞大的蛋白质组中找寻与特定疾病有密切关联的蛋白质，并理解其在组织病变中的作用仍然是一项极其艰巨的工作，而且，缺乏完善的抗体资源将会是制约抗体芯片技术发展的一个瓶颈问题。而血清/血浆中细胞微粒子所包含微小核糖核酸的检测技术，可以高通量地分析各种病人血清/血浆中微小核糖核酸的组成，临床适用性极强。由于器官组织的生理状态变化会引起血清/血浆中细胞微粒子及其所包含微小核糖核酸组成的改变，因此血清/血浆中细胞微粒子及其所包含微小核糖核酸可以作为“疾病指纹”，实现疾病的早期诊断。细胞微粒子包载微小核糖核酸用于疾病诊断及治疗的优越性包括：
(1)血清/血浆中细胞微粒子及其所包含微小核糖核酸作为新型的疾病标志物，具有检出谱系广、灵敏度高、检测成本低、取材方便、样本易存放(血清/血浆-20℃存放即可)等优点，该方法可广泛用于疾病普查等相关工作，成为早期诊断疾病的有效手段。而且因为细胞微粒子有宿主细胞的特征，细胞微粒子种类及其所包含微小核糖核酸的变化可以直接确认病源细胞。
(2)血清/血浆中细胞微粒子及其所包含微小核糖核酸作为新的疾病标记物将改进单一的标记物所难以克服的个体差异所带来的低特异性和低灵敏度，显著提高疾病的临床检出率和实现疾病的早期诊疗。血清/血浆中细胞微粒子及其所包含微小核糖核酸检测技术的优势在于其检测的是一系列疾病相关标记物，因而能够克服病人个体之间的差异(即年龄、性别、种族、饮食和环境等)，而这正是单一疾病标记物所无法逾越的一个主要问题。
(3)细胞微粒子及其所包含微小核糖核酸可被选择性地诱导产生。作为一种全新的稳定，高特异的微小核糖核酸传递工具，可有效地将特定微小核糖核酸导入靶细胞机组织，从而改善细胞状况和治疗疾病。
总之，使用血清/血浆细胞微粒子及其所包含微小核糖核酸检测技术可以早期确诊组织病变，这种新的血清/血浆疾病标记物不仅为人们在分子水平上全面了解组织病变的机理提供了物质基础，也加速了临床疾病诊断学和治疗学的进步。
四附图说明
图1显示正常人血清中直接分离到的部分细胞微粒子的透射电镜(A)及扫描电镜(B)观察结果。如图所示，从正常人血清/血浆中分离到的细胞微粒子大小不一，分布在10-100nm范围。
图2显示分离正常人血清中细胞膜微粒子并检测其中微小核糖核酸的RT-PCR结果。图2中的7个代号分别代表血细胞特异性的微小核糖核酸miR-21(21)、miR-150(150)、miR-181a(181a)、miR-142-3p(142-3p)、miR-142-5p(142-5p)、miR-223(223)和miR-205(205)。
图3显示受毒素及炎症因子(包括志贺毒素2，STX-2，和脂多糖LPS)刺激的血浆中细胞微粒子微小核糖核酸相对于正常人血清中微小核糖核酸的变化量。很显然，受毒素及免疫因子的影响，血浆中细胞微粒子以及所载的微小核糖核酸的数量及种类都有显著变化。
图4A和图4B分别显示培养的人体THP-1单核白细胞在炎症因子(糖基化终产物AGEs)刺激下的细胞微粒子所包含微小核糖核酸相对于细胞核细胞培养液超滤上清所包含的微小核糖核酸的比率。U6是分子量为100bp的snRNA，作为细胞核细胞微粒子微小核糖核酸实验的内参照分子。由于细胞培养液超滤上清中的绝大多数微小核糖核酸的量高于U6的含量，所以U6不作为细胞培养液超滤上清中微小核糖核酸实验的内参照分子。
图5显示THP-1单核白细胞细胞微粒子及所包含微小核糖核酸与毛细血管内皮细胞的特异相互作用。THP-1细胞分泌的微粒子标记为红色，毛细血管内皮细胞的细胞核染蓝色，图中可以发现THP-1细胞微粒子进入毛细血管内皮细胞，从而将THP-1细胞特有的微小核糖核酸导入毛细血管内皮细胞。这些外源的微小核糖核酸将会对毛细血管内皮细胞在诸多蛋白翻译水平进行调控，改变细胞受损修复以及凋亡等状况。
五具体实施方式
实施例1 血清/血浆中细胞微粒子的分离及观测
血清/血浆中细胞微粒子的分离主要是三种方法：
1)分级离心法。先将血清/血浆(3000转/分钟)离心30分钟除去各类细胞及碎片，然后将上清超速离心(80000转/分钟)4小时，取沉淀便是血清/血浆总的细胞微粒子；
2)免疫吸附法。将血细胞特异性的抗体吸附在组织培养皿上或直接用免疫磁珠，将除去各类细胞及碎片后的血清/血浆直接和培养皿或免疫磁珠温育(30分钟或1小时)，不同细胞的细胞微粒子可直接被吸附和回收；
3)过滤法。将除去各类细胞及碎片后的血清/血浆直接放在带有100kD滤膜的浓缩离心管，在4000转/分钟进行离心，细胞微粒子将留在离心管内被浓缩获得。
细胞微粒子将在透射电镜及扫描电镜下观察，细胞微粒子电镜标本的制备参照常规电镜标本的制备方法。
实施例2 血清/血浆中细胞微粒子所载微小核糖核酸的RT-PCR实验
使用RT-PCR技术发现并证明人血清/血浆中的各种微小核糖核酸很大部分来自细胞微粒子，而且其表达量相当丰富。具体步骤为：
(1)收集正常人及某些病人的血清/血浆；
(2)分离血清/血浆中细胞微粒子。该操作有两种方案，一种方案为将血清/血浆超高速离心(120000g，3小时)，然后取微粒子沉淀。另一种为使用免疫沉淀的方法，将针对细胞微粒子表面特异受体的抗体或配体固定在特定颗粒上，然后和包含微粒子的溶液或血清/血浆进行温育从而将各类微粒子吸附出来。
(3)分离制备cDNA样品。该操作有两种方案，一种方案为将细胞微粒子加入0.1％-0.2％的Triton X-100裂解，裂解后的细胞微粒子和除掉微粒子后的血清/血浆用酚和氯仿除蛋白后取10uL上清直接进行逆转录反应，另一种为使用Trizol试剂(Invitrogen公司)先提取细胞微粒子及除掉微粒子后的血清/血浆的总RNA，然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4μl5×AMV buffer、2μl 10mM each dNTP mixture(Takara公司)、0.5μl RNase Inhibitor(Takara公司)、2μl AMV(Takara公司)以及1.5μ1基因特异性反向引物混和物。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟；
(4)PCR及电泳观察。将cDNA按1/50稀释，取1μl稀释后的cDNA，加入0.3μl Taq酶(Takara公司)，0.2μl 10μM正向引物，0.2μl 10μM通用反向引物，1.2μl 25mM MgCl2，1.6μl 2.5mM each dNTP mixture(Takara公司)，2μl 10×PCR buffer，13.5μl H2O，20μl体系进行PCR。PCR的反应条件是：95℃，5分钟进行1个循环→95℃，15秒；60℃，1分钟进行40个循环。PCR产物取10μl进行3％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后在紫外灯下观察。具体实验结果见图2。图2是以正常人血清为研究对象，从将血清中通过超高速离心分离总的细胞微粒子，然后直接进行RT-PCR的实验结果。选用人全部五百多个成熟体微小核糖核酸进行PCR反应，图2为其中的7种微小核糖核酸。它们分别是血细胞特异性的微小核糖核酸miR-21、miR-181a、miR-223、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-150、miR-205。并非全部成熟体微小核糖核酸在血清/血浆细胞微粒子中都有高丰度表达，有些微小核糖核酸是很微量的，甚至不能正常检测到。
实施例3 血清/血浆中细胞微粒子所载微小核糖核酸的real-time PCR实验
定量PCR将用于研究细胞及细胞微粒子所载微小核糖核酸。定量PCR实验原理及实验步骤同RT-PCR一样，唯一不同是在PCR的时候加入了荧光染料EVA GREEN。仪器使用的是ABI Prism 7500荧光定量PCR仪，反应条件为95℃，5分钟进行1个循环→95℃，15秒；60℃，1分钟进行40个循环。数据处理方法为ΔΔCT法，CT设为反应达到域值时的循环数，则每个微小核糖核酸相对于标准内参的表达量可以用方程2-ΔCT表示，其中ΔCT＝CT样品-CT内参。实验中采用U6作为内参。结果见下表：
 
miRNA/U6 SD
miR-1 0.002838 0.003747
miR-122a 0.004827 0.00623
miR-9 0.007028 0.00093
miR-150 0.020586 0.007485
miR-223 0.020851 0.002701
miR-142-3p 0.032292 0.005813
miR-142-5p 0.040251 0.002315
miR-181b 0.524247 0.053386
miR-181a 1.992414 0.252502
miR-let-7a 4.759529 1.647556
同时从上表可以得到另一个信息，就是微粒子中含有的微小核糖核酸(microRNA)是有偏好的，其含有的microRNA与分泌它的细胞有关，这里我们检测的是血液里的微粒子，与之对应的是我们发现这些微粒子中血细胞特有或者血细胞富集的微小核糖核酸含量高(其中miR-150、miR-223、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-181a、miR-181b是血细胞特有的微小核糖核酸；let-7a是血细胞富集的microRNA)，而其它组织特有或富集的microRNA的量就很少(miR-1是骨骼肌心肌特有的微小核糖核酸，miR-122a是肝组织特有的微小核糖核酸，miR-9是脑特有的微小核糖核酸)。
实施例4 用于疾病诊断与预测的微小核糖核酸试剂盒的制作
微小核糖核酸试剂盒的制作工艺和操作流程是基于定量和半定量PCR技术和生物芯片技术。
首先通过测序的方法或PCR方法确定正常血清/血浆中有一个以上拷贝的微小核糖核酸。然后通过定量PCR技术和生物芯片技术筛选在疾病及正常生理状态下表达量和差异程度大的一类血清/血浆微小核糖核酸，作为预测是否发生癌变或其它疾病以及诊断病变程度的指标。最后筛选出的对应每种疾病的血清/血浆微小核糖核酸的数量控制在十几至几十条，这是在芯片探针库的基础上做出的最优化的精简。此试剂盒包括一批血清/血浆微小核糖核酸引物，Taq酶、dNTP等试剂。此试剂盒的价值在于只需要血清/血浆而不需要其它组织样品，通过最精简的探针库检测微小核糖核酸的变化趋势，再通过该变化趋势预测疾病发生的可能性或诊断疾病的病理阶段。因此将此试剂盒投入实践，可以增加在早期发现病变的可能，帮助指导诊断和治疗。
实施例5 血清/血浆中细胞微粒子所载微小核糖核酸随炎症因子刺激而变化
在人全血(抗凝)中加入STEC 0157：H7细菌分泌物(包括志贺毒素2，STX-2，和脂多糖LPS)并37度温育30-45分种，细胞微粒子中microRNA的变化。从图中可看出，对全血进行处理后，微粒子中的microRNA多数是上升的(处理/未处理大于1)，比较明显的是miR-181a等；也有不变化的情况，如miR-150等。
实施例6 体外诱导细胞分泌特定的细胞微粒子及其所载微小核糖核酸。
在THP-1细胞培养中，加入糖基化终产物(AGEs)炎症诱导因子，在37度温育6小时后，收集培养液中细胞分泌的微粒子(MP)进行微粒子计数(用流式细胞仪)和微粒子微小核糖核酸的定量PCR监测，微粒子的收集有两种方案：一种方案为将细胞培养液超高速离心(120000g，3小时)，然后取微粒子沉淀。另一种为将细胞培养液用截留分子量为100kD的超滤离心管离心。微粒子和除掉微粒子的细胞培养液RNA的提取方法可以和细胞一样用Trizol试剂(Invitrogen公司)，也可以加入0.1％-0.2％的Triton X-100裂解微粒，裂解后的微粒子及除掉微粒子的细胞培养液用酚和氯仿除蛋白后取10uL上清用来逆转。研究发现细胞在炎症状况下分泌的微粒子增多，而且在炎症状态下微粒子所载微小核糖核酸miR-16、miR-20a、miR-100、miR-106a、miR-142-3p、miR-181a、miR-210、miR-221、miR-222的量多于细胞中的相应含量。另外，在炎症状态下，微粒子中所含核糖核酸miR-106a、miR-130a、miR-146a、miR-214、miR-424的量多于超滤上清中的相应含量，尤其是miR16(图中没有显示)，颗粒中是血清中的100倍，而miR-222在超滤上清中则很多，是微粒子中的481倍。
实施例7细胞微粒子和靶细胞的特异相互作用(细胞微粒子所载微小核糖核酸的在不相邻细胞间的靶向高效传递)
利用THP-1细胞分泌的微粒子进行荧光标记(红色)，然后将THP-1细胞分泌的微粒子和毛细血管内皮细胞(HMEC-1)37度温育6小时，发现THP-1细胞微粒子和毛细血管内皮细胞特异性相互作用，并进入毛细血管内皮细胞，从而将THP-1细胞特有的微小核糖核酸导入毛细血管内皮细胞。蓝色为毛细血管内皮细胞的细胞核染色。

Claims (8)

1.一种细胞微粒子所载微小核糖核酸，其特征是从细胞上脱落下来的，大小分布在10-100nm范围，膜表成分与相应的细胞质膜成分相同，含有微小核糖核酸且与对应细胞的微小核糖核酸相同，所述组合包含受试者血清/血浆细胞微粒子中稳定存在且可检测的全部微小核糖核酸。
2.根据权利要求1所述细胞微粒子所载微小核糖核酸的组合，其特征在于，血清/血浆细胞微粒子中稳定存在且可检测的微小核糖核酸为人血清/血浆细胞微粒子中的成熟体微小核糖核酸。
3.根据权利要求1所述的细胞微粒子所载微小核糖核酸，其特征在于，所述细胞微粒子包括所有体液及血液中分离的以及体外培养条件下经不同刺激产生的各类细胞微粒子。细胞微粒子所载的微小核糖核酸包括迄今发现的所有微小核糖核酸，具体包含let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、let-7i、miR-1、miR-100、miR-101、miR-103、miR-105、miR-106a、miR-106b、miR-107、miR-10a、miR-10b、miR-122a、miR-124a、miR-125a、miR-125b、miR-126、miR-126*、miR-127、miR-128a、miR-128b、miR-129、miR-130a、miR-130b、miR-132、miR-133a、miR-133b、miR-134、miR-135a、miR-135b、miR-136、miR-137、miR-138、miR-139、miR-140、miR-141、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-143、miR-144、miR-145、miR-146a、miR-146b、miR-147、miR-148a、miR-148b、miR-149、miR-150、miR-151、miR-152、miR-153、miR-154、miR-154*、miR-155、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-17-3p、miR-17-5p、miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d、miR-182、miR-182*、miR-183、miR-184、miR-185、miR-186、miR-187、miR-188、miR-189、miR-18a、miR-18a*、miR-18b、miR-190、miR-191、miR-191*、miR-192、miR-193a、miR-193b、miR-194、miR-195、miR-196a、miR-196b、miR-197、miR-198、miR-199a、miR-199a*、miR-199b、miR-19a、miR-19b、miR-200a、miR-200a*、miR-200b、miR-200c、miR-202、miR-202*、miR-203、miR-204、miR-205、miR-206、miR-208、miR-20a、miR-20b、miR-21、miR-210、miR-211、miR-212、miR-213、miR-214、miR-215、miR-216、miR-217、miR-218、miR-219、miR-22、miR-220、miR-221、miR-222、miR-223、miR-224、miR-23a、miR-23b、miR-24、miR-25、miR-26a、miR-26b、miR-27a、miR-27b、miR-28、miR-296、miR-299-3p、miR-299-5p、miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-301、miR-302a、miR-302a*、miR-302b、miR-302b*、miR-302c、miR-302c*、miR-302d、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30b、miR-30c、miR-30d、miR-30e-3p、miR-30e-5p、miR-31、miR-32、miR-320、miR-323、miR-324-3p、miR-324-5p、miR-325、miR-326、miR-328、miR-329、miR-33、miR-330、miR-331、miR-335、miR-337、miR-338、miR-339、miR-33b、miR-340、miR-342、miR-345、miR-346、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-361、miR-362、miR-363、miR-363*、miR-365、miR-367、miR-368、miR-369-3p、miR-369-5p、miR-370、miR-371、miR-372、miR-373、miR-373*、miR-374、miR-375、miR-376a、miR-376a*、miR-376b、miR-377、miR-378、miR-379、miR-380-3p、miR-380-5p、miR-381、miR-382、miR-383、miR-384、miR-409-3p、miR-409-5p、miR-410、miR-411、miR-412、miR-421、miR-422a、miR-422b、miR-423、miR-424、miR-425、miR-425-5p、miR-429、miR-431、miR-432、miR-432*、miR-433、miR-448、miR-449、miR-450、miR-451、miR-452、miR-452*、miR-453、miR-455、miR-483、miR-484、miR-485-3p、miR-485-5p、miR-486、miR-487a、miR-487b、miR-488、miR-489、miR-490、miR-491、miR-492、miR-493、miR-493-3p、miR-494、miR-495、miR-496、miR-497、miR-498、miR-499、miR-500、miR-501、miR-502、miR-503、miR-504、miR-505、miR-506、miR-507、miR-508、miR-509、miR-510、miR-511、miR-512-3p、miR-512-5p、miR-513、miR-514、miR-515-3p、miR-515-5p、miR-516-3p、miR-516-5p、miR-517*、miR-517a、miR-517b、miR-517c、miR-518a、miR-518a-2*、miR-518b、miR-518c、miR-518c*、miR-518d、miR-518e、miR-518f、miR-518f*、miR-519a、miR-519b、miR-519c、miR-519d、miR-519e、miR-519e*、miR-520a、miR-520a*、miR-520b、miR-520c、miR-520d、miR-520d*、miR-520e、miR-520f、miR-520g、miR-520h、miR-521、miR-522、miR-523、miR-524、miR-524*、miR-525、miR-525*、miR-526a、miR-526b、miR-526b*、miR-526c、miR-527、miR-532、miR-542-3p、miR-542-5p、miR-544、miR-545、miR-548a、miR-548b、miR-548c、miR-548d、miR-549、miR-550、miR-551a、miR-552、miR-553、miR-554、miR-555、miR-556、miR-557、miR-558、miR-559、miR-560、miR-561、miR-562、miR-563、miR-564、miR-565、miR-566、miR-567、miR-568、miR-569、miR-570、miR-571、miR-572、miR-573、miR-574、miR-575、miR-576、miR-577、miR-578、miR-579、miR-580、miR-581、miR-582、miR-583、miR-584、miR-585、miR-586、miR-587、miR-588、miR-589、miR-590、miR-591、miR-592、miR-593、miR-594、miR-595、miR-596、miR-597、miR-598、miR-599、miR-600、miR-601、miR-602、miR-603、miR-604、miR-605、miR-606、miR-607、miR-608、miR-609、miR-610、miR-611、miR-612、miR-613、miR-614、miR-615、miR-616、miR-617、miR-618、miR-619、miR-620、miR-621、miR-622、miR-623、miR-624、miR-625、miR-626、miR-627、miR-628、miR-629、miR-630、miR-631、miR-632、miR-633、miR-634、miR-635、miR-636、miR-637、miR-638、miR-639、miR-640、miR-641、miR-642、miR-643、miR-644、miR-645、miR-646、miR-647、miR-648、miR-649、miR-650、miR-651、miR-652、miR-653、miR-654、miR-655、miR-656、miR-657、miR-658、miR-659、miR-660、miR-661、miR-662、miR-663、miR-7、miR-9、miR-9*、miR-92、miR-93、miR-95、miR-96、miR-98、miR-99a和miR-99b。
4.根据权利要求1所述的细胞微粒子所载的微小核糖核酸的制备方法，其特征是由以下步骤构成：
(1)分级离心法，先将血清/血浆或细胞培养液(3000转/分钟)离心30分钟除去各类细胞及碎片，然后将上清超速离心(80000转/分钟)4小时，取沉淀便是血清/血浆总的细胞微粒子，或
(2)免疫吸附法，将细胞特异性的抗体吸附在组织培养皿上或直接用免疫磁珠，将除去各类细胞及碎片后的血清/血浆或细胞培养液直接和培养皿或免疫磁珠温育(30分钟或1小时)，不同细胞的细胞微粒子可直接被吸附和回收，或
(3)过滤法，将除去各类细胞及碎片后的血清/血浆或细胞培养液直接放在带有100kD滤膜的浓缩离心管，在4000转/分钟进行离心，细胞微粒子将留在离心管内被浓缩获得。
5.根据权利要求1所述的细胞微粒子所载的微小核糖核酸的制备研究方法，其特征是由以下步骤构成：
(1)RT-PCR方法包括以下步骤：
a提取受试者的血清/血浆和细胞微粒子的总RNA，用0.1％-0.2％的Triton-X100裂解，裂解后的细胞微粒子和除掉微粒子后的血清/血浆用酚和氯仿除蛋白后上清直接进行逆转录反应得到cDNA样品；或者用Trizol试剂提取细胞微粒子及除掉微粒子后的血清/血浆的总RNA，然后通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；
b用微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；
c进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；
d EB染色后在紫外灯下观察结果：
(2)Real-time PCR方法包括以下步骤：
a提取受试者的血清/血浆和细胞微粒子的总RNA，用0.1％-0.2％的Triton-X100裂解，裂解后的细胞微粒子和除掉微粒
子后的血清/血浆用酚和氯仿除蛋白后上清直接进行逆转录反应得到cDNA样品；或者用Trizol试剂提取细胞微粒子及除掉微粒子后的血清/血浆的总RNA，然后通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；
b用微小核糖核酸设计引物；
c加入荧光探针进行PCR反应；
d检测并比较血清/血浆样本相对于正常血清/血浆中微小核糖核酸的量的变化，比较炎症状态下细胞微粒子、除掉微粒子的细胞培养液以及细胞中的微小核糖核酸的量。
6.根据权利要求1所述的细胞微粒子所载微小核糖核酸在介导不相邻细胞间信号传导、遗传物质交换和筛选待测物中的应用，尤其是在各种急慢性传染病、呼吸系统疾病、免疫系统疾病、血液与造血系统疾病、循环系统疾病、内分泌系统代谢性疾病、消化系统疾病、神经系统疾病、泌尿系统疾病、生殖系统疾病和运动系统疾病基因治疗中的应用。
7.根据权利要求1所述细胞微粒子所载微小核糖核酸制备的试剂盒，其特征是，所述试剂盒包含let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、let-7i、miR-1、miR-100、miR-101、miR-103、miR-105、miR-106a、miR-106b、miR-107、miR-10a、miR-10b、miR-122a、miR-124a、miR-125a、miR-125b、miR-126、miR-126*、miR-127、miR-128a、miR-128b、miR-129、miR-130a、miR-130b、miR-132、miR-133a、miR-133b、miR-134、miR-135a、miR-135b、miR-136、miR-137、miR-138、miR-139、miR-140、miR-141、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-143、miR-144、miR-145、miR-146a、miR-146b、miR-147、miR-148a、miR-148b、miR-149、miR-150、miR-151、miR-152、miR-153、miR-154、miR-154*、miR-155、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-17-3p、miR-17-5p、miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d、miR-182、miR-182*、miR-183、miR-184、miR-185、miR-186、miR-187、miR-188、miR-189、miR-18a、miR-18a*、miR-18b、miR-190、miR-191、miR-191*、miR-192、miR-193a、miR-193b、miR-194、miR-195、miR-196a、miR-196b、miR-197、miR-198、miR-199a、miR-199a*、miR-199b、miR-19a、miR-19b、miR-200a、miR-200a*、miR-200b、miR-200c、miR-202、miR-202*、miR-203、miR-204、miR-205、miR-206、miR-208、miR-20a、miR-20b、miR-21、miR-210、miR-211、miR-212、miR-213、miR-214、miR-215、miR-216、miR-217、miR-218、miR-219、miR-22、miR-220、miR-221、miR-222、miR-223、miR-224、miR-23a、miR-23b、miR-24、miR-25、miR-26a、miR-26b、miR-27a、miR-27b、miR-28、miR-296、miR-299-3p、miR-299-5p、miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-301、miR-302a、miR-302a*、miR-302b、miR-302b*、miR-302c、miR-302c*、miR-302d、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30b、miR-30c、miR-30d、miR-30e-3p、miR-30e-5p、miR-31、miR-32、miR-320、miR-323、miR-324-3p、miR-324-5p、miR-325、miR-326、miR-328、miR-329、miR-33、miR-330、miR-331、miR-335、miR-337、miR-338、miR-339、miR-33b、miR-340、miR-342、miR-345、miR-346、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-361、miR-362、miR-363、miR-363*、miR-365、miR-367、miR-368、miR-369-3p、miR-369-5p、miR-370、miR-371、miR-372、miR-373、miR-373*、miR-374、miR-375、miR-376a、miR-376a*、miR-376b、miR-377、miR-378、miR-379、miR-380-3p、miR-380-5p、miR-381、miR-382、miR-383、miR-384、miR-409-3p、miR-409-5p、miR-410、miR-411、miR-412、miR-421、miR-422a、miR-422b、miR-423、miR-424、miR-425、miR-425-5p、miR-429、miR-431、miR-432、miR-432*、miR-433、miR-448、miR-449、miR-450、miR-451、miR-452、miR-452*、miR-453、miR-455、miR-483、miR-484、miR-485-3p、miR-485-5p、miR-486、miR-487a、miR-487b、miR-488、miR-489、miR-490、miR-491、miR-492、miR-493、miR-493-3p、miR-494、miR-495、miR-496、miR-497、miR-498、miR-499、miR-500、miR-501、miR-502、miR-503、miR-504、miR-505、miR-506、miR-507、miR-508、miR-509、miR-510、miR-511、miR-512-3p、miR-512-5p、miR-513、miR-514、miR-515-3p、miR-515-5p、miR-516-3p、miR-516-5p、miR-517*、miR-517a、miR-517b、miR-517c、miR-518a、miR-518a-2*、miR-518b、miR-518c、miR-518c*、miR-518d、miR-518e、miR-518f、miR-518f*、miR-519a、miR-519b、miR-519c、miR-519d、miR-519e、miR-519e*、miR-520a、miR-520a*、miR-520b、miR-520c、miR-520d、miR-520d*、miR-520e、miR-520f、miR-520g、miR-520h、miR-521、miR-522、miR-523、miR-524、miR-524*、miR-525、miR-525*、miR-526a、miR-526b、miR-526b*、miR-526c、miR-527、miR-532、miR-542-3p、miR-542-5p、miR-544、miR-545、miR-548a、miR-548b、miR-548c、miR-548d、miR-549、miR-550、miR-551a、miR-552、miR-553、miR-554、miR-555、miR-556、miR-557、miR-558、miR-559、miR-560、miR-561、miR-562、miR-563、miR-564、miR-565、miR-566、miR-567、miR-568、miR-569、miR-570、miR-571、miR-572、miR-573、miR-574、miR-575、miR-576、miR-577、miR-578、miR-579、miR-580、miR-581、miR-582、miR-583、miR-584、miR-585、miR-586、miR-587、miR-588、miR-589、miR-590、miR-591、miR-592、miR-593、miR-594、miR-595、miR-596、miR-597、miR-598、miR-599、miR-600、miR-601、miR-602、miR-603、miR-604、miR-605、miR-606、miR-607、miR-608、miR-609、miR-610、miR-611、miR-612、miR-613、miR-614、miR-615、miR-616、miR-617、miR-618、miR-619、miR-620、miR-621、miR-622、miR-623、miR-624、miR-625、miR-626、miR-627、miR-628、miR-629、miR-630、miR-631、miR-632、miR-633、miR-634、miR-635、miR-636、miR-637、miR-638、miR-639、miR-640、miR-641、miR-642、miR-643、miR-644、miR-645、miR-646、miR-647、miR-648、miR-649、miR-650、miR-651、miR-652、miR-653、miR-654、miR-655、miR-656、miR-657、miR-658、miR-659、miR-660、miR-661、miR-662、miR-663、miR-7、miR-9、miR-9*、miR-92、miR-93、miR-95、miR-96、miR-98、miR-99a和miR-99b的引物。
8.根据权利要求6所述的细胞微粒子所载微小核糖核酸的试剂盒在评价受试者的生理或病理状态为测定受试者给予待测物后的生理或病理状态、筛选待测物，尤其是在各种疾病包括各种肿瘤、各种急慢性传染病、呼吸系统疾病、免疫系统疾病、血液与造血系统疾病、内分泌系统代谢性疾病、消化系统疾病、神经系统疾病、泌尿系统疾病、生殖系统疾病和运动系统疾病的诊断、治疗、预后中的应用。
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