CN102970994A - 与糖尿病中的mirna相关的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及治疗受试者的葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病的方法，包括向所述受试者施用能够调节受试者的一种或多种损伤细胞中的一种或多种miRNAs表达的成分。本发明还涉及治疗葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病的组合物，包括能够调节一种或多种损伤细胞中的一种或多种miRNAs表达的成分。本发明还涉及诊断受试者的葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病的方法，包括糖尿病视网膜病变的诊断。

Description

与糖尿病中的MIRNA相关的组合物和方法

技术领域

本发明涉及葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病中的微小RNA分子和微小RNA表达谱，包括糖尿病慢性病。

背景技术

在本发明全文中，在方括号内引用了多篇参考文献以便更加完整的描述与本发明相关的背景技术。

糖尿病视网膜病变

几乎所有的I型糖尿病患者和60％的II型糖尿病患者都会发展成视网膜病变。到2030年，预计全球糖尿病患者将会达到3.66亿。在加拿大，糖尿病患者数超过200万人，其中，约10％为I型糖尿病，约90％为II型糖尿病。在北美洲，糖尿病视网膜病变(DR)是导致失明的最重要的系统性原因。已有研究证实糖尿病视网膜病变中有几种蛋白质分子发生改变。针对治疗糖尿病视网膜病变的个别蛋白质的实验研究已开展了很长时间，但迄今为止所有的努力都没有在临床上取得成功。在所有的糖尿病慢性并发症中，包括糖尿病视网膜病变，血管内皮损伤是一个重要特征。内皮细胞排列在血管壁上，它对葡萄糖的摄取不依赖于胰岛素。当糖尿病患者体内血糖水平升高时，葡萄糖流入到内皮细胞中，导致内皮细胞损伤。

视网膜病变分为两种类型，或者说两个阶段：非增生性视网膜病变和增生性视网膜病变。在非增生性糖尿病视网膜病变阶段，眼睛中有些地方(微血管瘤)血管扩张。也可能出现血管堵塞。可能有少量出血(视网膜出血)，和液体渗漏到视网膜内。增生性视网膜病变阶段是更晚期和更严重的疾病状态。眼睛内开始生长出新的血管(血管生成)。这些新的血管非常脆弱并可能流血(出血)。随后视网膜和眼睛的其他部分(玻璃体)出现小块疤痕。最终的结果是视力丧失，以及其他问题。

微小RNA

微小RNA(“miRNA”)是近年来发现的自然界中存在的分子。miRNA是小的RNA分子(约由20-25个核苷酸组成)，其在调节基因表达中起到重要作用【1】。miRNA通过RNA聚合酶II转录，形成带有5’帽子结构和多聚腺苷酸尾巴结构的初级miRNA。初级miRNA在细胞核中加工成前体miRNA(由70-100个核苷酸组成的发夹结构)，是通过三种酶RNA酶II，Drosha和DGCR8调节的。前体miRNA形成后就通过核输出蛋白-5输出到细胞质中。在细胞质中，RNA酶III核糖核酸酶家族成员Dicer将前体miRNA进一步加工成成熟miRNA，即功能活性形式【1，2】。成熟的miRNA与RNA诱导的沉默复合物(RISC)一起结合到特定的mRNA靶上，引起特定的mRNA降解或者转录遏制【1，2】。一些研究者采用超表达实验证明了miRNA在多种细胞过程中的重要性。也有研究认为miRNAs在控制组蛋白修饰方面也起到重要作用【3】。大量的miRNA编码区位于蛋白编码基因的内含子区，并被认为与它们的宿主基因被共同调控。不过，它们也有可能是被自己的启动子调控的。已从恶性肿瘤中识别出几种miRNAs。研究表明它们可以调控多种因子，包括致癌基因(c-MYC)，转录因子(NFκB)和甲基化因子【1，2】。

有关miRNA在多种疾病中的潜在治疗应用在科学界引起了相当大的兴趣。从机理的角度看，一种miRNA可以调控多种基因，因此，靶向于一种或少数几种miRNAs提供了阻止多种基因表达的潜在的独特机会。由于靶miRNAs作用的特异性，这种以RNA为基础的疗法是非常有吸引力的。

miRNA表达的脱调节可能引起疾病，因此，检查miRNA的表达可能成为一种有用的诊断手段。

糖尿病中的miRNA

没有研究文献表明糖尿病个体视网膜中的特定miRNAs发生了显著改变。然而，对其他糖尿病并发症的研究表明miRNA已发生改变。比如，已有研究发现，在糖尿病中miR375的改变参与葡萄糖诱导的胰岛素基因表达过程【4】。研究发现，在2型糖尿病大鼠心脏微血管内皮细胞内miR320表达上调【5】。研究表明，MiR377通过调节P21-活化激酶和超氧化物歧化酶使得糖尿病肾病中纤维连接蛋白生成增加【6】。研究已发现，在糖尿病肾病中mi192通过影响TGFβ诱导的胶原蛋白表达而发生改变【7】。在糖尿病兔子心脏中发现miR133减少，从而调节HERG钾离子通道引起QT波延长【8】。此外，miR1参与葡萄糖诱导的心肌细胞凋亡过程。申请人最近的研究发现，在糖尿病大鼠的心脏和暴露于葡萄糖的心肌细胞中都出现了miR133a的下调，这直接关系到心肌细胞肥大【9】。在非糖尿病性心肌肥厚的其他研究中，也发现了miR1和miR133的下调【10，11】。

国际申请WO 2009/045356(WO‘356)中公开了通过施用miRNAs来改变血管内皮生长因子(VEGF)诱导细胞和组织响应或改变的能力来治疗疾病的方法。WO‘356还公开了治疗伤口痊愈和癌症、炎症和黄斑变性等疾病的方法。但是，WO‘356中并没有公开暴露于葡萄糖的细胞中或者糖尿病受试者视网膜中哪些miRNAs发生了改变。

本领域需要一种有效的治疗方法来治疗葡萄糖介导的细胞损伤相关的疾病，包括糖尿病慢性并发症，比如糖尿病视网膜病变。本领域也需要一种健全的早期检测糖尿病的方法。

发明概述

在一方面，本发明提供一种治疗受试者的葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病的方法，其特征在于，所述方法包括给受试者施用一种能够调节所需受试者的一种或多种细胞中的一种或多种miRNAs表达的成分或成分的混合物。

在另一方面，本发明提供一种治疗葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病的组合物，包括一种能够调节所需一种或多种细胞中的一种或多种miRNAs表达的成分或成分的混合物，和药学上可接受的载体。

在本发明中，所述成分或成分的混合物能够上调所需受试者的一种或多种细胞中的一种或多种miRNAs中的至少一种miRNA的表达。在一方面，所述一种或多种miRNAs中的至少一种miRNA选自miR-1，miR-146a，miR200b或者miR-320。

在本发明中，所述成分或成分的混合物包括一种寡核苷酸或寡核苷酸的混合物。

在本发明中，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物以miRNA、其衍生物或类似物、miRNA前体、成熟miRNA或者编码所述至少一种miRNA的DNA分子的形式提供。

在本发明中，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物以一种包括药学上可接受的载体的组合物的形式提供。

在本发明中，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物选自SEQ ID NOs.1-4。

在本发明中，所述成分或成分的混合物以不超过一种给药载体的方式提供。

在本发明中，所述给药载体选自病毒载体，微球，脂质体，胶体金颗粒，脂多糖，多肽，多糖，或聚乙二醇化病毒载体。

在本发明中，所述成分或成分的混合物能够下调所需的一种或多种细胞中的一种或多种miRNAs中的至少一种miRNA的表达。在一方面，所述一种或多种miRNAs中的至少一种miRNA选自miR-144或者miR-450。

在本发明中，所述成分或成分的混合物包括所述的至少一种miRNA的抑制剂或抑制剂的混合物。

在本发明中，所述抑制剂或抑制剂的混合物选自antagomir、反义RNA或者短干扰RNA。

在本发明中，所述抑制剂或抑制剂的混合物以一种包括药学上可接受的载体的组合物的形式提供。

在本发明中，所述疾病是糖尿病慢性并发症，包括糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病或者糖尿病大血管病变。

在本发明中，所述成分或成分的混合物通过胃肠外给药途径或者局部给药途径施用。

在本发明中，所述疾病是糖尿病视网膜病变，所述成分或成分的混合物通过眼内给药或者局部滴注到眼内的方式施用。

在本发明中，所述疾病是糖尿病视网膜病变，所述成分或成分的混合物通过眼部植入的方式施用。

在另一方面，本发明提供一种治疗受试者的糖尿病视网膜病变的方法，其特征在于，所述方法包括给受试者施用一种组合物，包括至少一种：(a)靶向于miR-1，miR-146a，miR-200b或者miR-320的寡核苷酸，和(b)miR-144或者miR-450的抑制剂。

在另一方面，本发明提供一种诊断受试者所患疾病的方法，所述疾病与葡萄糖介导的细胞损伤相关，其特征在于，所述方法包括检测受试者样本中的一种或多种miRNAs的表达谱，其中受试者样本的miRNA表达谱与正常样本或参考样本的miRNA表达谱的差异就是葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病的指征。

在本发明的诊断疾病的方法的一方面，所述疾病是糖尿病慢性并发症，包括糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病或者糖尿病大血管病变。

在本发明的诊断疾病的方法的一方面，所述方法是诊断受试者糖尿病视网膜病变的方法。

在本发明的诊断疾病的方法的一方面，所述一种或多种miRNAs选自miR1，miR146a，miR200b，miR320，miR144或者miR450。

在本发明的诊断疾病的方法的一方面，与正常样本或者参考样本相比miR1，miR146a，miR200b和miR320的下调和miR144或者miR450的上调就是该疾病的指征。

本发明具有如下优势：

(a)miRNAs是天然成分，当作为药物使用时是非常特异性的，

(b)miRNAs的合成非常容易，

(c)miRNAs可以通过眼内注射到玻璃体内。玻璃体内给药是公认的治疗视网膜疾病的方法，和

(d)miRNAs可用于诊断糖尿病和糖尿病并发症，包括糖尿病视网膜病变。提供了一种早期诊断这类疾病的新方法。

附图简述

参考下列的详细描述本发明将会被更好的理解，发明目的将变得清晰。描述参考附图，其中：

图1是miRNA阵列-散点图，显示出对照组与链脲佐菌素(STZ)诱导的(一种1型糖尿病模型)糖尿病组(处理组)大鼠视网膜中miRNA的改变情况。

图2a)是暴露于低浓度葡萄糖(LG)和高浓度葡萄糖(HG)的内皮细胞中的miR320表达水平的实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析图。图b)-d)显示内皮细胞中的下列因子表达水平的实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析图(b)纤维连接蛋白(FN)mRNA，(c)内皮素-1(ET-1)mRNA和(d)血管内皮生长因子(VEGF)mRNA，所述内皮细胞分别暴露于高浓度葡萄糖(HG)，低浓度葡萄糖(LG)，暴露于高浓度葡萄糖并经阴性mRNA转染(HG+neg)，暴露于高浓度葡萄糖并经miR320模拟物转染(HG+miR320)。图e)显示了内皮细胞中的有丝分裂原激活的蛋白激酶-细胞外信号调节激酶(MAPK(ERK1/2))的激活作用，所述内皮细胞分别暴露于低浓度葡萄糖(LG)，高浓度葡萄糖(HG)，经阴性转染并暴露于低浓度葡萄糖或高浓度葡萄糖(LG+Neg，HG+Neg)，经miR320模拟物转染并暴露于低浓度葡萄糖或高浓度葡萄糖(LG+miR320，HG+miR320)。*代表与低浓度葡萄糖组(LG)相比具有统计学意义上的显著差异。

图3a)是分别暴露于25mmol/L葡萄糖和5mmol/L葡萄糖的人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)中，和暴露于25mmol/L葡萄糖并经阴性miRNA转染(25mM+Scram)或者经miR146a模拟物转染(25mM+miR146a)的内皮细胞中的miRNA 146a表达水平的实时定量聚合酶链式反(qRT-PCR)应分析图。图b)-c)是人脐静脉血管内皮细胞中的下列因子表达水平的实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析图和酶联免疫吸附剂测定(ELISA)分析图，b)纤维连接蛋白(FN)mRNA和c)纤维连接蛋白水平，所述人脐静脉血管内皮细胞分别暴露于5mmol/L葡萄糖和25mmol/L葡萄糖，以及暴露于25mmol/L葡萄糖并经阴性(序列打乱的)miRNA转染(25mM+Scram)或者经miR146a模拟物转染(25mM+miR146a)。Scram表示序列打乱的，*表示与5mM组或者5mM scram组相比具有统计学意义上的显著差异；**表示与25mM组或25mM scram组相比具有显著差异；miRNA的水平以RNU6B(U6)的比值的形式表达，并归一化到低浓度葡萄糖组(LG组)的水平；mRNA的水平以18S RNA的比值的形式表示，并归一化到LG组的水平。

图4a)显示了链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠(D)视网膜组织中miR146a的水平与年龄和性别匹配的对照组(C)中miR146a的水平对比情况。图b)显示了玻璃体内给药的效率，其中，向玻璃体内注射miR146a模拟物(D+146a)导致视网膜内miR146a水平升高，而注射序列打乱的模拟物(D+SC)组并没有出现miR146a水平升高的现象。图c)-d)显示链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠视网膜组织中的纤维连接蛋白(FN)(c)mRNA水平和(d)蛋白质水平。该图显示向玻璃体内注射miR146a模拟物(D+miR146a)可以阻止糖尿病诱导的纤维连接蛋白(FN)mRNA水平和蛋白质水平的上调，而注射序列打乱的模拟物的对照组(D+Sc)并没有发现这一现象。数据以I，c)RNU6(U6)，d)18S的比值的形式表示，*表示与对相应的C组相比具有统计学意义上的显著差异，n为5例/每组。

图5a)是基于生物信息学预测的(www.TargetScan.org，www.microrna.org，www.ebi.ac.uk1)纤维连接蛋白(FN1)3’UTR序列与成熟miR146a序列的对比图。图b)-c)显示miR146a与(b)人和(c)大鼠FN1启动子结合的荧光素酶报告分析图。**表示与单独的载体组或者载体+序列打乱物组相比具有统计学意义上的显著差异。

图6a)是对照大鼠视网膜组织的LNA^TM-ISH研究的显微照片，显示了miR146a的定位。图(b)是(a)组的高倍显微镜照片，显示了视网膜毛细血管的阳性染色(箭头)。图c)是链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠视网膜组织的LNA^TM-ISH研究的显微照片，显示了miR146a在毛细血管内(箭头)的最小表达量(如果有的话)。用碱性磷酸酶(ALK Pho)作为色原体，不加复染剂。

图7显示了人脐静脉内皮细胞中的核因子-KB(NF-KB)的活力。X轴显示了下列条件：人脐静脉内皮细胞暴露于5mmol/L葡萄糖，25mmol/L葡萄糖，和暴露于25mmol/L葡萄糖并经阴性miRNA转染(25mM+Scram)或者经miR146a模拟物转染(25mM+miR146a)。*表示与其他组相比具有统计学意义上的显著差异。数据归一化到5mM葡萄糖组的水平。

图8显示了db/db糖尿病小鼠(db/db)(一种2型糖尿病的模型)视网膜组织中的miR146a水平与年龄和性别匹配的对照组(C)的miR146a水平的对比图。数据以RNU6(U6)比值的形式表达，*表示与其他组相比具有统计学意义上的显著差异。

图9显示了糖尿病大鼠视网膜内的微小RNA和血管内皮生长因子的变化情况。非糖尿病对照组和糖尿病组(链脲佐菌素诱导，患病1个月后)大鼠视网膜组织样本的图a)实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析图和图b)酶联免疫法分析图都显示糖尿病大鼠视网膜中血管内皮生长因子mRNA和蛋白质水平都升高。图c)是糖尿病大鼠与非糖尿病对照组大鼠视网膜中miR200b水平的实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析图。miRNA的数据以RNU6B(U6)的比值的形式表示，并归一化到对照组的水平；(mRNA的水平以18S RNA的比值的形式表示，并归一化到对照组的水平。*表示与其他组相比具有统计学意义上的显著差异。)

图10显示了葡萄糖诱导的人脐静脉血管内皮细胞中miR200b水平下调的影响。图a)显示分别暴露于25mmol/L葡萄糖(HG)，5mmol/L葡萄糖(LG)，和25mM L-葡萄糖(渗透对照，OSM)的人脐静脉血管内皮细胞中的miR200b的表达水平。图b)显示了人脐静脉血管内皮细胞中血管内皮生长因子mRNA的表达水平，所述的人脐静脉血管内皮细胞分别暴露于低浓度葡萄糖(LG)、高浓度葡萄糖(HG)、25mM L-葡萄糖(OSM)、经序列打乱的(scr)模拟物或者miR200b转染并暴露于低浓度葡萄糖(LG+Scr；LG+200b)或高浓度葡萄糖(HG+Scr；HG+200b)，和经antagomirs转染[200b(A)]以及经antagomirs转染并暴露于低浓度葡萄糖[LG+200b(A)]。图c)中与经序列打乱的(scr)模拟物组相比，经miR200b模拟物转染后暴露于高浓度葡萄糖的人脐静脉血管内皮细胞中miR200b表达水平的增加显示了miR200b模拟物转染的效率。图d)显示与人脐静脉血管内皮细胞类似，牛视网膜血管内皮细胞(BREC)中也显示出葡萄糖诱导的miR200b水平下调。图e)显示，用miR200b模拟物(采用在PcDNA3.1载体中克隆的miR200b(V200b)，而不是通过空白载体(V))转染牛视网膜血管内皮细胞能够使得高浓度葡萄糖诱导的VEGF mRNA表达的上调恢复正常。图f)中与载体对照组相比，经miR-200b模拟物转染的牛视网膜血管内皮细胞中miR-200b表达水平的提高程度显示了miR-200b模拟物在牛视网膜血管内皮细胞中的转染效率。(低浓度葡萄糖(LG)＝5mM葡萄糖，Scr＝序列打乱的miRNA，200b＝miR200b模拟物，200b(A)＝200b antagomir，OSM＝25mML葡萄糖[渗透对照]。*表示与LG组或LG scram组相比具有显著差异，+表示与HG组或者HG scram组相比有显著差异。miRNA的水平以RNU6B(U6)的比值的形式表达，并归一化到低浓度葡萄糖组(LG)的水平。mRNA的水平以18S RNA的比值的形式表示，并归一化到低浓度葡萄糖组(LG)的水平。

图11显示由高浓度葡萄糖(HG)诱导的和血管内皮生长因子(VEGF)介导的跨内皮通透性增加可以通过miR200b模拟物转染(200b)而被阻止，但不能通过序列打乱的(scr)模拟物转染而被阻止，图a)为时间依赖性数据，图b)为终点数据。图c)显示，类似地，葡萄糖诱导的内皮细胞(EC)管腔形成可以通过miR200b模拟物转染而被阻止，但不能通过序列打乱的(scr)模拟物转染而被阻止。图d)显示了管形成实验的量化分析。

(低浓度葡萄糖(LG)＝5mM葡萄糖，Scr＝序列打乱的miRNA，200b＝miR200b模拟物，200b(A)＝200b antagomir，OSM＝25mM L葡萄糖(渗透对照).*表示与LG组或者LGscram组相比具有显著差异，+表示与HG组或者HG scram组相比具有显著差异。miRNA的水平以RNU6B(U6)的比值的形式表达，并归一化到低浓度葡萄糖组(LG)的水平；mRNA的水平以18S RNA的比值的形式表达，并归一化到低浓度葡萄糖组(LG)的水平)。

图12a)显示基于生物信息学预测的(www.TargetScan.org，www.microma.org，www.ebi.ac.uk1)血管内皮生长因子3’UTR序列(和突变的[mut]血管内皮生长因子3’-UTR)与成熟miR200b序列的对比图。图b)(人)和图c)(大鼠)是miR200b与血管内皮生长因子启动子结合的荧光素酶报告分析图，显示了miR200b与血管内皮生长因子3’UTR的剂量依赖性的结合。相关启动子的活性以发光单位归一化为β-半乳糖苷酶表达水平的方式表达，*表示与单独载体组或者载体+序列打乱物组相比具有统计学意义上的显著差异。

图13显示了miR200b调节的视网膜血管内皮生长因子的改变及其被miR200b阻止。图a)和图b)分别是经过或者未经过玻璃体内注射miR200b模拟物(200b)和序列打乱的模拟物(Scr)的对照组(Cont)和糖尿病组(Diab)大鼠(链脲佐菌素诱导)视网膜中的a)血管内皮生长因子mRNA和b)蛋白水平的情况。

图c)中与注射序列打乱的模拟物组相比，玻璃体内注射miR200b模拟物后视网膜中miR200b表达量的增加显示了玻璃体内给药的效率。*表示与对照组或者Diabetic+scr组(右图)相比具有统计学意义上的显著差异，+表示与糖尿病组(diabetic)比较有显著差异。

图14的显微照片显示了miR200b介导的糖尿病视网膜血管内皮生长因子改变的功能性结果。a)是对照大鼠视网膜组织的LNA^TM-ISH研究的显微照片，显示了miR200b在视网膜毛细管内皮(箭头)，神经节细胞(楔形箭头)，内核层细胞(双楔形箭头，在神经胶质和神经元内)中的定位；插图为带有细胞质和细胞核miR200b定位的毛细管放大图(箭头)。图b)是链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠视网膜内的视网膜组织(与(a)组中的定位相似)的LNA^TM-ISH研究的显微照片，显示了miR200b的最小表达量(如果有的话)。图c)是用抗白蛋白抗体对对照组大鼠视网膜进行免疫细胞化学染色的显微照片，显示有血管内白蛋白出现(箭头)。图d)是对糖尿病大鼠(链脲佐菌素诱导)的视网膜进行与(c)组类似的免疫细胞化学染色的显微照片，显示出现血管内反应(箭头)和视网膜的弥漫着色，说明血管通透性增加。图e)的显微照片显示链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠视网膜经玻璃体内注射miR200b之后，白蛋白染色仅出现在血管内的间隔中(箭头)。在LNA^TM-ISH实验中，用碱性磷酸酶(ALKPho)作为色原体，不加复染剂。在白蛋白染色中使用DAB色原体和苏木精复染剂。

图15显示mir200b调节糖尿病诱导的p300的变化。图a)显示在以下情况下人脐静脉内皮细胞中的p300mRNA水平上调：人脐静脉内皮细胞分别暴露于5mmol/L葡萄糖(LG)，25mmol/L葡萄糖(HG)，暴露于25mmol/L葡萄糖并经阴性miRNA转染(HG+Scram)或者经miR200b模拟物转染(HG+200b)。图b)显示了miR200b在人脐静脉内皮细胞内的表达情况。未观察到p300siRNA转染对miR200b表达量的影响。图c)显示糖尿病大鼠视网膜中P300mRNA的表达情况(与对照组比较)。*表示与对照组或者低浓度葡萄糖组(LG)相比具有统计学意义上的显著差异。+表示与糖尿病组(diabetic)或高浓度葡萄糖组(HG)相比具有显著差异，scram＝序列打乱的对照组。

图16a)是来自非糖尿病的人视网膜的视网膜组织的LNA^TM-ISH研究的显微照片，显示了miR200b在视网膜毛细管(箭头)和内核层细胞(双楔形箭头)中的定位。插图是带有内皮染色的毛细管(箭头)的高清图片。图b)是糖尿病人视网膜(与(a)组中的定位相似)的显微照片，显示了miR200b的最小表达量(如果有的话)。图c)是用抗白蛋白抗体对非糖尿病人的视网膜进行免疫细胞化学染色的显微照片，显示有血管内白蛋白出现(箭头)。图d)是糖尿病人视网膜的显微照片，显示血管内白蛋白染色(箭头)和视网膜的弥漫着色，说明血管通透性增加。在LNA^TM-ISH实验中，用碱性磷酸酶(ALK Pho)作为色原体，不加复染剂。在白蛋白染色中使用DAB色原体和苏木精复染剂。

图17是对照组和糖尿病组(一种2型糖尿病的模型)(db/db)小鼠的视网膜中的miR200b表达水平的实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析图。*表示与对照组相比具有统计学意义上的显著差异。

图18是对照组和糖尿病动物组大鼠视网膜中的miR1表达水平的实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析图。与正常(对照)组大鼠视网膜相比较，糖尿病大鼠视网膜中的miRl表达水平具有统计学意义上的显著减少。*表示与对照组相比较p＜0.05。

图19a)是对照组和糖尿病组大鼠(链脲佐菌素诱导，1型糖尿病模型)视网膜组织样本中miR144表达水平的实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析图。图b)是对照组和糖尿病组大鼠视网膜组织样本中miR450表达水平的实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析图。*表示与对照组相比较p＜0.05。

图20是来自两名患有增生性糖尿病视网膜病变患者的玻璃纤维组织的扩增曲线(实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析)，显示了miR146a和miR320的存在。

在附图中，本发明的实施方案是通过举例的方式说明的。应当明确理解的是，说明书和附图只用于说明和帮助理解的目的，并不意味着对本发明的范围进行限制。

发明的详细描述

除非另有规定，本发明中使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属技术领域的普通技术人员通常已知的含义。此外，除非另有说明，除了在权利要求书中，使用“或”时也包括“和”的意思，反之亦然。除非有明确规定或者在上下文清楚的另外指明，开放式的术语不应解释成限制性的术语(例如“包括”，“含有”和“包含”通常表明“包括但不限于”)。除非另有明确规定，包括在权利要求书中使用的单数形式如“一”和该”也包括多个指代物。

本发明将通过引用附图对发明内容进行详细的解释。

本发明涉及发现暴露于相对高浓度葡萄糖的细胞中和糖尿病受试者的视网膜中的微小RNA(miRNA)表达水平的改变。

申请人发现暴露于相对高浓度葡萄糖的细胞中和糖尿病受试者的细胞中，包括糖尿病受试者视网膜中的某些miRNAs的表达谱发生改变。申请人进一步发现，miRNAs表达的改变可能与一些已知的在糖尿病中起到重要作用的蛋白质水平的上调或下调相关。此外，申请人发现miRNA分子可用于使翻译这些蛋白质的mRNAs的水平基本恢复正常。

本发明涉及治疗受试者的葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病的方法和组合物。所述方法包括给受试者施用能够调节所需受试者的一种或多种细胞中的一种或多种miRNAs表达的成分或成分的混合物。所述组合物包括能够调节所需的一种或多种细胞中的一种或多种miRNAs表达的成分或成分的混合物。

因此，本发明涉及基于miRNA的组合物和基于miRNA的方法，所述组合物和方法能够使得暴露于相对高浓度葡萄糖的细胞中和患有暴露于血糖水平相关疾病的受试者细胞中，如糖尿病患者，包括糖尿病受试者的视网膜中被上调或下调的mRNA的表达水平和蛋白质的生成量基本恢复正常。本发明还涉及诊断方法，所述方法基于糖尿病相关疾病中miRNAs表达谱的差异。

微小RNA

miRNAs与mRNAs的一部分或者一个或多个基因片段互补。而且，miRNAs与mRNA结合并不需要绝对的序列互补，使得它们能够调节范围广泛的靶转录物。通常miRNAs结合到靶序列时，在相匹配的核苷酸之间有缝隙。此处使用的术语“绝对的序列互补”的意思是用来描述两段序列长度上的每个核苷酸对都能无缝隙的结合，比如一种miRNA和一种靶基因或转录物的结合。术语“互补”的意思是描述两段序列，其中至少有50％的核苷酸从一段序列反式结合到另一段序列上。

miRNAs通常与mRNA转录物的3′UTR互补，然而，本发明中的miRNAs可以结合到靶mRNA的任何区域。或者说，此外，miRNAs靶向于响应编码靶mRNAs的基因的甲基化基因组位点。基因组DNA的甲基化状态部分决定了该DNA与转录因子结合的容易程度。因此，DNA的甲基化和去甲基化分别调节基因的沉默和表达。

本发明的miRNAs包括表1中的序列(SEQ ID NOs.1-6)及其同源体和类似物，miRNA的前体分子和编码所述miRNAs的DNA分子。

表1

miR1	SEQ ID NO.1
		miR146a	SEQ ID NO.2
miR200b	SEQ ID NO.3
		miR320	SEQ ID NO.4
miR144	SEQ ID NO.5
		miR450	SEQ ID NO.6

优选地，SEQ ID NOs 1-6序列的同源体的同一性至少为90％，更优选地，同一性至少为95％。

此外，本发明还包括能够在严格的条件下与SEQ ID NOs 1-6的核苷酸序列相杂交的核苷酸序列，其互补序列或与其高度相似的序列。严格的杂交条件包括在45℃下，在1×SSC和0.1％SDS溶液中清洗1小时，优选48℃，更优选50℃，尤其优选在0.2×SSC和0.1％SDS溶液中清洗1小时。

应当指出的是，成熟的miRNA通常可能有19-24个核苷酸的长度(或者此范围内的任何长度)，特别是21个，22个或23个核苷酸的长度。而miRNAs也可能以前体的形式存在，拥有大约70到100个核苷酸的长度(前体-miRNA)。应当指出的是，所述前体可以通过加工初级转录物的方式获得，所述初级转录物拥有超过100个核苷酸的长度(初级-miRNA)。

miRNA自身通常是单链分子，而miRNA-前体通常至少一部分自身互补分子能够形成双链结构，比如环-和茎-结构。本发明还包括编码miRNA，前体-miRNA和初级-miRNA分子的DNA分子。核酸可以选自RNA、DNA或核酸类似物分子，如糖-或骨架-修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。然而，应当指出的是，其他核酸类似物，如肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)，也是合适的。

本发明的核酸分子可以通过化学合成的方法或者重组的方法获得，比如，通过酶转录法从人工合成的DNA-模版或者从重组生物体内分离得到的DNA-质粒获得。通常，可使用噬菌体RNA-聚合酶进行转录，比如T7，T3或者SP6RNA-聚合酶。

本发明还涉及一种重组表达载体，包括重组核酸，其在表达时，能有效结合到表达操控序列上，比如，转录和优选地进一步加工得到如上文所述的miRNA-分子或miRNA前体(初级-或前体-miRNA)分子。所述载体是一种表达载体，适合核酸在真核细胞中表达，尤其是在哺乳动物细胞中表达。所述载体包含的重组核酸可以是一段序列，其能够引起miRNA-分子自身、其前体或者初级转录物的转录，这些转录物可被进一步加工得到miRNA-分子。miRNA调节因子

miRNAs在治疗过程中可以充当靶分子的角色，比如，抑制或者激活miRNA可以调节血管生成的过程。本发明的组合物和方法包括一种成分或者成分的混合物，比如miRNA分子，它是一种能够增加miRNA水平的分子，和/或miRNAs分子抑制剂，其能够改变或者减少肽的生成或者肽的活性从而引起受试者的至少一种细胞的响应。本发明中的术语“miRNA调节因子”包括能够增加、减少或减弱miRNA水平和/或miRNA抑制剂水平的分子或者化合物。

预计能够充当miRNA调节因子的成分可以包括miRNA分子、单链或者双链RNA或DNA多核苷酸、肽核酸(PNAs)、蛋白质、小分子、离子、聚合物、化合物、抗体、内抗体、antagomirs或其任意组合物。miRNA调节因子可以增加、减少、减弱或者抑制miRNA的表达水平、活性和/或功能。一种典型的miRNA抑制剂是antagomir。本发明的antagomirs可以是化学工程寡核苷酸，其能够特异性有效地使一种或多种miRNA表达沉默。antagomirs可以是与胆固醇结合的单链RNA分子，拥有大约21-23个核苷酸的长度，与至少一种成熟靶miRNA互补。

本发明的miRNA抑制剂可以通过比如靶向结合基因组序列、前体序列，阻止该基因或者miRNA自身的转录，或者引起miRNA或其前体降解，从而使得内源性或外源性miRNA基因的表达或者功能受到抑制或沉默。比如，抑制剂可以是干扰RNA(RNAi)、短干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、双链RNA(dsRNA)、反义寡核苷酸(RNAor DNA)、吗啉或肽核酸(PNA)。一方面，miRNA抑制剂可以是单链RNA、DNA或者PNA，其结合到miRNA上，生成dsRNA、DNA/RNA杂交体，或者RNA/PNA杂交体，这些杂交体随后被降解。另一方面，miRNA抑制剂可以是单链RNA、DNA或者PNA，其结合到miRNA上，生成dsRNA、DNA/RNA杂交体，或者RNA/PNA杂交体，从而阻止miRNA与靶序列结合。

miRNA抑制剂可是大约17至25个核苷酸的长度(此间的任何范围)，包括一段与成熟miRNA的5’到3’序列至少90％互补的5’到3’序列。

在本发明的另一方面，miRNA抑制剂可以用能够引起miRNA被降解或者被隔离成细胞腔隙或者细胞器的序列或者基团进行标记，以致miRNA分子不能与靶序列相结合。比如，miRNA抑制剂可用一个能够导致miRNA从细胞中被驱逐出来的分泌信号进行标记。此外，miRNA抑制剂也可使用能够导致miRNA被降解的泛素(ubiquitin)进行标记。

miRNA抑制剂可以降低miRNA的活力以减少细胞或组织中多肽的翻译，比如加性能力。在本发明的另一方面，miRNA抑制剂可以降低miRNA的活力以减少细胞或组织中多肽的翻译，比如协同能力。

在某方面，可以充当miRNA调节因子的成分可以是RNA或DNA分子，其包含至少一种被修饰的核苷酸类似物，比如，一种天然存在的核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸被非天然存在的核苷酸所取代。被修饰的核苷酸类似物可以位于核酸分子的5’-末端和/或3’-末端。

核苷酸类似物可以选自糖-或骨架-修饰的核糖核苷酸。然而，应当指出的是，碱基修饰的核糖核苷酸也是合适的，如核糖核苷酸，其包含一种非天然存在的碱基来代替天然存在的碱基，比如，在尿嘧啶核苷或者胞嘧啶核苷的5-位修饰，如5-(2-氨基)丙基尿嘧啶核苷、5-溴尿嘧啶核苷；在腺嘌呤核苷和鸟嘌呤核苷的8-位修饰，如8-溴鸟嘌呤核苷；脱氮核苷，如7-脱氮腺嘌呤核苷；O-和N-烷基化的核苷，如N6-甲基腺嘌呤核苷。在糖-修饰的核糖核苷酸中，2′-OH基团被选自如下的基团取代：氢，OR，R，卤素，SH，SR，NH₂，NHR，NR₂或者氰基，其中，R是C₁-C₆烷基，烯基或者炔基，卤素是氟，氯、溴或者碘。在优选的骨架-修饰的核糖核苷酸中，与邻近的核糖核苷酸相连的磷酸酯基团被一种修饰基团所取代，比如硫代磷酸基团。应该指出的是，上述修饰方法可以结合使用。

治疗方法

本发明一方面涉及治疗以miRNAs水平的上调或者下调为特征的疾病的方法。一方面，本发明提供一种治疗受试者的葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病的方法，其特征在于，所述方法包括给所需受试者施用一种能够调节受试者的一种或多种细胞中的一种或多种miRNAs表达的成分或成分的混合物。

在一个实施方案中，所述治疗方包括施用一种能够下调miRNAs水平和/或上调所述miRNAs的靶分子的水平的成分或成分的混合物。

在本发明的一个实施方案中，涉及能够抵消所需的一种或多种细胞中的miR144或者miR450或者miR144和miR450的上调的治疗方法，如葡萄糖介导的被损伤的细胞。可以预期，本发明描述的小鼠或者大鼠miRNAs的结果可以应用于人类相应的miRNA。所述治疗方法包括施用抑制剂类成分，如反义分子，使其直接与超表达的miRNAs相互作用。

在一个实施方案中，本发明涉及治疗以miRNAs水平的下调为特征的疾病的方法。所述治疗方法包括施用一种或多种本发明的miRNA调节因子，以上调miRNAs水平和/或下调所述miRNA的靶分子的水平。本发明的一个实施方案涉及能够抵消糖尿病介导的损伤细胞中的一种或多种miR1，miR146a，miR200b或者miR320水平下调的治疗方法。

可以进一步预期，本发明描述的miRNA分子水平的上调和/或下调同样可以用于治疗、诊断或者筛选方法。所述治疗方法包括施用至少一种miRNA分子(比如一种miRNA分子或者多种miRNA的混合物)以补充缺乏的一种或多种miRNAs，或者补充所述一种或多种miRNAs表达的诱导物。

关于附图1-18和20，申请人发现在暴露于相对高浓度葡萄糖的内皮细胞中，和糖尿病哺乳动物受试者的视网膜中的miRNAs，如miR1，miR146a，miR200b和miR320的水平被下调。申请人还发现在糖尿病受试者的视网膜中至少miR144和miR450的水平被上调。(参见附图19)

因此，那些能够调节一种或多种miR1，miR146a，miR200b或者miR320水平的上调的成分，或者能够调节一种或多种miR144或miR450水平的下调的成分，可用于治疗葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病。在本发明中，葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病可以包括糖尿病慢性并发症，包括糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病或者糖尿病大血管病变。

比如，miR200b靶向作用于血管内皮生长因子的翻译，是一种血管生成调节因子，可以起到血管生成抑制剂的作用。由于血管内皮生长因子还能引起黄斑水肿，miR200b还可以起到血管渗透性增加抑制剂和水肿抑制剂的作用。如上所述，糖尿病视网膜病变的增生阶段的特征是逐步的微血管异常，如血管再生。因此，这些成分，包括miRNA或其类似物、其前体或其抑制剂在细胞或组织中表达或者向其中传送，将提供预防和治疗疾病的效果，尤其是对抗糖尿病视网膜病变。

可以预期，本发明的治疗方法可以与另一种治疗葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病的方法联合使用。

对于诊断或者治疗的应用，miRNA或者miRNA调节因子可以包含在组合物中，如药物组合物。所述药物组合物包括至少一种miRNA或者miRNA调节因子作为活性成分，和任选的一种药学上可接受的载体。

传递载体

本发明的寡核苷酸可以采用已知的方法施用，其中，核酸在体内或体外被引入预期的靶细胞内。

本发明的一方面包括一种核酸构建体，其包含在传递载体之内。传递载体是一种实体，核苷酸序列可以通过它从至少一种媒介运送到另一种媒介。传递载体通常被用于核酸构建体内部编码的序列的表达和/或构建体在细胞内的传递。在本发明的范围内，传递载体可以是选自下组的一种载体：基于RNA的载体、基于DNA的载体/载体、基于脂质体的载体、基于病毒的载体和基于细胞的载体。所述传递载体的例子包括：可生物降解的聚合物微球、基于脂质体的制剂如脂质体载体、带有构建体涂层的胶体金颗粒、脂多糖、多肽、多聚糖、聚乙二醇化的病毒载体。

在本发明的一个实施方案中，包括病毒作为传递载体，其中病毒可以选自：腺病毒，逆转录病毒，慢病毒，腺相关病毒，疱疹病毒，牛痘病毒，泡沫病毒，巨细胞病毒，塞姆利基森林病毒，痘病毒，RNA病毒载体和DNA病毒载体。这些病毒载体是现有技术中熟知的。

常用的基因转移技术包括磷酸钙法、二乙氨乙基-葡聚糖法、转染法、电穿孔法和病毒法[12，13，14，15，16]。另一种将DNA引入细胞中的技术是阳离子脂质体的使用[17]。可商业化获得的阳离子脂质体制剂如Tfx 50(Promega)或者Lipofectamin 2000(Life Technologies)。

本发明的组合物可以是如可注射的溶液、乳剂、软膏、片剂、悬浮液等。所述组合物可以通过适当的方式施用，比如通过注射，尤其是眼内注射，通过口服，局部，鼻内，直肠用药等方式。载体可以是任何合适的可药用载体。优选地，使用能够增加RNA分子进入靶细胞的能力的载体。这类载体的合适的例子如脂质体，尤其是阳离子脂质体。

在本发明的一方面，进一步包括药物组合物，其包括一种或多种miRNAs或miRNA调节因子，以一种适合体内给药的生物相容的方式给受试者施用。本发明的miRNA调节因子的施用可以降低糖尿病视网膜病变患者体内过度生成的一种或多种蛋白质的生成，和/或增加这些患者体内生成不足的一种或多种蛋白质的生成，因此减少了随着时间的推移葡萄糖-和/或糖尿病-相关的损伤。本发明的miRNAs可以在表达载体内提供，如前所述的制备成合适的药物组合物。

“适合体内给药的生物相容的方式”是指被施用的一种物质的形式，其疗效远远超过其毒性。施用治疗有效量的本发明的药物组合物，或者“有效量”是指在剂量和时间周期上能达到增加/减少蛋白质生成的预期效果所必需的量。一种物质引起预期响应的治疗有效量可因多种因素而变化，如疾病状态/健康状态、接受者的年龄、性别和体重、具体多肽、编码该多肽的核酸或重组病毒本身的活性等。可以调节给药方案以达到最佳的治疗响应。比如可以每日或者定期服用不同的剂量，和/或根据治疗情况的紧急程度所示按比例减少剂量。miRNA或者miRNA调节因子的给药量依赖于给药途径、给药时间，并根据个体的响应情况而变化。合适的给药途径是肌肉注射、皮下注射、静脉注射或者腹膜内注射、口服和鼻内给药。在糖尿病视网膜病变的情况下，首选向受试者视网膜内注射基于miRNA-和/或miRNA调节因子的组合物。本发明的组合物也可以通过植入的方式提供，用于持续的缓慢释放该组合物。

在糖尿病视网膜病变的情况下，本发明的基于miRNA-和/或miRNA调节因子的组合物可以采用眼内局部给药的方式，有效剂量范围为约5微升至约75微升，比如约7微升至约50微升，优选为约10微升至约30微升。本发明的miRNA在水溶液中非常易溶。当向眼内局部灌注miRNA的量超过75微升时，可能会通过溢出或排出的方式导致miRNA从眼中流失。因此，优选以约5微升至约75微升的量向眼内局部灌注较高浓度的miRNA(比如100-1000nM)。

一方面，肠胃外给药途径可以是眼内给药。本发明的基于miRNA-的组合物的眼内给药可以通过注射或者直接(如局部)向眼内给药的方式给药，只要该给药途径允许miRNA调节因子进入眼内即可。除了上述的眼内给药的局部途径外，合适的眼内给药途径还包括玻璃体内给药，视网膜内给药，视网膜下给药，眼筋膜囊内给药、眼周-和球后给药、经角膜给药和经巩膜给药。这些眼内给药途径都属于现有技术的范围[18-21]。

诊断方法

在一个实施方案中，本发明还涉及诊断方法，所述方法是利用葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病中，包括糖尿病慢性并发症中，某些miRNAs的表达谱与已知的正常标准之间的差异而进行的。比如，可以检测生物样本中miRNAs的出现或者缺失，如组织切片或者血液等体液，以便确定和分类某些细胞类型或者组织类型，或者以miRNA-分子或者miRNA-分子模式的差异化表达为特征的miRNA-相关疾病。此外，还可以通过测定miRNA-分子的暂时性的表达来分类细胞发育阶段。

在本发明的一个实施方案中，提供一种诊断受试者疾病的方法，所述疾病是葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病。本发明的诊断方法可以包括测量来自受试者的样本内的一种或多种miRNAs的表达谱，其中，受试者样本的miRNA表达谱与正常样本或者参考样本的miRNA表达谱之间的差异就是葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病的指征。所述的一种或多种miRNAs可以选自miR1，miR146a，miR200b，miR320，miR144或者miR450。

葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病可以包括糖尿病慢性并发症，包括糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病或者糖尿病大血管病变。

一方面，本发明的诊断方法是诊断受试者的糖尿病视网膜病变的方法。

以上披露的信息是本发明内容的一般性描述。参考以下的具体实施例将对本发明内容有更加完整的理解。这些实施例仅用于说明本发明的内容，不意味着对本发明的范围进行限定。根据具体情况而做出的形式上的变化和等同替代是可以预期的。虽然本发明中使用了专业术语，但这些术语只是为了说明的目的，而不是对本发明内容进行限定。

实施例

实施例仅用于说明本发明的内容，不意味着对本发明的范围进行限定。

实施例1

1.材料和方法

实验动物

C57BL/6J小鼠购自Jackson laboratories(Bar Harbor，Maine，USA)。从6周龄开始，将小鼠随机分为二组。一组雄性小鼠通过腹膜内注射链脲佐菌素制造糖尿病模型【隔日注射50mg/kg，连续注射三次，柠檬酸盐为缓冲液，pH＝5.6】。同窝出生的性别匹配的小鼠作为对照，注射等量的柠檬酸盐缓冲液。连续两天血糖水平＞20mmol/L即被定义为糖尿病(Freestyle Mini，TheraSense Inc.，Alameda，CA，USA)。给予实验动物标准的啮齿动物的饮食和水，随意采食，监测高血糖、糖尿和酮尿(Uriscan Gluketo^TM，Yeong Dong Co.，Seoul，South Korea)[22-25]。没有任何动物接受外源性胰岛素。动物(n＝6例/每组)患糖尿病二个月后处死。取视网膜组织进行解剖和快速冷冻。

db/db小鼠(一种2型糖尿病模型)及对照小鼠均购自Jackson laboratories。开始患糖尿病后(血糖评估)继续跟进二个月。连续二个月监测代谢参数，体重，尿糖，尿酮等。这一时期结束时，处死小鼠采集视网膜组织。提取和分析miRNA(方法见下文)。

雄性SD大鼠(200-250克)从Charles River Colony获得，被随机分为对照组和糖尿病组。糖尿病诱导和监测的方法已在上文描述[22-24]。4周后，处死动物(n＝6例/每组)，快速冷冻视网膜组织进行基因表达和微小RNA分析，或者将其放置在10％福尔马林中进行石蜡包埋。

人类组织

将从福尔马林固定石蜡包埋组织中获得的5μm视网膜组织切片采集到带正电荷的载玻片上，该组织来自伦敦健康科学中心的档案中的手术摘除的眼球。采集该组织前已获得伦理委员会批准。此实验材料是从因非治疗原因摘除眼球的糖尿病个体和非糖尿病个体中采集的。该切片进行白蛋白染色以测试渗透性，并进行LNA^TM-ISH分析以获得miR200b定位(见下文)。

内皮细胞

将显示出葡萄糖诱导的异常的人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs；American Type CultureCollection，Rockville MD)，以2,500细胞/cm²的浓度接种到内皮细胞生长培养基上(EGM)(Clonetics，Rockland，ME)。EGM中添加10μg/l的重组人表皮生长因子，1.0mg/l的氢化可的松，50mg/l的庆大霉素，50μg/l两性霉素B，12mg/l牛脑提取液，和10％胎牛血清。当细胞出现80％融合时，向培养基中添加合适浓度的葡萄糖。除非另有说明，所有的实验都在加葡萄糖培养24小时后进行。添加葡萄糖前30分钟加入抑制剂。每个实验至少需要三批不同批次的细胞，进行三组平行试验。采用2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸基苯基)-2氢-四氮唑(WST-1；Roche，Laval，PQ)测定细胞存活率和增殖。这种比色定量测定细胞增殖和细胞存活率的方法，是建立在线粒体脱氢酶催化的四氮唑盐WST-1的裂解的基础上的。简要地说，人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)以1.0x104细胞/每孔的密度接种于96孔板，在100μl培养基中添加或者不添加特定试剂培养24小时。每孔添加10μl WST-1并在37℃条件下培养4小时。测量450nm波长下的吸光率[26-28]。

通过VEC技术(Rensselaer，NY)获得的牛视网膜毛细血管内皮细胞(BRECs)在纤维连接蛋白涂层烧瓶中的规定的EC生长培养基(MCDB-131complete，VEC Technologie)中生长。转染前24小时，所述细胞在带有纤维连接蛋白涂层的6孔板(Sigma，USA)中传代。培养条件已有其他人在前期报道过[29]。

HEK293A细胞也是从ATCC公司获得，按照他人前期报道过的方法使用[30]。所有细胞培养实验都是进行三组平行实验，重复4次或以上。除非另有规定，所有试剂都是购自SigmaChemicals(Sigma，Oakville，Ontario，Canada)。

miRNA表达的微阵列分析

微小RNA采用mirVana miRNA提取试剂盒(Ambion Inc.，Austin，TX，USA)从内皮细胞和视网膜组织中提取得到。简而言之，该组织在裂解/结合液(Lysis/Binding solution)中成为匀浆。将miRNA添加剂(1∶10)和等体积的酸酚∶氯仿加入裂解液中并在冰上培养10分钟。随后离心，去除水相，混合物在乙醇中培养。将该混合物通过滤芯过滤和洗脱液洗脱。

视网膜miRNA分析采用Asuragen公司的定制分析服务。该分析采用Agilent miRNAArrays(http://assuragen.com)。

采用基于PCR的miRNA阵列分析来检测暴露于葡萄糖的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)中miRNAs表达的改变情况，该分析是根据制造商的使用说明书采用TaqMan^TMPCR系统进行的。

miRNA的实时聚合酶链式反应(RT-PCR)分析

使用mirVana试剂盒(Ambion Inc.，Austin，TX，USA)分离miRNA。采用实时聚合酶链式反应验证阵列数据。引物(表2)购自Ambion Inc.(Austin，TX，USA)。最终的反应体积为20μL，加入下列试剂：10μL TaqMan 2×Universal PCR Master Mix(No AmpErase UNG)，8μL无核酸酶纯水(Nuclease-free water)，1μL TaqMan microRNA探针和1μL cDNA产物。数据归一化到RNU6B水平以解释逆转录效率和反应混合物中的模板量的差异。

蛋白质印迹

内皮细胞和视网膜组织经均质化、离心和在冰冷的RIPA裂解缓冲液(0.5M Tris-HCl，pH7.4，1.5M氯化钠，2.5％去氧胆酸，10％NP-40，10mM EDTA)中悬浮。随后将细胞裂解液超声降解，蛋白质通过BCA测定法(Pierce Endogen，IL，USA)来定量。为证实有丝分裂原激活的蛋白激酶-细胞外信号调节激酶(MAPK(ERK1/2))(New England Biolab)的表达，将30μg蛋白质加载到10％SDS-PAGE上进行分离，并在PVDF膜上(BIO-RAD Hercules，CA，USA)染色过夜。非特异性位点用5％的脱脂牛奶粉末的TBS溶液封闭。随后分别使用1∶1000和1∶5000的稀释剂与HRP辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(Santa Cruz Biotechnology Inc.，CA，USA)一起培养。含有MEF2的裂解液采用增强的化学发光蛋白质印迹检测系统(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ，USA)和Alphaimager 2200显现。使用相同的膜测定β-肌动蛋白(β-actin)的表达作为内参。

miRNA模拟物转染

使用转染试剂(Qiagen，ON，Canada)将内皮细胞用miR146a，miR200b，和miR320(20nM)的miRIDIAN^TM微小RNA模拟物(DHARMACON Inc.，Chicago，IL，USA)转染。构建体从Dharmacon Inc.公司定制。相关的寡核苷酸序列，以C.elegans miRNA为基础采用与miRIDIAN微小RNA模拟物类似的设计和修饰方法，用作阴性对照miRNA(20nM)以控制转染(在本文中也称作阴性转染)。miRNA的转染效率通过实时聚合酶链式反应(RT-PCR)测定。

视网膜转染：使用链脲佐菌素(STZ，65mg/kg，溶于柠檬酸盐缓冲液，腹膜内注射，对照组只注射缓冲液)在雄性斯普拉-道来(SD)大鼠中诱导糖尿病。连续两天的血糖水平＞20mmol/L即被定义为糖尿病，通过测试血糖来确认糖尿病。实验动物的治疗方法为，将溶于转染试剂的1.4μg miR146a或miR200b(总量为10μl)注入每只大鼠的右玻璃体腔内，每周一次持续四周。等量的溶于转染试剂的对照miRNA(无任何特异性结合的非特异性微小RNA)注入实验动物的左眼内。最后一次注射过后的一个星期，将实验动物处死并采集视网膜组织。将视网膜组织解剖，用来提取总RNA和miRNA进行在实时聚合酶链式反应(RT-PCR)分析或微小RNA分析。

对照组大鼠注射相同体积的生理盐水和Lipofectin Reagent

定制的miR模拟物或者antigomirs由Dharmacon公司合成，以hsa-miR200b的成熟微RNA的序列(SEQ ID NO.3)和序列打乱的对照物5’UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA3’；SEQ ID NO.7)为基础合成。玻璃体内p300siRNA注射在前期已经被报道过[31]。5个星期后处死动物，按照如上所述的方法采集视网膜组织。

细胞存活率

通过台盼蓝排染法检测细胞存活率。台盼蓝染色剂现用现配，将0.4％的台盼蓝溶液溶于0.9％的氯化钠中既得。细胞在PBS中洗涤，经胰蛋白酶消化和离心处理。将20微升的细胞悬液加入到20μL台盼蓝溶液中，用Burker细胞仪显微镜下计数有500个细胞。细胞存活率以台盼蓝阴性细胞在未处理的对照组中所占的百分比例来表达[26-28]。

萤光素酶检测

a)VEGF：使用分别在正向和反向携带Sac I和Hind III酶切位点的大鼠和人类基因组的VEGF 3’UTRs。人类VEGF的3’UTR克隆的引物在下文列出。3′UTRs和互补序列的扩增子在pCR

2.1载体中克隆，并在DH5α感受态细胞(Invitrogen，Burlington，ON，Canada)中扩增并经测序的方法证实。插入的靶基因被亚克隆到pMIR-REPORT^TM载体(Ambion，Austin，TX，USA)内，在DH5α感受态细胞(Invitrogen)中扩增并经测序的方法证实。将pMIR VEGF3′UTR，一种miRNA模拟物和pMIR-Report β-半乳糖苷酶内参质粒共转染到293A细胞中。通过PCR突变技术引入核苷酸代替物得到突变位点。转染48小时后，按照制造商的使用说明的指示采用双荧光素酶报告基因检测系统(Applied Biosystems)测试荧光素酶活性。使用Chemiluminescent SpectraMax M5(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)读取荧光素酶活性数据。通过按照制造商的使用说明测定β-半乳糖苷酶内参的活性，将荧光素酶活性归一化为转染效率。进行三组平行实验[30]。

人和大鼠VEGF的3’UTR突变克隆的引物是：

人VEGF 5’端

正向引物：5’AGAGCTCCCCGGCGAAGAGAAGAGAC 3’(SEQ ID NO.8)

反向引物：TCTAGAAAGCTTGGAGGGCAGAGCTGAGTGTTA 3’(SEQ ID NO.9)

大鼠VEGF

正向引物5’AGAGCTCGGGTCCTGGCAAAGAGAAG 3’(SEQ ID NO.10)

反向引物5’TCAAGCTTGGAGGGCAGAGCTGAGTGTTA 3’(SEQ ID NO.11)

b)纤维连接蛋白(FN)：FN1 3’-UTR和miR146a的反义序列(或称序列打乱的对照物)与pMIR-REPORT荧光素酶载体(载体)和含有B-半乳糖苷酸(B-gal)并带有CMV启动子的pMIR报告对照载体在293A细胞中共转染。转染48小时后，对细胞提取物进行荧光素酶表达分析。相应的启动子活性以发光单位的形式表达，归一化为β-半乳糖苷酶的水平。

在荧光素酶报告实验中，617bp的人纤维连接蛋白(FN)3’-UTR片段和644bp的大鼠FN3’-UTR片段分别从人和大鼠的cDNA开始通过PCR技术进行扩增，并迅速通过荧光素酶终止密码子下游的Sac I和Hind III位点插入到带有CMV启动子的pMIR REPORT荧光素酶载体(Applied Biosystems Inc，CA，USA)中。将pMIR_FN 3’UTR，miR-200b模拟物(或称序列打乱物)和pMIR REPORT荧光素酶载体和含有B-半乳糖苷酸(B-gal)并带有CMV启动子的报告对照载体共转染到293A细胞中，转染48小时后，按照制造商的使用说明使用双荧光素酶报告基因检测系统(Applied Biosystems)测量荧光素酶活性。使用ChemiluminescentSpectraMax M5(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)读取荧光素酶活性数据。按照制造商的使用说明测定β-半乳糖苷酶内参的活性，将荧光素酶活性归一化为转染效率。进行三组平行实验[30]

使用下组的引物生成特定片段：

人FN 3’UTR，

正向引物，5’-AGAGCTCATCATCTTTCCAATCCAGAGGAAC-3’；(SEQ ID NO.12)

反向引物，5’-TCAAGCTTTAATCACCCACCATAATTATACC-3’；(SEQ ID NO.13)

大鼠FN 3’-utr，

正向引物，5’-AGAGCTCTCCAGCCCAAGCCAACAAGTG-3’；(SEQ ID NO.14)

反向引物，5’-TCAAGCTTTCCACAGTAGTAAAGTGTTGGC-3’(SEQ ID NO.15)

带下划线的序列表示限制性内切酶的酶切位点。

RNA提取和实时聚合酶链式反应(RT-PCR)

如前期描述的方法，采用TRIzolTM试剂(Invitrogen Canada Inc.，ON，Canada)提取RNA[26-28，31]。总RNA(2μg)用于合成cDNA，使用oligo(dT)引物(Invitrogen Canada Inc.，ON，Canada)。通过加入Superscript^TM反转录酶(Invitrogen Canada Inc.，ON，Canada)实现反转录。得到的cDNA产物于-20℃下保存。使用LightCycler(Roche Diagnostics Canada，QC，Canada)进行实时定量RT-PCR分析。最终反应体积是20μL，加入了下列试剂：10μL SYBR^TM Green TaqReadyMix(Sigma-Aldrich，ON，Canada)，1.6μL 25mmol/L氯化镁，正向引物和反向引物各1μL(表2)，5.4μL水，和1μL cDNA。采用熔点曲线分析来确定具体的扩增产物和引物二聚体的熔融温度(TM)。每种基因的具体的熔融温度被用于信号采集步骤(比熔融温度低2-3℃)。数据归一化到18S RNA或者β-肌动蛋白mRNA的水平以解释逆转录效率和反应混合物中的模板量的差异。

表2.RT-PCR的寡核苷酸序列

对于ET-1SEQ ID NO 24：使用小沟结合物探针(Taqman；Applied Biosystems，Foster City，CA)以避免来自非特异性扩增产物的信号采集。这些探针的5′末端加入6-羧基荧光素(FAM)修饰，3′末端加入非荧光猝灭基因(MGBNFQ)修饰。随后的过程中，FAM被Taq DNA聚合酶的外切酶活性切除，同时观察到报告基因荧光发射增强。该报告基因荧光染料(FAM，Taqman，Applied Biosystems)像SYBR I一样具有激发和发射在相同的波长范围的特点，因此可以用相同的检测器检测。因此，该一端带有FAM另一端带有MGBFNQ的ET-1探针有一段额外的序列。

酶联接免疫吸附剂测定(ELISA)

根据制造商的使用说明使用市售的人和大鼠血管内皮生长因子试剂盒(ALPCO，Salem，NH，USA；R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)进行血管内皮生长因子的酶联接免疫吸附剂测定。

通透性实验

将人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)接种到24-孔板中的插入物(1μm探针)上，加入或者不加入特定试剂培养24小时，然后根据制造商的说明书使用体外血管通透性分析试剂盒(In Vitro Vascular Permeability Assay Kit)(Millipore，Billerica，MA，USA)测定血管的通透性。

血管生成分析

使用体外血管生成分析试剂盒(in vitro Angiogenesis Assay Kit)(Chemicon，Billerica，MA，USA)来评价人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)的管腔形成。在Leica Microsystems倒置显微镜上用Infinity Capture Application Version 3.5.1软件通过分支点计数法来量化管腔形成[33]。

免疫组化

使用抗人白蛋白抗体(1∶500)(Abcam，Inc，Cambridge，MA，USA)对大鼠和人视网膜切片进行白蛋白免疫组化染色以检查血管通透性增加。这些方法前期已被公开[25]。

原位杂交

标记大鼠和人的视网膜组织切片以测定mir200b的表达。将福尔马林固定，石蜡包埋的五微米厚的视网膜组织切片转移到带正电的载玻片上，用于标记。使用一种5’和3’双DIG-标记的定制汞LNA^TM miRNA探针(Exiqon，Vedbaek，Denmark)和原位杂交(ISH)试剂盒(Biochain Institute，Hayward，CA，USA)测定miR200b的表达[34]。

统计分析

所有的实验数据都以平均值±SD的形式表达，进行方差分析和事后分析或t-检验分析。P值小于或等于0.05被认为是显著的。

2.结果

a.糖尿病大鼠视网膜的微小RNA(miRNA)阵列分析

糖尿病引起视网膜中miRNA表达改变

本工作是在这样的假设下完成的，即糖尿病的关键基因的表达可能，部分地受到miRNAs的调节，因此申请人首先寻找在糖尿病中表达改变的miRNAs。为此，申请人使用一种糖尿病慢性病动物模型。链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠中出现了糖尿病视网膜病变(DR)的分子的、早期结构的和功能的改变[32-34]。对患糖尿病1个月的链脲佐菌素(STZ)诱导的雄性糖尿病大鼠的视网膜组织进行微阵列分析，同时对年龄和性别相匹配的对照组进行分析，以检测糖尿病视网膜病变(DR)中miRNA的改变。糖尿病动物显示出高血糖(糖尿病组血浆葡萄糖为19.2±4.7mmol/L而对照组为7.0±0.8m.mol/L，P＜0.005)和体重减轻(糖尿病组的体重为372.0±34.7g而对照组为445.7±17.4g.P＜0.01)的症状。对从这些组织中提取的miRNAs进行微阵列分析(图1)。该分析显示这些动物的视网膜组织内有多种miRNAs的表达发生改变(图1)。使用开源软件(www.TargetScan.org，www.microrna.org，www.ebi.ac.uk1)进行miRNA靶点预测，糖尿病视网膜病变(DR)中发生改变的已知基因/蛋白相关的miRNAs已得到确认。

图1是miRNA的阵列-散点图，显示出对照组与处理组(糖尿病组)大鼠视网膜中miRNA的改变情况。

图1中的每个圆圈代表一个miRNA。每个探针圆圈的大小与整个实验的miRNA检测率成比例，较大的点代表较高的百分比。根据两组中探针的平均表达并参考圆圈右侧的灰度等级为圆圈着色。左侧-1差异线和右侧1差异线之间的圆圈被认为呈现倍数变化＞2X(x-轴是两个实验组之间倍数变化的log2值)。与对照组相比，糖尿病组大鼠视网膜中的miRNAs，miR1，miR146a，miR200b和miR320的表达被下调，而miR144和miR450的表达被上调[使用Asuragen miRNA系统自定义分析]。

b.暴露于高浓度葡萄糖的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中的miR320的表达水平

研究了暴露于高浓度葡萄糖的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中的miR320的表达水平的实时定量聚合酶链式反应(PCR)分析。结果如图2所示。图2a)组显示出暴露于25mM葡萄糖(高浓度葡萄糖，HG)的内皮细胞中的miR320的表达量比暴露于5mM葡萄糖(低浓度葡萄糖，LG)的内皮细胞中的表达量有统计学意义上的显著减少。这种miR320表达水平的下调与纤维连接蛋白(FN，图2b))，内皮素-1(ET-1，图2c))和血管内皮生长因子(VEGF，图2d))mRNAs的统计学意义上的上调；以及有丝分裂原激活的蛋白激酶-细胞外信号调节激酶(MAPK(ERK1/2))的激活相关(图2e))。miR320模拟物(miR320)转染阻止了这种非正常的上调，而阴性转染(Neg)没有此效果(图2，b)-e)组)。在糖尿病视网膜病变中，细胞外信号调节激酶(ERK)的激活是一个重要步骤[28]。

c.暴露于高浓度葡萄糖的内皮细胞中和糖尿病大鼠视网膜中的miR146a的表达

通过实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术验证了图1所示的糖尿病大鼠视网膜中miR146a表达水平的下调。研究了暴露于高浓度葡萄糖的人脐静脉内皮细胞中(图3，a))和大鼠视网膜(图4，a)组和b)组)中miR146a表达水平的实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析。如图3a)所示，与暴露于5mmol/L葡萄糖组相比，暴露于25mmol/L葡萄糖组的人脐静脉内皮细胞中的miRNA 146a表达下调。与暴露于5mmol/L葡萄糖组相比，暴露于25mmol/L葡萄糖组的内皮细胞(ECs)中的FN mRNA(图3b))和FN蛋白(图3c))表达下调。用miR146a模拟物(但不是序列打乱的模拟物)转染内皮细胞可以使得高浓度葡萄糖诱导的miR146(图3a))的下调和FN mRNA(图3b))和FN蛋白的上调恢复正常(图3c))。用miR146a模拟物转染内皮细胞(HG+mi146a)也可以阻止内皮素-1mRNA(图3d))的上调，而阴性转染(HG+Neg)没有此效果(图3d))(参见上述对阴性转染的解释)。在图3a)中，与转染序列打乱的模拟物的对照组相比，经miR146a模拟物转染的人脐静脉内皮细胞中miR146的表达量增加体现了miR146a模拟物的转染效率。

在糖尿病大鼠眼睛的玻璃体腔内注射miR146模拟物可以使得糖尿病诱导的miR146a和纤维连接蛋白(FN)的上调恢复正常，纤维连接蛋白(FN)是糖尿病视网膜中表达增加的重要分子之一(图4)。链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠的视网膜组织与年龄和性别匹配的对照组(C)相比，糖尿病大鼠组(D)显示出miR146a表达水平减少(图4a))。而糖尿病大鼠视网膜组织中的FN mRNA(图4c))和蛋白(图4d))的水平上调。向玻璃体内注射miR 146a模拟物(D+miR146a)可以阻止糖尿病诱导的FN mRNA和蛋白的上调，而注射序列打乱的模拟物的对照物组(D+SC)并没有出现这种效果。图4b)显示了玻璃体内给药的效率，其中向玻璃体内注射miR146a模拟物(而不是序列打乱的模拟物)引起视网膜中miR146a表达上调。[数据分别以A)RNU6和B)18S的比值的形式表达，*代表与相应的C组相比具有显著差异，n＝5例/组]。

为了进一步验证miR146a靶向作用于FN，申请人考察了miR146a与FN1基因的3’UTR的结合。来自人和大鼠FN1 3’-UTR(分别在不同试验中完成)的含有miR146a互补位点的荧光素酶报告基因，和miR146a的反义序列(或称序列打乱的对照物)与pMIR REPORT荧光素酶载体(载体)和带有CMV启动子并含有β-半乳糖苷酸的pMIR报告对照载体在HEK-293A细胞中共转染。转染48小时后，分析细胞提取物中荧光素酶的表达。启动子的相对活性以发光单位的形式表达，归一化为β-半乳糖苷酶的水平。基于生物信息学预测(www.TargetScan.org，www.microrna.org，www.ebi.ac.uk1)研究了FN 3’UTR序列与成熟miR146a序列的对比图。成熟miR146a的5’末端是种子序列，与FN的3’UTR的7个核苷酸有很好的互补性(图5a)。miR146a与FN启动子结合的荧光素酶报告分析表明，FN的3’UTR与来自人(图b))和大鼠(图c))的含有miR146a互补位点的miR146a荧光素酶报告基因呈剂量依赖性的结合。

图6a)是对照大鼠视网膜组织的LNA^TM-ISH研究的显微照片，显示了miR146a的定位。图6b)的高倍显微镜照片显示了视网膜毛细血管的阳性染色(箭头)。图6c)是糖尿病大鼠视网膜组织的LNA^TM-ISH研究的显微照片，显示了miR146a在毛细血管内的最小表达量(如果有的话)，表明糖尿病诱导的血管通透性(用碱性磷酸酶(ALK Pho)作为色原体，不加复染剂。)。

miR146a调节葡萄糖诱导的核因子kb(NFKb)的活力

如图7所示，miR146a模拟物(miR146a)转染阻止了内皮细胞(ECs)中葡萄糖诱导的核因子kb(NFKb)的激活。核因子kb(NFKb)的激活是糖尿病视网膜病变(DR)的重要步骤[27，31]。

小鼠糖尿病视网膜病变中发现miR146a水平下调(2型糖尿病模型)

如图8所示，研究者通过实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析进一步证明，与年龄和性别匹配的对照组(C)的miR146a水平相比，db/db糖尿病组小鼠(db/db)(一种2型糖尿病模型)视网膜组织中的miR146a水平具有统计学意义上的显著下降。

d.miR200b

糖尿病引起视网膜中miR200b水平下调

实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析证实了图1中所示的糖尿病大鼠视网膜中miR200b水平的下调(图9c))。miR200b是一种血管内皮生长因子(VEGF)靶向miRNA。实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和酶联接免疫吸附剂测定(ELISA)(图9a)和b))显示糖尿病大鼠视网膜组织中VEGF mRNA和蛋白质水平升高。miR200b族的其他成员，即miR429，在糖尿病环境中未发生显著变化，miR-200a不靶向于VEGF。因此，糖尿病视网膜病变(DR)中miR200b的下调和VEGF的上调就建立起了一种联系。为测试miR200b和VEGF之间联系的特异性，申请人考察了纤维连接蛋白(FN)是否受到miR200b的调节，FN是基于另一种生物信息学的糖尿病视网膜病变(DR)中的miR200b和蛋白质的靶。然而，没有直接数据显示FN受到miR200b的调节(数据未附上)。

miR200b调节内皮细胞中葡萄糖诱导的血管内皮生长因子水平的上调

为建立miR200b和血管内皮生长因子(VEGF)之间的因果关系，申请人首先使用一种体外模型系统。由于内皮细胞(ECs)是糖尿病视网膜病变(DR)中最初的细胞靶点，申请人使用培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)来研究miR200b改变的机理方面和功能方面的意义。已有研究表明，暴露于高浓度葡萄糖的内皮细胞(ECs)(模拟高血糖)呈现了糖尿病血管病变的分子的和功能的特征[26-28]。申请人发现高浓度葡萄糖引起miR200b水平改变。25mmol/LD-葡萄糖(HG)(与5mmol/L D-葡萄糖(LG)相比)能够引起miR200b水平的显著下调(图10a))。通过VEGF表达的剂量-反应分析(数据未附上)以及申请人和其他人的前期实验研究来确定葡萄糖的剂量[35，30，36]。当内皮细胞(ECs)暴露于25mmol/L L-葡萄糖时未观察到miR200b水平的改变(图10a)，OSM)。当暴露于高浓度葡萄糖(HG)时miR200b表达减少，而VEGF的mRNA和蛋白质的表述却增加了(通过qRT-PCR和ELISA测量)。这种增加可以被miR200b模拟物转染所阻止。另一方面，miR200b antigomir转染却能够上调VEGF的转录而表现出模拟葡萄糖的效果(图10b))。

为了进一步建立本文中的这些糖尿病视网膜病变的研究结果之间的直接联系，申请人考察了在糖尿病毛细血管内皮细胞中是否会出现类似的变化。结果显示，25mmol/L D-葡萄糖(HG)(与5mmol/L D-葡萄糖(LG)相比)引起miR200b的显著下调(图10d))。在平行试验中，暴露于高浓度葡萄糖后，VEGF mRNA的水平上调(图10e)。miR200b模拟物转染可阻止葡萄糖诱导的VEGF水平上调(图10e)。

miR200b调节内皮细胞中葡萄糖诱导的功能改变

申请人接下来考察了内皮通透性和管腔形成，这是VEGF在本系统中的典型的功能效果。经过高浓度葡萄糖和VEGF肽处理后人脐静脉内皮细胞(HUVECs)显示出通透性增加和管腔形成增加。(图11a)-d))。为了考察miR200b的功能上的意义，我们在暴露于高浓度葡萄糖的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中转染了miR200b模拟物(和序列打乱的对照物)。通过分析miR200b在这些细胞中的表达量来确认转染效率(图10c))。转染后，我们观察到葡萄糖诱导的VEGF的上调恢复正常，而高浓度葡萄糖诱导的内皮通透性和管腔形成却被放大(图10b)-c))(图11a)-d))。这些实验结果确立了miR200b对高浓度葡萄糖诱导的VEGF的表达及其功能性后果的直接调节关系。

为了进一步验证miR200b靶向作用于VEGF，申请人考察了miR200b与VEGF基因的3’UTR的结合。来自人和大鼠(分别在不同试验中完成)的含有miR146a互补位点的荧光素酶报告基因的FN1 3’-UTR，和miR146a的反义序列在HEK-293A细胞中共转染。

图12a)显示了基于生物信息学预测的(www.TargetScan.org，www.microrna.org，www.ebi.ac.uk1)VEGF 3’UTR序列(和突变的VEGF 3’-UTR)与成熟miR200b序列的对比图。成熟miR200b的5’末端是种子序列，与VEGF的3’UTR的7个核苷酸有很好的互补性。图12b)(人类)和图12c)(大鼠)显示，miR200b的异常超表达显著抑制了VEGF 3’UTR的荧光素酶活性，表明二者之间的直接结合。当使用VEGF突变的3’-UTR(图12b)和c)分别是VEGFH突变和VEGFR突变)时未发现这一效果。

miR200b在视网膜中存在并调节糖尿病诱导的视网膜VEGF水平上调

已在体外确立了miR200b的VEGF靶向性，申请人随后测试了在糖尿病动物模型中miR200b是否还靶向作用于VEGF。miR200b模拟物注射到糖尿病大鼠一只眼睛的玻璃体腔内，1.4μg/周，连续注射4周(另一只眼睛注射同样剂量的序列打乱的对照物)。在另一组实验中，申请人将miR200b antigomirs通过玻璃体内注射到非糖尿病大鼠眼中，以制造类似糖尿病的效果。与注射序列打乱的对照物的糖尿病大鼠相比，注射miR200b模拟物的糖尿病大鼠视网膜中的VEGF mRNA和蛋白的水平显著降低。(图a)，b))。另一方面，注射antigomir的非糖尿病大鼠视网膜中的VEGF mRNA和蛋白的水平增加(图13a)，b))。

为研究通透性的变化，采用前期已公开过的白蛋白免疫染色实验测量视网膜血管中白蛋白的渗透[25，32]。图14a)是对照大鼠视网膜组织的LNA^TM-ISH研究的显微照片，显示了miR200b在视网膜毛细管(箭头)，神经节细胞(楔形箭头)，内核层细胞(双楔形箭头，在神经胶质和神经元内；插图为带有细胞质和细胞核miR200b定位的毛细管放大图(箭头处))中的定位。图14b)是糖尿病大鼠视网膜内的视网膜组织(定位相似)的LNA^TM-ISH研究的显微照片，显示了miR200b的最小表达量(如果有的话)，表明糖尿病视网膜中miR200b的缺失。图14c)是用抗白蛋白抗体对对照大鼠视网膜进行免疫细胞化学染色的显微照片，显示了血管内出现白蛋白(箭头)。图14d)是在糖尿病大鼠视网膜中进行与图14c)类似的染色，结果出现血管内反应(箭头)和视网膜的弥漫着色，说明血管通透性增加。miR200b模拟物注射可以阻止这种糖尿病诱导的血管通透性增加。在图14e)中，玻璃体内注射miR200b后，仅在血管内的间隔中出现白蛋白染色(箭头处)。注射序列打乱的miR200b后未出现这一效果(数据未附)(在LNA^TM-ISH实验中，用碱性磷酸酶(ALK Pho)作为色原体，不加复染剂。在白蛋白染色中使用DAB色原体和苏木精复染剂)。

葡萄糖诱导的miR200b减少调节转录共激活因子p300的上调

已有研究表明，miR200b通过控制p300，一种转录共激活因子，来调节恶性肿瘤中上皮细胞向间质细胞的转变[35-37]。研究发现，糖尿病视网膜病变(DR)中和暴露于葡萄糖的内皮细胞中p300增加(见图15a))[26，31，33]。申请人随后研究了高血糖症是否能够通过miR200b改变p300。申请人发现，miR200b模拟物转染阻止了内皮细胞中高浓度葡萄糖(HG)诱导的p300上调(图15a))。但是，葡萄糖诱导的内皮细胞中miR200b的下调并不能通过p300的沉默而得到校正(图15b))。为了进一步考察体内miR200b的某些作用机制是否是通过p300的调节而受到调节的，我们考察了玻璃体内注射miR200b模拟物之后视网膜组织中p300mRNA的表达水平。如图15c)所示，通过注射miR200b能够阻止糖尿病诱导的视网膜中p300mRNA的上调，提示了miR200b作用于血管活化因子的另一种可能的机理。

实施例2

目的：为了研究人糖尿病视网膜病变中miRNA是否也随着其靶标的改变而发生类似的改变。(2)为了研究内皮细胞中或者糖尿病动物中发生的变化是否也发生在人增生性糖尿病视网膜病变中。从患有已知视网膜病的糖尿病和非糖尿病个体尸体解剖中获取的视网膜组织在死亡6小时内采集。

人糖尿病视网膜病变中miR200b的表达下调

申请人采用原位杂交技术和免疫染色法考察了来自档案资源的离体眼球中的人视网膜。申请人发现，糖尿病人样本视网膜中miR200b表达减少而血管外白蛋白增加。miR200b在细胞内的分布与在大鼠眼中的分布类似(参见图16的显微照片)。

图16a)是来自非糖尿病人视网膜中的视网膜组织的LNA^TM-ISH研究的显微照片，显示了miR200b在视网膜毛细血管(箭头)和内核层细胞(双楔形箭头)中的定位。图16b)是糖尿病人视网膜中的视网膜组织的显微照片(与a)组中定位相似)，显示miR200b的最小表达量(如果有的话)。图16c)是用抗白蛋白抗体对非糖尿病人的视网膜进行免疫细胞化学染色的显微照片，显示血管内出现白蛋白(箭头)。图d)是糖尿病人视网膜的显微照片，显示血管内白蛋白染色(箭头)和视网膜的弥漫着色，说明血管通透性增加。(在LNA^TM-ISH实验中，用碱性磷酸酶(ALK Pho)作为色原体，不加复染剂。在白蛋白染色中使用DAB色原体和苏木精复染剂)。

实施例3

目的：为了研究其他糖尿病模型中糖尿病视网膜病变中的miRNA是否也随着其靶标的改变而发生类似的改变。

db/db小鼠(一种2型糖尿病模型)和对照小鼠均购自Jackson laboratories。开始患糖尿病后(血糖评估)继续跟进二个月。连续二个月监测代谢参数，体重，尿糖，尿酮等。这一时期结束时，处死小鼠采集视网膜组织。参照前面实施例1中的方法提取和分析miRNA。

小鼠糖尿病视网膜病变中miR200b水平下调(2型糖尿病模型)

进行了db/db小鼠视网膜中miR200b表达水平的实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析。图17显示，与正常(对照)小鼠视网膜相比，糖尿病小鼠视网膜中miR200b的表达具有统计学意义上的显著减少。与年龄和性别相匹配的对照组(C)相比，患糖尿病2个月后的db/db小鼠(db/db)视网膜中的miR200b水平减少。

小鼠糖尿病视网膜病变中miR146a水平下调(2型糖尿病模型)

如前所示，申请人通过实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析进一步证实了，与年龄和性别相匹配的对照组(C)的miR146a水平相比，db/db糖尿病组小鼠(db/db)(2型糖尿病模型)视网膜组织中的miR146a水平具有统计学意义上的显著下降(见图8)。

实施例4

人视网膜中的miR146a和miR320

图20是来自两名患有增生性糖尿病视网膜病变的人类患者的玻璃纤维组织的扩增曲线(实时定量聚合酶链反应分析)，显示了miR146a和miR320的存在。患有增生性糖尿病视网膜病变的患者接受了玻璃体切除术，纤维组织从玻璃体内剥离出来。采用实施例1中的方法，从人视网膜样本中提取miRNA并分析miR146a和miR320。仅发现很少量的miR320和miR146a。表明这些miRNAs在增生性糖尿病视网膜病变中非常重要，而且其表达可能减少。

实施例5

大鼠视网膜中的miR1

糖尿病动物视网膜中的miR1水平下调

实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析证实了图1所示的糖尿病大鼠视网膜中miR1水平的下调。图18显示，与正常(对照)大鼠视网膜相比较，糖尿病大鼠视网膜中的miR1表达水平具有统计学意义上的显著降低。实验操作与实施例1相似。

视网膜中miR144和miR450的表达

实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析证实了图1中所示的糖尿病大鼠视网膜中miR144和miR450水平的上调。图19a)和图19b)分别显示，与正常(对照)大鼠视网膜中的miR144和miR450的水平相比较，糖尿病大鼠视网膜中miR144和miR450的水平具有统计学意义上的显著上调。实验操作与实施例1相似。

讨论

上述实施例显示了引起糖尿病视网膜中血管内皮生长因子(VEGF)和纤维连接蛋白(FN)的表达和随后改变的一种新的通路。申请人的研究已表明，糖尿病中的高葡萄糖浓度能够引起：(a)控制纤维连接蛋白(FN)mRNA和蛋白质水平的miR-146a的水平下调；(b)控制VEGF mRNA和蛋白质水平的miR-200b的水平下调；(c)miR1和miR320的水平下调；(d)miR144和miR450的水平上调，体内和体外血管通透性都增加。申请人还证明，通过miR146a模拟物和miR-200b模拟物治疗能够分别阻止内皮细胞和视网膜中的糖尿病诱导的FN/VEGF-调节功能的改变。

申请人还从多个角度研究了机理。在最初确认了糖尿病视网膜中miR1，miR146a，miR200b和miR320等的水平下调，以及miR144和miR450的水平上调之后，申请人使用人脐静脉内皮细胞(HUVECs)确认了miRNAs水平改变的体外生物学意义。尽管这些人脐静脉内皮细胞(HUVECs)并非来源于视网膜，然而它们被广泛用作研究多种疾病中内皮异常的模型，包括糖尿病视网膜病变(DR)[31，32]。然而，在平行试验中，申请人研究了视网膜毛细管内皮细胞，证明与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)出现了类似的变化。进行了体外研究之后，申请人还采用已确立的1型和2型糖尿病动物模型以确认miRNA改变的体内意义。最后，申请人考察了来自正常个体和糖尿病个体的人视网膜组织，以证实类似的变化也同样存在于人视网膜中。这些工作建立了研究糖尿病视网膜病变中的miRNAs的初步方法，直接证明了miR1，miR146a，miR200b，miR320，miR144和miR450在糖尿病视网膜病变中的有用的和潜在的治疗和诊断用途。

与本发明提供的数据一致，前期的一项研究已经显示miR-200b存在于人和大鼠视网膜中[38]。前期研究和本发明的研究都显示了miR200b在人和大鼠中表达，这说明了进化的保守性，并反应出哺乳动物视网膜内一种可能的保守的功能作用。miRNAs在非糖尿病血管生成中的潜在作用已在Dicer亚效等位基因的纯合子转基因小鼠中进行了进一步研究。这些小鼠缺乏血管生成的能力并死于子宫内[39]。另一项研究发现，非致命的Dicer亚等位基因能够引起黄体中血管生成失败而导致雌性小鼠不育[40]。在一个眼缺血模型新血管生成中，视网膜中有七种miRNAs水平增加，三种降低[41]。另一方面，关于miRNA的水平，糖尿病视网膜病变中新血管生成与非糖尿病新血管生成可能不同。这种情况下未观察到miR-200b的改变[41]。

miR-200b对p300的调节作用也非常有趣。已有研究表明，miR-200能够调节p300，恶性肿瘤中的一种组蛋白乙酰化因子和转录共激活因子[37]。其他研究表明，在胰腺导管腺癌中，高转移组中有六种靶向作用于p300的miRNAs水平上调，包括miR-200b。申请人在前期研究中已发现了p300在糖尿病视网膜病变和其他糖尿病并发症中的作用，以及它能够调节糖尿病中多种基因和蛋白质的表达[31，42]。p300的这一作用受到其控制大量转录因子的活性的能力所调节[26]。本发明的研究显示了一种新的miR200b调节机理，糖尿病中的p300即通过该机理被调节。因此，除了对高血糖诱导的VEGF表达的直接抑制作用外，miRNA还可以通过调节p300间接地起到该作用。miR200b的这种p300调节作用可以潜在地影响多种血管活性因子的基因表达[26，31]。

糖尿病视网膜病变(DR)是一个复杂的问题，其中多种转录物发生改变，开启了多种异常通路。通过靶向于个别蛋白质而治疗糖尿病视网膜病变(DR)的研究已经进行了很长时间，但在临床上都失败了。从机理的角度看，一种miRNA能够调节多种基因，靶向于一种或少数几种miRNAs提供了阻止多种基因表达的潜在的独特机会。

以上披露的信息是本发明内容的一般性描述。根据具体情况而做出的形式上的变化和等同替代是可以预期的。虽然本发明中使用了专业术语，但这些术语只是为了说明的目的，而不是对本发明内容进行限定。本发明的其他变化和修改是可以接受的。因此，这些变化或者修改都被认为是包括在如所附的权利要求书中定义的本发明的范围之内。

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Claims (33)

1.一种治疗受试者的葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病的方法，其特征在于，所述方法包括给受试者施用一种能够调节所需受试者的一种或多种细胞中的一种或多种miRNAs表达的成分或成分的混合物。

2.权利要求1的方法，其特征在于，所述成分或成分的混合物能够上调所需受试者的一种或多种细胞中的一种或多种miRNAs中的至少一种miRNA的表达。

3.权利要求2的方法，其特征在于，所述一种或多种miRNAs中的至少一种miRNA选自miR-1，miR-146a，miR200b或者miR-320。

4.权利要求2的方法，其特征在于，所述成分或成分的混合物包括一种寡核苷酸或寡核苷酸的混合物。

5.权利要求4的方法，其特征在于，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物以miRNA、其衍生物或类似物、miRNA前体、成熟miRNA或者编码所述至少一种miRNA的DNA分子的形式提供。

6.权利要求4的方法，其特征在于，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物以一种包括药学上可接受的载体的组合物的形式提供。

7.权利要求4的方法，其特征在于，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物选自SEQ ID NOs.1-4。

8.权利要求4的方法，其特征在于，所述成分或成分的混合物以不超过一种给药载体的方式提供。

9.权利要求8的方法，其特征在于，所述给药载体选自病毒载体，微球，脂质体，胶体金颗粒，脂多糖，多肽，多糖，或聚乙二醇化的病毒载体。

10.权利要求1的方法，其特征在于，所述成分或成分的混合物能够下调所需的一种或多种细胞中的一种或多种miRNAs中的至少一种miRNA的表达。

11.权利要求10的方法，其特征在于，所述一种或多种miRNAs中的至少一种miRNA选自miR-1444或者miR-450。

12.权利要求10的方法，其特征在于，所述成分或成分的混合物包括所述至少一种miRNA的抑制剂或抑制剂的混合物。

13.权利要求11的方法，其特征在于，所述抑制剂或抑制剂的混合物选自antagomir、反义RNA或者短干扰RNA。

14.权利要求12的方法，其特征在于，所述抑制剂或抑制剂的混合物以一种包括药学上可接受的载体的组合物的形式提供。

15.权利要求1-14中任一项的方法，其特征在于，所述疾病是糖尿病慢性并发症，包括糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病或者糖尿病糖尿病大血管病变。

16.权利要求1的方法，其特征在于，所述成分或成分的混合物通过胃肠外给药途径或者局部给药途径施用。

17.权利要求15的方法，其特征在于，所述疾病是糖尿病视网膜病变，其中成分或成分的混合物通过眼内给药或者局部滴注到眼内的方式施用。

18.权利要求15的方法，其特征在于，所述疾病是糖尿病视网膜病变，其中成分或成分的混合物通过眼部植入的方式施用。

19.一种治疗受试者的糖尿病视网膜病变的方法，其特征在于，所述方法包括给受试者施用一种组合物，包括至少一种：(a)靶向于miR-1，miR-146a，miR-200b或者miR-320的寡核苷酸，和(b)miR-144或者miR-450的抑制剂。

20.一种诊断受试者所患疾病的方法，所述疾病与葡萄糖介导的细胞损伤相关，其特征在于，所述方法包括检测受试者样本中的一种或多种miRNAs的表达谱，其中受试者样本的miRNA表达谱与正常样本或参考样本的miRNA表达谱的差异就是葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病的指征。

21.权利要求20的诊断疾病的方法，其特征在于，所述一种或多种miRNAs选自miR1，miR146a，miR200b，miR320，miR144或者miR450。

22.权利要求21的诊断疾病的方法，其特征在于，与正常样本或者参考样本相比miR1，miR146a，miR200b和miR320的表达下调和miR144或者miR450的表达上调就是该疾病的指征。

23.根据权利要求20-22中任一项的诊断疾病的方法，其特征在于，所述疾病是糖尿病慢性并发症，包括糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病或者糖尿病大血管病变。

24.一种治疗葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病的组合物，包括能够调节所需的一种或多种细胞中的一种或多种miRNAs的表达的一种成分或成分的混合物，和药学上可接受的载体。

25.权利要求24的组合物，其特征在于，所述成分或成分的混合物能够上调所需的一种或多种细胞中的一种或多种miRNAs中的至少一种miRNA的表达。

26.权利要求25的组合物，其特征在于，所述至少一种miRNA选自miR-1，miR-146a，miR200b或者miR-320。

27.权利要求25的组合物，其特征在于，所述成分或成分的混合物包括一种寡核苷酸或寡核苷酸的混合物。

28.权利要求27的组合物，其特征在于，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物以miRNA、其衍生物或类似物、miRNA前体、成熟miRNA或者编码所述至少一种miRNA的DNA分子的形式提供。

29.权利要求27的组合物，其特征在于，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物选自SEQ ID NOs.1-4。

30.权利要求25的组合物，其特征在于，所述成分或成分的混合物能够下调一种或多种miRNAs中的至少一种miRNA的表达。

31.权利要求30的组合物，其特征在于，一种或多种miRNAs中的至少一种选自miR-1444或者miR-450。

32.权利要求30的组合物，其特征在于，成分或成分的混合物包括所述的至少一种miRNA的抑制剂或抑制剂的混合物。

33.权利要求32的组合物，其特征在于，抑制剂或抑制剂的混合物选自antagomir、反义RNA或者短干扰RNA。

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