CN106030311B

CN106030311B - 线粒体融合蛋白的方法和用途

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Publication number: CN106030311B
Application number: CN201580008666.4A
Authority: CN
Inventors: C·坎托阿尔瓦雷斯; S·库尔卡尼; A·索萨诺
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA
Priority date: 2014-02-17
Filing date: 2015-02-16
Publication date: 2019-10-18
Anticipated expiration: 2035-02-16
Also published as: CN106030311A; JP2017512068A; US20190204342A1; EP3108257B1; WO2015121461A1; EP3108257A1

Abstract

本发明涉及一种鉴定能够与线粒体融合蛋白‑1(Mfn1)结合的物质的方法，所述方法包括提供Mfn1多肽以及检测所述Mfn1多肽与候选物质之间的结合。

Description

线粒体融合蛋白的方法和用途

技术领域

本发明涉及线粒体融合蛋白-1(mitofusin-1)。更具体地讲，本发明涉及鉴定能够与线粒体融合蛋白-1结合或调节线粒体融合蛋白-1的活性或表达的物质。本发明还涉及通过这些方法鉴定的物质以及这些物质在疗法中的用途。

背景技术

线粒体是存在于体内几乎所有细胞的细胞器。它们在许多细胞过程中，最显著的是在能量代谢中起关键作用。线粒体功能障碍与许多病理相关，包括代谢和心血管并发症、神经退化性疾病和癌症。

然而，线粒体并非单独的隔离的细胞器。相反，它们是动态结构，所述动态结构能够移动穿过细胞，融合以及分裂，以便使细胞的呼吸容量适应其代谢需求。

若干基团对线粒体的融合和分裂而言至关重要。其中，线粒体融合蛋白-1和线粒体融合蛋白-2(Mfn1和Mfn2)负责线粒体的外膜融合。这两种蛋白质是位于线粒体外膜中的跨膜GTP酶。Mfn1与Mfn2之间的主要差异在于Mfn2不仅能够将线粒体连接在一起，而且还能将线粒体与细胞中的内质网隔室连接(de Brito O.M.and Scorrano L.(2008)Nature456:605-10(de Brito O.M.和Scorrano L.(2008)《自然》456:605-10))。

Mfn1和Mfn2表达的调控通常受到控制线粒体生物发生的主程序的协调安排，例如其由过氧化物酶体增殖物激活受体辅活化因子α(PGC-1α)的激活所触发(Soriano F.X.etal.(2006)Diabetes 55:1783-91(Soriano F.X.等人，(2006)《糖尿病》55:1783-91))。Mfn1和Mfn2的过表达导致异常伸长的线粒体。反之，Mfn1和Mfn2的下调导致小的圆形线粒体(称为“分裂的线粒体(fissioned mitochondria)”)。

已证实线粒体在患有2型糖尿病的患者中展示出高度分裂的结构(Bach D.et al.(2003)J.Biol.Chem.278:17190-7(Bach D.等人，(2003)《生物化学杂志》278:17190-7))。此外，也已在肥胖症和2型糖尿病的情况中鉴定出Mfn2的下调(Bach D.et al.(2003)J.Biol.Chem.278:17190-7(Bach D.等人，(2003)《生物化学杂志》278:17190-7))。已提出这可解释通常在糖尿病患者中所观察到的线粒体功能障碍。根据这些结果，据信Mfn1或Mfn2的下调是糖尿病发展中的贡献因素。

Mfn1和Mfn2的体内研究最初受到开发Mfn1或Mfn2缺陷型转基因小鼠模型的困难的阻碍。Mfn1或Mfn2的种系缺失导致小鼠在妊娠中期死亡(Chen H.et al.(2003)J.CellBiol.160:189-200(Chen H.等人，(2003)《细胞生物学期刊》160:189-200))。为了克服该情况，产生了条件敲除小鼠模型，在该模型中，Mfn2可以组织特异性方式缺失。这些小鼠随后回交至C57Bl/6J背景以促进相关的代谢研究。C57Bl/6J背景是此类研究中最常用的品系，因为其能够在高脂肪饲喂时模拟人类代谢疾病。

肝脏特异性Mfn2缺陷(Mfn2LKO)小鼠的研究符合此前的工作。此模型证实肝脏中具有显著的线粒体功能障碍，并且小鼠显现出空腹高血糖(Sebastian D.et al.(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109:5523-8(Sebastian D.等人，(2012)《美国科学院院报》109:5523-8))。当用高脂肪膳食测试时，小鼠对胰岛素抗性的发展极其敏感。这证实改变的线粒体结构对于葡萄糖稳态而言可能是有害的。

普遍预期的是对Mfn1缺陷小鼠的类似研究将产生相似的结果。

发明内容

在一个方面，本发明提供一种鉴定能够与线粒体融合蛋白-1(Mfn1)结合的物质的方法，所述方法包括提供Mfn1多肽以及检测Mfn1多肽与候选物质之间的结合。

在一个实施例中，所述方法用于鉴定能够相比于线粒体融合蛋白-2(Mfn2)优先与Mfn1结合的物质。例如，所述物质与Mfn1结合的亲和力可高于与Mfn2结合的亲和力。在一个实施例中，所述物质与Mfn1结合但不与线粒体融合蛋白-2(Mfn2)结合。

在另一方面，本发明提供一种用于鉴定调节Mfn1的活性的物质的方法，所述方法包括提供包含Mfn1多肽或多核苷酸和候选物质的制品，以及检测所述候选物质是否影响Mfn1多肽或多核苷酸的活性。

在一个实施例中，Mfn1的活性通过测定Mfn1的GTP酶活性来测量。

在另一个实施例中，所述方法包括使候选物质与Mfn1多肽在存在GTP的情况下接触并测量GTP向GDP的水解。

在一个实施例中，所述方法用于鉴定能够相比于线粒体融合蛋白-2(Mfn2)优先调节(例如抑制)Mfn1的活性的物质。在另一个实施例中，所述方法用于鉴定能够调节Mfn1的活性但不调节线粒体融合蛋白-2(Mfn2)的活性的物质。Mfn2的活性可通过测定Mfn2的GTP酶活性来测量。例如，所述物质对Mfn1抑制的IC50值低于对Mfn2抑制的IC50值。在一个实施例中，所述物质抑制Mfn1的活性但不抑制线粒体融合蛋白-2(Mfn2)的活性。

在另一个实施例中，所述方法用于鉴定降低Mfn1的活性的物质。与不存在候选物质的情况下的活性相比，Mfn1的活性可降低5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

在另一个实施例中，所述方法用于鉴定能够治疗或预防代谢疾病的物质，所述代谢疾病为例如选自以下的疾病：胰岛素抗性、葡萄糖耐量降低、空腹血糖异常和糖尿病。

在另一方面，本发明提供一种鉴定能够调节Mfn1与GTP之间的相互作用的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供Mfn1多肽；

b)提供GTP分子；以及

c)在存在候选物质的情况下检测Mfn1多肽与GTP分子之间的结合。

在另一方面，本发明提供一种用于鉴定调节Mfn1多肽的表达或加工的物质的方法，所述方法包括使表达Mfn1多肽的细胞与候选物质接触并监测所述Mfn1多肽的表达或加工的增加或降低。

在一个实施例中，所述方法用于鉴定降低Mfn1多肽的表达或加工的物质，所述方法包括使表达Mfn1多肽的细胞与候选物质接触并监测所述Mfn1多肽的表达或加工的降低。与不存在候选物质的情况下的表达水平相比，Mfn1的表达可降低5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

在一个实施例中，前述方法中的任一种用于鉴定预防、调节、减轻或改善疾病症状的物质，所述疾病为例如与Mfn1相关的疾病，或线粒体融合或功能障碍。所述方法可用于鉴定预防、减轻或改善代谢疾病的症状的物质。代谢疾病可选自胰岛素抗性、葡萄糖耐量降低、空腹血糖异常和糖尿病。

在另一方面，本发明提供一种鉴定预防、调节、减轻或改善代谢疾病的症状的物质的方法，所述方法包括将鉴定为调节Mfn1活性的物质施用于针对所述代谢疾病的动物模型并观察所述动物模型中的代谢疾病的进展。

在一个实施例中，使用前述方法中的任一种来鉴定候选物质。

代谢疾病可选自胰岛素抗性、葡萄糖耐量降低、空腹血糖异常和糖尿病。

前述方法的物质可为siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA或小分子。

在另一方面，本发明提供一种用于治疗或预防代谢疾病的能够调节Mfn1的活性或调节Mfn1的表达或加工的物质。

在一个实施例中，用于治疗或预防代谢疾病的物质为能够降低Mfn1的活性、表达或加工的物质。所述物质可选自siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、多核苷酸、多肽或小分子。

在另一方面，本发明提供一种编码siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA或多肽的载体，其用于治疗根据本发明的前述方面的代谢疾病。

本发明的载体或物质可用于治疗或预防选自胰岛素抗性、葡萄糖耐量降低、空腹血糖异常和糖尿病的代谢疾病。

在另一方面，本发明提供Mfn1多肽或编码所述Mfn1多肽的多核苷酸在筛选预防或治疗代谢疾病的物质的方法中的用途。

在另一方面，本发明提供Mfn1多肽或编码所述Mfn1多肽的多核苷酸作为代谢疾病的生物标志物的用途。

在另一方面，本发明提供诊断受试者的代谢疾病或所述疾病易感性的方法，所述方法包括测量获自受试者的样品中的Mfn1的表达水平。代谢疾病可选自胰岛素抗性、葡萄糖耐量降低、空腹血糖异常和糖尿病。

附图说明

图1：饲喂普通饲料饮食的Mfn1LKO小鼠中的血糖控制不受影响。(A)以2g/kg体重向18周龄雄性对照或Mfn1LKO小鼠进行腹膜内注射并且在指示时间期间追踪血糖水平。(B)以0.3U/kg胰岛素向20周龄雄性对照或Mfn1LKO小鼠进行腹膜内注射并且在指示时间期间追踪血糖水平。所有值以对照小鼠(n＝11)和Mfn1LKO小鼠(n＝9)的平均值+/-SEM展示。

图2：Mfn1LKO小鼠在高脂肪饲喂时展示出更佳的糖耐受性和胰岛素敏感性。(A)10周龄对照和Mfn1LKO小鼠维持低脂肪膳食(LFD)或高脂肪膳食(HFD)。(A)体重发展。(B)如通过Echo-MRI所测量的8周高脂肪饲喂后的身体组成。(C)HFD开始后10周，以2g/kg体重向小鼠进行腹膜内注射并且在指示时间期间追踪血糖水平。(D)HFD开始后12周，以0.75U/kg胰岛素向老龄向小鼠进行腹膜内注射并且在指示时间期间追踪血糖水平。曲线上面积(AOC)定量在右侧图表中示出。所有值以对照小鼠(n＝10)和Mfn1LKO小鼠(n＝10)的平均值+/-SEM展示。*指示相对于各对照小鼠的统计意义上的显著性差异，p<0.05。

图3：二甲双胍的降血糖效应在Mfn1LKO小鼠中增强。

将12周龄对照和Mfn1LKO小鼠用高脂肪膳食饲喂8周(D12492，美国食品研究有限公司(Research Diets Inc.,USA))。然后，将小鼠禁食过夜并注射盐水(作为媒介物)或二甲双胍(125mg/kg)，将血糖水平追踪指示的时间点。所有值以每组n＝10只小鼠的平均值+/-SEM表示。*指示对照与Mfn1LKO小鼠之间的统计意义上的显著性差异，p<0.05。使用白色方形表示对照小鼠值，使用暗色方形表示Mfn1LKO。

图4：二甲双胍对WT和Mfn1LKO小鼠中线粒体呼吸作用的抑制

将来自WT和Mfn1LKO小鼠的新鲜提取的线粒体在呼吸介质中均质化，并使用2mg组织进行呼吸测量法分析。其中，通过添加苹果酸盐和谷氨酸盐来刺激复合物I活性。然后，添加ADP以实现最大的偶联呼吸作用，随后滴定二甲双胍。柱形图以4种线粒体制备物/基因型的平均值+/-SEM示出绝对呼吸作用水平。*指示基因型之间的统计意义上的显著性差异，p<0.05。下面的表描绘在不同二甲双胍剂量下所保留的最大呼吸作用的百分比。使用白色柱表示对照小鼠，使用黑色柱表示Mfn1LKO小鼠。

具体实施方式

发明人生成了肝脏特异性Mfn1缺陷(Mfn1LKO)小鼠模型。要实现此模型，通过使Mfn1基因两侧加有LoxP位点的(Mfn1floxed)小鼠(即，其中Mfn1基因侧接两个loxP位点的小鼠)与其中Cre重组酶表达受白蛋白启动子控制的小鼠杂交来克服种系Mfn1缺失的胚胎致死性。发明人发现，虽然Mfn1LKO小鼠具有正常的外观并且与对照小鼠具有相等的能量消耗，但它们具有将脂肪作为能量源的偏向(表1)。此外，它们的肝脏展示出较高的呼吸容量和呼吸复合物丰度(表2)。

然而意外的是，当饲喂常规的低脂肪膳食时，Mfn1LKO小鼠未展示出在Mfn2LKO小鼠中观察到的空腹高血糖或葡萄糖稳态异常(图1A-B)(Sebastian D.et al.(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109:5523-5528(Sebastian D.等人，(2012)《美国科学院院报》109:5523-5528))。甚至更意外的是，当用高脂肪膳食测试时，发明人发现Mfn1LKO小鼠获得与对照小鼠相等的重量(图2A)和脂肪量(图2B)，但保持更高的糖耐受性(图2C)和胰岛素敏感性(图2D)。此显著的突破表明下调Mfn1可提供对抗糖尿病的强效策略。

现将通过非限制性实例来描述本发明的各优选特征和实施例。

除非另外指明，本发明的实践将采用常规化学、分子生物学、微生物学和免疫学技术，这些技术均在本领域普通技术人员的能力范围之类。此类技术在文献中有所阐述。参见例如J.Sambrook,E.F.Fritsch,and T.Maniatis(1989)Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Second Edition,Books 1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press(J.Sambrook、E.F.Fritsch和T.Maniatis(1989)《分子克隆：实验室手册》，第2版，第1-3册，冷泉港实验室出版社)；Ausubel,F.M.et al.(1995and periodic supplements)CurrentProtocols in Molecular Biology,Ch.9,13,and 16,John Wiley&Sons,New York,NY(Ausubel,F.M.等人(1995年及定期增刊)《最新分子生物学实验方法汇编》，第9、13和16章，约翰威利父子出版公司，纽约州纽约)；B.Roe,J.Crabtree,and A.Kahn(1996)DNAIsolation and Sequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons(B.Roe、J.Crabtree和A.Kahn(1996)《DNA分离和测序：基本技术》，约翰威利父子出版公司)；J.M.Polak and James O’D.McGee(1990)In Situ Hybridization:Principles andPractice；Oxford University Press(J.M.Polak和James O’D.McGee(1990)《原位杂交:原理和实践》，牛津大学出版社)；M.J.Gait(ed.)(1984)Oligonucleotide Synthesis:APractical Approach,IRL Press(M.J.Gait(编辑)(1984)《寡核苷酸合成：实践方法》，IRL出版社)；以及D.M.J.Lilley and J.E.Dahlberg(1992)Methods of Enzymology:DNAStructure Part A:Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods inEnzymology,Academic Press(M.J.Lilley和J.E.Dahlberg(1992)《酶学：DNA结构A部：DNA的合成和物理分析》，酶学，学术出版社)。这些一般性文本中的每一个以引用的方式并入本文。

线粒体融合蛋白

线粒体融合蛋白-1(Mfn1)和线粒体融合蛋白-2(Mfn2)为果蝇属Fzo的哺乳动物同系物或酵母Fzo1蛋白质。哺乳动物Mfn1和Mfn2蛋白质在许多组织中广泛表达，但它们的表达水平随组织而变化。Mfn1和Mfn2两者对于维持线粒体结构而言是至关重要的。

Mfn1和Mfn2通过C末端膜结合域锚定至线粒体外膜。这两种蛋白质均包含细胞质N末端GTP酶域。此外，至少Mfn1携带C末端七肽重复区。已证实此区可形成介导线粒体圈合的二聚体反平行卷曲螺旋(Koshiba et al.(2004)Science 305:858-62(Koshiba等人(2004)《科学》305:858-62)。

Mfn1蛋白质和Mfn2蛋白质两者以及它们的功能性GTP酶域对于线粒体融合而言必不可少。

在本发明的一个实施例中，Mfn1源自智人。例如，Mfn1可包含以下序列：

MAEPVSPLKHFVLAKKGITAIFDQLLEFVTEGSHFVEATYKNPELDRIATEDDLVEMQGYKDKLSIIGEVLSRRHMKVAFFGRTSSGKSSVINAMLWDKVLPSGIGHITNCFLSVEGTDGDKAYLMTEGSDEKKSVKTVNQLAHALHMDKDLKAGCLVRVFWPKAKCALLRDDLVLVDSPGTDVTTELDSWIDKFCLDADVFVLVANSESTLMNTEKHFFHKVNEWLSKPNIFILNNRWDASASEPEYMEDVRRQHMERCLHFLVEELKVANALEAQNRIFFVSAKEVLSARKQKAQGMPESGVALAEGFHARLQEFQNFEQIFEECISQSAVKTKFEQHTIRAKQILATVKNIMDSVNLAAEDKRHYSVEEREDQIDRLDFIRNQMNLLTLDVKKKIKEVTEEVANKVSCAMTDEICRLSVLVDEFCSEFHPNPDVLKIYKSELNKHIEDGMGRNLADRCTDEVNALVLQTQQEIIENLKPLLPAGIQDKLHTLIPCKKFDLSYNLNYHKLCSDFQEDIVFRFSLGWSSLVHRFLGPRNAQRVLLGLSEPIFQLPRSLASTPTAPTTPATPDNASQEELMITLVTGLASVTSRTSMGIIIVGGVIWKTIGWKLLSVSLTMYGALYLYERLSWTTHAKERAFKQQFVNYATEKLRMIVSSTSANCSHQVKQQIATTFARLCQQVDITQKQLEEEIARLPKEIDQLEKIQNNSKLLRNKAVQLENELENFTKQFLPSSNEES

(GenBank登录号AAK06840.1；SEQ ID NO:1)

在另一个实施例中，Mfn1源自小家鼠(Mus musculus)。例如，Mfn1可包含以下序列：

MAETVSPLKHFVLAKKAITAIFGQLLEFVTEGSHFVEATYRNPELDRIASEDDLVEIQGYRNKLAVIGEVLSRRHMKVAFFGRTSSGKSSVINAMLWDKVLPSGIGHTTNCFLSVEGTDGDKAYLMTEGSDEKKSVKTVNQLAHALHMDKDLKAGCLVHVFWPKAKCALLRDDLVLVDSPGTDVTTELDIWIDKFCLDADVFVLVANSESTLMNTEKHFFHKVNERLSKPNIFILNNRWDASASEPEYMEDVRRQHMERCLHFLVEELKVVSPSEARNRIFFVSAKEVLNSRKHKAQGMPEGGGALAEGFQARLQEFQNFEQTFEECISQSAVKTKFEQHTIRAKQILDTVKNILDSVNVAAAEKRVYSMEEREDQIDRLDFIRNQMNLLTLDVKKKIKEVTEEVANKVSCAMTDEICRLSVLVDEFCSEFHPTPSVLKVYKSELNKHIEDGMGRNLADRCTNEVNASILQSQQEIIENLKPLLPAGIQNKLHTLIPCKKFDLSYDLNCHKLCSDFQEDIVFRFSLGWSSLVHRFLGSTNAQRVLLGLSEPIFQVPRSLASTPTAPSNPAAPDNAAQEELMITLITGLASLTSRTSMGIIVVGGVIWKTVGWKLISVTLSMYGALYLYERLTWTTRAKERAFKQQFVNYATEKLQMIVSFTSANCSHQVQQEMATTFARLCQQVDVTQKHLEEEIARLSKEIDQLEKIQNNSKLLRNKAVQLESELENFSKQFLHPSSGES

(GenBank登录号AAO34660.1；SEQ ID NO:2)

在一个优选的实施例中，Mfn1包含与SEQ ID NO:1或2具有50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％同一性并且能够促进线粒体融合和/或向线粒体外膜中整合的氨基酸序列。

在另一个实施例中，Mfn1可由包含核苷酸序列的多核苷酸编码，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO:1或2的蛋白质或与SEQ ID NO:1或2具有50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％氨基酸同一性并且能够促进线粒体融合和/或向线粒体外膜中整合的蛋白质。

在本发明的一个实施例中，Mfn2源自智人。例如，Mfn2可包含以下序列：

MSLLFSRCNSIVTVKKNKRHMAEVNASPLKHFVTAKKKINGIFEQLGAYIQESATFLEDTYRNAELDPVTTEEQVLDVKGYLSKVRGISEVLARRHMKVAFFGRTSNGKSTVINAMLWDKVLPSGIGHTTNCFLRVEGTDGHEAFLLTEGSEEKRSAKTVNQLAHALHQDKQLHAGSLVSVMWPNSKCPLLKDDLVLMDSPGIDVTTELDSWIDKFCLDADVFVLVANSESTLMQTEKHFFHKVSERLSRPNIFILNNRWDASASEPEYMEEVRRQHMERCTSFLVDELGVVDRSQAGDRIFFVSAKEVLNARIQKAQGMPEGGGALAEGFQVRMFEFQNFERRFEECISQSAVKTKFEQHTVRAKQIAEAVRLIMDSLHMAAREQQVYCEEMREERQDRLKFIDKQLELLAQDYKLRIKQITEEVERQVSTAMAEEIRRLSVLVDDYQMDFHPSPVVLKVYKNELHRHIEEGLGRNMSDRCSTAITNSLQTMQQDMIDGLKPLLPVSVRSQIDMLVPRQCFSLNYDLNCDKLCADFQEDIEFHFSLGWTMLVNRFLGPKNSRRALMGYNDQVQRPIPLTPANPSMPPLPQGSLTQEEFMVSMVTGLASLTSRTSMGILVVGGVVWKAVGWRLIALSFGLYGLLYVYERLTWTTKAKERAFKRQFVEHASEKLQLVISYTGSNCSHQVQQELSGTFAHLCQQVDVTRENLEQEIAAMNKKIEVLDSLQSKAKLLRNKAGWLDSELNMFTHQYLQPSR

(GenBank登录号AAK18728.1；SEQ ID NO:3)

在另一个实施例中，Mfn2源自小家鼠。例如，Mfn2可包含以下序列：

MSLLFSRCNSIVTVKKDKRHMAEVNASPLKHFVTAKKKINGIFEQLGAYIQESASFLEDTHRNTELDPVTTEEQVLDVKGYLSKVRGISEVLARRHMKVAFFGRTSNGKSTVINAMLWDKVLPSGIGHTTNCFLRVGGTDGHEAFLLTEGSEEKKSVKTVNQLAHALHQDEQLHAGSMVSVMWPNSKCPLLKDDLVLMDSPGIDVTTELDSWIDKFCLDADVFVLVANSESTLMQTEKQFFHKVSERLSRPNIFILNNRWDASASEPEYMEEVRRQHMERCTSFLVDELGVVDRAQAGDRIFFVSAKEVLSARVQKAQGMPEGGGALAEGFQVRMFEFQNFERQFEECISQSAVKTKFEQHTVRAKQIAEAVRLIMDSLHIAAQEQRVYCLEMREERQDRLRFIDKQLELLAQDYKLRIKQITEEVERQVSTAMAEEIRRLSVLVDEYQMDFHPSPVVLKVYKNELHRHIEEGLGRNLSDRCSTAIASSLQTMQQDMIDGLKPLLPVSMRNQIDMLVPRQCFSLSYDLNCDKLCADFQEDIEFHFSLGWTMLVNRFLGPKNSRRALLGYSDQVQRPLPLTPANPSMPPLPQSSLTQEELMVSMVTGLASLTSRTSMGILVVGGVVWKAVGWRLIALSFGLYGLLYVYERLTWTTKAKERAFKRQFVEYASEKLQLIISYTGSNCSHQVQQELSGTFAHLCQQVDITRDNLEQEIAAMNKKVEALDSLQSRAKLLRNKAGWLDSELNMFTHQYLQPSR

(GenBank登录号AAM88577.1；SEQ ID NO:4)

在一个优选的实施例中，Mfn2包含与SEQ ID NO:3或4具有50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％同一性并且能够介导线粒体融合的氨基酸序列。

在另一个实施例中，Mfn2可由包含核苷酸序列的多核苷酸编码，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO:3或4的蛋白质或与SEQ ID NO:3或4具有50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％氨基酸同一性并且能够介导线粒体融合的蛋白质。

线粒体融合蛋白结合

本发明包括用于鉴定能够结合线粒体融合蛋白例如Mfn1或Mfn2的物质的方法。

所述方法可提供定性或定量结果。本发明的方法可用于鉴定能够与Mfn1或其片段结合的物质，并且可选地或另外地表征此类结合。例如，所述方法允许测量绝对或相对结合亲和力，和/或结合的焓和熵。结合亲和力可以平衡解离常数(K_d)或缔合(K_a)常数表示。

候选物质可为任何具有潜在利益的物质，例如肽、多肽、核酸、抗体或小分子。优选地，候选物质为具有潜在治疗利益的化合物或混合物。优选地，候选物质对哺乳动物，特别是人类具有低毒性。在一些实施例中，候选物质可包括营养物质和/或食品成分，包括天然存在的化合物或化合物的混合物例如植物或动物提取物。

候选物质可构成物质文库的一部分，例如由组合化学产生的文库或噬菌体展示文库。在一个实施例中，候选物质构成植物生物活性分子文库的一部分。

本领域中已知许多测定技术用于鉴定候选物质与蛋白质之间的结合。所采用的测定技术优选地为适于对候选物质进行自动化和/或高通过量筛选的测定技术。可在诸如微量滴定板、微珠、树脂或类似物的固体载体上进行测定。

例如，Mfn1可固定在例如微珠、树脂、微量滴定板或阵列的固体载体上。然后可使候选物质与固定的Mfn1接触。任选地，可应用洗涤工序以去除弱特异性或非特异性结合物质。然后可检测并鉴定任何与Mfn1结合的物质。为有利于结合物质的检测，可用可易于检测的标志物标记候选物质。标志物可包括例如放射性标记、酶标记、抗体标记、荧光标记，颗粒(例如乳胶或金)标记或类似物。

或者，可将上述工序颠倒，并且可将候选物质固定并可使Mfn1与所述固定的物质接触。任选地，可应用洗涤工序以去除弱特异性或非特异性结合的Mfn1。然后可检测并鉴定任何与Mfn1结合的物质。为有利于结合的检测，可用如上所述的可易于检测的标志物标记Mfn1。

除了上述测定之外，其他合适的测定技术也是本领域中已知的。此类技术的例子为放射性测定、荧光测定、ELISA、荧光偏振、荧光各向异性、等温滴定量热法(ITC)、表面等离子体共振(SPR)等。可应用这些测定来鉴定与Mfn1结合的物质。实际上，用于对许多这些技术进行自动化以有利于高通过量筛选的平台是本领域中广泛已知的。

可使用不止一种测定技术来提供对候选物质与Mfn1结合的详细理解。例如，可将提供定性结合信息的测定用作方法中的第一步骤，然后进行使用不同技术的另外的测定以提供定量结合数据。

尽管上文已论述了用于鉴定能够与Mfn1结合的物质的技术，但应当理解，这些技术同样适于鉴定能够与Mfn2结合的物质。此外，应当理解，这些技术也将允许鉴定不与Mfn1或Mfn2结合的物质。

上述测定技术可适于进行竞争结合研究。例如，这些技术同样适于分析蛋白质与底物或辅因子在存在候选物质的情况下的结合。因此，将可能的是使用上述技术来筛选并鉴定调节蛋白质与其底物或辅因子之间的结合的物质。例如，这些测定将允许在存在候选物质的情况下检测Mfn1或Mfn2与GTP之间的结合。因此将可能的是鉴定调节Mfn1或Mfn2与GTP结合，例如减少与GTP结合的物质。

优选地，本发明的物质将以高亲和力与Mfn1结合。例如，本发明的物质将以小于100μM，更优选地小于10μM，例如小于1μM、小于100nM或小于10nM的Kd与Mfn1结合。

与Mfn2相比，本发明的物质通常优先与Mfn1结合。换句话讲，所述物质对Mfn1的选择性通常超过Mfn2，例如物质在相同的条件下与Mfn1结合的亲和力高于与Mfn2结合的亲和力。结合亲和力可使用本领域已知的标准技术例如表面等离子体共振、ELISA等等(例如如上所述)来测量，并且可以缔合(K_a)或解离(K_d)常数定量。

在一个优选的实施例中，所述物质以至少2:1(例如K_a(Mfn1)/K_a(Mfn2)≥2)的亲和力比率与Mfn1和Mfn2结合。在另外的实施例中，所述物质对Mfn1/Mfn2的亲和力比率可为至少5:1、至少10:1、至少100:1、至少1000:1或至少10,000:1。例如，所述物质可以小于100μM，优选地小于1μM，更优选地小于100nM，更优选地小于10nM的K_d与Mfn1结合。所述物质可以大于10nM，优选地大于100nM，更优选地大于1μM，更优选地大于100μM的K_d与Mfn2结合。在一个实施例中，所述物质不与Mfn2结合(例如，所述物质在标准测定条件下显示出忽略不计的与Mfn2的结合或基本上不与Mfn2结合)。

线粒体融合蛋白活性

本发明还包括用于鉴定能够调节线粒体融合蛋白例如Mfn1或Mfn2的活性的物质的方法。可直接分析Mfn1或Mfn2的活性，例如通过分析Mfn1或Mfn2GTP酶的酶活性来分析。作为另外一种选择或除此之外，可间接分析Mfn1或Mfn2的活性，例如通过分析细胞内的线粒体的融合来分析。

候选物质降低蛋白质例如酶如GTP酶的活性的能力可以IC50值表示。IC50为使得蛋白质的活性产生50％降低(例如酶活性的50％降低)所需的物质浓度。IC50值的计算在本领域中是已知的。优选地，本发明的物质对Mfn1活性(例如GTP酶活性)的抑制的IC50值小于100μM，更优选地小于10μM，例如小于1μM、小于100nM或小于10nM。

与Mfn2相比，本发明的物质通常优先抑制Mfn1的活性。换句话讲，所述物质通常选择性地抑制Mfn1，例如所述物质在相同条件下对Mfn1活性抑制的IC50值与对Mfn2活性抑制的IC50值相比较低。在一个优选的实施例中，所述物质以至少2:1的IC50比率(例如，IC50(Mfn2)/IC50(Mfn1)≥2)抑制Mfn2和Mfn1。在另外的实施例中，所述物质对Mfn2/Mfn1的IC50比率为至少5:1、至少10:1、至少100:1、至少1000:1或至少10,000:1。例如，所述物质对Mfn1抑制的IC50可小于100μM，优选地小于1μM，更优选地小于100nM，更优选地小于10nM。所述物质对Mfn2抑制的IC50可大于10nM，优选地大于100nM，更优选地大于1μM，更优选地大于100μM。在一个实施例中，所述物质不抑制Mfn2的活性(例如，所述物质在标准测定条件下显示出忽略不计的对Mfn2活性的抑制或基本上不抑制Mfn2的活性)。

GTP酶测定

本领域中已知许多技术用于测量GTP酶活性。此类GTP酶测定可基于检测通过GTP酶使GTP向GDP的转化，该转化伴随着无机磷酸盐的释放。这些技术可应用于已从细胞分离出的GTP酶，例如Mfn1或Mfn2。可能已使用重组技术来表达Mfn1或Mfn2。优选地，Mfn1或Mfn2已被纯化。用于表达和纯化Mfn1和Mfn2的方法是本领域已知的。

在一个实施例中，可通过使用[α-³²P]-标记的GTP来监测GTP向GDP的转化，从而测定GTP酶活性。简而言之，可在各时间点对GTP酶反应进行GTP和GDP的薄层色谱法分离。然后可通过磷屏成像(phosphorimager)分析来定量GTP和GDP在每个时间点的相对水平。合适的基于[α-³²P]的GTP酶测定描述于Ishihara N.et al.(2004)J.Cell Sci.117:6535-46(Ishihara N.等人(2004)《细胞科学期刊》117:6535-46)(应用于Mfn1)，和Warnock D.E.etal.(1996)J.Biol.Chem.271:22310-4(Warnock D.E.等人(1996)《生物化学期刊》271:22310-4)。

在另一个实施例中，可使用检测GTP水解时产生的无机磷酸盐(P_i)的测定来测定GTP酶活性。例如，本领域中众所周知的是孔雀石绿比色测定用于检测酶反应期间无机磷酸盐的释放。简而言之，这些测定基于的原理是，孔雀石绿检测物质在结合无机磷酸盐时会发生色变。所述色变可通过允许对随时间推移释放的无机磷酸盐的量进行定量的分光光度检测来测量。合适的商业孔雀石测定是可用的，例如来自伊诺威生物科技公司(InnovaBiosciences)的GTP酶测定。此类比色测定充分适于高通过量筛选。

线粒体融合测定

候选物质对线粒体融合的效应还可直接在细胞内进行分析。用于分析线粒体融合是本领域中众所周知的。例如，可使用时移共聚焦显微镜法来使线粒体可视化。此技术由Chen等人(Chen H.et al.(2003)J.Cell Biol.160:189-200(Chen H.等人(2003)《细胞生物学期刊》160:189-200)描述来研究Mfn1和Mfn2敲除对线粒体动态和融合的效应。

线粒体融合蛋白表达

本发明中可采用分析Mfn1或Mfn2的表达的方法来筛选候选物质对蛋白质水平的效应。此外，作为诊断方法的一部分，可分析来自受试者的样品中的蛋白质例如Mfn1、Mfn2或其他生物标志物的表达水平。蛋白质的表达水平可与疾病或疾病易感性相关联。

本领域中已知许多技术用于测定蛋白质的表达水平。可应用这些技术来测试候选物质对Mfn1和/或Mfn2的表达水平的效应。所采用的技术优选地为适于对候选物质进行自动化和/或高通过量筛选的技术。

例如，筛选可使用携带编码Mfn1和/或Mfn2的核酸的细胞来进行，Mfn1和/或Mfn2有效连接至报告基因部分。报告基因部分可有效连接至内源Mfn1-和/或Mfn2-编码基因。或者，有效连接至报告基因部分的Mfn1和/或Mfn2的外源拷贝可插入细胞中。在此实施例中，细胞可被工程化为对天然Mfn1和/或Mfn2表达具有缺陷。连接至Mfn1和Mfn2的报告基因部分可为彼此不同的或区别明显的。合适的报告基因部分包括荧光标记，例如荧光蛋白如绿色、黄色、樱桃红色、青色或橙色荧光蛋白。

“有效连接”应被理解为是指所述组分处于允许使它们按照本身预期的方式发挥作用的关系。

可使此类细胞与候选物质接触，并且可通过分析细胞中报告基因部分表达的水平来监测Mfn1和/或Mfn2的表达水平。可通过本领域中已知的许多技术例如流式细胞计量术、荧光激活细胞分选术(FACS)和荧光显微镜法来分析荧光报告基因部分。Mfn1或Mfn2的表达可在同一细胞中单独或同时分析。可对与候选物质接触之前和之后的Mfn1和/或Mfn2的表达水平进行比较。或者，可对与候选物质接触的细胞与对照细胞之间的Mfn1和/或Mfn2的表达水平进行比较。如果对Mfn1和Mfn2的表达的效应得以确定，则候选物质的效应可以Mfn1和Mfn2表达的比率表示。

其他方法可用于分析蛋白质例如Mfn1和Mfn2的表达。可直接分析蛋白质表达。例如，可使用诸如SDS-PAGE分析通过考马斯(Coomassie)或银染色进行可视化的方法来对表达进行定量分析。或者，使用蛋白质印迹法或酶联免疫吸附测定(ELISA)通过结合蛋白质产物的抗体探针来对表达进行定量分析。用报告基因部分标记的Mfn1和/或Mfn2(如上所述)还可用于这些方法中。或者，可例如通过研究与蛋白质例如Mfn1和/或Mfn2对应的mRNA的量来间接分析蛋白质表达，所述mRNA在细胞中转录。这可使用诸如定量逆转录PCR和Northern印迹法的方法来实现。

siRNA、shRNA、miRNA和反义DNA/RNA

可使用转录后基因沉默(PTGS)来调节线粒体融合蛋白的表达。双链RNA(dsRNA)介导的转录后基因沉默为控制外源基因表达的保守细胞防御机制。据认为，诸如转座子或病毒之类的元件的随机整合引起dsRNA的表达，该表达激活同源单链mRNA或病毒基因组RNA的序列特异性降解。沉默效应被称为RNA干扰(RNAi)(Ralph et al.(2005)Nat.Medicine 11:429-33(Ralph等人(2005))《自然医学》11:429-33)。RNAi的机制涉及将长dsRNA加工成约21-25核苷酸(nt)RNA的双链体。这些产物被称为小干扰或沉默RNA(siRNA)，是mRNA降解的序列特异性介导物。在分化的哺乳动物细胞中，已发现dsRNA>30bp可活化干扰素响应，导致蛋白质合成关闭和非特异性mRNA降解(Stark et al.(1998)Ann.Rev.Biochem.67:227-64(Stark等人(1998)《生物化学年鉴》67:227-64))。然而，可使用21nt siRNA双链体来绕过此响应(Elbashir et al.(2001)EMBO J.20:6877-88(Elbashir等人(2001)《欧洲分子生物学学会会刊》20:6877-88)；Hutvagner et al.(2001)Science 293:834-8(Hutvagner等人(2001)《科学》293:834-8))，从而允许在哺乳动物细胞中分析基因功能。

shRNA由小环序列组成的短的反向RNA重复序列组成。这些shRNA被细胞机器快速加工成19-22nt siRNA，从而抑制靶基因表达。

微小RNA(miRNA)为小的(长度为22-25个核苷酸)非编码RNA，该小的非编码RNA可通过与它们的3'非翻译区(UTR)结合而有效地减少靶mRNA的翻译。微小RNA是生物体中自然产生的一大群小RNA，其中的至少一些调控靶基因的表达。微小RNA家族的基础成员为let-7和lin-4。let-7基因编码小的、高度保守的RNA种类，其在蠕虫发育过程中调控内源性蛋白编码基因的表达。活性RNA种类开始被转录成～70nt的前体，在转录后加工成成熟的～21nt的形式。let-7和lin-4被转录成为发夹RNA前体，RNA前体通过Dicer酶被加工成它们的成熟形式。

反义概念是使细胞中的短的可能修饰的DNA或RNA分子与信使RNA选择性地结合并防止编码的蛋白质的合成。

用于设计调节靶蛋白质表达的siRNA、shRNA、miRNA和反义DNA/RNA的方法，以及用于将这些物质递送至所关注的细胞的方法是本领域中熟知的。此外，本领域中熟知的是例如通过使用组织特异性启动子来对生物体内某些细胞类型的蛋白质表达进行特异性调节(例如降低)。

代谢疾病

本发明的物质可用于代谢疾病的治疗或预防。代谢疾病可为糖尿病、胰岛素抗性、葡萄糖耐量降低或空腹血糖异常。优选地，代谢疾病为糖尿病。糖尿病可为1型或2型糖尿病，优选地2型糖尿病。

糖尿病是一种代谢病症，其主要特征是由身体无法产生或利用胰岛素而导致的高血糖水平。高血糖可导致包括许多临床并发症，包括神经元损伤、失明、截肢、肾脏损伤、视网膜病、动脉粥样硬化、糖尿病性坏疽、心脏病发作或中风等。

最常见的糖尿病类型是胰岛素依赖型糖尿病(1型糖尿病)和2型糖尿病，后者是目前为止最多的类型。2型糖尿病的增加主要是由肥胖率的升高所致。据估计，目前有超过11亿人超重，其中约3.2亿为肥胖症患者。

1型糖尿病是导致产生胰岛素的胰腺β细胞破坏的自身免疫疾病。2型糖尿病是这样一种状态，其中胰岛素以不足的量分泌(胰岛素缺乏)或胰岛素抑制血糖水平的效应被减弱(胰岛素耐受性或抗性)。

2型糖尿病发生的病理生理学是复杂的并且多因素的。肥胖、久坐不动的生活方式和/或年龄增大可导致胰岛素抗性，并且导致循环胰岛素浓度随着时间的推移而升高。在某一时间点，血糖的失控开始出现，导致葡萄糖耐量降低或空腹血糖异常。最终可导致2型糖尿病。因此，胰岛素抗性、葡萄糖耐量降低和空腹血糖异常是指介于正常葡萄糖稳态与糖尿病之间的代谢状态。

代谢疾病的动物模型

代谢疾病例如糖尿病、胰岛素抗性和葡萄糖耐量降低的许多动物模型是本领域已知的。如上所述，C57Bl/6J小鼠模型通常用于基于动物的研究，因为其能够在高脂肪饲喂时模拟人类代谢疾病。

可通过对发展出自身免疫疾病的啮齿动物进行β细胞化学消融或繁育来开发1型糖尿病的模型。啮齿动物或更高等动物的化学消融可例如使用STZ或lloxan来实现。1型糖尿病的自身免疫模型包括NOD小鼠、BB大鼠和LEW.1AR1/-iddm大鼠。此外，患有遗传诱导的胰岛素依赖型糖尿病的AKITA小鼠可用作1型糖尿病模型。更高等的生物体模型例如猪和猕猴可在胰脏切除或β细胞化学消融后用作1型糖尿病模型。

2型糖尿病模型通常也作为胰岛素抗性模型。许多2型糖尿病模型为肥胖的例如Lep^ob/ob小鼠、Lep^db/db小鼠、Zucker肥胖大鼠和Zucker糖尿病性肥胖大鼠、KK小鼠、OLETF大鼠、新西兰肥胖小鼠等等。2型糖尿病模型还可通过对例如C57Bl/6J小鼠进行高脂肪饲喂来形成。2型糖尿病的非肥胖模型包括Goto-Kakizaki大鼠和hIAPP小鼠。此外，2型糖尿病的猫、狗、猪和旧世界非人类灵长类动物模型是本领域中已知的。这些模型系统可用于本发明的方法中。

本领域中已知的合适的动物模型由King等人详述(King A.J.et al.(2012)Br.J.Pharmacol.166:877-94(King A.J.等人(2012)《英国药理学杂志》))。此外，上述Mfn1LKO和Mfn2LKO小鼠也可用作代谢疾病的动物模型。

向细胞中引入多肽和多核苷酸

用于本发明中的物质可为多肽或多核苷酸。还需要将多核苷酸和多肽引入细胞中来作为本发明的方法或筛选测定的一部分。

在本发明利用多肽的情况下，可直接施用多肽(例如，可施用多肽本身)，或通过将编码多肽的核酸序列在允许于所关注的细胞中表达该多肽的条件下引入细胞中。可使用载体将核酸引入细胞中。

载体是允许或有利于将实体从一种环境转移到另一种环境的工具。根据本发明并且以举例的方式，用于重组DNA技术的一些载体允许实体，例如核酸区段(如异源DNA区段，如异源cDNA区段)被转移到靶细胞。载体可用于维持细胞内的异源核酸(DNA或RNA)，从而有利于包含核酸区段的载体的复制，或有利于核酸区段所编码的蛋白质的表达。载体可为非病毒载体或病毒载体。用于重组核酸技术中的载体的例子包括但不限于质粒、染色体、人工染色体和病毒。载体还可为例如裸核酸(例如，DNA)。当载体呈其最简单的形式时，载体本身可为所关注的核苷酸。

可用于本发明中的载体可为例如质粒或病毒载体并且可包括用于多核苷酸表达的启动子以及任选的启动子的调控因子。

可使用多种本领域中已知的技术例如转化和转导将用于本发明中的包含多核苷酸的载体引入细胞中。用重组病毒载体(例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒和单纯性疱疹病毒载体)感染；以及直接注射核酸和基因枪转化。

非病毒递送体系包括但不限于DNA转染方法。此处，转染包括使用非病毒载体来将基因递送至靶细胞的方法。

多肽或多核苷酸的转移可通过本领域中已知的以物理方式或以化学方式使细胞膜透化的任意方法来进行。细胞穿透肽还可用于将多肽转移到细胞中。

非病毒递送体系包括但不限于DNA转染方法和磷酸钙沉淀。典型的转染方法包括电穿孔、DNA基因枪、脂质介导的转染、密集DNA介导的转染、脂质体、免疫脂质体、微脂粒感染、阳离子剂介导的转染、阳离子表面两亲物(CFA)(Nature Biotechnology 1996 14；556(《自然生物技术》1996 14；556))以及它们的组合。

此外，本发明可采用基因靶向方案，例如DNA修饰物质的递送。

载体可为表达载体。本文描述的表达载体可包含核酸区，所述核酸区包含能够被转录的序列。因此，编码mRNA、tRNA和rRNA的序列包括在此定义内。

表达载体优选地包含用于本发明中的多核苷酸，所述多核苷酸有效连接至控制序列，所述控制序列能够通过宿主细胞提供对编码序列的表达。“有效连接”至编码序列的调控序列的连接方式使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下实现。可例如通过添加另外的转录调控元件来修饰控制序列，以使得由所述控制序列引导的转录的水平更易于响应转录调节因子。

多核苷酸

本发明的多核苷酸可包括DNA或RNA。它们可为单链的或双链的。本领域技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸可编码相同的多肽。此外，应当理解，本领域技术人员可使用常规技术进行下述核苷酸置换，所述置换不影响本发明的多核苷酸编码的多肽序列，以反映其中将表达本发明的多肽的任何特定宿主生物体的密码子应用。

可通过本领域中可用的任何方法对多核苷酸进行修饰。可进行此类修饰以增强本发明多核苷酸的体内活性或存活期(life span)。

多核苷酸，例如DNA多核苷酸可通过重组、合成或通过本领域技术人员可用的任何方法来制备。还可通过标准技术对它们进行克隆。

通常使用重组方法来制备较长的多核苷酸，例如使用聚合酶链反应(PCR)克隆技术。这将包括制备一对旁侧具有需要被克隆的靶序列的引物(例如大约15至30个核苷酸)，使所述引物与获自动物或人类细胞的mRNA或cDNA进行接触，在引起所需区扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片断(例如通过琼脂糖凝胶纯化反应混合物)以及回收扩增的DNA。引物可被设计为含有合适的限制性酶识别位点，使得扩增的DNA可被克隆到合适的载体中。

蛋白质

如本文所用，术语“蛋白质”包括单链多肽分子以及多个多肽的复合物，在所述复合物中，各个组成多肽通过共价方式或非共价方式连接。如本文所用，术语“多肽”和“肽”是指其中单体为氨基酸并通过肽键或二硫键接合在一起的聚合物。

变体、衍生物、类似物、同系物和片段

除了本文提到的具体蛋白质和核苷酸之外，本发明还涵盖变体、衍生物、类似物、同系物以及它们的片段。

在本发明的上下文中，任何给定序列的变体是这样的序列，其中各残基(无论是氨基酸残基还是核酸残基)的具体序列已被修饰，所述修饰的方式为使得所讨论的多肽或多核苷酸保持其内源功能中的至少一种。可通过对天然存在的蛋白质或核苷酸中存在的至少一个残基进行添加、缺失、置换、修饰、替代和/或变异来获得变体序列。

与本发明的蛋白质或多肽相关的本文所用的术语“衍生物”包括对来自序列的一个(或多个)氨基酸残基进行的任何置换、变异、修饰、替代、缺失和/或将一个(或多个)氨基酸残基添加至序列，前提条件是所产生的蛋白质或多肽保持其内源功能中的至少一种。

与多肽或多核苷酸相关的本文所用的术语“类似物”包括任何模拟物，即这样的化合物，所述化合物具有其所模拟的多肽或多核苷酸的内源功能中的至少一种。

通常，可例如从1、2或3至10或20个置换作出氨基酸置换，前提条件是被修饰的序列保持所需的活性或能力。氨基酸置换可包括使用非天然存在的类似物的。

用于本发明中的蛋白质还可具有这样的氨基酸残基缺失、插入或置换，即所述缺失、插入或置换产生不活跃的变化并且导致功能上等同的蛋白质。还可基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲特性的相似性做出有意的氨基酸置换，只要内源功能得以保持即可。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；包含具有相似亲水性值的不带电荷的极性头部基团的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。

保守置换可例如按下表进行。第二列同一格中的氨基酸，优选第三列同一行中的氨基酸可互相置换：

“同系物”意指与野生型氨基酸序列或野生型核苷酸序列具有某种同一性的实体。术语“同源性”可等同于“同一性”。

在本发明上下文中，同源序列旨在包括可与主题序列具有至少50％、55％、65％、75％、85％或90％同一性，优选具有至少95％或97％或99％同一性的氨基酸序列。通常，同系物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。尽管还可以相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)考虑同源性，但在本发明的上下文中，优选地以序列同一性表达同源性。

在本发明上下文中，同源序列旨在包括可与主题序列具有至少50％、55％、65％、75％、85％或90％同一性，优选具有至少95％或97％或99％同一性的核苷酸序列。尽管还可以相似性考虑同源性，但在本发明的上下文中，优选地以序列同一性表达同源性。

同源性比较可通过肉眼进行，或更通常地，借助于易得序列比较程序进行。这些商购计算机程序可计算两个或更多个序列之间的同源性或同一性百分比。

同源性百分比可通过连续的序列来计算，即将一条序列与另一条序列进行比对，并将一条序列中的每个氨基酸或核苷酸与另一条序列中的相应氨基酸或核苷酸直接比较，一次一个残基。这称为“无空位”比对。通常，此类无空位比对仅在相对短数目的残基范围内进行。

尽管这是十分简单和可靠的方法，但其未能考虑例如在原本相同的序列对中，氨基酸或核苷酸序列中的一个插入或缺失可导致后面的残基或密码子不再对齐，从而在进行全局比对时可能导致同源性百分比有大的降低。因此，将大多数序列比较方法被设计产生最佳比对，所述最佳比对考虑可能的插入和缺失而不会过度罚掉整体同源性分数。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。

然而，这些更复杂的方法向比对结果中出现的每个空位赋予“空位罚分”，使得对于同样数目的相同氨基酸或核苷酸，具有尽可能少空位的序列比对(反映两条比较序列之间具有较高的相关性)将获得比具有许多空位的序列比对结果更高的分数。通常使用“仿射空位成本(Affine gap cost)”，其对空位的存在收取相对较高的成本，对空位中每一个后续残基收取较少的罚分。这是最通常使用的空位评分系统。高空位罚分当然会产生具有较少空位的最佳比对结果。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当使用这种软件进行序列比较时优选使用默认值。例如当使用GCG Wisconsin Bestfit程序包时，氨基酸序列的默认空位罚分为：空位：-12，每个延伸：-4。

因此，最大同源性百分比的计算首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。适用于进行这种比对的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit程序包(University ofWisconsin,U.S.A.；Devereux et al.(1984)Nucleic Acids Research 12:387(美国威斯康星大学；Devereux等人(1984)《核酸研究》12:387))。可进行序列比较的其他软件的例子包括但不限于例如：BLAST软件包(参见Ausubel et al.(1999)出处同上–第18章)、FASTA(Atschul et al.(1990)J.Mol.Biol.403-410(Atschul等人(1990)《分子生物学杂志》403-410))和比较工具的GENEWORKS套件。BLAST和FASTA可用于离线和在线检索(参见Ausubel等人(1999)出处同上，第7-58页至7-60页)。然而，对于一些应用，优选使用GCG Bestfit程序。称为BLAST 2Sequences的另一种工具也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMSMicrobiol.Lett.(1999)174(2):247-50；FEMS Microbiol.Lett.(1999)177(1):187-8(《欧洲微生物学会联合会微生物学通讯》(1999)174(2):247-50；《欧洲微生物学会联合会微生物学通讯》(1999)177(1):187-8))。

尽管最终的同源性百分比也可以同一性来量度，但比对过程本身通常不是基于全或无的(all-or-nothing)成对比较。相反，通常使用标度化相似性评分矩阵，该矩阵基于化学相似性或进化距离向每一成对比较赋予分值。通常使用的这种矩阵的例子是BLOSUM62矩阵(BLAST程序套件的默认矩阵)。GCG Wisconsin程序通常使用公共默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(关于进一步的细节参见用户手册)。对于一些应用而言，优选的是使用GCG软件包的各默认值，或就其他软件而言，使用默认矩阵，例如BLOSUM62。

一旦该软件产生了最佳比对，则可计算同源性百分比，优选序列同一性百分比。作为序列比较的一部分，该软件通常进行这些计算并产生数值结果。

“片段”也是变体，该术语通是常指多肽或多核苷酸中的在功能上或在例如测定中所关注的选定区域。“片段”因此是指属于全长多肽或多核苷酸的一部分的氨基酸或核酸序列。

此类变体可使用标准重组DNA技术如定点诱变来制备。在要制备插入物的情况下，可制备编码该插入物的合成DNA以及与天然序列对应的位于插入位点任一侧的5'和3'旁侧区。所述旁侧区将包含对应于天然序列中的位点的适宜的限制性位点，使得该序列可用适当的酶进行切割并且合成DNA可连接到切口中。然后根据本发明表达DNA以制备所编码的蛋白质。这些方法仅仅是说明许多本领域已知的用于操纵DNA序列的标准技术，其他已知的技术也可使用。

本发明的线粒体融合蛋白(例如，Mfn1或Mfn2)的所有变体、片段或同系物将保持其结合介导线粒体融合的能力。

密码子优化

本发明中所用的多核苷酸可经过密码子优化。密码子优化此前在WO 1999/41397和WO 2001/79518中已有描述。不同的细胞在它们对特定密码子的用法上存在差异。此密码子偏向与特定tRNA在细胞类型中的相对丰度的偏向对应。通过改变序列中的密码子，使得将它们受到调控以匹配对应的tRNA的相对丰度，则有可能提高表达。同样，通过有意选择已知其对应的tRNA在特定细胞类型中稀有的密码子，有可能降低表达。因此，可获得额外程度的翻译控制。本领域已知哺乳动物细胞以及多种其他生物体的密码子用法表。

抗体

如本文所用的抗体是指能够结合所选靶标的完全抗体或抗体片段，并且包括Fv\ScFv\F(ab’)和F(ab’)₂、单克隆和多克隆抗体、工程化抗体(包括嵌合抗体、CDR-移植抗体和人源化抗体)以及使用噬菌体展示或其他技术产生的人工选择抗体。

此外，本发明中还可使用经典抗体的替代形式，例如“阿维体(avibody)”、“阿维聚体(Avimer)”、“抗转运蛋白(anticalins)”、“纳体(nanobody)”和“锚蛋白重复蛋白(DARPin)”。

用于产生抗体的方法是本领域的技术人员已知的。或者，抗体可源自商业来源。

如果需要多克隆抗体，则可对选定的哺乳动物(例如小鼠、兔子、山羊、马等)进行免疫。可收集来自免疫的动物的血清并根据已知工序进行处理。如果血清含有针对其他抗原的多克隆抗体，则多克隆抗体可通过免疫亲和层析来纯化。用于制备并加工多克隆抗血清的技术是本领域已知的。

针对本发明中使用的抗原(例如蛋白质)的单克隆抗体也可由本领域的技术人员容易地制备。通过杂交瘤制备单克隆抗体的一般方法是众所周知的。永生化抗体生成细胞系可通过细胞融合产生，并且也通过其他技术如利用致癌DNA直接转化B淋巴细胞，或用埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)转染来产生。可筛选产生的针对抗原的单克隆抗体的图谱(panel)的各种性质，例如同种型和表位亲和力。

一种可选的技术涉及筛选噬菌体展示文库，其中例如噬菌体在其衣壳表面表达scFv片段以及各种互补性决定区(CDR)。此技术是本领域众所周知的。

针对抗原的抗体(单克隆和多克隆抗体两者)具体可用于诊断中，其中中和型的那些抗体可用于被动免疫疗法中。单克隆抗体具体可用于激发抗独特型抗体。抗独特型抗体是携带需要针对提供保护的传染剂抗原的“内部图像”的免疫球蛋白。

用于激发抗独特型抗体的技术是本领域已知的。这些抗独特型抗体也可用于治疗，以及用于阐明抗原的致免疫区。

治疗方法

应认识到，本文对治疗的所有提及包括治愈性、如息性和预防性治疗。优选哺乳动物，特别是人类的治疗。人类和兽医治疗均在本发明的范围之内。

施用

虽然用于本发明中的物质可单独施用，但它们通常与药物载体、赋形剂或稀释剂混合施用，特别是对于人类疗法而言。在一些实施例中，所述物质为营养剂、食品添加剂或食品成分，并可因此调配在合适的食品组合物中。因此，物质可以例如食品、饮料、宠物食品、食物补充剂、营养保健品或营养配方食品的形式施用。

剂量

无需进行过多实验，本领域的普通技术人员可容易地确定向受试者施用的本发明物质之一的适当剂量。通常，医师会确定对个体患者最适合的实际剂量，并且该剂量将取决于多种因素，包括所采用的具体化合物的活性、化合物的代谢稳定性和作用时长、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用模式和时间、排泄速度、药物组合、特定病症的严重程度和个体正接受的疗法。当然也可存在有益的较高或较低剂量范围的个别情况，这在本发明的范围之内。

生物标志物和诊断方法

样品

在本发明的范围内，诊断和预后方法的上下文中的“样品”是指源自受试者的样品。生物样品可直接获自受试者或可源自从所述受试者获得的培养的细胞。

在本发明的范围内，筛选测定的上下文中的“样品”是指合适的细胞、细胞群、动物模型或人类。这些样品无需源自受试者。本文上下文中的样品可为来自细胞系的细胞群。

受试者

“受试者”是指人类或非人类动物。非人类动物的例子包括脊椎动物例如哺乳动物，如非人类灵长类动物(特别是高等灵长类动物)、狗、啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠或豚鼠)、猪和猫。在一个优选的实施例中，受试者是人类。

实例

实例1：一般方法：

材料除非另外说明，所有化学品(包括PJ34)均来自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)。

动物实验。纯C57B1/6J背景的Mfn1基因两侧加有LoxP位点的雄性小鼠由巴塞罗那生物医学研究院(西班牙)(IRB Barcelona(Spain))的Antonio Zorzano教授创建。使这些小鼠与表达Cre重组酶的小鼠杂交以产生Mfn1基因肝脏特异性缺失(Mfn1-LKO)的小鼠。基因两侧加有LoxP位点的动物用作对照。使小鼠随意获取水和标准啮齿类动物普通饲料饮食(D12450J，美国新泽西州新不伦瑞克的食品研究有限公司(Research Diets Inc.,NewBrunswick,NJ,USA)或获取高热量、高脂肪膳食(60千卡脂肪，美国新泽西州新不伦瑞克的食品研究有限公司)并将小鼠保持12小时的暗光循环。所有动物实验均按照地方、国家以及欧盟的伦理准则进行。为了监测体重，在每周的同一天对小鼠称重并测量饲料消耗。在所有研究中，将动物禁食6小时(从8:00开始)后处死(14:00)，如下所述采集并加工组织。口服糖耐受性测试和腹膜内胰岛素耐受性如前所述进行确定(Lagouge等人，2006年)。使用特定的ELISA物质盒(Mercodia)测定肝素化血浆样品中的血浆胰岛素。收集肝素化管中的血样并在离心之后分离血浆。我们在开路间接量热系统(美国内华达州拉斯维加斯的萨布雷系统公司(Sabre systems,Las Vegas,NV,USA))中历经24-48小时按照所述测量了O₂消耗、CO₂产量和自发活动度(Lagouge等人，2006年)。使用20.1J/mL O₂的能量当量获得能量消耗。呼吸商为CO₂产量与O₂消耗的比率。在活动测量(actimetry)期间，每15分钟对光束线交叉进行汇总。绘制每15分钟时段的总光束线交叉相对于时间的图线，并且计算每只小鼠的AUC，为每次实验队列的平均值。

mRNA分析：使用TRIzol(Invitrogen)根据制造商的说明制备总RNA。用脱氧核糖核酸酶处理RNA并将2mg RNA用于逆转录(RT)。在QIAquick PCR净化柱(美国加利福尼亚州巴伦西亚的凯杰公司(Qiagen,Valencia,CA,USA))上纯化cDNA。将50倍稀释的cDNA用于RT-定量PCR(RT-qPCR)反应(Lagouge等人，2006年)。使用Light-Cycler系统(罗氏应用科学公司(Roche Applied Science))和qPCR Supermix(凯杰公司)通过下列引物进行RT-qPCR反应：β-2-微球蛋白(看家；F：TTCTGGTGCTTGTCTCACTG(SEQ ID NO:5)；R：TATGTTCGGCTTCCCATTCT(SEQ ID NO:6))；亲环蛋白(看家：F：CAGGGGAGATGGCACAGGAG(SEQ ID NO:7)；R：CGGCTGTCTGTCTTGGTGCTCTCC(SEQ ID NO:8))；Mfn1(F:AGGGGACCGATGGAGATAAAG(SEQ IDNO:9)；R：AAGAGGGCACATTTTGCTTTG(SEQ ID NO:10))；Mfn2(F:ACGTCAAAGGGTACCTGTCCA(SEQID NO:11)；R：CAATCCCAGATGGCAGAACTT(SEQ ID NO:12))。Mfn1和Mfn2表达评估通过这两个看家基因来校正。

线粒体分离、SDS-PAGE、蛋白质印迹。如此前所述使用0.5mg肝脏来分离线粒体(Frezza等人，2007年)。将最终的线粒体沉淀重悬于裂解缓冲液(50mM Tris、100mM KCl、EDTA 1mM、NP40 1％、烟酰胺5mM、丁酸钠1mM、蛋白酶抑制品pH 7.4)中。使用BCA蛋白质测定物质盒(美国伊利诺斯州罗克福德的赛默科技公司(Thermo Scientific,Rockford,IL,USA))测量蛋白质浓度，调节样品稀释度以产生相等的蛋白质浓度。将蛋白质通过SDS-PAGE分离并转移到硝化纤维膜上，如此前所述(Canto等人，2004年)。

用于蛋白质印迹应用的抗体。Mfn1、膜孔蛋白(porin)和OXPHOS混合物抗体购自英国剑桥的艾博抗公司(Abcam(Cambridge,UK))，OPA-1抗体购自美国旧金山的BD生物科学公司(BD Biosciences(San Francisco,USA))。过氧化物酶共轭的二级小鼠和兔抗体购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)。

线粒体呼吸：使用呼吸测量法来评估线粒体功能(Oroboros Oxygraph-2k；奥地利因斯布鲁克的Oroboros仪器公司(Oroboros Instruments,Innsbruck,Austria))，如此前所述(Holmstrom等人，2012年)。将一块新鲜提取的肝脏(大约50mg)称重并置于缓和溶液(2.8mM Ca2K2EGTA、7.2mM K2EGTA、5.8mM ATP、6.6mM MgCl2、20mM牛磺酸、15mM磷酸肌酸钠、20mM咪唑、0.5mM二硫苏糖醇和50mM MES、pH 7.1)中，并且在解剖工序结束时，在200微升冰冷呼吸测量法介质(0.5mM EGTA、3mM MgCl2、60mM乳糖醛酸钾、20mM牛磺酸、10mMKH2PO4、20mM HEPES、110mM蔗糖和0.1％(w/v)牛血清白蛋白，pH 7.1)中用eppendorf研杵将组织轻缓均质化。然后调节呼吸测量法介质的体积以获得0.1mg组织/微升的浓度。然后，将2mg匀浆加载到呼吸室中。所有测量均以一式两份进行。通过添加底物苹果酸盐(终浓度2mM)、谷氨酸盐(20mM)和丙酮酸盐(10mM)来测量来自呼吸链的复合物I(渗出物)的基线O2通量。对于穿过复合物I+II的会聚电子流而言，通过添加ADP(5mM)，然后添加复合物II底物琥珀酸盐(10mM)来对氧化磷酸化进行定量。然后滴定质子团(protonophore)羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)-苯腙(0.2μM)以实现穿过电子转移体系的最大通量。最终，通过分别依序添加鱼藤酮(0.1μM)和抗霉素A(2.5μM)来抑制穿过复合物I和III的电子传递。

统计学分析。对于动物研究中的统计分析而言，验证所有数据的正态分布。为了评估显著性，我们对独立的样品进行了斯氏t检验(Student's t-test)。所用统计软件为GraphPad Prism 5(GraphPad软件有限公司(GraphPad Software,Inc.))并且所有小于0,05的p值均被认为是显著的。

实例2.Mfn1肝脏特异性缺失(Mfn1-LKO)不改变总体外观、食物摄入量、身体活动或能量消耗，但提高了全身脂质氧化速率。(表1)对16周龄的Mfn1LKO小鼠和对照小鼠进行Echo-MRI分析以分析身体组成，然后立即进行CLAMS分析以评价日常活动和食物摄入量。将24周龄小鼠处死，然后从小鼠的肝脏中提取总mRNA以通过RT-qPCR分析Mfn1和Mfn2表达。

实例3。来自Mfn1LKO小鼠的肝脏展示出较高的呼吸容量。(表2)将对照小鼠和Mfn1LKO小鼠在24周龄时处死。(A)将整个肝脏均质化或用于呼吸测量法测定，如实例1中所述。所有值以对照小鼠(n＝11)和Mfn1LKO小鼠(n＝9)的平均值+/-SEM展示。

实例4。饲喂普通饲料饮食的Mfn1LKO小鼠中的血糖控制不受影响。(图1)(A)以2g/kg体重向18周龄雄性对照或Mfn1LKO向小鼠进行腹膜内注射并且在指示时间期间追踪血糖水平。(B)以0.3U/kg胰岛素向20周龄雄性对照或Mfn1-LKO向小鼠进行腹膜内注射并且在指示时间期间追踪血糖水平。所有值以对照小鼠(n＝11)和Mfn1-LKO小鼠(n＝9)的平均值+/-SEM展示。

实例5.Mfn1LKO小鼠在高脂肪饲喂时展示出更佳的糖耐受性和胰岛素敏感性。(图2)(A)10周龄对照和Mfn1LKO小鼠维持低脂肪膳食(LFD)或高脂肪膳食(HFD)。(A)体重发展。(B)如通过Echo-MRI所测量的8周高脂肪饲喂后的身体组成。(C)HFD开始后10周，以2g/kg体重向小鼠进行腹膜内注射并且在指示时间期间追踪血糖水平。(D)HFD开始后12周，以0.75U/kg胰岛素向老龄向小鼠进行腹膜内注射并且在指示时间期间追踪血糖水平。曲线上面积(AOC)定量在右侧示出。所有值以对照小鼠(n＝10)和Mfn1LKO小鼠(n＝10)的平均值+/-SEM展示。*指示相对于各对照小鼠的统计意义上的显著性差异，p<0.05。

实例6-二甲双胍的降血糖效应在Mfn1LKO小鼠中增强。

二甲双胍是双胍类的口服抗糖尿病药。二甲双胍是治疗2型糖尿病的一线选择药物，特别是在超重和肥胖个体以及具有正常肾功能的个体中。二甲双胍也用于其中胰岛素抗性可为重要因素的疾病中。二甲双胍通过抑制肝脏产生葡萄糖来发挥作用。有时结合胰岛素或其他药物来开具二甲双胍处方。

从图3看出，二甲双胍的降血糖效应在Mfn1LKO小鼠中增强。将12周龄对照和Mfn1LKO小鼠用高脂肪膳食饲喂8周(D12492，美国食品研究有限公司(Research DietsInc.,USA))。然后，将小鼠禁食过夜并注射盐水(作为媒介物)或二甲双胍(125mg/kg)，将血糖水平追踪指示的时间点。所有值以每组n＝10只小鼠的平均值+/-SEM表示。*指示对照与Mfn1LKO小鼠之间的统计意义上的显著性差异，p<0.05。

实例7-在Mfn1LKO小鼠中注射二甲双胍时AMPK活化增强

将12周龄对照和Mfn1LKO小鼠用高脂肪膳食饲喂8周(D12492，美国食品研究有限公司(Research Diets Inc.,USA))。然后，将小鼠禁食过夜并且注射盐水(作为媒介物)或二甲双胍(125mg/kg)。90分钟后处死小鼠，然后立即提取并冷冻肝脏。获得蛋白质提取物并用于蛋白质印迹分析以测试AMPK活化的标志物：CRTC2、eIF2alpha和GAPDH。相比于对照小鼠，Mfn1LKO小鼠显示出增强的AMPK活化，如通过AMPK活化的被测标志物所证实。

实例8-二甲双胍对野生型和Mfn1LKO小鼠中线粒体呼吸作用的抑制

测量线粒体呼吸作用的方法描述于实例1中。将来自WT和Mfn1LKO小鼠的新鲜提取的线粒体重悬于呼吸介质中，并使用100μg蛋白质进行呼吸测量法分析。通过添加苹果酸盐和谷氨酸盐来刺激复合物I活性。然后，添加ADP以实现最大的偶联呼吸作用，随后滴定二甲双胍。图4的柱形图以4种线粒体制备物/基因型的平均值+/-SEM示出绝对呼吸作用水平。*指示WT和Mfn1LKO之间的统计意义上的显著性差异，p<0.05。下面的表描绘在不同二甲双胍剂量下所保留的最大呼吸作用的百分比。

一般来讲，虽然认为复合物I的抑制是主要贡献因素，但二甲双胍的作用还未得到充分理解(Metformin:From Mechanisms of Action to Therapies,Foretz et al.,2014,Cell Metabolism(二甲双胍：作用机制到疗法，Foretz等人，2014年，《细胞代谢》)；DOI:10.1016/j.cmet.2014.09.018)。如本实例中所证实，在施用二甲双胍后，线粒体复合物I呼吸作用在Mfn1LKO小鼠中受到的抑制多于在对照小鼠中受到的抑制。

表1：对照小鼠和Mfn1-LKO小鼠的总体外观和能量消耗参数。所有值以对照小鼠(n ＝11)和Mfn1 LKO小鼠(n＝9)的平均值+/-SEM展示。

表2：来自对照小鼠和Mfn1-LKO小鼠的肝脏中的呼吸作用值(pmol/(s*mg组织))这些值是扣除添加抗霉素-A(复合物III抑制品)后所保留的残余呼吸后得到的净呼吸速率。所有值以对照小鼠(n＝11)和Mfn1 LKO小鼠(n＝9)的平均值+/-SEM展示。

参考文献

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Anila K.Madiraju,Derek M.Erion,Yasmeen Rahimi,Xian-Man Zhang,Demetrios T.Braddock,Ronald A.Albright,Brett J.Prigaro,J ohn L.Wood,SanjayBhanot,Michael J.MacDonald,Michael J.Jurczak,Joao-Paulo Camporez,Hui-YoungLee,Gary W.Cline,Varman T.Samuel,Richard G.Kibbey&Gerald I.Shulman(2014)Metformin suppresses gluconeogenesis by inhibiting mitochondrialglycerophosphate dehydrogenase,Nature 510,542–546(26June 2014)(AnilaK.Madiraju、Derek M.Erion、Yasmeen Rahimi、Xian-Man Zhang、Demetrios T.Braddock、Ronald A.Albright、Brett J.Prigaro、John L.Wood、Sanjay Bhanot、MichaelJ.MacDonald、Michael J.Jurczak、Joao-Paulo Camporez、Hui-Young Lee、Gary W.Cline、Varman T.Samuel、Richard G.Kibbey&Gerald I.Shulman(2014)二甲双胍通过抑制线粒体磷酸甘油脱氢酶来抑制葡萄糖异生作用，《自然》510,542–546(2014年6月26日))

在上述说明书中提到的所有出版物均以引用方式并入本文。本发明的所述方法的各种修改形式和变型形式将在不脱离本发明范围和精神的情况下对本领域的技术人员显而意见。虽然已结合具体优选实施例对本发明进行了描述，但是应当理解，受权利要求书保护的本发明不应不当地限于此类具体实施例。实际上，对生物化学和生物技术或相关领域技术人员显而易见的对用于实践本发明的所述模式的各种修改旨在落在以下权利要求书的范围内。

Claims

1.一种用于鉴定调节Mfn1的活性的物质的方法，所述方法包括提供包含Mfn1多肽或多核苷酸和候选物质的制品，以及检测所述候选物质是否影响所述Mfn1多肽或多核苷酸的活性，其中所述方法用于鉴定能够抑制Mfn1的活性但不抑制线粒体融合蛋白-2(Mfn2)的活性的物质。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述Mfn1的活性通过测定Mfn1的GTP酶活性来测量。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述方法包括使所述候选物质与所述Mfn1多肽在存在GTP的情况下接触并测量GTP向GDP的水解。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述Mfn2的活性通过测定Mfn2的GTP酶活性来测量。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述方法用于鉴定降低Mfn1的活性的物质。

6.一种鉴定能够调节Mfn1与GTP之间的相互作用的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：

d)提供Mfn1多肽；

e)提供GTP分子；以及

f)在存在候选物质的情况下检测所述Mfn1多肽与所述GTP分子之间的结合；

其中所述物质抑制Mfn1的活性但不抑制Mfn2的活性。

7.一种用于鉴定调节Mfn1多肽的表达或加工的物质的方法，所述方法包括使表达Mfn1多肽的细胞与候选物质接触并监测所述Mfn1多肽的表达或加工的增加或降低，其中所述物质抑制Mfn1的活性但不抑制Mfn2的活性。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述方法用于鉴定降低Mfn1多肽的表达或加工的物质，所述方法包括使表达Mfn1多肽的细胞与候选物质接触并监测所述Mfn1多肽的表达或加工的降低。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述方法用于鉴定降低Mfn1多肽的表达或加工但不调节Mfn2多肽的表达或加工的物质。

10.根据权利要求1-4和6-9任一项所述的方法，其中所述方法用于鉴定预防、减轻或改善代谢疾病的症状的物质，其中所述代谢疾病选自胰岛素抗性、葡萄糖耐量降低、空腹血糖异常和糖尿病。

11.一种鉴定预防、调节、减轻或改善代谢疾病的症状的物质的方法，所述方法包括将鉴定为调节Mfn1活性的物质施用于针对所述代谢疾病的动物模型并观察所述动物模型中的所述代谢疾病的进展，其中所述代谢疾病选自胰岛素抗性、葡萄糖耐量降低、空腹血糖异常和糖尿病，其中所述物质抑制Mfn1的活性但不抑制Mfn2的活性。

12.根据权利要求11所述的方法，其中使用权利要求1至10中任一项所述的方法来鉴定所述候选物质。

13.根据权利要求11至12中任一项所述的方法，其中所述物质为siRNA、shRNA、miRNA或反义RNA。

14.能够调节Mfn1的活性的物质在制备用于治疗或预防代谢疾病的药物中的用途，其中所述代谢疾病选自胰岛素抗性、葡萄糖耐量降低、空腹血糖异常和糖尿病，其中所述物质抑制Mfn1的活性但不抑制Mfn2的活性。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述物质能够降低所述Mfn1的活性。

16.根据权利要求14或15所述的用途，其中所述物质选自siRNA、shRNA、miRNA或反义RNA。

17.一种编码siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA或多肽的载体，所述载体用于治疗根据权利要求13至15任一项所述的代谢疾病，其中所述代谢疾病选自胰岛素抗性、葡萄糖耐量降低、空腹血糖异常和糖尿病，其中所述siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA或多肽抑制Mfn1的活性但不抑制Mfn2的活性。

18.Mfn1多肽或编码所述Mfn1多肽的多核苷酸在筛选预防或治疗代谢疾病的物质的方法中的用途，其中所述代谢疾病选自胰岛素抗性、葡萄糖耐量降低、空腹血糖异常和糖尿病，其中所述物质抑制Mfn1的活性但不抑制Mfn2的活性。