WO2004074482A1 - Método de diagnóstico para diabetes y obesidad - Google Patents

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WO2004074482A1
WO2004074482A1 PCT/ES2004/000077 ES2004000077W WO2004074482A1 WO 2004074482 A1 WO2004074482 A1 WO 2004074482A1 ES 2004000077 W ES2004000077 W ES 2004000077W WO 2004074482 A1 WO2004074482 A1 WO 2004074482A1
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mfn2
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polypeptide
animal
diabetes
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PCT/ES2004/000077
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Daniel BACH GONZÁLEZ
Bernhard Baumgartner
Josep ORIOLA AMBRÓS
Manuel PALACÍN PRIETO
Sara Pich Comas
Francisca Rivera Fillat
Xavier Testar Ymbert
Deborah Paola Naon Elbirt
Hubert Vidal
Antonio Zorzano Olarte
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Universidad De Barcelona
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to the field of diabetes mellitus and obesity. More specifically, it refers to methods for the diagnosis of susceptibility to the development of type 2 diabetes or obesity and methods of identifying compounds for the treatment of type 2 diabetes or obesity, based on the Mitofusin-2 (Mfn2) gene and its derivative products .
  • Mfn2 Mitofusin-2
  • Diabetes mellitus - hereinafter simply "diabetes" - is one of the biggest public health problems, with more than 120 million people affected worldwide. Genetic factors play an important role in the development of diabetes. Some forms of diabetes are the result of mutations in a single gene, others are of polygenic origin. Monogenic forms of diabetes can represent 5% of all cases of diabetes, and have various causes. Diabetes can be the result of mutations in the insulin gene and insulin receptor genes, as well as in genes encoding the glycolytic enzyme glucokinase and in the nuclear transcription factors of hepatocytes-1 ⁇ (nuclear factoor-1 hepatocyte: HNF-1 ⁇ ), HNF-4 ⁇ and the insulin-promoting factor-1 (insulin promoter factor-1: IPF-1).
  • Type 2 diabetes is the most common form of diabetes, responsible for approximately 90% of all cases of diabetes, and it affects between 10 and 20% of individuals over 45 in most developed countries.
  • the pathogenesis of type 2 diabetes is characterized by the existence of defects in the action of insulin (insulin resistance) in muscle, adipose tissue and liver, as well as a relative failure of the ⁇ cells of the pancreas in production of sufficient amounts of insulin. Both insulin resistance and insulin deficiency have been shown to have genetic components.
  • Type 2 diabetes is the result of the combination of multiple genetic and environmental factors. Recently, new methods of treatment for type 2 diabetes have been proposed, based on the identification of the NIDDM1 locus as well as the calpain 10 gene (cf. WO 00/23603-A2).
  • Obesity is highly associated with insulin resistance, and constitutes the greatest risk factor for the development of non-insulin dependent diabetes or type 2 diabetes mellitus. A better method of identifying the population at risk of developing diabetes is needed. Obesity, since an individual may have normal plasma glucose values despite having a risk of developing diabetes, or having a normal young weight and being at risk of developing obesity. This could be resolved if it were possible to diagnose the subjects susceptible to these diseases before the development of diabetes or obesity. This is currently not possible in individuals with a classic form of diabetes or obesity, due to their multifactorial origin. Consequently, it is highly desirable to have new diagnostic and / or treatment methods for diabetes and / or obesity.
  • Mfn1 and Mfn2 Two genes called Mitofusina-1 (Mfn1) and Mitofusina-2 (Mfn2) have been described, which play a role in the generation of the mitochondrial network in human cells (cf. A. Santel and MTFuller, J.Cell Sci. 2001 , vol. 114, pp. 867-874). Based on this fact, the role of Mfn1 and Mfn2 has been described as anti-insecticidal and antifungal agents (cf. WO 01/25274-A1) and as important proteins for the regulation of mitochondrial fusion and for embryonic development (cf. H. Chen et al., J. Cell Bio. 2003, vol. 160, pp. 189-200).
  • Mfn2 is a key gene in the development of obesity and type 2 diabetes, and therefore a useful gene for the early diagnosis and treatment of such diseases.
  • one aspect of the present invention relates to a method for determining if an animal is at risk of developing type 2 diabetes and / or obesity characterized in that it comprises examining the expression of Mfn2 in said subject, a different expression being indicative of risk. of the wild
  • the expression of the Mfn2 gene is decreased in obesity and type 2 diabetes.
  • said test comprises determining the level of mRNA or the level of Mfn2 polypeptide.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for evaluating an animal model for a disorder or disease state comprising determining whether the ⁇ vlfn2 gene in said animal model is expressed at a predetermined level.
  • said level is lower than the level in a wild or normal animal.
  • another aspect of the present invention relates to a diagnostic method for type 2 diabetes and / or obesity in an animal characterized in that it comprises: obtaining a sample of the animal's nucleic acid, and analyzing the nucleic acid to detect a polymorphism in a Mfn2-coding segment of the nucleic acid, being the detection of the polymorphism indicative of a propensity to develop type 2 diabetes or obesity.
  • the nucleic acid encodes a portion of the Mfn2 gene, and specifically, encodes an Mfn2 polypeptide.
  • the Mfn2-coding nucleic acid segment is DNA that can specifically comprise an Mfn2 gene; an Mfn2-encoding cDNA, and / or an mRNA.
  • the nucleic acid analysis step comprises a selected technique. between the PCR, the RNAse protection assay, the RFLP assay, the SSCP procedure and the nucleic acid sequencing to obtain its sequence.
  • the sequence obtained from the nucleic acid is compared with a known sequence of the Mfn2 gene.
  • the nucleic acid encodes an Mfn2 polypeptide.
  • Another aspect of the invention relates to a method for regulating type 2 diabetes and / or obesity in an animal comprising the step of modulating in the animal the function of the Mfn2 gene and / or the activity of the Mfn2 gene.
  • said method further comprises the step of diagnosing type 2 diabetes or obesity in an animal by analyzing a sequence of an Mfn2-coding nucleic acid.
  • the step of modulating the function of the Mfn2 gene comprises providing Mfn2 polypeptide to the animal, being a native Mfn2 polypeptide or a mutated and partially modified polypeptide.
  • the provision of the Mfn2 polypeptide is achieved by inducing the expression of Mfn2 polypeptide, particularly by inducing the expression of the Mfn2 polypeptide encoded in the genome of the animal or encoded by a nucleic acid provided to the animal.
  • the provision of Mfn2 polypeptide is achieved by a method comprising the introduction into the animal of an Mfn2-encoding nucleic acid or by injection into the animal of a pharmacologically effective amount of Mfn2 polypeptide.
  • the step of modulating the function of the Mfn2 gene comprises providing a modulator of the function of the Mfn2 gene to the animal, for example a modulator of the function of the Mfn2 gene selected from the group consisting of an agonist, an antagonist , an activator and an inhibitor of the Mfn2 polypeptide.
  • the Mfn2 gene function modulator modulates the transcription of an Mfn2-encoding nucleic acid.
  • Another aspect of the present invention relates to the purified preparation of an antibody directed against the Mfn2 polypeptide, particularly a polyclonal antibody.
  • Figure 1 is a graphic illustration of the single base polymorphism (SNP) analysis CV1267235 of the Mfn2 gene (Celera Datábase).
  • Panel A Results obtained after the digestion of PCR products with Taql of control (C), obese (O) DNA samples and individuals with type 2 (D) diabetes.
  • Panel B Genotypic control frequencies (C), obese (O) and individuals with type 2 (D) diabetes.
  • Figure 2 is a graphic illustration of the human tissue distribution of Mfn2 mRNA.
  • the blot of RNA shows mRNA expression in human tissue. The position of RNA molecular size markers is shown on the left.
  • Figure 3 is a graphic illustration of the rat tissue distribution of the mfn2 mRNA.
  • the blot of RNA shows the expression of Mfn2 in rat tissues.
  • Figure 4 is a graphic illustration of the expression of mfn2 mRNA levels in skeletal muscle of obese Zucker rats.
  • the RNA blot shows the expression of the mfn2 mRNA in control rat tissue (C) and obese rats (O).
  • Panel B shows the data in arbitrary units (AU, "arbitrary units") expressed as mean ⁇ standard error. The differences between the control and obese groups are statistically significant at P ⁇ 0.01.
  • FIG. 6 is a graphic illustration of Mfn2 mRNA expression in cultured cells.
  • the blot of RNA shows the expression of Mfn2 mRNA in 3T3-L1 fibroblast (F) or adipocyte (A) cells and in L6E9 myoblast (Mb) or myoube (Mt) cells.
  • FIG 7 is a graphic illustration of the expression of the Mfn2 protein in rabies tissue.
  • Western blo ⁇ shows the expression of the iVifn2 protein in different rat tissues (B, brown adipose tissue; K: kidney; M: skeletal muscle; H: heart; W: white adipose tissue).
  • Western blotting was performed with a polyclonal anti-Mfn2 antibody (A), with an anti-Mfn2 antibody in the presence of 400 g / ml peptide used to dissociate the antibody (B) or a preimmune serum (C).
  • Figure 8 is a graphic illustration of impaired glucose oxidation and mitochondrial membrane potential in L6E9 myotubes as a consequence of repression of Mfn2.
  • Panel A Glucose oxidation (AU, arbitrary units) determined in L6E9 myotubes before being infected by adenovirus at 100 pfu / cell, coding for ⁇ -galactosidase ( ⁇ -GAL) or for a mouse Mfn2 antisense sequence (AS); uninfected myotubes (C). The results are expressed as mean + standard error of 4 independent observations. * indicates a statistically significant difference between ⁇ -GAL cells and AS cells, at P ⁇ 0.05.
  • Panel B Myotubes infected with adenovirus AS (AS), with adenovirus encoding ⁇ -galactosidase ( ⁇ -GAL) and uninfected (C) stained with potentiometric marker JC-1.
  • Mitochondrial membrane potential (AU, arbitrary units) determined as a ratio between the red fluorescence (of JC1 aggregates formed proportionally to the membrane potential) and the green fluorescence (of the JC-1 monomers). The results are expressed as mean + standard error of 8 independent cells. ** indicates a statistically significant difference between ⁇ -GAL cells and AS cells, at P ⁇ 0.001.
  • Figure 9 is a graphic illustration of repression of Mfn2 by stable transfection of murine Mfn2 antisense sequences.
  • Panel A Total RNA was obtained from wild 10T1 / 2 cells (wt), or from cells transfected with the empty vector (pcDNA3), or with murine Mfn2 antisense sequences (clones AS1 and AS2). Mfn2 mRNA levels were detected by Northern blot.
  • Panel B Crude protein extracts were obtained from wild 10T1 / 2 cells (wt), transfected with the empty vector (pcDNA3), or with murine Mfn2 antisense sequences (clones AS1 and AS2). The abundance of the Mfn2 protein was detected by Western blot using specific antibodies.
  • Figure 10 is a graphic illustration of the effect of repression of Mfn2 on glucose oxidation.
  • the oxidation of glucose e, glucose nmols / ⁇ g protein
  • the results are means + standard error of 4 independent observations.
  • FIG 11 is a graphic illustration of the effect of repression of Mfn2 on cellular respiration.
  • the oxygen consumption of 2 x 10 6 control cells or AS2 e, nmols oxygen / min / 10 6 cells
  • the oxygen consumption of 2 x 10 6 control cells or AS2 was measured on a Clark electrode, under different conditions, in order to calculate the total mitochondrial (t) oxygen consumption (t) (m), or not mitochondrial (nm), the consumption of coupled oxygen (intended for the synthesis of ATP) (cr), and decoupled (loss of proton gradient) (ur).
  • the results are expressed as mean + standard error of 4 independent observations. * indicates a statistically significant difference between control cells and AS2, at P ⁇ 0.05.
  • Figure 12 is a graphic illustration showing that the skeletal muscle of obese Zucker rats has an altered mitochondrial network (M).
  • Soleus muscles of control rats (L), or obese Zucker rats (O) were processed for stereological analysis of mitochondria.
  • the muscles were fixed and sectioned at random in different orientations and prepared for the electron microscope. 80 photographs were taken at 5000x and the mitochondrial membrane surface was determined per unit of mitochondrial volume using the "vertical section method".
  • the extent of the mitochondrial network is calculated as a volume / mitochondrial surface ratio (M).
  • M mitochondrial surface ratio
  • Figure 13 is a graphic illustration of the repression of Mfn2 protein in skeletal muscle of obese Zucker rats and obese human individuals.
  • Mitochondria-enriched fractions obtained from skeletal muscle from thin (L) and obese (O) (Panel A) or from control (L) and obese (O) (O) (Panel B) human individuals.
  • Mfn2 and Porina were detected by Western blot with specific antibodies. Protein loading control was done by staining with Ponceau proteins on Immobilon membranes. The values are expressed relative to control levels (average of a control group of 100). * indicates a statistically significant difference between the control and the obese, at P ⁇ 0.05 (Panel A). The difference between control and obese human individuals (Panel B) was statistically significant, at P ⁇ 0.005.
  • Northen blot assays were performed with 20 ⁇ g of total RNA, as described (cf. A. Castello et al., J. Biol. Chem. 1994, vol. 269, pp. 5905-5912) using as probes the fragment of C31 (321 bp) cDNA labeled with 32 P obtained from subtractive hybridization or the 32 P labeled SCF (stem-cell factor) cDNA fragment obtained by PCR.
  • the C31 cDNA fragment is identical to the 2,098-2,419 nucleotide sequence of rat U41803 (GenBank).
  • RNA samples were co-amplified with an internal competitor at different known concentrations, using the same pair of primers: 5'-atgcatccccacttaagcac-3 '(from 396 to 416 of the D86987 sequence of GenBank) and S'-ccagagggcagaactttgtc -S 1 (from 677 to 697 of the D86987 sequence of GenBank).
  • concentration of ⁇ Vlfn2 was extrapolated from the eoric point at which the two products would be equally amplified.
  • the rabbit antibody against the specific Mfn2 LGPKNSRRALMGYNDQVQRP peptide (from 557 to 576 of BAA34389.1) purchased from Research Genetics was used.
  • Anti-Porin serum was used as a mitochondrial marker.
  • 10% SDS-PAGE electrophoresis were separated from total homogenate proteins or from the mitochondrial enriched fractions and transferred to Immobilon membranes.
  • An antibody incubation was performed and subsequently detected by chemiluminescence as described (cf. A. Castello et al., J. Biol. Chem. 1994, vol. 269, pp. 5905-5912).
  • Skeletal muscle mitochondrial membrane volume and surface measurements were performed using the "vertical section method" (cf. A.J. Baddeley e ⁇ al., J. Microscopy 1986, vol. 142, pp. 259-276). Sole muscles of obese Zucker rats and four of control rats were fixed and sectioned in different random orientations, always perpendicular to their longitudinal axis, and 80 photographs were obtained per random group at 5000x. The photographs were obtained excluding the subsarcolemal population of mi ⁇ ocondrias and always including a Z-disk in the field. For each image, the surface and volume were calculated from the number of punches and randomly distributed cycloid arcs in a given area.
  • the number of points within the mitochondria is indicative of volume, and the number of cycloid arcs that cross the outer mitochondrial membrane is indicative of the surface.
  • the volume / surface ratio is an intrinsic parameter of the mitochondria and does not depend on the number of mitochondria studied ( Figure 12).
  • 10T / 2 fibroblasts were maintained in DMEM medium, 10% FBS.
  • a plasmid containing two independent expression cassettes for the expression of Mfn2 and GFP was prepared to carry out a transient transfection. Each expression cassette was initiated by a CMV promoter and contained a polyadenylation signal. The cells Transfected were identified by GFP fluorescence. Cells transfected with the empty vector were used as control. For stable transfection, an IMAGE 3746-e24 clone digestion was prepared with Kpnl and Xhol.
  • the antisense fragment corresponding to the 1-370 sequence of mouse Mfn2 was purified and cloned into a vector pcDNA3 vector (Invitrogene) between the Xhol-Kpnl targets. Isolation of individual clones was achieved by selection with geneticin at 500 ⁇ g / ml. All transfections were performed with 20 ⁇ g of plasmid using the calcium phosphate method (cf. T. Santalucia et al., J. Biol. Chem. 1999, vol. 274, pp. 17626-17634).
  • Recombinant adenoviruses were generated expressing GFP, lacZ or the Mfn2 antisense cDNA fragment by homologous recombination as described (cf. AJ Bett et al., Proa Nati. Acad. Sci. 1994, vol. 91, pp. 8802).
  • the mouse Mfn2 sequence (GenBank AY028170) was cloned into nucleotides 1-1370 in antisense orientation on the shuttle plasmid pdelE1sp1 and 293-HEK cells were co-transfected with plasmid strain together with pJM17 to achieve homologous recombination. Individual colonies were isolated and checked by Northern blot.
  • Recombinant adenoviruses were amplified in 293-HE cells, purified by gradient centrifugation of cesium chloride, dialyzed with 1 mM MgCl 2 , 10 mM Tris pH 7.4, 10% glycerol and stored at -80 ° C.
  • the DNA was isolated from purified viral particles and verified by restriction enzyme analysis.
  • Virus stocks were titrated by infection of 293-HEK cells with serial dilutions of the preparation and plaque forming units (pfu, "piate forming units”) were monobilized on the monolayer 15 days after infection.
  • Glucose oxidation was determined in cells expressing or not expressing the antisense sequence of Mfn2. The cells were incubated in Hank's saline medium (2% FBS, 5 mmol / l glucose) with 0.33 ⁇ M 14 C- (U) -D-glucose (323 Ci / mol) (Amersham Pharmacy), and 14 C ⁇ 2 issued as described (cf. N. Auestad et al., J. Neurochem. 1991, vol. 56, pp. 1376-1386). Measures of cellular respiration rate.
  • the respiration rate was calculated using two 2 ml Clark electrodes (Rank Brothers, Bottisham, Cambridge, UK) at 37 ° C connected to a recorder, assuming a ratio of 479 nmol of oxygen per ml of air.
  • the rate of cellular respiration was expressed as a function of the number of cells.
  • the cells were diluted with Krebs-Ringer buffer supplemented with 5 mM glucose and 2% BSA until 4x10 6 cells / ml were obtained on a Clark electrode of 2 ml at 37 ° C.
  • Inhibitors were used at times and concentrations that caused maximum inhibition, and measurements were taken at 70% air saturation after 5 min.
  • Non-mitochondrial breathing can be defined as myxotiazole-insensitive respiration (200 ⁇ M) and myxotiazole-sensitive breathing as mitochondrial respiration.
  • oligomycin-sensitive respiration 80 ⁇ g / ml represents respiration coupled to ATP synthesis
  • oligomycin-insensitive but myxotiazole-sensitive respiration is defined as mitochondrial respiration associated with loss of proton gradient or respiration. uncoupled
  • iV1fn2 controls myochondrial metabolism.
  • Mfn2 expression is decreased in obesity and diabeis jipo 2.
  • Human skeletal muscle in obesity is characterized by metabolic alterations that include insulin resistance, intracellular accumulation of triglycerides, reduction of oxidation processes and thermogenesis.
  • metabolic alterations that include insulin resistance, intracellular accumulation of triglycerides, reduction of oxidation processes and thermogenesis.
  • skeletal muscle shows a mebic profile characterized by a reduction in glucose uptake and oxidation, an alienated metabolism of fatty acids, resistance to Insulin and reduced oxygen consumption.
  • Mfn2 mRNA expression in obese Zucker rats was 34% lower than in thin control rats (Figure 4).
  • Mfn2 gene expression in skeletal muscle of human obese individuals was also determined. Obese individuals were normoglycemic and hyperinsulinemic and had a 50% reduction in absorption of Insulin-stimulated glucose (4.9 ⁇ 0.8 and 10.1 + 1, 1 mg / kg / min for obese and control individuals respectively).
  • Total RNA from vastus lateralis muscle was purified from individuals and a quantitative competitive RT-PCR was performed in order to determine the mfn2 mRNA (Figure 5A). Expression was 36% lower in obese subjects (Figure 5A). A negative linear relationship between Mfn2 mRNA levels and body mass index was detected (Figure 5B).
  • Mfn2 protein was then examined in mitochondrial fractions of skeletal muscle. Mfn2 expression in obese Zucker rats was 39% lower than in controls ( Figure 13A). In addition, the expression of Mfn2 in skeletal muscle of obese humans was 43% lower compared to controls ( Figure 13B).
  • the mitochondrial network is modified in obesity and type 2 diabetes.
  • SNPs single-base polyphormisms
  • the detection of SNPs was done by PCR with suitable primers and sequencing directly or as an alternative, by PCR followed by digestion with a suitable restriction enzyme.
  • the enzyme used was Taql ( Figure 1 A).
  • a genetic association of certain Mfn2 genotypes was observed in SNP CV1267235, with type 2 diabetes ( Figure 1 B), based on genotypic frequencies.

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Abstract

Los inventores han encontrado la implicación de la Mitofusina-2 (Mfn2) en el metabolismo mitocondrial, y una asociación entre las alteraciones en el gen Mfn2 y su expresión, y la diabetes tipo 2 y/o la obesidad. Dado que Mfn2 es un gen clave en el desarrollo de la obesidad y la diabetes tipo 2, resulta ser útil para el diagnóstico precoz y el tratamiento de dichas enfermedades en animales, incluidos los humanos. Así pues, la invención proporciona un método de diagnóstico para diabetes y obesidad que comprende los pasos de la obtención de una muestra de ácido nucleico del animal, y el análisis del ácido nucleico para detectar un polimorfismo en el segmento que codifica Mfn-2, siendo la detección de tal polimorfismo en el ácido nucleico indicativo de la propensión a la obesidad o la diabetes tipo 2.

Description

Método de diagnóstico para diabetes y obesidad
La presente invención se refiere al campo de la diabetes mellitus y la obesidad. Más concretamente se refiere a métodos para el diagnóstico de susceptibilidad al desarrollo de diabetes tipo 2 u obesidad y métodos de identificación de compuestos para el tratamiento de diabetes tipo 2 u obesidad, basándose en el gen de Mitofusina-2 (Mfn2) y sus productos derivados.
ESTADO DE LA TÉCNICAANTERIOR
La diabetes mellitus -en adelante simplemente "diabetes"- es uno de los mayores problemas de salud pública, con más de 120 millones de personas afectadas en todo el mundo. Los factores genéticos juegan un papel importante en el desarrollo de la diabetes. Algunas formas de diabetes son el resultado de mutaciones en un único gen, otras son de origen poligénico. Las formas monogénicas de diabetes pueden representar un 5% de todos los casos de diabetes, y tienen diversas causas. La diabetes puede ser el resultado de mutaciones en el gen de la insulina y los genes receptores de la insulina, así como en genes que codifican al enzima glucolítico glucoquinasa y en los factores de transcripción nucleares de hepatocitos-1α (hepatocyte nuclear facíor-1 : HNF-1α), HNF-4α y en el factor- 1 promotor de la insulina (insulin promoíer factor-1 : IPF-1).
La diabetes de tipo 2 es la forma más común de diabetes, responsable de aproximadamente el 90% de todos los casos de diabetes, y que afecta entre un 10 y un 20% de los individuos mayores de 45 años en la mayoría de países desarrollados. La patogénesis de la diabetes de tipo 2 se caracteriza por la existencia de defectos en la acción de la insulina (resistencia a la insulina) en músculo, tejido adiposo e hígado, así como por una fallada relativa de las células β del páncreas en la producción de cantidades suficientes de insulina. Tanto la resistencia a la insulina como la deficiencia de insulina han mostrado tener componentes genéticos. La diabetes de tipo 2 es el resultado de la combinación de múltiples factores genéticos y ambientales. Recientemente se han propuesto nuevos métodos de tratamiento para la diabetes de tipo 2, basados en la identificación del locus NIDDM1 así como del gen de la calpaína 10 (cfr. WO 00/23603-A2). Actualmente se dispone de distintas terapias para la diabetes que incluyen las sulfonilureas, la insulina, las tiazolidinedionas o las biguanidas. Los tratamientos con agentes hipoglucémicos orales son en general insuficientes porque la extensión, características y duración del efecto antidiabético es ¡mpredecible y estos agentes antidiabéticos se caracterizan a menudo por su ineficacia. Debido a que los agentes hipoglucémicos orales muestran un bajo beneficio hipoglucémico, se prefiere la terapia con insulina. En aquellos individuos diabéticos para los cuales la terapia oral actual no ofrece suficiente control de su condición, las inyecciones de insulina son necesarias. No obstante, las inyecciones diarias conllevan numerosos riesgos como la hipoglicemia. Además, las fluctuaciones importantes de las concentraciones de glucosa que requieren múltiples determinaciones al día de la glucosa en suero y múltiples inyecciones de insulina, así como un estricto control de la dieta, a menudo conllevan a un pobre cumplimiento. Otros inconvenientes incluyen la dificultad de la administración de la dosis apropiada por parte del sujeto diabético, especialmente en pacientes mayores o poco firmes en la administración del agente terapéutico. Algunos pacientes son virtualmente intratables con insulina debido a que sus células no pueden usar de manera efectiva o son resistentes a la terapia con insulina. Todos los tratamientos para la diabetes de tipo 2 tienen limitaciones. Aun cuando el ejercicio físico y la reducción de la ingesta de calorías en la dieta conllevan una mejora en las condiciones de la diabetes, la consecución del tratamiento es difícil. Por lo anterior es necesaria la identificación y aplicación clínica de nuevos agentes terapéuticos dirigidos a disminuir la resistencia a la insulina.
Bajo condiciones de abundancia nutricional, un gran segmento de la población acumula un exceso de reservas lipídicas. La obesidad está creciendo por encima del 30% de la población en las sociedades occidentales. Estudios en familias han permitido demostrar la naturaleza heredable de la obesidad, y estudios en gemelos y en individuos adoptados muestran que el patrón familiar es debido principalmente a factores genéticos. El mecanismo de herencia es complejo, y los estudios de segregación han dado soporte tanto a una herencia poligénica como a la influencia de un gen mayor recesivo. Varios genes importantes que afectan a la obesidad se han descrito recientemente en ratón. No obstante en humanos, salvo raras excepciones, no se han encontrado relaciones claras entre determinados genotipos y fenotipos de obesidad. Sin embargo, la obesidad está altamente asociada con resistencia a insulina, y constituye el mayor factor de riesgo al desarrollo de diabetes no dependiente de insulina o diabetes mellitus de tipo 2.
Existen distintas terapias para la obesidad. Algunas de estas incluyen la administración de inhibidores de la deposición de lípidos o estimuladores de la termogénesis del tejido adiposo o de la lipólisis. Otras terapias han sido dirigidas a encontrar alguna señal que informe al cerebro de las proporciones de la masa del tejido graso A pesar de esto, todavía no hay terapias en el mercado basadas en estas señales. Así, el tratamiento terapéutico de la obesidad no es totalmente satisfactorio, por lo que es necesario el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos.
Tanto la diabetes como la obesidad son enfermedades multigénicas. La obesidad está altamente asociada con la resistencia a la insulina, y constituye el mayor factor de riesgo para el desarrollo de diabetes no dependiente de insulina o diabetes mellitus de tipo 2. Es necesario un mejor método de identificación de población con riesgo a desarrollar diabetes u obesidad, puesto que un individuo puede tener unos valores de glucosa en plasma normales a pesar de poseer riesgo de desarrollar diabetes, o tener un peso normal de joven y estar en riesgo a desarrollar obesidad. Esto podría resolverse si fuese posible diagnosticar a los sujetos susceptibles a estas enfermedades antes del desarrollo de la diabetes o la obesidad. Actualmente esto no es posible en individuos con una forma clásica de diabetes o de obesidad, por el origen multifactorial de éstas. En consecuencia es altamente deseable poseer nuevos métodos de diagnóstico y/o tratamiento para la diabetes y/o la obesidad.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Han sido descritos dos genes llamados Mitofusina-1 (Mfn1) y Mitofusina-2 (Mfn2), los cuales juegan un papel en la generación de la red mitocondrial en células humanas (cfr. A. Santel and M.T.Fuller, J.Cell Sci. 2001 , vol. 114, pp. 867-874). En base a este hecho, se ha descrito el papel de Mfn1 y Mfn2 como agentes anti-insecticidas y antifungicidas (cfr. WO 01/25274-A1) y como proteínas importantes para la regulación de la fusión mitocondrial y para el desarrollo embrionario (cfr. H. Chen et al., J. Cell Bio. 2003, vol. 160, pp. 189-200).
Los inventores de la presente invención han encontrado sorprendentemente que existe una implicación de Mfn2 en el metabolismo mitocondrial, y consecuentemente una asociación entre alteraciones en el gen de Mfn2 y en su expresión, y la diabetes tipo 2 y/o obesidad. Todo ello indica que Mfn2 es un gen clave en el desarrollo de la obesidad y la diabetes tipo 2, y por tanto un gen útil para el diagnóstico precoz y tratamiento de dichas enfermedades.
Así, un aspecto de la presente invención se refiere a un método para determinar si un animal tiene riesgo de desarrollar diabetes tipo 2 y/o obesidad caracterizado porque comprende el examen de la expresión de Mfn2 en dicho sujeto, siendo indicativa de riesgo una expresión distinta de la salvaje. En una realización particular de este método, la expresión del gen Mfn2 está disminuida en la obesidad y diabetes tipo 2. En otra realización, dicho examen comprende determinar el nivel de ARNm o el nivel de polipéptido Mfn2.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para evaluar un modelo animal para un desorden o estado de enfermedad que comprende determinar si el gen Ívlfn2 en dicho modelo animal se expresa a un nivel predeterminado. En una realización particular dicho nivel es menor que el nivel en un animal salvaje o normal.
Además, otro aspecto de la presente invención se refiere a un método de diagnóstico para diabetes tipo 2 y/o obesidad en un animal caracterizado porque comprende: la obtención de una muestra de ácido nucleico del animal, y el análisis del ácido nucleico para detectar un polimorfismo en un segmento Mfn2-cod ¡ficante del ácido nucleico, siendo la detección del polimorfismo indicativa de una propensión al desarrollo de la diabetes tipo 2 o la obesidad. En una realización particular de dicho método, el ácido nucleico codifica una porción del gen Mfn2, y específicamente, codifica un polipéptido Mfn2. En realizaciones particulares de este método, el segmento de ácido nucleico Mfn2-codificante es ADN que concretamente puede comprender un gen Mfn2; un ADNc Mfn2-codificante, y/o un ARNm. En otra realización el paso de análisis del ácido nucleico comprende una técnica seleccionada entre la PCR, el ensayo de protección a ARNasa, el ensayo de RFLP, el procedimiento de SSCP y la secuenciación del ácido nucleico para obtener su secuencia. En una realización particular de este análisis, la secuencia obtenida del ácido nucleico es comparada con una secuencia conocida del gen Mfn2. En otra realización particular, el ácido nucleico codifica un polipéptido Mfn2.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método para regular la diabetes tipo 2 y/o la obesidad en un animal que comprende el paso de modular en el animal la función del gen Mfn2 y/o la actividad del gen Mfn2. En una realización particular dicho método comprende además el paso de diagnosticar diabetes tipo 2 u obesidad en un animal mediante el análisis de una secuencia de un ácido nucleico Mfn2-codificante. En otra realización el paso de modular la función del gen Mfn2 comprende proveer polipéptido Mfn2 al animal, siendo un polipéptido Mfn2 nativo o un polipéptido mutado y parcialmente modificado. En una realización particular la provisión del polipéptido Mfn2 se consigue induciendo la expresión de polipéptido Mfn2, particularmente induciendo la expresión del polipéptido Mfn2 codificado en el genoma del animal o codificado por un ácido nucleico provisto al animal. En otra realización, la provisión de polipéptido Mfn2 se consigue por un método que comprende la introducción en el animal de un ácido nucleico Mfn2- codificante o por inyección al animal de una cantidad farmacológicamente efectiva de polipéptido Mfn2. En otra realización de dicho método el paso de modulación de la función del gen Mfn2 comprende proveer un modulador de la función del gen Mfn2 al animal, por ejemplo un modulador de la función del gen Mfn2 seleccionado del grupo que consiste en un agonista, un antagonista, un activador y un inhibidor del polipéptido Mfn2. En una realización particular, el modulador de la función del gen Mfn2 modula la transcripción de un ácido nucleico Mfn2-codificante.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a la preparación purificada de un anticuerpo dirigido contra el polipéptido Mfn2, particularmente un anticuerpo policlonal.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. El resumen de esta solicitud se incorpora aquí como referencia.
Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes realizaciones particulares y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 es una ilustración gráfica del análisis del polimorfismo en una sola base (SNP, "Single Nucleotide Polimorphism") CV1267235 del gen de Mfn2 (Celera Datábase). Panel A: Resultados obtenidos después de la digestión de los productos de PCR con Taql de muestras de ADN control (C), obeso (O) e individuos con diabetes tipo 2 (D). A: homozigotos para la forma A del SNP (AA, es cortado por Taql); B: homozigoíos para la forma B del SNP (BB, no cortado por Taql); H: heterozigotos AB (un cromosoma es cortado por Taql pero el otro no). Panel B: Frecuencias genotípicas de control (C), obeso (O) y individuos con diabetes tipo 2 (D). El análisis estadístico Chi cuadrado muestra diferencias significativas entre individuos diabéticos y no diabéticos (P(chi) = 2,29 x 10"15).
La Figura 2 es una ilustración gráfica de la distribución en tejido humano del ARNm de Mfn2. El blot de ARN muestra la expresión de ARNm en tejido humano. La posición de los marcadores de tamaño molecular de ARN se muestra a la izquierda. Carriles: 1 , cerebro; 2, corazón; 3, músculo esquelético; 4, colon; 5, timo; 6, bazo; 7, riñon; 8, hígado; 9, intestino delgado; 10, placenta; 11 , pulmón; 12 leucocitos periféricos.
La Figura 3 es una ilustración gráfica de la distribución en tejido de rata del ARNm de Mfn2. El blot de ARN muestra la expresión de Mfn2 en tejidos de rata. Carriles: 1, músculo esquelético; 2, corazón; 3, tejido adiposo blanco; 4, riñon; 5, cerebro; 6 hígado.
La Figura 4 es una ilustración gráfica de la expresión de los niveles de ARNm de Mfn2 en músculo esquelético de ratas Zucker obesas. En el panel A el blot de ARN muestra la expresión del ARNm de Mfn2 en tejido de ratas control (C) y ratas obesas (O). El panel B muestra los datos en unidades arbitrarias (AU, "arbitrary units") expresados como media±error estándar. Las diferencias entre los grupos control y obeso son estadísticamente significativas a P<0,01.
La Figura 5 es una ilustración gráfica de la expresión de los niveles de ARNm de Mfn2 en músculo esquelético humano de pacientes obesos. Los niveles de ARNm de Mfn2 fueron determinados por análisis de RT-PCR cuantitativa. El panel A muestra la media+error estándar de seis y siete observaciones independientes. El panel B muestra la correlación entre los niveles de ARNm de Mfn2 en músculo esquelético y el índice de masa corporal (BMI, "body mass index"). Los datos se expresan como atomoles de Mfn2/μg ARN (e). Los datos se ajustan a una función linear y el coeficiente de correlación es r = 0,670.
La Figura 6 es una ilustración gráfica de la expresión de ARNm de Mfn2 en células en cultivo. El blot de ARN muestra la expresión del ARNm de Mfn2 en células 3T3-L1 fibroblastos (F) o adipocitos (A) y en células L6E9 mioblastos (Mb) o mioíubos (Mt).
La Figura 7 es una ilustración gráfica de la expresión de la proteína Mfn2 en tejido de raías. El Western bloí muestra la expresión de la proteína iVifn2 en diferentes tejidos de rata (B, tejido adiposo marrón; K: riñon; M: músculo esquelético; H: corazón; W: tejido adiposo blanco). El Western blot fue realizado con un anticuerpo policlonal anti-Mfn2(A), con un anticuerpo anti- Mfn2 en presencia de 400 g/ml de péptido usado para desunir el anticuerpo (B) o un suero preinmune (C).
La Figura 8 es una ilustración gráfica de la alteración de la oxidación de glucosa y el potencial de la membrana mitocondrial en miotubos L6E9 a como consecuencia de la represión de Mfn2. Panel A: Oxidación de glucosa (AU, unidades arbitrarias) determinada en miotubos L6E9 antes de ser infectados por adenovirus a 100 pfu/célula, codificando para β-galactosidasa (β-GAL) o para una secuencia antisentido Mfn2 de ratón (AS); miotubos no infectados (C). Los resultados se expresan como media+error estándard de 4 observaciones independientes. * indica una diferencia estadísticamente significativa entre las células β-GAL y las células AS, a P<0,05. Panel B: Miotubos infectados con adenovirus AS (AS), con adenovirus codificando β- galactosidasa (β-GAL) y no infectados (C) teñidos con el marcador potenciométrico JC-1. Potencial de la membrana mitocondrial (AU, unidades arbitrarias) determinado como ratio entre la fluorescencia roja (de agregados de JC1 formados proporcionalmente al potencial de membrana) y la fluorescencia verde (de los monómeros de JC-1). Los resultados se expresan como media+error estándard de 8 células independientes. ** indica una diferencia estadísticamente significativa entre células β-GAL y células AS, a P<0,001.
La Figura 9 es una ilustración gráfica de la represión de Mfn2 mediante transfección estable de secuencias antisentido de Mfn2 murinas. Panel A: Se obtuvo ARN total a partir de células 10T1/2 salvajes (wt), o de células transfectadas con el vector vacío (pcDNA3), o con secuencias antisentido de Mfn2 murinas (clones AS1 y AS2). Los niveles de ARNm de Mfn2 fueron detectados mediante Northern blot. Panel B: Se obtuvieron extractos crudos de proteína a partir de células 10T1/2 salvajes (wt), transfecíadas con el vector vacío (pcDNA3), o con secuencias antiseníido de Mfn2 murinas (clones AS1 y AS2). La abundancia de la proteína Mfn2 fue detectada por Western blot usando anticuerpos específicos.
La Figura 10 es una ilustración gráfica del efecto de la represión de Mfn2 sobre la oxidación de glucosa. La oxidación de glucosa (e, nmols de glucosa/μg de proteína) fue determinada en células 10T1/2 salvajes, pcDNAS, AS1 y AS2 a diferentes tiempos (t, horas). Los resultados son medias+error estándar de 4 observaciones independientes.
La Figura 11 es una ilustración gráfica del efecto de la represión de Mfn2 sobre la respiración celular. Se midió el consumo de oxígeno de 2 x 106 células control o AS2 (e, nmols oxígeno/min/106 células) en un electrodo de Clark, en diferentes condiciones, para poder calcular el consumo de oxígeno total (t), mitocondrial (m), o no mitocondrial (nm), el consumo de oxígeno acoplado (destinado a la síntesis de ATP) (cr), y desacoplado (pérdida de gradiente de protones) (ur). Los resultados se expresan como media+error estándar de 4 observaciones independientes. * indica una diferencia estadísticamente significativa entre las células control y AS2, a P<0,05. La Figura 12 es una ilustración gráfica en la que se muestra que el músculo esquelético de ratas Zucker obesas presenta una red mitocondrial alterada (M). Se procesaron músculos soleus de ratas control (L), o de ratas Zucker obesas (O) para realizar análisis estereológicos de mitocondria. Se fijaron y seccionaron los músculos al azar en diferentes orientaciones y se prepararon para el microscopio electrónico. Se tomaron 80 fotografías a 5000x y se determinó la superficie de membrana mitocondrial por unidad de volumen mitocondrial usando el "método de secciones verticales". La extensión de la red mitocondrial se calcula como ratio volumen/superficie mitocondrial (M). Los resultados se expresan como media+error estándard de 4 experimentos independientes. ** indica una diferencia estadísticamente significativa entre los grupos control y obesos, a P<0,01.
La Figura 13 es una ilustración gráfica de la represión de proteína Mfn2 en músculo esquelético de ratas Zucker obesas e individuos humanos obesos. Fracciones enriquecidas en mitocondria obtenidas de músculo esquelético de ratas Zucker delgadas (L) y obesas (O) (Panel A) o de individuos humanos control (L) y obesos (O) (Panel B). Mfn2 y Porina se detectaron por Western blot con anticuerpos específicos. El control de la carga de proteína se hizo por tinción con Ponceau de proteínas sobre membranas Immobilon. Los valores se expresan relativos a niveles control (media de un grupo control de 100). * indica una diferencia estadísticamente significativa entre las raías control y las obesas, a P<0,05 (Panel A). La diferencia entre los individuos humanos control y obesos (Panel B) fue estadísticamente significativa, a P<0,005.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE REALIZACIONES PARTICULARES
Hibridación sustractiva.
Se realizó la extracción de ARN mensajero de músculo gastrocnemius de ratas control (fa/+) y obesas (fa/fa) con columnas de oligo(dT)2o-celulosa, como está descrito (cfr. S. Mora et al., Biochem.J., 1997, vol. 324, pp. 455- 459). Se preparó el ADN complementario a partir de 2 μg de ARNm usando Superscript II (Life Technologies). Se utilizó el kit PCR-Select cDNA
Subtraction kit (Clontech) para seleccionar los genes que están disminuidos en obesos. Los fragmentos de ADNc obtenidos fueron depositados en placas de 96 pozos y analizados con ADNc control marcado.
Northern Blot.
Se realizaron ensayos de Northen blot con 20 μg de ARN total, como está descrito (cfr. A. Castello et al., J. Biol. Chem. 1994, vol. 269, pp. 5905-5912) usando como sondas el fragmento de ADNc de C31 (321 bp) marcado con 32P obtenido de la hibridación sustractiva o el fragmento de ADNc de SCF (stem-cell factor) marcado con 32P obtenido por PCR. El fragmento de ADNc C31 es idéntico a la secuencia de nucleótidos 2.098-2.419 de U41803 de rata (GenBank).
PCR cuantitativa.
La RT-PCR competitiva-cuantitativa se realizó a partir de 0,1 μg de ARN total de músculo vastus lateralis de individuos control y obesos, como está descrito (cfr. D. Auboeuf eí al., Anal. Biochem. 1997, vol. 245, pp. 141-148). Cada muestra de ARNm de Mfn2 fue co-amplificada con un competidor interno a diferentes concentraciones conocidas, usando el mismo par de primers: 5'-atgcatccccacttaagcac-3' (de 396 a 416 de la secuencia D86987 de GenBank) y S'-ccagagggcagaactttgtc-S1 (de 677 a 697 de la secuencia D86987 de GenBank). Se extrapoló la concentración de ¡Vlfn2 a partir del punto íeórico en el cual los dos producios esíarían igualmeníe amplificados.
Individuos y protocolos.
En el estudio participaron trece voluntarios control (51±2 años; BMI: 23±1 kg/m2; glucosa en sangre: 4,9+0,1 mmol/l; Insulina en plasma: 34±2 pmol/l) y nueve voluntarios obesos (46±2 years; BMI: 34±1 kg/m2; glucosa en sangre: 4,9±0,1 mmol/l; Insulina en plasma: 62±6 pmol/l). Se obtuvieron biopsias percutáneas de músculo vastus lateralis. Después se realizaron ensayos para determinar el grado de sensibilidad a insulina del individuo (3-h euglycemic hyperinsulinemic clamp; tasa de infusión de insulina de 12 pmol/kg/min), como está descrito (cfr. F. Andreelli et al., Diabetoloqia 1999, vol. 42, pp. 358- 364). La utilización de glucosa estimulada por insulina se determinó como está descrito (cfr. D. Auboeuf et al., Anal. Biochem. 1997, vol. 245, pp. 141- 148). Western blot.
Se utilizó el anticuerpo de conejo contra el péptido específico de Mfn2 LGPKNSRRALMGYNDQVQRP (de 557 a 576 de BAA34389.1 ) comprado a Research Genetics. Se utilizó el suero Anti-Porina como marcador mitocondrial. Se separaron por electroforesis 10% SDS-PAGE las proteínas de homogenados totales o de las fracciones enriquecidas en mitocondria y se transfirieron a membranas Immobilon. Se realizó una incubación con anticuerpos y posteriormente se detectó por quimioluminiscencia como está descrito (cfr. A. Castello et al., J. Biol. Chem. 1994, vol. 269, pp. 5905-5912).
Medida de volumen y superficie mitocondrial en músculo esquelético.
Se realizaron medidas de volumen y superficie de membrana mitocondrial de músculo esquelético con el "método de secciones verticales" (cfr. A.J. Baddeley eí al., J. Microscopy 1986, vol. 142, pp. 259-276). Se fijaron músculos soleμs de ratas Zucker obesas y cuatro de ratas control y se seccionaron en diferentes orientaciones al azar, siempre perpendicularmeníe a su eje longitudinal, y se obtuvieron 80 fotografías por grupo al azar a 5000x. La fotografías se obtuvieron excluyendo la población subsarcolemal de miíocondrias y siempre incluyendo un disco-Z en el campo. Para cada imagen, se calculó la superficie y el volumen a partir del número de punios y de arcos cicloides distribuidos al azar en un área determinada. El número de puntos dentro la mitocondria es indicativo del volumen, y el número de arcos cicloides que atraviesan la membrana mitocondrial externa es indicativo de la superficie. El ratio volumen/superficie es un parámetro intrínseco de la mitocondria y no depende del número de mitocondrias estudiadas (Figura 12).
Estudios de transfección transitoria v estable.
Se mantuvieron en cultivo fibroblastos 10T/2 en medio DMEM, 10% FBS. Se preparó un plásmido que contenía dos cassettes de expresión independientes para la expresión de Mfn2 y GFP para llevar a cabo una transfección transitoria. Cada cassette de expresión estaba iniciado por un promotor CMV y contenía una señal de poliadenilación. Las células transfectadas se identificaron mediante fluorescencia de GFP. Se utilizaron como control células transfectadas con el vector vacío. Para la transfección estable, se preparó una digestión del clon IMAGE 3746-e24 con Kpnl y Xhol. El fragmento antisentido correspondiente a la secuencia 1-370 de Mfn2 de ratón (GenBank AY028170) se purificó y clonó en un vector pcDNA3 vector (Invitrogene) entre las dianas Xhol-Kpnl. El aislamiento de clones individuales se consiguió por selección con geneticina a 500 μg/ml. Todas las transfecciones se realizaron con 20 μg de plásmido mediante el método de fosfato calcico (cfr. T. Santalucia et al., J. Biol. Chem. 1999, vol. 274, pp. 17626-17634).
Producción de adenovirus.
Se generaron adenovirus recombinantes expresando GFP, lacZ o el fragmento de ADNc antisentido de Mfn2 por recombinación homologa como está descrito (cfr. A.J. Bett et al., Proa Nati. Acad. Sci. 1994, vol. 91, pp. 8802). Se clonó la secuencia de Mfn2 de ratón (GenBank AY028170) eníre los nucleótidos 1-1370 en orientación antisentido en el plásmido lanzadera pdelE1sp1 y se co-íransfecíaron células 293-HEK con esíe plásmido junto con pJM17 para conseguir la recombinación homologa. Se aislaron colonias individuales y se comprovaron mediante Northern blot. Los adenovirus recombinaníes se amplificaron en células 293-HE , se purificaron por cenirifugación en gradieníe de cloruro de cesio, fueron dializados con 1 mM MgCI2, 10 mM Tris pH 7.4, 10% glicerol y conservados a -80°C. Se aisló el ADN de partículas virales purificadas y se verificó por análisis de enzimas de restricción. Los stocks de virus se titularon mediante infección de células 293- HEK con diluciones seriadas de la preparación y se coníabilizaron las unidades formadoras de placa (pfu, "píate forming units") sobre la monocapa 15 días después de la infección.
Determinación de oxidación de glucosa.
La oxidación de glucosa se determinó en células expresando o no la secuencia antisentido de Mfn2. Las células fueron incubadas en medio salino de Hank (2% FBS, 5 mmol/l glucosa) con 0,33 μM 14C-(U)-D-glucosa (323 Ci/mol) (AmershamPharmacia), y se determinó el 14Cθ2 emitido como está descrito (cfr. N. Auestad et al., J. Neurochem. 1991 , vol. 56, pp. 1376-1386). Medidas de tasa de respiración celular.
La tasa de respiración se calculó utilizando dos electrodos de Clark de 2 mi (Rank Brothers, Bottisham, Cambridge, UK) a 37 °C conectados a un registrador, asumiendo una relación de 479 nmol de oxígeno por mi de aire. La tasa de respiración celular se expresó en función del número de células. Se diluyeron las células con tampón Krebs-Ringer suplementado con 5 mM glucosa y BSA 2% hasta conseguir 4x106 células/ml en un electrodo de Clark de 2 mi a 37 °C. Se emplearon inhibidores a tiempos y concentraciones que provocaban la máxima inhibición, y se tomaron medidas a 70% de saturación de aire después de 5 min. Se puede definir como respiración no mitocondrial la respiración insensible al mixotiazol (200 μM) y como respiración mitocondrial la respiración sensible al mixotiazol. De manera similar, la respiración sensible a oligomicina (80 μg/ml) representa la respiración acoplada a la síntesis de ATP, y la respiración insensible a oligomicina pero sensible a mixotiazol se define como respiración mitocondrial asociada a la pérdida del gradiente de protones o respiración desacoplada.
Aislamiento del fragmento de Mfn2.
En un experimento diseñado para identificar genes expresados diferencialmeníe en raías Zucker obesas empleando PCR-Selecí cDíMA Subtraction kit, se aisló un clon de 321 bp (C31) que hibridaba con un ARNm de 4,7 kb en músculo esquelético. La secuencia de ADNc C31 era idéntica a la secuencia de rata U41803 de GenBank entre los nucleótidos 2.098 y 2.419, y un 79% idéntica a la secuencia de ADNc humano D86987 publicada por Nagase et al., en GenBank, identificada como Mfn2 (cfr. A. Santel et al., J. Cell Sci. 2001 , vol. 114, pp. 867-874). El Multi-alineamiento de Mfn2 humana con otros productos génicos demostró que Mfn2 humana es un 95% idéntica a la proteína Mfn2 de rata (U41308), un 94% idéntica a su homologa de ratón (GenBank AY028170) y un 47% idéntica a Mfn2 de Drosophila melanogaster (GenBank AF355475). Existe menor identidad con el producto del gen fzo de D. melanogaster (31% de identidad) (cfr. K.G. Hales et al., Cejl 1997, vol. 90, pp. 121-129) y con la de Saccharomyces cerevisiae (8% de identidad) (cfr. D. Rapaport et al., J. Biol. Chem. 1998, vol. 273, pp. 20150- 20155). Mfn2 está altamente expresada en músculo y es inducida durante la miogénesis.
Se examinó la distribución tisular del ARNm de Mfn2 de humano por análisis de Northern blot en condiciones altamente estrictas (Figura 2). El ARNm de 4,7 kb hibridaba con el clon de 321 bp. Los transcritos predominaban en músculo esquelético y corazón pero la expresión era menor en cerebro, riñon e hígado (Figura 2). En tejido de rata se observó una distribución similar. (Figura 3).
Basándose en la expresión abundante de ARNm de Mfn2 en músculo esquelético, se examinó si la expresión estaba regulada durante la miogénesis. Los mioblastos L6E9 y los fibroblastos 3T3-1 apenas expresaban Mfn2 pero se detectaba una clara inducción de los niveles de ARNm de Mfn2 durante la diferenciación en miotubos y adipocitos respectivamente (Figura 6). Se obtuvo un anticuerpo policlonal contra la secuencia de Mfn2, que detectaba una banda de 110 kDa en extractos de corazón, músculo esquelético, tejido adiposo marrón y riñon en raías (Figura 7A); la banda se lavó específicamente con un exceso de péptido inmunogénico (Figura 7B) y no apareció en el suero preinmune (Figura 7C).
iV1fn2 controla el metabolismo miíocondrial.
Se examinó si la reducción de la expresión de Mfn2 ocasionaba alteraciones en el metabolismo mitocondrial. La represión de la expresión de Mfn2 mediante la expresión de AS adenoviral en miotubos L6E9, redujo la oxidación de glucosa en un 30% (Figura 8). Este efecto era específico y la infección con un vector adenoviral codificando para β-galactosidasa no alteraba la oxidación de glucosa (Figura 8A). Es importante destacar que no todos los mioblastos L6E9 se diferencian en miotubos en cultivo, sino que cerca de un 30% de los mioblastos permanecen indiferenciados; debido a que los mioblastos indiferenciados no pueden ser infectados por adenovirus, la reducción observada en la oxidación de glucosa está subestimada. En estas condiciones, la represión de Mfn2 reducía el potencial de membrana mitocondrial (Figura 8B). También se transfectaron de manera estable células 10T1/2 con una secuencia antisentido de Mfn2. Los niveles de ARNm y proteína Mfn2 eran menores en los clones antisentido que en los no transfectados o en las células transfectadas control (los niveles de proteína Mfn2 variaban de un 32 a un 67% respecto los valores control en las células AS) (Figura 9). La represión de Mfn2 en células 10T1/2 también reducía la oxidación de glucosa en un 30% (Figura 10). Además, las células AS mostraban un 30% de reducción en el consumo de oxígeno (Figura 11). En estas condiciones, el consumo de oxígeno acoplado a la síntesis de ATP se mantenía inalterado mientras que la respiración asociada a la pérdida de gradiente de protones se reducía considerablemente en células AS (Figura 11). Estos datos indican que la reducción de la expresión de Mfn2 provoca alteraciones en el metabolismo mitocondrial caracterizadas por una reducción del consumo de oxígeno y un decremento de la oxidación de glucosa.
La expresión de Mfn2 está disminuida en obesidad v diabeíes jipo 2.
El músculo esquelético humano en la obesidad se caracteriza por alteraciones metabólicas que incluyen resisíencia a la insulina, acumulación intracelular de triglicéridos, reducción de los procesos de oxidación y termogénesis. En algunos modelos animales de obesidad, como las ratas Zucker o los ratones ob/ob, el músculo esquelético muestra un perfil meíabólico caracieri∑ado por una reducción de la capíación y oxidación de glucosa, un alíerado metabolismo de los ácidos grasos, resistencia a la insulina y, consumo reducido de oxígeno. En particular, los mecanismos por los que la obesidad conduce a una deficiente oxidación de sustratos en músculo permanecen sin explicación y son concomitantes con una inalferada actividad de enzimas mitocondriales claves como piruvato deshidrogenasa, citrato sintasa, succinato deshidrogenasa o β-hidroxiacetil-CoA deshidrogenasa.
Basándose en el papel de Mfn2 en el metabolismo mitocondrial, se determinó su expresión en obesidad. La expresión de ARNm de Mfn2 en ratas Zucker obesas era un 34% menor que en ratas delgadas control (Figura 4). También se determinó la expresión del gen de Mfn2 en músculo esquelético de individuos obesos humanos. Los individuos obesos eran normoglucémicos e hiperinsulinémicos y presentaban un 50% de reducción de absorción de glucosa estimulada por insulina (4,9±0,8 y 10,1+1 ,1 mg/kg/min para los individuos obesos y control respectivamente). Se purificó el ARN total de músculo vastus lateralis de individuos y se realizó una RT-PCR competitiva cuantitativa con el objetivo de determinar el ARNm de Mfn2 (Figura 5A). La expresión fue un 36% menor en sujetos obesos (Figura 5A). Se detectó una relación linear negativa entre los niveles de ARNm de Mfn2 y el índice de masa corporal (Figura 5B).
Después se examinó la expresión de proteína Mfn2 en fracciones mitocondriales de músculo esquelético. La expresión de Mfn2 en ratas Zucker obesas era un 39% menor que en los controles (Figura 13A). Además, al expresión de Mfn2 en músculo esquelético de humanos obesos era un 43% menor respecto los controles (Figura 13B).
La red mitocondrial está modificada en obesidad y diabetes tipo 2.
Se examinó si la red mitocondrial estaba modificada en el músculo esquelético durante la obesidad. Para este fin, se obtuvieron y prepararon músculos de ratas Zucker obesas para su análisis por microscopio electrónico y se evaluó la extensión de la red mitocondrial calculada como ratio entre volumen mitocondrial por unidad de superficie mitocondrial (cfr. A.J. Baddeley eí al., J. ¡Vücroseopy 1986, vol. 142, pp. 259-276). No se enconíraron diferencias en el volumen total de miíocondrias eníre los grupos control y obesos, indicando que la masa mitocondrial total permanece inalterada. Por el contrario, la densidad de mitocondrias era mayor en los grupos obesos (8,2±0,5 y 11 ,2±0,6 orgánulos por 10 μm2 en los grupos control y obeso, respecfivamente, P<0,001) (Figura 12). Esto sugiere una reducción en el tamaño mitocondrial y una fragmentación de la red mitocondrial en músculo esquelético durante la obesidad. En relación a estos hechos, se observó que la superficie mitocondrial total era un 42% mayor en los grupos obesos y en consecuencia, el ratio volumen mitocondrial por unidad de superficie era menor (25%) en la obesidad (Figura 12).
Asociación genética de Mfn2 con obesidad v/o diabetes tipo 2.
Se estudiaron veintinueve poliformismos de una sola base (SNP) del gen de Mfn2, doce de los cuales eran de la región exónica y los diecisiete restantes de la región intrónica. La detección de los SNPs se hizo por PCR con primers adecuados y secuenciando directamente o como alternativa, por PCR seguida por digestión con una enzima de restricción adecuada. En el caso específico del polimorfismo CV1267235 (base de datos de Celera), el enzima empleada fue Taql (Figura 1 A). Se observó una asociación genética de ciertos genotipos de Mfn2 en el SNP CV1267235, con la diabetes tipo 2 (Figura 1 B), basada en frecuencias genotípicas.
Por consiguiente, el análisis de este SNP y cualquier de los otros, se puede utilizar en el diagnóstico de la diabetes tipo 2 previa al comienzo de la enfermedad.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método para determinar si un animal, humano incluido, está en riesgo de desarrollar diabetes tipo 2 y/o obesidad que comprende el examen de la expresión de Mfn2 en dicho sujeto, siendo indicativa de riesgo una expresión distinta de la salvaje.
2. Método según la reivindicación 1 , en el que la expresión del gen Mfn2 está disminuida en diabetes tipo 2 y/o obesidad.
3. Método según la reivindicación 1, en el que dicho examen comprende determinar el nivel de ARNm o el nivel de polipéptido Mfn2.
4. Método para evaluar un modelo animal para un desorden o estado de enfermedad que comprende determinar si el gen Mfn2 en dicho modelo animal se expresa a un nivel predeterminado.
5. Método según la reivindicación 4, en el que dicho nivel es menor que el nivel en un animal salvaje o normal.
6. Método de diagnóstico para diabetes tipo 2 y/o obesidad en un animal, humano incluido, que comprende los pasos de: obtención de una muestra de ácido nucleico del animal, y análisis del ácido nucleico para detectar un polimorfismo en un segmento Mfn2-codificante del ácido nucleico; siendo la detección del polimorfismo en el ácido nucleico indicativa de una propensión al desarrollo de diabetes tipo 2 y/o obesidad.
7. Método según la reivindicación 6, en el que el ácido nucleico codifica una porción del gen Mfn2.
8. Método según la reivindicación 7, en el que el ácido nucleico codifica un polipéptido Mfn2.
9. Método según la reivindicación 7, en el que el segmento de ácido nucleico Mfn2-codificante es ADN.
10. Método según la reivindicación 9, en el que el ADN comprende un gen Mfn2.
11. Método según la reivindicación 9, en el que el ADN es un ADNc Mfn2- codificante.
12. Método según la reivindicación 7, en el que el segmento de ácido nucleico Mfn2-cod ¡ficante es un ARNm.
13. Método según la reivindicación 7, en el que el paso de análisis del ácido nucleico comprende una técnica seleccionada entre el grupo consistente en
PCR, ensayo de protección a ARNasa, ensayo de RFLP y procedimiento de SSCP.
14. Método según la reivindicación 7, en el que el paso de análisis del ácido nucleico comprende la secuenciación del ácido nucleico para obtener su secuencia.
15. Método según la reivindicación 14, en el que la secuencia obtenida del ácido nucleico es comparada con una secuencia conocida del gen Mfn2.
16. Método según la reivindicación 14, en el que el ácido nucleico codifica un polipépíido Mfn2.
17. Método para regular diabetes tipo 2 y/o obesidad en un animal, humano incluido, que comprende el paso de la modulación en el animal de la función del gen Mfn2 o la modulación de la actividad del gen Mfn2.
18. Método según la reivindicación 17, que comprende además el paso de diagnosticar diabetes tipo 2 y/o obesidad en un animal medianfe el análisis de una secuencia de un ácido nucleico Mfn2-codificante.
19. Método según la reivindicación 17, en el que el paso de modular la función del gen Mfn2 comprende proveer polipéptido Mfn2 al animal.
20. Método según la reivindicación 19, en el que el polipéptido Mfn2 es un polipéptido Mfn2 nativo.
21. Método según la reivindicación 19, en el que el polipéptido Mfn2 es un polipéptido mutado y parcialmente modificado.
22. Método según la reivindicación 19, en el que la provisión del polipéptido Mfn2 se consigue induciendo la expresión de polipéptido Mfn2.
23. Método según la reivindicación 22, en el que se induce la expresión del polipéptido Mfn2 codificado en el genoma del animal.
24. Método según la reivindicación 22, en el que se induce la expresión del polipéptido Mfn2 codificado por un ácido nucleico provisto al animal.
25. Método según la reivindicación 19, en el que la provisión de polipéptido Mfn2 se consigue por un método que comprende la introducción en el animal de un ácido nucleico Mfn2-codificante.
26. Método según la reivindicación 19, en el que la provisión de polipéptido Mfn2 se consigue por inyección al animal de una cantidad farmacológicamente efectiva de polipéptido Mfn2.
27. Método según la reivindicación 17, que comprende un paso de modulación de la función del gen ¡ n2 que comprende proveer un modulador de la función del gen Mfn2 al animal.
28. Método según la reivindicación 27, en el que el modulador de la función del gen Mfn2 se selecciona entre del grupo que consiste en un agonista, un antagonista, un activador y un inhibidor del polipéptido Mfn2.
29. Método según la reivindicación 27, en el que el modulador de la función del gen Mfn2 modula la transcripción de un ácido nucleico Mfn2-cod ¡ficante.
30. Formulación purificada de un anticuerpo dirigido contra el polipéptido Mfn2.
31. Formulación según la reivindicación 30, en la que dicho anticuerpo es un anticuerpo policlonal.
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