JP2004254628A - 変異型ｈｃｎ４遺伝子 - Google Patents
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Abstract
【課題】新規な変異ＨＣＮ４の遺伝子及びその応用に関する。
【解決手段】本発明にかかる変異ＨＣＮ４の遺伝子は、いわゆる野生型のＨＣＮ４の遺伝子であり、ミスセンス変異およびスプライシング部位での変異があることを特徴とする。
【選択図】 図２
【解決手段】本発明にかかる変異ＨＣＮ４の遺伝子は、いわゆる野生型のＨＣＮ４の遺伝子であり、ミスセンス変異およびスプライシング部位での変異があることを特徴とする。
【選択図】 図２
Description
【０００１】
【関連する技術分野】
本発明は、不整脈惹起性疾患に関連する変異型ＨＣＮ４遺伝子、及びその応用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝性ＱＴ延長症候群（ＬＱＴＳ）、即ち、突然死のリスクが高い不整脈惹起性疾患は、心臓イオンチャネルの遺伝子、ＫＣＮＱ１（ＫｖＬＱＴ１）、ＫＣＮＨ２（ＨＥＲＧ）、ＳＣＮ５Ａ、ＫＣＮＥ１（ＭｉｎＫ）、ＫＣＮＥ２（ＭｉＲＰ１）およびＫＣＮＪ２での変異によって生じることが知られている１−７（例えば非特許文献１参照）。患者の半数以上ではこれらの疾病遺伝子において原因となる変異を確認することができるが、その他の患者は未確認の疾病遺伝子の変異に原因がある可能性があると言える８、９。
またＳＣＮ５Ａでの変異もまた特発性心室細動（ＩＶＦ）（突然死に至る別の不整脈惹起性疾患）を有する患者の一部で見られるが１０、１１、患者の大部分では原因となる変異についていまだ知られていない。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｔｏｗｂｉｎ， Ｊ．Ａ． ＆ Ｖａｔｔａ， Ｍ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ＱＴ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ． Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． １１０， ３８５−３９８ （２００１）．
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
不整脈惹起性疾患における過分極活性化環状ヌクレオチド依存チャネル１２をコードしているＨＣＮ４遺伝子での変異を分析検討し、かかる原因の解明に基づき不整脈惹起性疾患の遺伝子診断方法等を開発することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等はかかる目的を達成すべく鋭意研究し、ＬＱＴＳまたはＩＶＦの患者についてその原因を解明した。すなわち不整脈惹起性疾患における過分極活性化環状ヌクレオチド依存チャネルをコードしているＨＣＮ４遺伝子での変異を分析検討した結果、ＬＱＴＳおよびＩＶＦの患者において、該疾患にＨＣＮ４遺伝子の変異が関連していることを見出した。さらにその具体的な変異がミスセンス変異およびスプライシング変異であることをもそれぞれ見い出した。、かかる知見に基づいて本発明を完成した。
【０００６】
スプライシング部位変異は不完全なチャネルをコードしているものと推測され、一方ミスセンス変異は、ＨＣＮ４チャネルの表面発現を減少させ、そして静止電位でのチャネルの活性化を誘導し、活性速度をより一層速め、またプラトー電位における不活性外向き電流を減少させた。これらの観察結果は、ＨＣＮ４変異がＬＱＴＳおよびＩＶＦの原因となり得ることを示唆している。
【０００７】
従って、本発明は不整脈惹起性疾患を惹き起こすＨＣＮ４遺伝子の変異に関する。その具体的な変異の一例として、過分極活性化環状ヌクレオチド依存チャネルをコードしているＨＣＮ４遺伝子（野生型）において、ミスセンス変異および／又はスプライシング変異であることを含む。さらに、本発明はかかる遺伝子によりコードされる変異型ＨＣＮ４に関する。
【０００８】
また本発明は、前記変異型ＨＣＮ４及び／または変異型ＨＣＮ４遺伝子を利用することを特徴とする不整脈惹起性疾患に対する種々の遺伝子診断方法、さらには不整脈惹起性疾患に対する遺伝子診断用キット、また不整脈惹起性疾患に対する遺伝子診断用組成物に関する。
また本発明は、前記変異型ＨＣＮ４及び／または変異型ＨＣＮ４遺伝子を利用することを特徴とする、不整脈惹起性疾患に対する遺伝子治療方法に関する。
【０００９】
また本発明は、前記変異型ＨＣＮ４及び／または変異型ＨＣＮ４遺伝子を利用することを特徴とする、不整脈惹起性疾患に対する医薬物質のスクリーニング方法に関する。
また本発明は、本発明により見出された変異型ＨＣＮ４遺伝子により組み換えられた不整脈惹起性疾患モデル動物を提供する。
以下本発明を実施の形態に即して説明する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
（変異ＨＣＮ４）
本発明にかかるＨＣＮ４遺伝子（過分極活性化環状ヌクレオチド依存チャネルをコードしている）の変異には該変異により不整脈惹起性疾患を惹き起こす変異を含むものであり特に制限はない。また変異の起きる部位についても制限はなく、野生型ＨＣＮ４遺伝子の、１つ若しくは数箇所の部位において起きるものを含む。さらに変異の種類についても特に制限はなく、１つ若しくは数個の塩基配列の欠失、置換、付加により起こされた変異を含む。
【００１１】
かかる変異には、ミスセンス変異、スプライシング変異、終止変異、フレームシフト変異等が挙げられる。これらは単独で生じる場合も、複数の変異が生じる場合も含むものである。より具体的な一例として、ミスセンス変異及び／又はスプライシング変異がある。
【００１２】
すなわち、ＬＱＴＳおよび／又はＩＶＦについての新規な疾病遺伝子を探索するために、発明者等は、ＬＱＴＳと診断された１２人の患者およびＩＶＦと診断された１５人の患者について既知の疾病遺伝子（ＫＣＮＪ２を除く）を分析検討した。
【００１３】
６人のＬＱＴＳ患者で、２人にはＫＣＮＱ１、３人にはＫＣＮＨ２、１人にはＳＣＮ５Ａが見つかり、また３人のＩＶＦ患者で、２人にはＳＣＮ５Ａまた１人にはＫＣＮＥ２が見つかった。残りの患者では、変異は認められず、これらの患者についてさらに検討した。
【００１４】
ＬＱＴＳ多発家系の一例を図１に示す。既知のＬＱＴＳ／ＩＶＦ素因遺伝子は心臓で発現する電位依存性イオンチャネルをコードしているので、染色体１５ｐ２４−２５上に位置する過分極活性化環状ヌクレオチド依存性（ＨＣＮ）カチオンチャネル４遺伝子、即ちＨＣＮ４１２、は新規な疾病遺伝子の候補である。ＨＣＮ４はＫＣＮＨ２と相同の環状ヌクレオチド結合ドメインを有するイオンチャネルをコードし、ＨＣＮチャネルファミリーに属している１３、１４。
【００１５】
ＨＣＮ４のゲノム構成は、ＨＣＮ４ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００５４７７）をゲノム配列（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＣ ００９６６０）と配列させることによって決定された（配列表の配列番号１を参照）。
【００１６】
図２ａに示したように、ＨＣＮ４ゲノム遺伝子は、１２０３個のアミノ酸のチャネル（６個の膜貫通領域（Ｓ１−Ｓ６）、ポア領域および環状ヌクレオチド結合性ドメイン（ＣＮＢＤ）を含有する）をコードする９個のエキソンからなっていた。これらのタンパク質をコードするエキソンおよび隣接するイントロンを一本鎖立体配座多形性（ＳＳＣＰ）分析および直接配列決定を使用して配列の変化を分析した。その結果、２人の患者に二つの変異を見つけ出した（図２ａ）。またそれぞれの患者は変異について異型接合であった。これらの変異は３８０個のコントロール染色体では見られなかった。このことは、これらの変異が疾病関連変異であって、多型性ではないことを示唆するものである。
【００１７】
ＩＶＦ患者で見つかった一つの変異体、ＩＶＳ２ＤＳはエキソン２とイントロン２とのスプライシング部位での４個のヌクレオチドの挿入体であった（図２ｂ）。この挿入体は、コドン４０４でのＩｌｅ−Ｖａｌ変化およびそれに続く４２個の非関連アミノ酸を伴うフレームシフトを含有するｍＲＮＡとして発現され不完全なＨＣＮ４チャネルをもたらす（図２ｄ）。
【００１８】
家族性ＬＱＴＳで見られたミスセンス変異（図１）はエキソン５でのＧ−Ａトランジッションであった（図２ｃ）。これはコドン５５３でのＡｓｐ（ＧＡＣ）からＡｓｎ（ＡＡＣ）へのアミノ酸置換を結果として生じる。この変異（Ｄ５５３Ｎ）はＳ６とＣＮＢＤとの間のリンカー領域に位置していた（図２ｄ）。この領域はＨＣＮチャネルファミリー間の進化保存領域である（図２ｅ）。ＬＱＴＳ多発家系ではＬＱＳＴ表現型とＤ５５３Ｎ変異との共分離が確認され（図１ａ）、罹患個体はいずれもが変異について異型接合であった。
【００１９】
Ｄ５５３Ｎ変異で惹起される機能的変化を明らかにするために、発明者等は、野生型ウサギＨＣＮ４（ｒｂ−ＷＴ）およびヒトＨＣＮ４のＤ５５３Ｎと同等である変異導入ウサギＨＣＮ４（ｒｂ−Ｄ５５４Ｎ）についてグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）標識チャネルタンパク質として細胞内の分布を比較した（図２ｅ）。共焦点蛍光顕微鏡を使用して、ｒｂ−ＷＴの細胞内トラフィッキング（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）を、原形質膜上のＧＦＰ−標識ｒｂ−ＷＴから発する強い蛍光シグナルによって確認した（図３ａ）。これに対して、ＧＦＰ−標識ｒｂ−Ｄ５５４Ｎでは弱いシグナルのみが細胞表面に認められ、そして多量のシグナルが細胞内に滞留したままであった（図３ｂ）。ｒｂ−ＷＴとＧＦＰ−標識ｒｂ−Ｄ５５４ＮとのコトランスフェクションはＧＦＰシグナルの細胞内滞留を解除したが（図３ｃ）、これに対してｒｂ−Ｄ５５４ＮとＧＦＰ−標識ｒｂ−ＷＴとのコトランスフェクションでは細胞表面でのＧＦＰシグナルが減少していた（図３ｄ）。これらの観察結果は、正常および変異ＨＣＮ４の四量体チャネル複合体が部分的には細胞表面に到達し得たが、Ｄ５５３Ｎ変異がＨＣＮ４チャネルのトラフィッキング欠如をもたらしたことを示したものである。同様なトラフィッキング欠如が、ＬＱＴＳまたはＩＶＦに関連するＫＣＮＨ２、ＫＣＮＥ１、ＫＣＮＱ１およびＳＣＮ５Ａ変異についても報告されている１５−１８。
【００２０】
発明者等はまたｒｂ−ＷＴまたはｒｂ−Ｄ５５４Ｎの何れかを発現するかまたはこれらの両者を共発現するＣＯＳ７細胞での過分極活性電流（Ｉｈ）を分析してＤ５３３Ｎ変異の機能上の結果を洞察した（図４ａ）。電位依存性活性化で顕著な正のシフトがｒｂ−Ｄ５５４Ｎ単独で認められ、またｒｂ−Ｄ５５４Ｎおよびｒｂ−ＷＴ（ｒｂ−Ｄ５５４Ｎ／ｒｂ−ＷＴ）がコトランスフェクションされた細胞でも同様なシフトが記録された（図４ｂ）；ｒｂ−ＷＴについては、半最大活動電位（Ｖ１／２）＝−７４．３０±１．８７ｍＶ、スロープファクター（ｋ）＝８．４７±１．８７ｍＶ；ｒｂ−Ｄ５５４Ｎについては、Ｖ１／２＝−６９．２８±１．８９ｍＶ、ｋ＝５．７２±１．７２ｍＶ；ｒｂ−Ｄ５５４Ｎ／ｒｂ−ＷＴについては、Ｖ１／２＝−６８．５０±１．３９ｍＶ、ｋ＝６．８０±１．２４ｍＶであった。図４ｃに示すように、ｒｂ−Ｄ５５４Ｎまたはｒｂ−Ｄ５５４Ｎ／ｒｂ−ＷＴの静止電位レベル（約−８０ｍＶ）での相対コンダクタンス（０．５１１±０．０３４）または（０．３１２±０．０３３）は、ｒｂ−ＷＴの相対コンダクタンス（０．１８９±０．０４４）よりも有意に高いものであり、これは変異チャネルの存在によりＨＣＮチャネル複合体の開放確立が増大したことを示しているものである。さらにまた、活性化の時間常数（τ）がより早くなり、そしてｒｂ−Ｄ５５４Ｎおよびｒｂ−Ｄ５５４Ｎ／ｒｂ−ＷＴにおいて電位依存性が正の方向にシフトした（図４ｄ）。それゆえ、Ｄ５３３Ｎ変異は、野生型チャネルよりもより低い負の電位でかつより迅速な活性化速度で、電位依存性活性化に関して、ＨＣＮ４チャネルコンプレックスの機能的変化を生じたことが示唆された。
【００２１】
Ｉｈは一般には心臓活動電位の第４相脱分極の過程で、特に洞房（ＳＡ）結節細胞で活性化される１９−２１。ｒｂ−Ｄ５５４Ｎでみられる機能的変化は、Ｉｈが拡張期脱分極の過程で活性化され、そして患者でのＳＡ結節の自動性を変則させ得ることを示唆する。しかしながら、心室細胞では、Ｉｈの活性は拡張期電圧に対する影響については無視し得るものである。それは、静止電位レベルが高く、内向き整流Ｋ＋チャネルにより運搬される主外向き電流が存在し、またＨＣＮ４チャネルの発生量が比較的低いことによるものである。一方、Ｉｈの不活性化外向きテール電流（Ｉｔａｉｌ）は−２０ｍＶまでの以下の脱分極で発生する。図５に示したように、Ｉｈ振幅および外向き電流電位（Ｉｔａｉｌ−Ｖ）の関係はｒｂ−Ｄ５５４Ｎおよびｒｂ−Ｄ５５４Ｎ／ｒｂ−ＷＴを発現している細胞ではより小さいものであり、これは外向きテール電流が変異により顕著に低下していることを示している。心臓活動電位のうち、初期の再分極相（第１相）においては、一過性外向きカリウム電位（Ｉｔｏ）はこの相の形成およびプラトー電位の形成に重要な役割を果たし、そしてＩｔａｉｌはＩｔｏに対して追加の役割を付与するものと考えられる２２。第１相の終わりでの膜コンダクタンスおよびプラトーは、内向きおよび外向き電流の微妙なバランスにのっとった極めて低いものであるので、電流のいずれかの方向での多少の増減が再分極ひいては活性電位持続時間を変更し得るものである。本研究の知見から、第１相およびプラトーでの全外向き電流は変異の存在で低減したことが示唆される。この外向き電流の変異誘起低下は、−２０ｍＶよりも正のプラトー電位で活性電位持続時間を調節することによってＬＱＴＳ表現型に関与し得るものである。
【００２２】
かかる結果から、Ｄ５５４Ｎ変異体は正常なサブユニットを持つ四量体を形成し得る欠損チャネルサブユニットをコードしていること、またＨＣＮチャネルの機能が抑制されていることが示唆される。一方、ＩＶＳ２ＤＳ患者の場合、フレームシフトはＮ−末端からＳ４までが適切な立体配座を有し、ポア領域を有しない不完全なチャネル分子を形成し得る。ＨＣＮチャネルのＮ末端が多量体形成び寄与するので２３、異常ＨＣＮ４タンパク質は正常ＨＣＮ４サブユニットとチャネル複合体を形成することができ、これが優性ネガティブ様式で細胞表面の変異発現を低減させ、チャネル機能を抑制するものである。発明者等はここに、ＨＣＮ４変異がＬＱＴＳおよびＩＶＦの新規な疾病遺伝子であることを示唆する遺伝的、機能的な証拠を呈示するものである。
【００２３】
（遺伝子診断方法、遺伝子診断用キット、及び遺伝子診断用組成物）
上で説明したように、本発明において見出された不整脈惹起性疾患に関連する特異的なＨＣＮ４の変異は、特定部位におけるミスセンス変異および／又はスプライシング部位変異であって、かかる変異ＨＣＮ４の発現により不整脈惹起性疾患が惹起されるものである。従って、本発明にかかる遺伝子診断方法は、かかる変異の有無を判断し得る方法であれば特に制限はなく、従来公知の種々の方法が使用可能である。さらには変異ＨＣＮ４遺伝子、又はそれにより発現される変異ＨＣＮ４タンパク質、若しくはそれらの変異を含む部分のいずれかが検出可能であればよい。
【００２４】
本発明には、従って、かかる変異を検出するために用いることができる組成物が含まれる。例えば、これらの変異を選択的に検出可能とするプローブが含まれる。このようなプローブの好ましい塩基配列、塩基数には特に制限はないが、当業者にとっては上の変異部分を含む塩基配列を認識する以上通常公知の方法を用いて設計することは容易である。
【００２５】
また本発明にはこれらの検出方法を迅速かつ正確に行うために上の組成物を含む遺伝子診断用キットも含まれる。キットには、変異ＨＣＮ４遺伝子全部又は一部の塩基配列情報を利用するものであって、変異を特異的に検出できるプローブと、検出用試薬、検出用装置等が含まれる。さらにキットには、変異ＨＣＮ４タンパク質の全部又は一部のアミノ酸列情報を利用するものであって、変異を特異的に検出できるプローブと、検出用試薬、検出用装置等が含まれる。具体的には変異タンパク質を検出する抗体を含む診断用キットが挙げられる。
【００２６】
（遺伝子治療方法）
上で説明したように、本発明において見出されたＨＣＮ４の特異的な変異（特定部位におけるミスセンス変異および／又はスプライシング部位での変異）により不整脈惹起性疾患が惹起されるものである。従って、かかる疾患を治療する方法が可能となる。
【００２７】
１つには変異ＨＣＮ４遺伝子によるＨＣＮ４タンパク質の発現を抑制する方法である。かかる発現を抑制する方法は、従来公知の種々の方法が制限なく使用できる。具体的にはいわゆるアンチセンス法、リボザイム法、抑制ＲＮＡ法（ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ法）等である。
または野生型ＨＣＮ４遺伝子を導入して野生型ＨＣＮ４タンパク質を十分発現させることにより変異型ＨＣＮ４タンパク質の発現の影響を相対的に抑制する方法である。かかる野性型ＨＣＮ４遺伝子（またはその一部）を導入する方法は従来公知の種々の方法が制限なく使用可能である。具体的に細胞に導入するにはレトロウイルス、アデノウイルス等のウイルスを用いる方法、またはリポソームを用いる方法が可能である。
【００２８】
（医薬物質のスクリーニング方法）
上で説明したように、本発明において見出されたＨＣＮ４の特異的な変異（特定部位におけるミスセンス変異および／又はスプライシング部位での変異）により不整脈惹起性疾患が惹起されるものであり、またかかる変異による不整脈現象が定量的に解析可能となることから、かかる不整脈現象をモニタすることにより不整脈惹起性疾患治療のための医薬物質の活性をスクリーニングすることが可能となる。
また、種々の化合物をスクリーニングすることにより、従来知られてない不整脈惹起性疾患治療のための医薬物質を見出すことが可能となる。
【００２９】
（不整脈惹起性疾患モデル動物）
上で説明したように、本発明において見出されたＨＣＮ４の特異的な変異（特定部位におけるミスセンス変異および／又はスプライシング部位での変異）により不整脈惹起性疾患が惹起されるものであり、またかかる変異による不整脈現象が定量的に解析可能となることから、かかる不整脈現象を発現するモデル動物の作成が可能となる。具体的には該動物に変異型ＨＣＮ４遺伝子を導入し、変異型ＨＣＮ４タンパク質を発現させることが可能である。マウス等のモデル動物についてかかる遺伝子導入方法は従来公知の方法が使用可能であり、特に制限はない。
以下実施例によりさらに詳細に説明する。
【００３０】
【実施例】
被験者
被験者として、遺伝学的には無関係であるＬＱＴＳおよびＩＶＦの発端者患者１２人および１５人をそれぞれ選定した。ＩＶＦの患者の１人はＳＣＮ５Ａ変異を有している旨先に報告されている７。何人かの患者については罹患家族係累をも解析した。患者または家族係累はいずれもＫＣＮＪ２変異によって生じるアンダーソン症候群の臨床的徴候、例えば、周期性四肢麻痺および身体的異形性を示さなかった７。それで、発明者等はＫＣＮＪ２遺伝子については分析検討をしなかった。コントロール被験者は無作為に選定された血縁無関係の健康な日本人１９０名であった。インフォームド・コンセントを得た後、それぞれの被験者から血液サンプルを得た。この研究プログラムは東京医科歯科大学難治疾患研究所倫理審査委員会の承認を得ている。Ｄ５５３Ｎを持つ発端者患者は２０歳の時に最初の失神を起した４３歳の婦人であった。この患者は３４歳でけたたましい音を聞いて二度目の失神に至った。着装携行式心電図記録計を使用して得られたこの患者の２４時間記録心電図（ＥＣＧ）では、心拍停止に次いでトルサード ド ポワン心室性頻脈をきたしたことが判った（図１ｂ）。この患者の平常時ＥＣＧは低電位Ｔ波および長いＱＴ間隔を示した。心拍数について補正したＱＴ間隔（ＱＴｃ）は０．６０秒であり、これはメキシレチンまたはピルジカイニドの投与により十分に改善されて０．４６秒となった。ＩＶＳ２ＤＳを持つ患者は、安静時に失神を起した４１歳の男性であり、入院し、そして２４時間記録のこの患者のＥＣＧは睡眠中の多形性心室頻拍を示した。この患者のＱＴｃは０．４４〜０．４７５秒であり、正常域の上限ないし軽度延長であった。この患者には心臓除細動デバイスが装着された。この患者には明確な家族歴がなかった。
【００３１】
変異分析
発明者等はＨＣＮ４の８個のタンパク質コードエキソンを別々に増幅するプライマーをデザインした。３５サイクルＰＣＲでプライマー５Ｆ（５′−ＣＴＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡ−３′）および５Ｒ（５′−ＧＡＣＡＧＧＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＣＡＧＡ−３′）を使用してエキソン５を増幅した。エキソン２−イントロン２境界の増幅は５′−ＧＡＣＣＣＧＣＡＧＣＧＴＴＡＡＡＡＴ−３′および５′−ＴＴＴＣＣＣＣＣＡＡＧＡＧＧＴＴＴＧＣＡ−３′のプライマーにより行った。この分析に使用するその他のプライマーの例として以下の表１に示した。また各エクソンに対するプライマーの使用例を表２に示した。患者からのＰＣＲ生成物を既報の通り２４ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法により配列変更について検討した。正常および異常ＳＳＣＰ型のＰＣＲ生成物は、自動シークエンサーでのＢｉｇ Ｄｙｅ Ｄｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して直接またはプラスミドベクターにクローニングした後に配列決定して配列変化を確認した。
【００３２】
【表１】
【００３３】
【表２】
【００３４】
ＨＣＮ４チャネルの機能的発現および電気生理学的解析
ウサギＨＣＮ４ｃＤＮＡ（ｒｂ−ＷＴ）はＤｒｓ．Ｍ．ＴａｋａｎｏおよびＤｒ．Ｈ．Ｏｈｍｏｒｉから好意により寄贈されたものであった。Ｄ５３３Ｎ−当量変異をオーバーラップエクステンションＰＣＲ手順によってｒｂ−ＨＣＮ４−ＷＴに導入してｒｂ−Ｄ５６４Ｎを得た。これらの構築物から、ＧＦＰ−標識チャネル構築物を、末端コドンをＧＡＴＡＴＣの配列で置換し、そしてプライマー、５′−ｇａｔａｔｃＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡ−３′および５′−ｔｃｔａｇａＣＧＣＴＴＴＴＧＴＡＧＡＧＣＴＣＡＴＣＣＡ−３′でｐｃＤＮＡ３．１／ＮＴ−ＧＦＰベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）から増幅したＧＦＰ配列を挿入することにより、製造した。これらの構築物を製造業者の指示に従ってＳｕｐｅｒｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．）を使用してＣＯＳ７細胞中にトランスフェクションした。細胞を１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）および抗生物質を補足したダルベッコ変性イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）で培養し、構築物をトランスフェクションした。トランスフェクションされたＤＮＡの量は、ｐＧＦＰ−Ｃ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）について０．４μｇ／３５−ｍｍディッシュそしてＧＦＰ−非標識ＨＣＮ４について１．６μｇ／３５−ｍｍディッシュであった（ｒｂ−ＷＴ：ｒｂ−Ｄ５４４Ｎ＝１：１、ｒｂ−ＷＴおよびｒｂ−Ｄ５４４Ｎの共発現の場合）。ＧＦＰ−標識ＨＣＮ構築物の場合、０．２μｇ／ウエルＤＮＡを、ガラススライドを取り付けたＬａｂ−Ｔｅｋ４チャンバー（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ，Ｉｎｃ．）でのトランスフェクションに使用し、そしてトランスフェクションされた細胞のＧＦＰ−シグナルを共焦点蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．）で検鏡した。細胞をトランスフェクション後３６〜３８時間に顕微鏡上で培養皿からチャンバーに移し、ＧＦＰ−陽性細胞についてパッチクランプテストを行った。３３〜３５°Ｃの温度でＡｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を使用する全細胞パッチクランプ技術で、膜電流を記録した。電流測定値を０．５ｋＨｚで低域フィルターした。データ取得および解析はコンバーターを通して市販のソフトウェア（ｐＣｌａｍｐ７およびＣｌａｍｐｅｘ８，Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を使用して行った。データは７〜１５の細胞で平均し、そして平均値±Ｓ．Ｅ．で示した。統計学的差異は不対ステューデントｔ検定を使用して評価した。
【００３５】
【発明の効果】
ＬＱＴＳまたはＩＶＦの患者について、過分極活性化環状ヌクレオチド依存チャネルをコードしているＨＣＮ４遺伝子での変異を分析検討した結果、ミスセンス変異および／又はスプライシング部位変異がＬＱＴＳおよびＩＶＦの患者でそれぞれ見つかった。スプライシング部位変異は不完全なチャネルをコードしているものと推測され、一方ミスセンス変異は、ＨＣＮ４チャネルの表面発現を減少させ、そして静止電位でのチャネルの活性化を誘導し、活性速度をより一層速め、またプラトー電位における不活性外向き電流を減少させる。
【００３６】
かかる知見に基づき、ＨＣＮ４変異がＬＱＴＳおよびＩＶＦの原因となることが示され、これを利用することにより、不整脈惹起性疾患に対する遺伝子診断方法、遺伝子診断用キット、遺伝子診断用組成物、さらには遺伝子治療方法が可能となる。
【００３７】
さらに不整脈惹起性疾患に対する医薬物質のスクリーニング方法やそれから得られる不整脈惹起性疾患に対する医薬物質の取得が可能となる。さらには、変異型ＨＣＮ４遺伝子により組み換えられた不整脈惹起性疾患モデル動物の作成をも可能とする。
【００３８】
（参考文献）
１． Ｔｏｗｂｉｎ， Ｊ．Ａ． ＆ Ｖａｔｔａ， Ｍ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ＱＴ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ． Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． １１０， ３８５−３９８ （２００１）．
２． Ｗａｎｇ， Ｑ． ｅｔ ａｌ． Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｇｅｎｅ： ＫＶＬＱＴ１ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｃａｕｓｅ ｃａｒｄｉａｃ ａｒｒｙｔｈｍｉａｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． １２， １７−２３ （１９９６）．
３． Ｃｕｒｒａｎ， Ｍ． Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｃａｒｄｉａｃ ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ： ＨＥＲＧ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｃａｕｓｅ ｌｏｎｇ ＱＴ ｓｙｎｄｒｏｍｅ． Ｃｅｌｌ ８０， ７９５−８０３ （１９９５）．
４． Ｗａｎｇ， Ｑ． ｅｔ ａｌ． ＳＣＮ５Ａ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｃａｒｄｉａｃ ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ， ｌｏｎｇ ＱＴ ｓｙｎｄｒｏｍｅ． Ｃｅｌｌ ８０， ８０５−８１１ （１９９５）．
５． Ｓｐｌａｗｓｋｉ， Ｉ． Ｔｒｉｓｔａｎｉ−Ｆｉｒｏｕｚｉ， Ｍ．， Ｌｅｈｍａｎｎ， Ｍ．Ｈ．， Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ， Ｍ．Ｃ． ＆ Ｋｅａｔｉｎｇ， Ｍ． Ｔ． Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｍｉｎＫ ｇｅｎｅ ｃａｕｓｅ ｌｏｎｇ ＱＴ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ＩＫｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． １７， ３３８−３４０ （１９９６）．
６． Ａｂｂｏｔｔ， Ｇ．Ｗ． ｅｔ ａｌ． ＭｉＲＰ１ ｆｏｒｍｓ ＩＫｒ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｗｉｔｈ ＨＥＲＧ ａｎｄ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃａｒｄｉａｃ ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ． Ｃｅｌｌ ９７， １７５−１８７ （１９９９）．
７． Ｐｌａｓｔｅｒ， Ｎ． Ｍ． ｅｔ ａｌ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｋｉｒ２．１ ｃａｕｓｅ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ｅｐｉｓｏｄｉｃ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆ Ａｎｄｅｒｓｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ． Ｃｅｌｌ １０５， ５１１−５１９ （２００１）．
８． Ｍｏｓｓ， Ａ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｌｏｎｇ ＱＴ ｓｙｎｄｒｏｍｅ． Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ３２８ ｆａｍｉｌｉｅｓ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８４， １１３６−１１４４ （１９９１）．
９． Ｓｐｌａｗｓｋｉ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｌｏｎｇ−ＱＴ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｇｅｎｅｓ． ＫＶＬＱＴ１， ＨＥＲＧ， ＳＣＮ５Ａ， ＫＣＮＥ１， ａｎｄ ＫＣＮＥ２． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０２， １１７８−１１８５ （２０００）．
１０． Ｃｈｅｎ， Ｑ． ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｂａｓｉｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ ３９２， ２９３−２９６ （１９９８）．
１１． Ａｋａｉ， Ｊ．， Ｍａｋｉｔａ， Ｎ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｎｏｖｅｌ ＳＣＮ５Ａ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｙｐｉｃａｌ ＥＣＧ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｂｒｕｇａｄａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４７９， ２９−３４ （２０００）．
１２． Ｓｅｉｆｅｒｔ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｌｏｗｌｙ ｇａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｈａｎｎｅｌ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈａｌａｍｕｓ， ｈｅａｒｔ， ａｎｄ ｔｅｓｔｉｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９６， ９３９１−９３９６ （１９９９）．
１３． Ｋａｕｐｐ， Ｕ． Ｂ． ＆ Ｓｅｉｆｅｒｔ， Ｒ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｐａｃｅｍａｋｅｒ ｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌｓ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ６３， ２３５−２５７ （２００１）．
１４． Ｂｉｅｌ， Ｍ．， Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ａ． ＆ Ｗａｈｌ， Ｃ． Ｃａｒｄｉａｃ ＨＣＮ ｃｈａｎｎｅｌｓ： ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｍｅｄ． １２， ２０６−２１３ （２００２）．
１５． Ｚｈｏｕ， Ｚ．， Ｇｏｎｇ， Ｑ．， Ｅｐｓｔｅｉｎ， Ｍ． Ｌ． ＆ Ｊａｎｕａｒｙ， Ｃ． Ｔ． ＨＥＲＧ ｃｈａｎｎｅｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｏｎｇ ＱＴ ｓｙｎｄｒｏｍｅ． Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｅｆｅｃｔｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３， ２１０６１−２１０６６ （１９９８）．
１６． Ｂｉａｎｃｈｉ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＬＱＴ５−ｍｉｎＫ ｍｕｔａｎｔｓ： ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ＩＫｓ， ＩＫｒ ａｎｄ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｉｎ ｌｏｎｇ ＱＴ ｓｙｎｄｒｏｍｅ． Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． ８， １４９９−１５０７（１９９９）．
１７． Ｂｉａｎｃｈｉ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｉ （Ｋｓ） ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＬＱＴ１ ｍｕｔａｎｔｓ． Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７９， Ｈ３００３− Ｈ３０１１ （２０００）．
１８． Ｂａｒｏｕｄｉ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． Ｎｏｖｅｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ Ｂｒｕｇａｄａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ． Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＳＣＮ５Ａ ｍｕｔａｎｔ （Ｒ１４３２Ｇ）． Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ８８， ｅ７８−ｅ８３ （２００１）．
１９． ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏ， Ｄ． Ｐａｃｅｍａｋｅｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ｔｉｓｓｕｅ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５５， ４５５−４７２ （１９９３）．
２０． Ｓｕｒａｗｉｃｚ， Ｂ． Ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｉｎ ｃｙｃｌｅ ｌｅｎｇｔｈ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｄｕｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃａｒｄｉａｃ Ｐｕｒｋｉｎｊｅ ａｎｄ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｍｕｓｃｌｅ ｆｉｂｅｒｓ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｒｅｓ． ２６， １０２１−１０２９ （１９９２）．
２１． Ｚａｚａ， Ａ．， Ｍｉｃｈｅｌｅｔｔｉ， Ｍ．， Ｂｒｉｏｓｃｈｉ， Ａ． ＆ Ｒｏｃｃｈｅｔｔｉ， Ｍ． Ｉｏｎｉｃ ｃｕｒｒｅｎｔｓ ｄｕｒｉｎｇ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｐａｃｅｍａｋｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ ｓｉｎｏ−ａｔｒｉａｌ ｍｙｏｃｙｔｅｓ．
Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５０５， ６７７−６８８ （１９９７）．
２２． Ｖｅｒｋｅｒｋ， Ａ． Ｏ． ＆ ｖａｎ Ｇｉｎｎｅｋｅｎ， Ａ． Ｃ． Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｏｕｔｗａｒｄ Ｋ （＋） ｃｕｒｒｅｎｔ ｉｎ ｃｅｌｌｓ ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｕｒｒｅｎｔ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｒｅｓ． ５２， ５１７−５２０ （２００１）．
２３． Ｔｒａｎ， Ｎ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ＮＨ２ ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｏｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐａｃｅｍａｋｅｒ ｃｈａｎｎｅｌｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７， ４３５８８−４３５９２ （２００２）．
２４． Ｎｉｓｈｉ， Ｈ．， Ｋｉｍｕｒａ， Ａ．， Ｈａｒａｄａ， Ｈ．， Ｔｏｓｈｉｍａ， Ｈ． ＆ Ｓａｓａｚｕｋｉ， Ｔ． Ｎｏｖｅｌ ｍｉｓｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ｂｅｔａ ｍｙｏｓｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｇｅｎｅ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ａ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １８８， ３７９−３８７ （１９９２）．
２５． Ｉｓｈｉｉ， Ｔ．， Ｔａｋａｎｏ， Ｍ．， Ｘｉｅ， Ｌ−Ｈ．， Ｎｏｍａ， Ａ． ＆ Ｏｈｍｏｒｉ， Ｈ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｔｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ ｈｅａｒｔ ｓｉｎｏａｒｔｅｒｉａｌ ｎｏｄｅ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４， １２８３５−１２８３９ （１９９９）．
【００３９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、家族性ＬＱＴＳを持つ患者の遺伝的およびＥＣＧ所見を示す。ここでａ）は、ＨＣＮ４Ｄ５５３Ｎ変異を有するＬＱＴＳ多発家系の家系図であり、中実四角は罹患男性を、中実円は罹患女性を、中空四角は罹患していない男性を、中空円は罹患していない女性を、斜線（／）が付いた灰色の円は医療記録による確定のない死亡女性を示す。矢印は発端者患者を示す。ｂ）は罹患発端者のＱＴｃを記録したものであって、トルサード ド ポワン心室性頻脈の開始時の心電図を示す。
【図２】図２は、ＨＣＮ４の変異の解析を示す。ここで、ａ）はＬＱＳＴ／ＩＶＦ患者で見られたＨＣＮ４の遺伝子構造および配列変化を示す。ｂ）は、ＩＶＦ患者からの正常および変異エキソン２およびイントロン２を含むプラスミドクローンの配列を示す。変異ＩＶＳ２ＤＳはスプライシング部位での４個のヌクレオチド（四角で囲まれている）の挿入体であることを示す。斜線および矢印は正常なエキソンーイントロン境界および変異時の推定スプライシング位置をそれぞれ指示している。ｃ）は、Ｄ５５３Ｎ変異を持つＬＱＴＳの発端者患者でのエキソン５の直接配列決定法による塩基配列を示す。ｄ）は、ＨＣＮ４チャネルを図式的に表示したものである。ｅ）は、残基Ｄ５３３の進化的保存を示すＨＣＮチャネルの配列のアラインメントを示す。「−」はヒトＨＣＮ４チャネルと同一の残基であることを示している。
【図３】図３は、ＧＦＰ標識チャネルタンパク質の共焦点蛍光顕微鏡画像を示す。ここでＣＯＳ７細胞に種々のＨＣＮ４構築体をトランスフェクションし、３６〜４８時間後にＧＦＰシグナルを検討した。ａ）はＧＦＰ標識ｒｂ−ＷＴ、ｂ）はＧＦＰ標識ｒｂ−Ｄ５５４Ｎ、ｃ）はＧＦＰ標識ｒｂ−Ｄ５５４Ｎおよび非標識ｒｂ−ＷＴのコトランスフェクション、ｄ）はＧＦＰ標識ｒｂ−ＷＴおよび非標識ｒｂ−Ｄ５５４Ｎのコトランスフェクションを示す。
【図４】図４は、ＨＣＮ４をトランスフェクションした細胞の電位依存性活性化を示す。ここでａ）はＨＣＮ４電流の代表的な記録を示す。点線はゼロ電位を指示している。電流活性化は、保持電位−３０ｍＶから１０ｍＶの減少量で−４０ｍＶと−１２０ｍＶとの間での５秒の脱分極試験パルスで得られた。浴液は１４４ｍＭＮａＣｌ、０．３３ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、４ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ２、０．５３ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび５．５ｍＭグルコースを含有していた（ｐＨ７．４）。ピペット抵抗は、１００ｍＭ Ｋ−アスパルテート、２０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＡＴＰ−Ｍｇ、５ｍＭ クレアチンリン酸ニカリウム、５ｍＭ ＥＧＴＡおよび５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有する溶液（ｐＨ７．４）で満たした場合、２〜３ＭΩであった。記録データを次の作図に使用した。ｂ）はＩｈ−Ｖ関連曲線、ｃ）は相対コンダクタンス曲線およびｄ）は活性化時間定数の対数曲線を示す。各パネルにおいて、円はｒｂ−ＷＴを示し、三角はｒｂ−Ｄ５５４Ｎを示し、そして四角はｒｂ−Ｄ５５４ＮとｒｂーＷＴとの１：１混合物を示す。
【図５】図５ａ）は、ＨＣＮ４構築体でトランスフェクションされた細胞の外向きテール電流であって保持電位から５秒間−１００ｍＶの活性化電位後の１０ｍＶ増加量での−６０と３０ｍＶとの間の調節電圧の間で電流不活性化を記録したものである。ｂ）は外向きテール電流の拡大トレースを、ｃ）はｒｂ−ＷＴ（円）、ｒｂ−Ｄ５５４Ｎ（三角）そしてｒｂ−Ｄ５５４Ｎとｒｂ−ＷＴとの１：１混合物（四角）でトランスフェクションされた細胞から得られたＩｔａｉｌ−Ｖの関係を示す。
【関連する技術分野】
本発明は、不整脈惹起性疾患に関連する変異型ＨＣＮ４遺伝子、及びその応用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝性ＱＴ延長症候群（ＬＱＴＳ）、即ち、突然死のリスクが高い不整脈惹起性疾患は、心臓イオンチャネルの遺伝子、ＫＣＮＱ１（ＫｖＬＱＴ１）、ＫＣＮＨ２（ＨＥＲＧ）、ＳＣＮ５Ａ、ＫＣＮＥ１（ＭｉｎＫ）、ＫＣＮＥ２（ＭｉＲＰ１）およびＫＣＮＪ２での変異によって生じることが知られている１−７（例えば非特許文献１参照）。患者の半数以上ではこれらの疾病遺伝子において原因となる変異を確認することができるが、その他の患者は未確認の疾病遺伝子の変異に原因がある可能性があると言える８、９。
またＳＣＮ５Ａでの変異もまた特発性心室細動（ＩＶＦ）（突然死に至る別の不整脈惹起性疾患）を有する患者の一部で見られるが１０、１１、患者の大部分では原因となる変異についていまだ知られていない。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｔｏｗｂｉｎ， Ｊ．Ａ． ＆ Ｖａｔｔａ， Ｍ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ＱＴ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ． Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． １１０， ３８５−３９８ （２００１）．
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
不整脈惹起性疾患における過分極活性化環状ヌクレオチド依存チャネル１２をコードしているＨＣＮ４遺伝子での変異を分析検討し、かかる原因の解明に基づき不整脈惹起性疾患の遺伝子診断方法等を開発することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等はかかる目的を達成すべく鋭意研究し、ＬＱＴＳまたはＩＶＦの患者についてその原因を解明した。すなわち不整脈惹起性疾患における過分極活性化環状ヌクレオチド依存チャネルをコードしているＨＣＮ４遺伝子での変異を分析検討した結果、ＬＱＴＳおよびＩＶＦの患者において、該疾患にＨＣＮ４遺伝子の変異が関連していることを見出した。さらにその具体的な変異がミスセンス変異およびスプライシング変異であることをもそれぞれ見い出した。、かかる知見に基づいて本発明を完成した。
【０００６】
スプライシング部位変異は不完全なチャネルをコードしているものと推測され、一方ミスセンス変異は、ＨＣＮ４チャネルの表面発現を減少させ、そして静止電位でのチャネルの活性化を誘導し、活性速度をより一層速め、またプラトー電位における不活性外向き電流を減少させた。これらの観察結果は、ＨＣＮ４変異がＬＱＴＳおよびＩＶＦの原因となり得ることを示唆している。
【０００７】
従って、本発明は不整脈惹起性疾患を惹き起こすＨＣＮ４遺伝子の変異に関する。その具体的な変異の一例として、過分極活性化環状ヌクレオチド依存チャネルをコードしているＨＣＮ４遺伝子（野生型）において、ミスセンス変異および／又はスプライシング変異であることを含む。さらに、本発明はかかる遺伝子によりコードされる変異型ＨＣＮ４に関する。
【０００８】
また本発明は、前記変異型ＨＣＮ４及び／または変異型ＨＣＮ４遺伝子を利用することを特徴とする不整脈惹起性疾患に対する種々の遺伝子診断方法、さらには不整脈惹起性疾患に対する遺伝子診断用キット、また不整脈惹起性疾患に対する遺伝子診断用組成物に関する。
また本発明は、前記変異型ＨＣＮ４及び／または変異型ＨＣＮ４遺伝子を利用することを特徴とする、不整脈惹起性疾患に対する遺伝子治療方法に関する。
【０００９】
また本発明は、前記変異型ＨＣＮ４及び／または変異型ＨＣＮ４遺伝子を利用することを特徴とする、不整脈惹起性疾患に対する医薬物質のスクリーニング方法に関する。
また本発明は、本発明により見出された変異型ＨＣＮ４遺伝子により組み換えられた不整脈惹起性疾患モデル動物を提供する。
以下本発明を実施の形態に即して説明する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
（変異ＨＣＮ４）
本発明にかかるＨＣＮ４遺伝子（過分極活性化環状ヌクレオチド依存チャネルをコードしている）の変異には該変異により不整脈惹起性疾患を惹き起こす変異を含むものであり特に制限はない。また変異の起きる部位についても制限はなく、野生型ＨＣＮ４遺伝子の、１つ若しくは数箇所の部位において起きるものを含む。さらに変異の種類についても特に制限はなく、１つ若しくは数個の塩基配列の欠失、置換、付加により起こされた変異を含む。
【００１１】
かかる変異には、ミスセンス変異、スプライシング変異、終止変異、フレームシフト変異等が挙げられる。これらは単独で生じる場合も、複数の変異が生じる場合も含むものである。より具体的な一例として、ミスセンス変異及び／又はスプライシング変異がある。
【００１２】
すなわち、ＬＱＴＳおよび／又はＩＶＦについての新規な疾病遺伝子を探索するために、発明者等は、ＬＱＴＳと診断された１２人の患者およびＩＶＦと診断された１５人の患者について既知の疾病遺伝子（ＫＣＮＪ２を除く）を分析検討した。
【００１３】
６人のＬＱＴＳ患者で、２人にはＫＣＮＱ１、３人にはＫＣＮＨ２、１人にはＳＣＮ５Ａが見つかり、また３人のＩＶＦ患者で、２人にはＳＣＮ５Ａまた１人にはＫＣＮＥ２が見つかった。残りの患者では、変異は認められず、これらの患者についてさらに検討した。
【００１４】
ＬＱＴＳ多発家系の一例を図１に示す。既知のＬＱＴＳ／ＩＶＦ素因遺伝子は心臓で発現する電位依存性イオンチャネルをコードしているので、染色体１５ｐ２４−２５上に位置する過分極活性化環状ヌクレオチド依存性（ＨＣＮ）カチオンチャネル４遺伝子、即ちＨＣＮ４１２、は新規な疾病遺伝子の候補である。ＨＣＮ４はＫＣＮＨ２と相同の環状ヌクレオチド結合ドメインを有するイオンチャネルをコードし、ＨＣＮチャネルファミリーに属している１３、１４。
【００１５】
ＨＣＮ４のゲノム構成は、ＨＣＮ４ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００５４７７）をゲノム配列（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＣ ００９６６０）と配列させることによって決定された（配列表の配列番号１を参照）。
【００１６】
図２ａに示したように、ＨＣＮ４ゲノム遺伝子は、１２０３個のアミノ酸のチャネル（６個の膜貫通領域（Ｓ１−Ｓ６）、ポア領域および環状ヌクレオチド結合性ドメイン（ＣＮＢＤ）を含有する）をコードする９個のエキソンからなっていた。これらのタンパク質をコードするエキソンおよび隣接するイントロンを一本鎖立体配座多形性（ＳＳＣＰ）分析および直接配列決定を使用して配列の変化を分析した。その結果、２人の患者に二つの変異を見つけ出した（図２ａ）。またそれぞれの患者は変異について異型接合であった。これらの変異は３８０個のコントロール染色体では見られなかった。このことは、これらの変異が疾病関連変異であって、多型性ではないことを示唆するものである。
【００１７】
ＩＶＦ患者で見つかった一つの変異体、ＩＶＳ２ＤＳはエキソン２とイントロン２とのスプライシング部位での４個のヌクレオチドの挿入体であった（図２ｂ）。この挿入体は、コドン４０４でのＩｌｅ−Ｖａｌ変化およびそれに続く４２個の非関連アミノ酸を伴うフレームシフトを含有するｍＲＮＡとして発現され不完全なＨＣＮ４チャネルをもたらす（図２ｄ）。
【００１８】
家族性ＬＱＴＳで見られたミスセンス変異（図１）はエキソン５でのＧ−Ａトランジッションであった（図２ｃ）。これはコドン５５３でのＡｓｐ（ＧＡＣ）からＡｓｎ（ＡＡＣ）へのアミノ酸置換を結果として生じる。この変異（Ｄ５５３Ｎ）はＳ６とＣＮＢＤとの間のリンカー領域に位置していた（図２ｄ）。この領域はＨＣＮチャネルファミリー間の進化保存領域である（図２ｅ）。ＬＱＴＳ多発家系ではＬＱＳＴ表現型とＤ５５３Ｎ変異との共分離が確認され（図１ａ）、罹患個体はいずれもが変異について異型接合であった。
【００１９】
Ｄ５５３Ｎ変異で惹起される機能的変化を明らかにするために、発明者等は、野生型ウサギＨＣＮ４（ｒｂ−ＷＴ）およびヒトＨＣＮ４のＤ５５３Ｎと同等である変異導入ウサギＨＣＮ４（ｒｂ−Ｄ５５４Ｎ）についてグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）標識チャネルタンパク質として細胞内の分布を比較した（図２ｅ）。共焦点蛍光顕微鏡を使用して、ｒｂ−ＷＴの細胞内トラフィッキング（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）を、原形質膜上のＧＦＰ−標識ｒｂ−ＷＴから発する強い蛍光シグナルによって確認した（図３ａ）。これに対して、ＧＦＰ−標識ｒｂ−Ｄ５５４Ｎでは弱いシグナルのみが細胞表面に認められ、そして多量のシグナルが細胞内に滞留したままであった（図３ｂ）。ｒｂ−ＷＴとＧＦＰ−標識ｒｂ−Ｄ５５４ＮとのコトランスフェクションはＧＦＰシグナルの細胞内滞留を解除したが（図３ｃ）、これに対してｒｂ−Ｄ５５４ＮとＧＦＰ−標識ｒｂ−ＷＴとのコトランスフェクションでは細胞表面でのＧＦＰシグナルが減少していた（図３ｄ）。これらの観察結果は、正常および変異ＨＣＮ４の四量体チャネル複合体が部分的には細胞表面に到達し得たが、Ｄ５５３Ｎ変異がＨＣＮ４チャネルのトラフィッキング欠如をもたらしたことを示したものである。同様なトラフィッキング欠如が、ＬＱＴＳまたはＩＶＦに関連するＫＣＮＨ２、ＫＣＮＥ１、ＫＣＮＱ１およびＳＣＮ５Ａ変異についても報告されている１５−１８。
【００２０】
発明者等はまたｒｂ−ＷＴまたはｒｂ−Ｄ５５４Ｎの何れかを発現するかまたはこれらの両者を共発現するＣＯＳ７細胞での過分極活性電流（Ｉｈ）を分析してＤ５３３Ｎ変異の機能上の結果を洞察した（図４ａ）。電位依存性活性化で顕著な正のシフトがｒｂ−Ｄ５５４Ｎ単独で認められ、またｒｂ−Ｄ５５４Ｎおよびｒｂ−ＷＴ（ｒｂ−Ｄ５５４Ｎ／ｒｂ−ＷＴ）がコトランスフェクションされた細胞でも同様なシフトが記録された（図４ｂ）；ｒｂ−ＷＴについては、半最大活動電位（Ｖ１／２）＝−７４．３０±１．８７ｍＶ、スロープファクター（ｋ）＝８．４７±１．８７ｍＶ；ｒｂ−Ｄ５５４Ｎについては、Ｖ１／２＝−６９．２８±１．８９ｍＶ、ｋ＝５．７２±１．７２ｍＶ；ｒｂ−Ｄ５５４Ｎ／ｒｂ−ＷＴについては、Ｖ１／２＝−６８．５０±１．３９ｍＶ、ｋ＝６．８０±１．２４ｍＶであった。図４ｃに示すように、ｒｂ−Ｄ５５４Ｎまたはｒｂ−Ｄ５５４Ｎ／ｒｂ−ＷＴの静止電位レベル（約−８０ｍＶ）での相対コンダクタンス（０．５１１±０．０３４）または（０．３１２±０．０３３）は、ｒｂ−ＷＴの相対コンダクタンス（０．１８９±０．０４４）よりも有意に高いものであり、これは変異チャネルの存在によりＨＣＮチャネル複合体の開放確立が増大したことを示しているものである。さらにまた、活性化の時間常数（τ）がより早くなり、そしてｒｂ−Ｄ５５４Ｎおよびｒｂ−Ｄ５５４Ｎ／ｒｂ−ＷＴにおいて電位依存性が正の方向にシフトした（図４ｄ）。それゆえ、Ｄ５３３Ｎ変異は、野生型チャネルよりもより低い負の電位でかつより迅速な活性化速度で、電位依存性活性化に関して、ＨＣＮ４チャネルコンプレックスの機能的変化を生じたことが示唆された。
【００２１】
Ｉｈは一般には心臓活動電位の第４相脱分極の過程で、特に洞房（ＳＡ）結節細胞で活性化される１９−２１。ｒｂ−Ｄ５５４Ｎでみられる機能的変化は、Ｉｈが拡張期脱分極の過程で活性化され、そして患者でのＳＡ結節の自動性を変則させ得ることを示唆する。しかしながら、心室細胞では、Ｉｈの活性は拡張期電圧に対する影響については無視し得るものである。それは、静止電位レベルが高く、内向き整流Ｋ＋チャネルにより運搬される主外向き電流が存在し、またＨＣＮ４チャネルの発生量が比較的低いことによるものである。一方、Ｉｈの不活性化外向きテール電流（Ｉｔａｉｌ）は−２０ｍＶまでの以下の脱分極で発生する。図５に示したように、Ｉｈ振幅および外向き電流電位（Ｉｔａｉｌ−Ｖ）の関係はｒｂ−Ｄ５５４Ｎおよびｒｂ−Ｄ５５４Ｎ／ｒｂ−ＷＴを発現している細胞ではより小さいものであり、これは外向きテール電流が変異により顕著に低下していることを示している。心臓活動電位のうち、初期の再分極相（第１相）においては、一過性外向きカリウム電位（Ｉｔｏ）はこの相の形成およびプラトー電位の形成に重要な役割を果たし、そしてＩｔａｉｌはＩｔｏに対して追加の役割を付与するものと考えられる２２。第１相の終わりでの膜コンダクタンスおよびプラトーは、内向きおよび外向き電流の微妙なバランスにのっとった極めて低いものであるので、電流のいずれかの方向での多少の増減が再分極ひいては活性電位持続時間を変更し得るものである。本研究の知見から、第１相およびプラトーでの全外向き電流は変異の存在で低減したことが示唆される。この外向き電流の変異誘起低下は、−２０ｍＶよりも正のプラトー電位で活性電位持続時間を調節することによってＬＱＴＳ表現型に関与し得るものである。
【００２２】
かかる結果から、Ｄ５５４Ｎ変異体は正常なサブユニットを持つ四量体を形成し得る欠損チャネルサブユニットをコードしていること、またＨＣＮチャネルの機能が抑制されていることが示唆される。一方、ＩＶＳ２ＤＳ患者の場合、フレームシフトはＮ−末端からＳ４までが適切な立体配座を有し、ポア領域を有しない不完全なチャネル分子を形成し得る。ＨＣＮチャネルのＮ末端が多量体形成び寄与するので２３、異常ＨＣＮ４タンパク質は正常ＨＣＮ４サブユニットとチャネル複合体を形成することができ、これが優性ネガティブ様式で細胞表面の変異発現を低減させ、チャネル機能を抑制するものである。発明者等はここに、ＨＣＮ４変異がＬＱＴＳおよびＩＶＦの新規な疾病遺伝子であることを示唆する遺伝的、機能的な証拠を呈示するものである。
【００２３】
（遺伝子診断方法、遺伝子診断用キット、及び遺伝子診断用組成物）
上で説明したように、本発明において見出された不整脈惹起性疾患に関連する特異的なＨＣＮ４の変異は、特定部位におけるミスセンス変異および／又はスプライシング部位変異であって、かかる変異ＨＣＮ４の発現により不整脈惹起性疾患が惹起されるものである。従って、本発明にかかる遺伝子診断方法は、かかる変異の有無を判断し得る方法であれば特に制限はなく、従来公知の種々の方法が使用可能である。さらには変異ＨＣＮ４遺伝子、又はそれにより発現される変異ＨＣＮ４タンパク質、若しくはそれらの変異を含む部分のいずれかが検出可能であればよい。
【００２４】
本発明には、従って、かかる変異を検出するために用いることができる組成物が含まれる。例えば、これらの変異を選択的に検出可能とするプローブが含まれる。このようなプローブの好ましい塩基配列、塩基数には特に制限はないが、当業者にとっては上の変異部分を含む塩基配列を認識する以上通常公知の方法を用いて設計することは容易である。
【００２５】
また本発明にはこれらの検出方法を迅速かつ正確に行うために上の組成物を含む遺伝子診断用キットも含まれる。キットには、変異ＨＣＮ４遺伝子全部又は一部の塩基配列情報を利用するものであって、変異を特異的に検出できるプローブと、検出用試薬、検出用装置等が含まれる。さらにキットには、変異ＨＣＮ４タンパク質の全部又は一部のアミノ酸列情報を利用するものであって、変異を特異的に検出できるプローブと、検出用試薬、検出用装置等が含まれる。具体的には変異タンパク質を検出する抗体を含む診断用キットが挙げられる。
【００２６】
（遺伝子治療方法）
上で説明したように、本発明において見出されたＨＣＮ４の特異的な変異（特定部位におけるミスセンス変異および／又はスプライシング部位での変異）により不整脈惹起性疾患が惹起されるものである。従って、かかる疾患を治療する方法が可能となる。
【００２７】
１つには変異ＨＣＮ４遺伝子によるＨＣＮ４タンパク質の発現を抑制する方法である。かかる発現を抑制する方法は、従来公知の種々の方法が制限なく使用できる。具体的にはいわゆるアンチセンス法、リボザイム法、抑制ＲＮＡ法（ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ法）等である。
または野生型ＨＣＮ４遺伝子を導入して野生型ＨＣＮ４タンパク質を十分発現させることにより変異型ＨＣＮ４タンパク質の発現の影響を相対的に抑制する方法である。かかる野性型ＨＣＮ４遺伝子（またはその一部）を導入する方法は従来公知の種々の方法が制限なく使用可能である。具体的に細胞に導入するにはレトロウイルス、アデノウイルス等のウイルスを用いる方法、またはリポソームを用いる方法が可能である。
【００２８】
（医薬物質のスクリーニング方法）
上で説明したように、本発明において見出されたＨＣＮ４の特異的な変異（特定部位におけるミスセンス変異および／又はスプライシング部位での変異）により不整脈惹起性疾患が惹起されるものであり、またかかる変異による不整脈現象が定量的に解析可能となることから、かかる不整脈現象をモニタすることにより不整脈惹起性疾患治療のための医薬物質の活性をスクリーニングすることが可能となる。
また、種々の化合物をスクリーニングすることにより、従来知られてない不整脈惹起性疾患治療のための医薬物質を見出すことが可能となる。
【００２９】
（不整脈惹起性疾患モデル動物）
上で説明したように、本発明において見出されたＨＣＮ４の特異的な変異（特定部位におけるミスセンス変異および／又はスプライシング部位での変異）により不整脈惹起性疾患が惹起されるものであり、またかかる変異による不整脈現象が定量的に解析可能となることから、かかる不整脈現象を発現するモデル動物の作成が可能となる。具体的には該動物に変異型ＨＣＮ４遺伝子を導入し、変異型ＨＣＮ４タンパク質を発現させることが可能である。マウス等のモデル動物についてかかる遺伝子導入方法は従来公知の方法が使用可能であり、特に制限はない。
以下実施例によりさらに詳細に説明する。
【００３０】
【実施例】
被験者
被験者として、遺伝学的には無関係であるＬＱＴＳおよびＩＶＦの発端者患者１２人および１５人をそれぞれ選定した。ＩＶＦの患者の１人はＳＣＮ５Ａ変異を有している旨先に報告されている７。何人かの患者については罹患家族係累をも解析した。患者または家族係累はいずれもＫＣＮＪ２変異によって生じるアンダーソン症候群の臨床的徴候、例えば、周期性四肢麻痺および身体的異形性を示さなかった７。それで、発明者等はＫＣＮＪ２遺伝子については分析検討をしなかった。コントロール被験者は無作為に選定された血縁無関係の健康な日本人１９０名であった。インフォームド・コンセントを得た後、それぞれの被験者から血液サンプルを得た。この研究プログラムは東京医科歯科大学難治疾患研究所倫理審査委員会の承認を得ている。Ｄ５５３Ｎを持つ発端者患者は２０歳の時に最初の失神を起した４３歳の婦人であった。この患者は３４歳でけたたましい音を聞いて二度目の失神に至った。着装携行式心電図記録計を使用して得られたこの患者の２４時間記録心電図（ＥＣＧ）では、心拍停止に次いでトルサード ド ポワン心室性頻脈をきたしたことが判った（図１ｂ）。この患者の平常時ＥＣＧは低電位Ｔ波および長いＱＴ間隔を示した。心拍数について補正したＱＴ間隔（ＱＴｃ）は０．６０秒であり、これはメキシレチンまたはピルジカイニドの投与により十分に改善されて０．４６秒となった。ＩＶＳ２ＤＳを持つ患者は、安静時に失神を起した４１歳の男性であり、入院し、そして２４時間記録のこの患者のＥＣＧは睡眠中の多形性心室頻拍を示した。この患者のＱＴｃは０．４４〜０．４７５秒であり、正常域の上限ないし軽度延長であった。この患者には心臓除細動デバイスが装着された。この患者には明確な家族歴がなかった。
【００３１】
変異分析
発明者等はＨＣＮ４の８個のタンパク質コードエキソンを別々に増幅するプライマーをデザインした。３５サイクルＰＣＲでプライマー５Ｆ（５′−ＣＴＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡ−３′）および５Ｒ（５′−ＧＡＣＡＧＧＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＣＡＧＡ−３′）を使用してエキソン５を増幅した。エキソン２−イントロン２境界の増幅は５′−ＧＡＣＣＣＧＣＡＧＣＧＴＴＡＡＡＡＴ−３′および５′−ＴＴＴＣＣＣＣＣＡＡＧＡＧＧＴＴＴＧＣＡ−３′のプライマーにより行った。この分析に使用するその他のプライマーの例として以下の表１に示した。また各エクソンに対するプライマーの使用例を表２に示した。患者からのＰＣＲ生成物を既報の通り２４ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法により配列変更について検討した。正常および異常ＳＳＣＰ型のＰＣＲ生成物は、自動シークエンサーでのＢｉｇ Ｄｙｅ Ｄｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して直接またはプラスミドベクターにクローニングした後に配列決定して配列変化を確認した。
【００３２】
【表１】
【表２】
ＨＣＮ４チャネルの機能的発現および電気生理学的解析
ウサギＨＣＮ４ｃＤＮＡ（ｒｂ−ＷＴ）はＤｒｓ．Ｍ．ＴａｋａｎｏおよびＤｒ．Ｈ．Ｏｈｍｏｒｉから好意により寄贈されたものであった。Ｄ５３３Ｎ−当量変異をオーバーラップエクステンションＰＣＲ手順によってｒｂ−ＨＣＮ４−ＷＴに導入してｒｂ−Ｄ５６４Ｎを得た。これらの構築物から、ＧＦＰ−標識チャネル構築物を、末端コドンをＧＡＴＡＴＣの配列で置換し、そしてプライマー、５′−ｇａｔａｔｃＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡ−３′および５′−ｔｃｔａｇａＣＧＣＴＴＴＴＧＴＡＧＡＧＣＴＣＡＴＣＣＡ−３′でｐｃＤＮＡ３．１／ＮＴ−ＧＦＰベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）から増幅したＧＦＰ配列を挿入することにより、製造した。これらの構築物を製造業者の指示に従ってＳｕｐｅｒｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．）を使用してＣＯＳ７細胞中にトランスフェクションした。細胞を１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）および抗生物質を補足したダルベッコ変性イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）で培養し、構築物をトランスフェクションした。トランスフェクションされたＤＮＡの量は、ｐＧＦＰ−Ｃ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）について０．４μｇ／３５−ｍｍディッシュそしてＧＦＰ−非標識ＨＣＮ４について１．６μｇ／３５−ｍｍディッシュであった（ｒｂ−ＷＴ：ｒｂ−Ｄ５４４Ｎ＝１：１、ｒｂ−ＷＴおよびｒｂ−Ｄ５４４Ｎの共発現の場合）。ＧＦＰ−標識ＨＣＮ構築物の場合、０．２μｇ／ウエルＤＮＡを、ガラススライドを取り付けたＬａｂ−Ｔｅｋ４チャンバー（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ，Ｉｎｃ．）でのトランスフェクションに使用し、そしてトランスフェクションされた細胞のＧＦＰ−シグナルを共焦点蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．）で検鏡した。細胞をトランスフェクション後３６〜３８時間に顕微鏡上で培養皿からチャンバーに移し、ＧＦＰ−陽性細胞についてパッチクランプテストを行った。３３〜３５°Ｃの温度でＡｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を使用する全細胞パッチクランプ技術で、膜電流を記録した。電流測定値を０．５ｋＨｚで低域フィルターした。データ取得および解析はコンバーターを通して市販のソフトウェア（ｐＣｌａｍｐ７およびＣｌａｍｐｅｘ８，Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を使用して行った。データは７〜１５の細胞で平均し、そして平均値±Ｓ．Ｅ．で示した。統計学的差異は不対ステューデントｔ検定を使用して評価した。
【００３５】
【発明の効果】
ＬＱＴＳまたはＩＶＦの患者について、過分極活性化環状ヌクレオチド依存チャネルをコードしているＨＣＮ４遺伝子での変異を分析検討した結果、ミスセンス変異および／又はスプライシング部位変異がＬＱＴＳおよびＩＶＦの患者でそれぞれ見つかった。スプライシング部位変異は不完全なチャネルをコードしているものと推測され、一方ミスセンス変異は、ＨＣＮ４チャネルの表面発現を減少させ、そして静止電位でのチャネルの活性化を誘導し、活性速度をより一層速め、またプラトー電位における不活性外向き電流を減少させる。
【００３６】
かかる知見に基づき、ＨＣＮ４変異がＬＱＴＳおよびＩＶＦの原因となることが示され、これを利用することにより、不整脈惹起性疾患に対する遺伝子診断方法、遺伝子診断用キット、遺伝子診断用組成物、さらには遺伝子治療方法が可能となる。
【００３７】
さらに不整脈惹起性疾患に対する医薬物質のスクリーニング方法やそれから得られる不整脈惹起性疾患に対する医薬物質の取得が可能となる。さらには、変異型ＨＣＮ４遺伝子により組み換えられた不整脈惹起性疾患モデル動物の作成をも可能とする。
【００３８】
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２２． Ｖｅｒｋｅｒｋ， Ａ． Ｏ． ＆ ｖａｎ Ｇｉｎｎｅｋｅｎ， Ａ． Ｃ． Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｏｕｔｗａｒｄ Ｋ （＋） ｃｕｒｒｅｎｔ ｉｎ ｃｅｌｌｓ ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｕｒｒｅｎｔ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｒｅｓ． ５２， ５１７−５２０ （２００１）．
２３． Ｔｒａｎ， Ｎ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ＮＨ２ ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｏｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐａｃｅｍａｋｅｒ ｃｈａｎｎｅｌｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７， ４３５８８−４３５９２ （２００２）．
２４． Ｎｉｓｈｉ， Ｈ．， Ｋｉｍｕｒａ， Ａ．， Ｈａｒａｄａ， Ｈ．， Ｔｏｓｈｉｍａ， Ｈ． ＆ Ｓａｓａｚｕｋｉ， Ｔ． Ｎｏｖｅｌ ｍｉｓｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ｂｅｔａ ｍｙｏｓｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｇｅｎｅ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ａ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １８８， ３７９−３８７ （１９９２）．
２５． Ｉｓｈｉｉ， Ｔ．， Ｔａｋａｎｏ， Ｍ．， Ｘｉｅ， Ｌ−Ｈ．， Ｎｏｍａ， Ａ． ＆ Ｏｈｍｏｒｉ， Ｈ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｔｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ ｈｅａｒｔ ｓｉｎｏａｒｔｅｒｉａｌ ｎｏｄｅ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４， １２８３５−１２８３９ （１９９９）．
【００３９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、家族性ＬＱＴＳを持つ患者の遺伝的およびＥＣＧ所見を示す。ここでａ）は、ＨＣＮ４Ｄ５５３Ｎ変異を有するＬＱＴＳ多発家系の家系図であり、中実四角は罹患男性を、中実円は罹患女性を、中空四角は罹患していない男性を、中空円は罹患していない女性を、斜線（／）が付いた灰色の円は医療記録による確定のない死亡女性を示す。矢印は発端者患者を示す。ｂ）は罹患発端者のＱＴｃを記録したものであって、トルサード ド ポワン心室性頻脈の開始時の心電図を示す。
【図２】図２は、ＨＣＮ４の変異の解析を示す。ここで、ａ）はＬＱＳＴ／ＩＶＦ患者で見られたＨＣＮ４の遺伝子構造および配列変化を示す。ｂ）は、ＩＶＦ患者からの正常および変異エキソン２およびイントロン２を含むプラスミドクローンの配列を示す。変異ＩＶＳ２ＤＳはスプライシング部位での４個のヌクレオチド（四角で囲まれている）の挿入体であることを示す。斜線および矢印は正常なエキソンーイントロン境界および変異時の推定スプライシング位置をそれぞれ指示している。ｃ）は、Ｄ５５３Ｎ変異を持つＬＱＴＳの発端者患者でのエキソン５の直接配列決定法による塩基配列を示す。ｄ）は、ＨＣＮ４チャネルを図式的に表示したものである。ｅ）は、残基Ｄ５３３の進化的保存を示すＨＣＮチャネルの配列のアラインメントを示す。「−」はヒトＨＣＮ４チャネルと同一の残基であることを示している。
【図３】図３は、ＧＦＰ標識チャネルタンパク質の共焦点蛍光顕微鏡画像を示す。ここでＣＯＳ７細胞に種々のＨＣＮ４構築体をトランスフェクションし、３６〜４８時間後にＧＦＰシグナルを検討した。ａ）はＧＦＰ標識ｒｂ−ＷＴ、ｂ）はＧＦＰ標識ｒｂ−Ｄ５５４Ｎ、ｃ）はＧＦＰ標識ｒｂ−Ｄ５５４Ｎおよび非標識ｒｂ−ＷＴのコトランスフェクション、ｄ）はＧＦＰ標識ｒｂ−ＷＴおよび非標識ｒｂ−Ｄ５５４Ｎのコトランスフェクションを示す。
【図４】図４は、ＨＣＮ４をトランスフェクションした細胞の電位依存性活性化を示す。ここでａ）はＨＣＮ４電流の代表的な記録を示す。点線はゼロ電位を指示している。電流活性化は、保持電位−３０ｍＶから１０ｍＶの減少量で−４０ｍＶと−１２０ｍＶとの間での５秒の脱分極試験パルスで得られた。浴液は１４４ｍＭＮａＣｌ、０．３３ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、４ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ２、０．５３ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび５．５ｍＭグルコースを含有していた（ｐＨ７．４）。ピペット抵抗は、１００ｍＭ Ｋ−アスパルテート、２０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＡＴＰ−Ｍｇ、５ｍＭ クレアチンリン酸ニカリウム、５ｍＭ ＥＧＴＡおよび５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有する溶液（ｐＨ７．４）で満たした場合、２〜３ＭΩであった。記録データを次の作図に使用した。ｂ）はＩｈ−Ｖ関連曲線、ｃ）は相対コンダクタンス曲線およびｄ）は活性化時間定数の対数曲線を示す。各パネルにおいて、円はｒｂ−ＷＴを示し、三角はｒｂ−Ｄ５５４Ｎを示し、そして四角はｒｂ−Ｄ５５４ＮとｒｂーＷＴとの１：１混合物を示す。
【図５】図５ａ）は、ＨＣＮ４構築体でトランスフェクションされた細胞の外向きテール電流であって保持電位から５秒間−１００ｍＶの活性化電位後の１０ｍＶ増加量での−６０と３０ｍＶとの間の調節電圧の間で電流不活性化を記録したものである。ｂ）は外向きテール電流の拡大トレースを、ｃ）はｒｂ−ＷＴ（円）、ｒｂ−Ｄ５５４Ｎ（三角）そしてｒｂ−Ｄ５５４Ｎとｒｂ−ＷＴとの１：１混合物（四角）でトランスフェクションされた細胞から得られたＩｔａｉｌ−Ｖの関係を示す。
Claims (9)
- 不整脈惹起性疾患を惹き起こす変異型ＨＣＮ４遺伝子。
- 過分極活性化環状ヌクレオチド依存チャネルをコードしているＨＣＮ４遺伝子において、ミスセンス変異、スプライシング変異、終止変異、又はフレームシフト変異のいずれかに変異があることを特徴とする、変異型ＨＣＮ４の遺伝子。
- 請求項１又は２のいずれかに記載の遺伝子により発現する変異型ＨＣＮ４。
- 請求項１〜３のいずれかに記載された、変異型ＨＣＮ４及び／またはＨＣＮ４の遺伝子を用いる、不整脈惹起性疾患に対する遺伝子診断方法。
- 請求項１〜３のいずれかに記載された、変異型ＨＣＮ４及び／またはＨＣＮ４の遺伝子を用いる、不整脈惹起性疾患に対する遺伝子診断用キット。
- 請求項１〜３のいずれかに記載された、前記変異型ＨＣＮ４及び／またはＨＣＮ４の遺伝子を用いる、不整脈惹起性疾患に対する遺伝子診断用組成物。
- 請求項１〜３のいずれかに記載された、前記変異型ＨＣＮ４及び／またはＨＣＮ４の遺伝子を用いる、不整脈惹起性疾患に対する遺伝子治療方法。
- 請求項１〜３のいずれかに記載された、前記変異型ＨＣＮ４及び／またはＨＣＮ４の遺伝子を用いる、不整脈惹起性疾患に対する医薬物質のスクリーニング方法。
- 請求項１又は２のいずれかに記載の変異型ＨＣＮ４遺伝子により組み換えられた不整脈惹起性疾患モデル動物。
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|---|---|---|---|---|
| JP2009502259A (ja) * | 2005-07-21 | 2009-01-29 | ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク | タンデム型心臓ペースメーカーシステム |
| JP2009532680A (ja) * | 2006-03-31 | 2009-09-10 | フェラーニ−カイル，カリマ | 生物活性多タンパク質複合体を得て、かつ使用するための方法および組成物 |
| WO2022235610A1 (en) * | 2021-05-03 | 2022-11-10 | University Of Washington | Electrophysiological modification to suppress arrhythmias |
-
2003
- 2003-02-27 JP JP2003050469A patent/JP2004254628A/ja active Pending
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